Institut für Entwicklungsgenetik - Helmholtz Zentrum München

Institut für Entwicklungsgenetik
Institute of Developmental Genetics
Neuherberg
(Direktor / Director: Prof. Dr. Wolfgang Wurst)
Die Institute
Im Institut für Entwicklungsgenetik werden
in fünf unterschiedlichen neurobiologischorientierten
Forschungsbereichen (Molekulare
Neurogenetik, molekulare Augenentwicklung,
Neurogenetik des Zebrafisches,
Somitenentwicklung, neuronale Migration
und adulte Neurogenese) spezifisch die
nachstehenden Ziele verfolgt: 1) die Identifizierung
und Charakterisierung molekularer
Netzwerke, die die neuronale Musterbildung,
die Differenzierung und Entwicklung
des Mittel- und Hinterhirns steuern, 2) die
Entschlüsselung molekularer Mechanismen
und Signalwege, die zu neurodegenerativen
(Morbus Parkinson, Augenerkrankungen)
und psychiatrischen (Depression, Angststörungen)
Erkrankungen führen, und 3) die
Mutagenese des kompletten Mausgenoms
mittels konditionaler gene trapping und
gene targeting Strategien, sowie mittels
RNA Interferenz.
Schwerpunkt der Forschung bildet die
Etablierung von Tiermodellen für humane
Erkrankungen. Nach Inaktivierung oder
Überexpression bestimmter Kandidatengene
werden am Tiermodell pathophysiologische
Veränderungen untersucht. Die phänotypischen
Veränderungen der Mutanten
werden durch neuropathologische, immunohistochemische,
neuroendokrinologische
und verhaltensbiologische Analysen bestimmt.
Parallel zur Weiterentwicklung
molekulargenetischer Techniken werden
bioinformatische Ansätze integriert, um das
Genom in silico zu analysieren, neue Gene
zu identifizieren, zu annotieren und deren
Funktionen sowie genetische Interaktionen
vorherzusagen, die anschließend im Tiermodell
experimentell verifiziert werden. Für
Erkrankungen wie Lisenzepalie, Depression,
T
he Institute of Developmental
Genetics focuses on five different
areas of neurobiological research
(molecular neurogenetics, molecular eye
development, zebrafish neurogenetics,
somite development, neuronal migration,
and adult neurogenesis) with three primary
research goals: i) the dissection of the
molecular genetic networks that underlie
pattern formation, specification, differentiation,
and proliferation of mid- and
hindbrain neurons, ii) the decoding of
molecular mechanisms and pathways that
lead to neurodegenerative (Morbus
Parkinson, eye disorders) and psychiatric
(depression, anxiety) diseases, and iii) the
mutagenesis of the complete mouse
genome using conditional gene trapping,
gene targeting strategies, and RNA interference.
The research focuses on the establishment
and use of zebrafish and mice as animal
models of human disease. Candidate genes
are inactivated or ectopically expressed
and the pathophysiological alterations
investigated. The phenotypic alterations in
the mutants are determined using neuropathological,
immunohistochemical,
neuroendocrinological, and behavioural
assays. Bioinformatics approaches are
applied in parallel to the development of
molecular genetics methods in order to
analyse the genome in silico, and to
identify novel genes, determine their role in
genetic networks, and predict their functions
and genetic interactions. These predictions
are then verified experimentally in animal
models. The first animal models for
diseases such as lisencephaly, depression,
anxiety, Morbus Parkinson, and eye
GSF 145

Angststörungen, Augenerkrankungen und
Morbus Parkinson wurden bereits erste
Tiermodelle von den Wissenschaftlern des
Institut erfolgreich etabliert.
Das Institut für Entwicklungsgenetik interagiert
im Rahmen des Deutschen Humangenomprojektes
(DHGP) und des Nationalen
Genomforschungsnetzes (NGFN) interdisziplinär
sowohl mit vielen Instituten innerhalb
der GSF als auch mit Max-Planck-
Instituten (MPI) und Universitäten im gesamten
Bundesgebiet. Außerdem bestehen
eine Vielzahl an Kooperationen mit internationalen
Institutionen weltweit.
Dem Institut ist eine klinische Kooperationsgruppe
„Molekulare Neurogenetik“
angegliedert, die in Zusammenarbeit mit
dem MPI für Psychiatrie, München, Tiermodelle
für psychiatrische Krankheiten etabliert,
um neue Therapiemodelle für die
klinische Forschung bereitzustellen.
Zu den größten Erfolgen des Institut im
Jahr 2005 gehören die Etablierung der
BMBF-geförderten Systematisch-Methodischen
Plattform RNAi (SMP RNAi), sowie
die beiden im 6. Europäischen Rahmenprogramm
geförderten Forschungsverbünde
FLPFLEX (Entwicklung konditionaler gene
trapping und gene targeting Vektoren) und
EUCOMM, dessen Ziel es ist, möglichst alle
Gene des Säugetiergenoms zu mutieren.
Sowohl die SMP RNAi als auch EUCOMM
werden vom Direktor des Instituts für Entwicklungsgenetik
an der GSF, Prof. Wolfgang
Wurst, geleitet und koordiniert.
Beteiligung des Instituts an POF-Programmen
Das Institut für Entwicklungsgenetik ist an
dem POF-Programm ’Comparative Genomics
for Human Health’ beteiligt und trägt
im Rahmen dieses Programmes zur großangelegten
funktionellen Analyse von Genen
bei. Mit Hilfe der Genfallentechnologie, der
RNA-Interferenztechnologie (RNAi) und
unter Verwendung einer chemischen Mutagenesestrategie
(ENU) werden Gene im
Großmaßstab in Maus- und Zebrafischmodellen
mutiert und die entsprechenden
mutanten Phänotypen im Institut und in der
German Mouse Clinic (GMC) analysiert.
Darauf aufbauend erfolgt dann die Entschlüsselung
der genetischen Netzwerke,
in denen die mutierten Gene im Rahmen
des Gesamtorganismus aktiv sind mittels
disorders have already been established by
the Institute’s scientists.
Under the framework of the German
Human Genome Project (DHGP) and the
National Genome Research Network
(NGFN), the Institute fosters interdisciplinary
exchange with other GSF institutes, with
Max-Planck-Institutes, and with universities
across Germany, as well as with many
international institutes.
A clinical cooperation group ‘Molecular
Neurogenetics’ is affiliated to the Institute;
the group collaborates closely with
the Max-Planck-Institute of Psychiatry in
Munich to develop animal models for
psychiatric diseases in order to provide
new therapeutic models for clinical
research.
The major achievements in 2005 include
the establishment of a BMBF-funded
Systematic-Methodological Platform on
RNAi technology (SMP RNAi) and the
launch of the programmes FLPFLEX
(development of conditional gene trapping
and gene targeting vectors) and EUCOMM,
the largest public funded mouse mutagenesis
initiative, under the 6th EU Framework.
Both, the SMP RNAi and EUCOMM
are coordinated by the Institute’s Director
Professor Wolfgang Wurst.
Participation in POF Programmes
The Institute participates in the POF
programme ‘Comparative Genomics for
Human Health’, in which it contributes to
the large scale functional analysis of genes.
Gene trapping, gene targeting, and RNA
interference (RNAi) technologies are used
together with a chemical mutagenesis
strategy (ENU) to mutate genes on a large
scale in mouse and zebrafish model
organisms. The resultant mutant phenotypes
are analysed by the Institute and the
German Mouse Clinic (GMC). Following
these experiments, the genetic networks
underlying the activities of the mutated
genes in the organism are analysed using
microarray and yeast-two-hybrid strategies
as well as bioinformatics approaches.
Heads of research groups and FE projects
• Dr. Laure Bally-Cuif
• Professor Jochen Graw
• Dr. Kenji Imai
146 GSF

der Mikroarraytechnologie, des Yeast-two-
Hybridverfahrens sowie unter Einbeziehung
bioinformatischer Analysen.
Gruppenleiter/innen//FE-Vorhabenleiter/innen
• Dr. Laure Bally-Cuif
• Prof. Dr. Jochen Graw
• Dr. Kenji Imai
• Dr. Reinhard Köster
• Dr. Chichung Lie
• Prof. Dr. Wolfgang Wurst
Im Jahre 2005 waren am Institut für Entwicklungsgenetik
insgesamt 118 Mitarbeiter/
innen beschäftigt. Unter den 57 beschäftigen
Wissenschaftler/innen, von denen 28
sonderfinanziert wurden, waren 19 Gastwissenschaftler/innen
und 27 Doktorand/innen.
• Dr. Reinhard Köster
• Dr. Chichung Lie
• Professor Wolfgang Wurst
In 2005 the Institute had 118 members
of staff, including 57 scientists of whom
19 were visiting scientists and 27 postgraduate
students – 28 scientists were
supported by grants.
Die Institute
Etablierung von Krankheitsmodellen
durch RNA Interferenz Technologie
RNA-vermittelte Interferenz (RNAi) ist eine
leistungsfähige natürliche zelluläre Strategie
zur gezielten, sequenzspezifischen Downregulation
von Genexpression, die sowohl in
unterschiedlichen Organismen als auch in
Pflanzen nachgewiesen werden konnte.
RNAi wird durch doppelsträngige RNA-
Moleküle (dsRNA) ausgelöst; diese werden
durch die Endonuklease „Dicer“ in 21-23
Basenpaare große Fragmente zerkleinert,
die als ‚short interfering RNAs’, kurz siRNAs,
bezeichnet werden. siRNAs werden vom
„RNA-induced Silencing Complex (RISC)“
als Zielfaktoren verwendet, um zu den
siRNAs komplementäre mRNAs abzubauen.
Der Einsatz von RNAi als experimentelles
Werkzeug macht sich diesen natürlichen
Mechanismus der Gen-Downregulation zunutzen,
um die Expressionsstärke spezifischer
endogener Gene zu regulieren. Dazu
werden die entsprechenden siRNAs in
Zellen oder Organismen eingeführt. Die
Einfachheit und Effizienz des RNAi-Ansatzes
hat zur schnellen, weitverbreiteten Akzeptanz
von RNAi als neue Methode zur gezielten
Herunterregulation von Genen in unterschiedlichen
experimentellen Systemen,
von C. elegans bis hin zu menschlichen
Zellen, geführt. RNAi-vermitteltes gene
silencing führt in der Regel nicht zum vollständigen
Abbau der Ziel mRNA, aber zu
einer starken Reduktion auf etwa 5 – 10%
des normalen Werts. Zahlreiche Anwendungen
der RNAi Technik in Zelllinien belegen,
dass dieser Wert bei vielen Genen ausreicht,
um zu einer phänotypischen Defizienz zu
führen, die Rückschlüsse über die Genfunktion
ermöglicht.
Zudem eignet sich RNAi hervorragend zur
Untersuchung polygenetischer Erkrankungen,
da mehrere unterschiedliche siRNAs
gleichzeitig eingesetzt werden können.
Im Rahmen der vom nationalen Genomforschungsnetz
(NGFN) geförderten systematisch-methodologischen
Plattform SMP-
RNAi etablieren wir RNA Interferenz zu einer
standardisierten, zeitsparenden Methodik,
die es ermöglichen soll „Knockdown“
Mausmutanten in größerer Zahl und mit
weniger Aufwand zu erzeugen, als dies mit
der klassischen Knockout-Technik möglich
ist. Hierdurch wird die Zeitspanne zwischen
der Frage nach der Funktion eines Gens und
deren Beantwortung aufgrund von in vivo
Untersuchungen erheblich verkürzt. Ferner
werden konditionale Methoden entwickelt,
die es ermöglichen, RNA Interferenz in der
Maus nur in spezifischen Zelltypen auszuprägen
oder zu induzieren. Die Technik zur
Erstellung von RNAi-Mäusen wird dann
angewendet, um Mausmodelle zur krankheitsorientierten
Forschung zu generieren.
Technologie zur Herstellung von
shRNA Vektor Mäusen
Bei unserem auf embryonalen Stammzellen
(ES Zellen) basierenden Ansatz werden
GSF 147

shRNA Expressionsvektor
Promoter shRNA
attB
attB
RMCE
U6 Promotor
Stopsignal
TTTTT TTTTT TTTTT
loxP
loxP
attP
hygro/TK
attP
Blastozysteninjektion
Knockdown Maus
U6 Promotor
Cre Rekombinase
TTTTT
loxP
shRNA/RNAi
ES Zellkultur
Abb. 1: Herstellung von shRNA Vektor Mausstämmen.
shRNA Vektoren werden durch Rekombinase-vermittelten
Kassettenaustausch
(RMCE) in einen definierten chromosomalen
Locus in ES Zellen eingesetzt. Aus den vektortragenden
ES Zellen können durch Blastozysteninjektion
„Knockdown“ Mauslinien generiert
werden, die shRNAs exprimieren und damit ein
ausgewähltes Zielgen mittels RNAi reprimieren.
shRNA Expressionsvektoren durch Rekombinase-vermittelten
Kassettenaustausch
(RMCE) in eine definierte chromosomale
Akzeptorstelle inseriert. Da RNAi mit der
Expression von Zielgenen auf der mRNA
Ebene interferiert, können shRNA Vektoren
jeglicher Spezifität in den gleichen chromosomalen
Locus inseriert werden. Hierzu
wurden universell verwendbare ES Zelllinien
konstruiert, die C31-Rekombinase Akzeptorsequenzen
(attP) in einer definierten Integrationsstelle
auf Chromosom 6 (Rosa26) enthalten.
Diese Konfiguration ermöglicht es
mittels C31-Integrase einen oder mehrere
shRNA Vektoren, die mit entsprechenden
Donorsequenzen (attP) flankiert sind, effizient
in das Genom von ES Zellen ortsspezifisch
einzuführen (Abb. 1). Bisher haben wir
dieses Verfahren anhand von über 20 shRNA
Vektoren verschiedener Spezifität erfolgreich
angewandt; der Aufwand zur Herstellung
rekombinanter ES Zellklone wird hierdurch
im Vergleich zur Knockout-Technologie etwa
50-fach reduziert.
Derartige shRNA Vektor tragende ES
Zellklone werden anschließend in Blastozysten
injiziert, um das Konstrukt über die
Keimbahn chimärer Mäuse an Nachkommen
weiterzugeben, die im folgenden zur
Abb. 2: Konditionale shRNA Vektoren. Die Insertion
eines von Cre Rekombinase Erkennungssequenzen
(loxP) flankierten Stopsignals verhindert
zunächst die Produktion von aktiven shRNA
Molekülen. Nach Deletion des Stopsignals in Cre
Rekombinase exprimierenden Zellen werden
vollständige shRNAs produziert, die zum Knockdown
des ausgewählten Zielgens führen.
Phänotypanalyse eingesetzt werden können.
Alternativ ist es auch möglich shRNA Vektortragende
ES Zellen in tetraploide Präimplantationsembryonen
einzuführen, um Mäuse
zu erzeugen, die vollständig von diesen ES
Zellen abstammen (ES Mäuse) und sofort
phänotypisch untersucht werden können.
Im Rahmen des Projekts sollen mit dieser
Technik bis zu 25 verschiedene Knockdown-
Mausstämme etabliert und phänotypisiert
werden. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt
wurden Vektoren mit Spezifität für 11 Gene
in ES Zellen inseriert und hieraus bisher 5
Mausstämme etabliert. Bei den hierbei
bearbeiteten Genen handelt es sich zum Teil
um Validationsstudien, bei denen der Verlustphänotyp
aufgrund von Knockout Mäusen
beschrieben ist und anhand der RNAi-
Mäuse die Leistungsfähigkeit der Methode
in vivo genau überprüft werden soll (CRHR1,
Wnt1, Leptin-R.). Bei einer zweiten Gruppe
von Genen handelt es sich um Kandidatengene
von Morbus Parkinson, deren Knockout
Phänotyp teilweise bekannt (DJ1,
Parkin), bzw. unbekannt ist (LRRK2, Pink1).
Anhand dieser Gene soll u.a. die Leistungsfähigkeit
der RNAi Methodik bezüglich des
gleichzeitigen Knockdowns mehrerer Gene
und somit deren Eignung zur Etablierung
von Tiermodellen polygenischer Krankheiten
getestet werden.
148 GSF

Konditionales Gensilencing
Zur Untersuchung von Genen mittels RNAi
deren Inaktivierung zu embryonaler Lethalität
führt, haben wir die Strategie des konditionalen
Knockdown entwickelt (Abb.2), die
es ermöglicht die Produktion der inhibitorischen
shRNAs auf einen ausgewählten
Zelltyp zu beschränken. Hierzu werden
shRNA Vektoren verwendet, die durch
Insertion eines Stopsignals zunächst inaktiviert
sind, deren Aktivität aber durch Cre
Rekombinase, die das Stopsignal im ausgewählten
Zelltyp entfernt, angeschaltet werden
können. Die zeitliche und räumliche
Kontrolle dieser konditionalen shRNA Vektoren
ermöglicht es, embryonale Lethalität
des Gensilencing zu vermeiden, sowie die
Funktion der Zielgene mit höherer Genauigkeit
in vivo zu untersuchen. Zur Anwendung
dieser Technik in vivo verwenden wir etablierte
Cre transgene Mausstämme, die
Rekombinase in allen Neuronen oder nur in
Neuronen des Vorderhirns ausprägen.
Gegenwärtig wird die Technik des konditionalen
Knockdown anhand mehrerer Gene,
deren komplette Inaktivierung zu embryonaler
Lethalität führt, in der Maus erprobt.
Molekulare Augenentwicklung
Die X-chromosomale Retinoschisis (griech:
schisis, Spaltung; Netzhautspaltung) ist eine
erblich bedingte degenerative Erkrankung
der Netzhaut, die fast ausschließlich männliche
Personen betrifft. Beim Menschen ist
sie eine der häufigsten Ursachen für eine
Degeneration des „gelben Flecks“, der
Stelle des schärfsten Sehens. Typischerweise
treten die ersten Beeinträchtigungen
der Sehschärfe im Alter von etwa 5 Jahren
auf. Mit zunehmender Dauer der Krankheit
verschlechtert sich gewöhnlich das Sehvermögen
und führt in der 5.–6. Lebensdekade
zur Erblindung.
Im Augen-Screen der Deutschen Mausklinik
(GMC) wurde in Zusammenarbeit mit
dem University of Tennesse Health Service
Center, Memphis, USA und dem GSF-Institut
für Humangenetik eine Mauslinie untersucht,
die ein ähnliches Krankheitsbild
aufweist wie menschliche Patienten mit
Retinoschisis. Die Mauslinie 44TNJ wurde
unter den Nachkommen eines Mutagenesescreens
mit Ethylnitrosoharnstoff (ENU)
gefunden und ist durch reduzierte Amplituden
bei der Antwort der Netzhaut auf einen
Lichtreiz gekennzeichnet (Elektroretinographie).
Auf histologischen Bildern der Netzhaut
von 44TNJ-Mäusen ist deutlich die
gestörte Schichtung ihrer verschiedenen
Lagen zu erkennen. Besonders in der äußeren
Körnerschicht, aber auch am unteren
Rand der inneren Körnerschicht bilden sich,
zusätzlich zu den hier auftretenden Löchern,
wellenförmige Strukturen (Abb. 3).
In Zusammenarbeit mit dem Institut für
Humangenetik wurde die 44TNJ-Mutation
auf das X-Chromosom in die Nähe des
Die Institute
A
Nervenfaserschicht
Ganglienzellschicht
B
Innere plexiforme Schicht
Innere Körnerschicht
Äußere plexiforme Schicht
Äußere Körnerschicht
Abb. 3: Histologische Analyse der Netzhaut. Links die Netzhaut einer 44TNJ-Maus (A) und rechts zum
Vergleich die normale Netzhaut einer Wildtyp-Maus (B).
GSF 149

wt
Exon1 Intron1 Exon2
c
Intron2
Exon3
TGAAGgtatgt
gctcagCCA//
CAGAGgtatgttacag
tgcagGATGA
44TNJ
(insertion of 10 bp)
Wildtype
Transkript 1
(+10 bp)
Transkript 2
(–26 bp)
CAGAGGCA..
Abb. 4: Sequenzanalyse der cDNA einer Wildtyp-
Maus (wt) und einer 44TNJ-Maus. Die Pfeile
markieren die Anfänge der überlappenden Splicevariantensequenz.
Abb. 5: Splicevarianten des Rs1h-Gens bei der
44TNJ-Maus. Eine Variante enthält zusätzlich
10 Basen (Transkript 1), der 2. Variante fehlen
26 Basen bzw. das Exon 2 (Transkript 2).
Markers DXMIT117 kartiert. In Anbetracht
der Rekombinationsfrequenz und des Krankheitsbildes
wurde das Rs1h-Gen als guter
Kandidat eingestuft und tatsächlich zeigte
eine Sequenzanalyse eine Punktmutation in
der 2. Base des Intron 2. Dieser Basenaustausch
von Thymin nach Cytosin bildete
eine neue Restriktionsschnittstelle für das
Enzym NlaIII, die im Wildtypgen nicht vorhanden
war. Im Gegensatz zu den 44TNJ-
Mäusen konnte diese Schnittstelle im Rs1h-
Gen bei Wildtyptieren der Stämme C57BL/6,
C3H, BALB/c, 129 und JF1 nicht nachgewiesen
werden. Als Folge des Basenaustausches
in der genomischen DNA wurden
zwei zusätzliche Splicevarianten der Rs1hmRNA
gefunden (Abb. 4). Die eine Variante
enthält zusätzlich die ersten 10 Basen des
Intron 2 (mit Basenaustausch T zu C), während
in der zweiten Variante 29 Basen fehlen,
die dem Exon 2 entsprechen (Abb. 5).
Zusammenarbeit
Mitarbeiter des Institutes sind Mitglieder im Vorstand der
Gesellschaft für Genetik, im Internationalen Genannotationskomitee
und im Chromosom 9-Komitee der Maus.
Weiterhin sind Mitarbeiter des Instituts Mitglied im
Verbund biowissenschaftlicher und biomedizinischer
Gesellschaften und der "Faculty of 1000" sowie Mitglieder
in den Editorial Boards der Zeitschriften "Experimental
Eye Research", "Ophthalmic Research" und "Anatomy
& Embryology". Das Institut hat Forschungsverträge und
sonderfinanzierte Forschungsvorhaben bei der Europäischen
Union (4), bei der DFG (2), beim Deutschen
Humangenomprojekt (4), beim Nationalen Genomforschungsnetz
(10), beim BMBF (4), bei der Hemholtz-
Gemeinschaft der Forschungszentren (2) und bei der VW-
Stiftung (2).
Die wissenschaftlichen Mitarbeiter/innen sind in den
Lehrbetrieb der TU München eingebunden.
Beide Splicevarianten führen zu einem
vorzeitigen Stopp-Codon und damit vermutlich
zu einem verkürzten Protein.
Neben bereits etablierten Tiermodellen
am Institut für Entwicklungsgenetik reproduziert
die Mutation des Rs1h-Gen der 44TNJ-
Maus das Krankheitsbild der Retinoschisis
des Menschen und trägt so wesentlich zur
weiteren Untersuchung und Aufklärung
menschlicher neurodegenerativer Erkrankungen
bei.
Ausgewählte Veröffentlichungen
Graw, J., Löster, J., Puk, O., Münster, D., Haubst, N.,
Soewarto, D., Fuchs, H., Meyer, B., Nürnberg, P., Pretsch,
W., Selby, P., Favor, J., Wolf, E., Hrabé de Angelis, M.:
Three novel pax6 alleles in the mouse leading to the
same small-eye phenotype caused by different consequences
at target promoters. Invest Ophthalmol Vis Sci.
46:4671-83 (2005)
Lie, D.C., Colamarino, S.A., Song, H.J., Désiré, L., Mira, H.,
Consiglio, A., Lein, E.S., Jessberger, S., Lansford, H.,
Dearie, H.R., Gage, F.H.: Wnt signalling regulates adult
hippocampal neurogenesis. Nature. 2005. 437:1370-1375
Letters to Editor (27 Oct 2005)
Ninkovic, J., Tallafuss, A., Leucht, C., Topczewski, J.,
Tannhauser, B., Solnica-Krezel, L., Bally-Cuif, L.: Inhibition
of neurogenesis at the zebrafish midbrain-hindbrain
boundary by the combined and dose-dependent activity
of a new hairy/E(spl) gene pair. Development.
132(1):75-88 (2005 Jan)
Rieger, S., Kulkarni, R.P., Darcy, D., Fraser, S.E., Koster,
R.W.: Quantum dots are powerful multipurpose vital
labeling agents in zebrafish embryos. Dev Dyn.
234(3):670-81 (2005 Nov)
Schnütgen, F., De-Zolt, S., Van Sloun, P., Hollatz, M.,
Floss, T., Hansen, J., Altschmied, J., Seisenberger, C.,
Ghyselinck, N.B., Ruiz, P., Chambon, P., Wurst, W., von
Melchner, H.: Genomewide production of multipurpose
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Proc Natl Acad Sci U S A. 102(20):7221-6 (2005 May 17)
150 GSF