Kryoforschungsbank & Zentrum für ... - Biotechnologie.de
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<strong>Kryoforschungsbank</strong><br />
& <strong>Zentrum</strong> <strong>für</strong><br />
Kryobiotechnologie
Inhalt<br />
Vorwort 2<br />
Kryotechnologie am IBMT – Neue technologische Lösungen <strong>für</strong> die<br />
Kryokonservierung in <strong>de</strong>r <strong>Biotechnologie</strong> und Medizin 7<br />
Grundlagenforschung zur Kryokonservierung –<br />
Von <strong>de</strong>r Kryobiologie zur Kryotechnologie 10<br />
Anwendungsfel<strong>de</strong>r <strong>de</strong>r Kryotechnologie –<br />
Beispiel regenerative Medizin 15<br />
Fraunhofer-Technologieplattform 19<br />
Kryobiophysik & Kryotechnologie – Forschung und Entwicklung<br />
am <strong>Zentrum</strong> <strong>für</strong> Kryobiotechnologie 19<br />
Kryobiophysik 22<br />
Molekulare Prozesse beim Einfrieren von Zellen 24<br />
Tieftemperaturelektronik 27<br />
Kryobioinformatik / ChameleonLab 29<br />
Kryoequipment & Kryorobotik 31<br />
Kryoforschungs- und Demonstrationsbank – Langzeitlagerung<br />
leben<strong>de</strong>r Zellproben 34<br />
Historie 37<br />
Ausstattung, Angebote & Produkte 40<br />
Kryobiophysik & Kryotechnologie 40<br />
Kryoequipment & Kryorobotik 41<br />
Nachwuchsgruppe »Kryo-Nanobiotechnologie« <strong>de</strong>s BMBF 41<br />
<strong>Kryoforschungsbank</strong> 42<br />
Zusammenfassung <strong>de</strong>r Dienstleistungen am<br />
<strong>Zentrum</strong> <strong>für</strong> Kryobiotechnologie 44<br />
Möglichkeiten <strong>de</strong>r Unterstützung gemeinnütziger Sammlungen –<br />
Kryotankspen<strong>de</strong> & Patenschaft 46<br />
Danksagung 48<br />
So fin<strong>de</strong>n Sie uns 49<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik 1
Vorwort<br />
Prof. Dr. Günter R. Fuhr<br />
(Direktor Fraunhofer-Institut <strong>für</strong><br />
Biomedizinische Technik IBMT)<br />
Der Begriff <strong>de</strong>r Kryokonservierung ist<br />
<strong>de</strong>n meisten Menschen nicht so geläufig<br />
wie an<strong>de</strong>re Bezeichnungen <strong>de</strong>r <strong>Biotechnologie</strong><br />
und Medizin, beispielsweise<br />
das Sequenzieren <strong>für</strong> die Genomanalyse.<br />
Er leitet sich aus <strong>de</strong>m griechischen<br />
Wort »Kryos« ab, was so viel<br />
wie »Kälte, Eis« be<strong>de</strong>utet. Unter Kryokonservierung<br />
versteht man die Lagerung<br />
von Zellen und Gewebestücken<br />
bei Temperaturen unter –130 °C, in<br />
<strong>de</strong>r Regel durch Kühlung mittels verflüssigtem<br />
Stickstoff. Dabei wird die<br />
Vitalität <strong>de</strong>r Zellen aufrecht erhalten,<br />
obgleich das biologische System in <strong>de</strong>n<br />
Zustand eines Festkörpers übergeht.<br />
Abgesehen von <strong>de</strong>r Trocknung einiger<br />
Organismen, wie z.B. Bakterien und<br />
Pilzen, ist die Tieftemperaturlagerung<br />
gegenwärtig die einzige Möglichkeit<br />
tierische, pflanzliche und vor allem<br />
menschliche Zellen und Zellverbän<strong>de</strong><br />
über nahezu beliebige Zeiträume<br />
lebensfähig abzulegen und zu gegebener<br />
Zeit zu reanimieren.<br />
Die Atmosphäre <strong>de</strong>r Er<strong>de</strong> besteht zu<br />
ca. 78% aus Stickstoff, einem inerten<br />
Gas, das unter Normaldruck bei ca.<br />
–196 °C in <strong>de</strong>n flüssigen Aggregatzustand<br />
übergeht. Als Kühlphase hat es<br />
sich sowohl aus Sicht <strong>de</strong>r Handhabung,<br />
aber auch aus Kostengrün<strong>de</strong>n<br />
bewährt. Gelagert wer<strong>de</strong>n die Proben<br />
in großen Stahlbehältern, die nach<br />
<strong>de</strong>m Dewar-Prinzip aufgebaut sind.<br />
Zwei Behälter sind unter möglichst<br />
geringem Kontakt ineinan<strong>de</strong>r montiert<br />
und durch einen Vakuumbereich thermisch<br />
zueinan<strong>de</strong>r isoliert, wobei <strong>de</strong>r<br />
innere zu etwa einem Viertel o<strong>de</strong>r<br />
auch vollständig mit flüssigem Stickstoff<br />
gefüllt wird. Die Zell- und Gewebeproben<br />
befin<strong>de</strong>n sich in speziellen<br />
Metallregalen und Plastikbehältern in<br />
<strong>de</strong>r Regel in <strong>de</strong>r kühlen Gasphase o<strong>de</strong>r<br />
verschlossen eingetaucht in <strong>de</strong>r flüssigen<br />
Kühlphase. Proben, die auf diese<br />
Weise gelagert wer<strong>de</strong>n, können über<br />
Jahre, Jahrzehnte perspektivisch bis zu<br />
Jahrhun<strong>de</strong>rten ohne Einbuße <strong>de</strong>r<br />
Lebensfähigkeit überdauern. Der Stoffwechsel<br />
<strong>de</strong>r Zellen kommt vollständig<br />
zum Erliegen - alle Lebensvorgänge,<br />
d.h. jedwe<strong>de</strong> Biochemie, stehen still.<br />
Da sehr oft in diesem Zusammenhang<br />
von eingefrorenen Tieren, Menschen,<br />
<strong>de</strong>ren Köpfen o<strong>de</strong>r Organen in <strong>de</strong>r<br />
Tagespresse die Re<strong>de</strong> ist, erscheint es<br />
notwendig, klarzustellen, was gegenwärtig<br />
lebend konserviert wer<strong>de</strong>n kann<br />
und was nicht. Zunächst ist wichtig zu<br />
wissen, dass es sich beim Einfrieren<br />
von Zellen bei <strong>de</strong>rart niedrigen Temperaturen<br />
nicht um einen Vorgang han<strong>de</strong>lt,<br />
<strong>de</strong>r an irgend einer Stelle <strong>de</strong>r Er<strong>de</strong><br />
natürlich auftritt o<strong>de</strong>r in <strong>de</strong>r Vergangenheit<br />
aufgetreten ist. Die Verflüssigung<br />
<strong>de</strong>r Gase, maßgeblich durch Carl<br />
von Lin<strong>de</strong> in die Technik eingeführt, ist<br />
eine Erfindung <strong>de</strong>s Menschen, wenngleich<br />
wir Planeten und Mon<strong>de</strong> (Pluto,<br />
Titan) kennen, auf <strong>de</strong>nen <strong>de</strong>rart tiefe<br />
Temperaturen herrschen, dass <strong>de</strong>r<br />
Stickstoff in Form flüssiger Seen und<br />
Meere auftreten könnte. Das Abkühlen<br />
eines Körpers ist durch physikalische<br />
Parameter, wie die Wärmeleitung, die<br />
Geometrie und die Größe <strong>de</strong>s Körpers,<br />
festgelegt und in <strong>de</strong>r Abkühlrate<br />
limitiert.<br />
Ohne Gefrierschutzmittel ist eine<br />
Lebendkonservierung biologischen<br />
Materials zu<strong>de</strong>m nicht möglich. Doch<br />
auch das Gefrierschutzmittel muss in<br />
alle Zellen hineingelangen. Allein aus<br />
<strong>de</strong>r Wärmeleitung und <strong>de</strong>r Diffusion<br />
<strong>de</strong>r Kryoprotektiva ergibt sich, dass<br />
ganz bestimmte Temperaturverläufe<br />
<strong>für</strong> biologische Proben einzuhalten<br />
sind. Bei<strong>de</strong> Prozesse wer<strong>de</strong>n mit steigen<strong>de</strong>r<br />
Größe <strong>de</strong>r einzufrieren<strong>de</strong>n<br />
Objekte in ihrer Geschwindigkeit und<br />
Verteilungscharakteristik immer langsamer<br />
und komplexer, so dass die<br />
Lebendkonservierung von zellulärem<br />
2<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik
Gewebe bereits bei einigen Kubikmillimeter<br />
großen Stücken an physikalische<br />
Grenzen stößt. Da weltweit, wenn<br />
überhaupt gestattet, eine Tieftemperaturkonservierung<br />
von Menschen erst<br />
nach <strong>de</strong>m natürlichen To<strong>de</strong> stattfin<strong>de</strong>n<br />
darf und die Wärme nicht rasch genug<br />
aus <strong>de</strong>m Köper abgeleitet wer<strong>de</strong>n<br />
kann sowie die Gefrierschutzmittel<br />
schlecht in alle Zellen gelangen können,<br />
ist mit hoher Gewissheit davon<br />
auszugehen, dass die mancherorts eingefrorenen<br />
Menschen (z.B. in <strong>de</strong>n<br />
USA) niemals wie<strong>de</strong>r zum Leben<br />
erweckt wer<strong>de</strong>n können. Es müsste<br />
neben <strong>de</strong>n Gefrierschä<strong>de</strong>n auch <strong>de</strong>r<br />
eingetretene Tod mit <strong>de</strong>n jeweils spezifischen<br />
Zell- und Organschädigungen<br />
behoben wer<strong>de</strong>n, was auch späteren<br />
Generationen schwer fallen dürfte.<br />
Zu<strong>de</strong>m ging es <strong>de</strong>n entsprechen<strong>de</strong>n<br />
Personen nicht um eine genetische<br />
Rekonstruktion in Form eines neuen<br />
Organismus, son<strong>de</strong>rn um <strong>de</strong>n bislang<br />
und wohl auch bis auf Weiteres unerfüllbaren<br />
Traum <strong>de</strong>s bewussten Erlebens<br />
einer späteren Zeit bei erhaltener<br />
Persönlichkeit und vollständiger Rückerinnerung.<br />
Schädigungen treten bei leben<strong>de</strong>n<br />
makroskopischen Organismen bereits<br />
auf, wenn flüssiger Stickstoff die Körperoberfläche<br />
berührt. Eine <strong>de</strong>rartige<br />
Erfrierung gleicht nach <strong>de</strong>m Auftauen<br />
einer Verbrennung. Ebenso verhält es<br />
sich beim Einfrieren von Menschen,<br />
<strong>de</strong>ren vor allem dichte Gewebeteile<br />
nach <strong>de</strong>m Auftauen Risse und neben<br />
<strong>de</strong>n mikroskopischen auch makroskopische<br />
Zerstörungen aufweisen.<br />
Gegenwärtig besitzt das Einfrieren von<br />
Hun<strong>de</strong>n, Katzen und Menschen mit<br />
<strong>de</strong>m Ziel <strong>de</strong>r Wie<strong>de</strong>rbelebung daher<br />
keinen wissenschaftlichen Hintergrund.<br />
Auch die Hoffnung auf eine Lösung<br />
<strong>de</strong>s Problems in <strong>de</strong>r Zukunft erscheint<br />
gering, da insbeson<strong>de</strong>re die dichten<br />
Gewebeteile wie das Herz, das Gehirn<br />
und an<strong>de</strong>re lebenswichtige Organe am<br />
stärksten geschädigt o<strong>de</strong>r zerstört wür<strong>de</strong>n<br />
und nach <strong>de</strong>m Auftauen, ähnlich<br />
einer Frucht, außen gut erhalten, innen<br />
aber im Zellverband funktionell<br />
unbrauchbar wären. So spektakulär<br />
das Einfrieren mit <strong>de</strong>m Ziel <strong>de</strong>s Weiterlebens<br />
in beliebiger Zukunft auch sein<br />
mag, <strong>de</strong>r Motor <strong>de</strong>r Wissenschaft, insbeson<strong>de</strong>re<br />
auch <strong>de</strong>r Kryobiotechnologie,<br />
ist es nicht.<br />
Das häufig beschriebene Einfrieren<br />
einiger Organismen im Eis erfolgt nach<br />
ähnlichen, am En<strong>de</strong> aber doch an<strong>de</strong>ren<br />
Prinzipien als die hier behan<strong>de</strong>lte Tieftemperaturkonservierung.<br />
Einige wenige<br />
Fische, Frösche, Insekten, aber auch<br />
Algen sowie Mikroorganismen frieren<br />
im Bo<strong>de</strong>n o<strong>de</strong>r in wässriger Umgebung<br />
bei Temperaturen unter 0 Grad bis zu<br />
–30 °C ein und vermögen diesem<br />
Stress über Tage, manchmal sogar<br />
Wochen und Monate zu wi<strong>de</strong>rstehen.<br />
Ein Frosch im Eisblock ging vor Jahren<br />
durch die Medien. Ungeachtet <strong>de</strong>s tiefgefrorenen<br />
Anscheins leben diese Tiere<br />
<strong>de</strong>nnoch und sind nicht zu einem Festkörper<br />
erstarrt, wie die Zellen bei <strong>de</strong>n<br />
Temperaturen <strong>de</strong>s flüssigen Stickstoffs.<br />
Es wird berichtet, dass die Blutzirkulation<br />
<strong>de</strong>rartig unterkühlter Organismen<br />
zum Stillstand kommt, Wun<strong>de</strong>n daher<br />
nicht bluten und die Frequenz <strong>de</strong>s<br />
Herzschlags stark herabgesetzt ist<br />
(STOREY & STOREY, Pharmaceutical<br />
News, Vol. 6, No. 3, S. 9-14, 1999). Die<br />
bezeichneten Tiere nutzen zwei Effekte<br />
zum Überleben bei Kälte: zum einen<br />
die Entwässerung <strong>de</strong>r Zellen und damit<br />
eine Erniedrigung <strong>de</strong>s Gefrierpunkts<br />
durch Konzentrierung <strong>de</strong>r gelösten<br />
Stoffe (Ionen, Proteine), zum an<strong>de</strong>ren<br />
die Produktion spezieller Gefrierschutzsubstanzen,<br />
die die Eisstruktur beeinflussen<br />
(Verhin<strong>de</strong>rung großer Eisdomänen).<br />
Kühlt man sie weiter ab, so frieren<br />
sie durch und es gelingt nicht, sie<br />
nach <strong>de</strong>m Auftauen wie<strong>de</strong>r zum Leben<br />
zu erwecken.<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik 3
Eiskristallstrukturen in einer Saccharose-Mo<strong>de</strong>lllösung und mit Zusatz unterschiedlicher AFPIII-Konzentrationen (Anti<br />
Freeze Protein) nach 70 Stun<strong>de</strong>n Lagerzeit, Lagertemperatur –8 °C. (Quelle: Chemie Ingenieur Technik 2004, 76,<br />
No. 4, Volker Gaukel und Walter E. L. Spieß, Einfluss von Antigefrierproteinen auf die Rekristallisation von Eis in<br />
Mo<strong>de</strong>lllösungen <strong>für</strong> Eiskrem, Abbildung 2.)<br />
All das, was bei größeren Geweben<br />
und Organismen nicht funktioniert,<br />
lässt sich jedoch mit vereinzelten Zellen<br />
nahezu problemlos durchführen. Die<br />
Größe <strong>de</strong>r meisten unserer Zellen, die<br />
bei einigen zehn Mikrometern liegt,<br />
erlaubt das <strong>de</strong>finierte Einbringen von<br />
Kryoprotektiva (Gefrierschutzmitteln)<br />
in die Zellen und ihre Abkühlung zu<br />
Temperaturen unter –130 °C, einer<br />
kritischen Temperaturmarke, unterhalb<br />
<strong>de</strong>r eine Rekristallisation von Eis nicht<br />
mehr möglich ist bzw. extrem langsam<br />
erfolgt. Somit lassen sich Zellen in suspendierter<br />
Form und adhärent auf<br />
Oberflächen sehr gut und reproduzierbar<br />
kryokonservieren und lagern. Im<br />
Unterschied zur erläuterten Gefrierschutzerniedrigung<br />
einiger kältetoleranter<br />
Tiere kommen die Lebensprozesse<br />
im Zellinneren hierbei jedoch<br />
vollständig zum Stillstand. Die einzige<br />
Begrenzung <strong>de</strong>r Lagerdauer liegt in <strong>de</strong>r<br />
kosmischen Strahlung begrün<strong>de</strong>t, die<br />
auch die Zellproben im gefrorenen<br />
Zustand und im Stahltank permanent<br />
trifft. Sie wür<strong>de</strong> sehr langsam nach<br />
mehreren zehntausend Jahren zur<br />
Zerstörung <strong>de</strong>s Genoms führen. Für<br />
die Zwecke <strong>de</strong>r <strong>Biotechnologie</strong> und<br />
Medizin ist dieser Effekt allerdings<br />
belanglos.<br />
Womit sich diese Broschüre beschäftigt,<br />
ist ausschließlich die Tieftemperaturkonservierung<br />
von zellulären<br />
Lebendproben <strong>für</strong> die <strong>Biotechnologie</strong>,<br />
Medizin, <strong>de</strong>n Umwelt-, Arten- und Verbraucherschutz,<br />
aber auch die Anlage<br />
von Bioressourcen <strong>de</strong>r Zukunft, <strong>für</strong> die<br />
Forschung und zur retrospektiven<br />
Untersuchung leben<strong>de</strong>n Materials <strong>für</strong><br />
spätere Generationen mit <strong>de</strong>ren, heute<br />
noch unbekannten Messmetho<strong>de</strong>n<br />
und Geräten.<br />
Nach eingehen<strong>de</strong>r Diskussion und Prüfung<br />
hat die Fraunhofer-Gesellschaft in<br />
Kooperation mit <strong>de</strong>m Saarland im<br />
Jahre 2001 die Entwicklung <strong>de</strong>r Kryobiotechnologie<br />
<strong>für</strong> vordringlich und<br />
fundamental <strong>für</strong> die Einführung <strong>de</strong>r<br />
<strong>Biotechnologie</strong> in einer industriellen<br />
Skalierung eingestuft und beschlossen,<br />
unikal in Deutschland und <strong>de</strong>r Welt,<br />
diesen Technologiebereich in <strong>de</strong>n<br />
nächsten Jahren zu entwickeln.<br />
Obwohl nahezu in je<strong>de</strong>m Biolabor verfügbar<br />
und gut etabliert, ist die Kryokonservierung<br />
von Zellen <strong>de</strong>nnoch <strong>de</strong>n<br />
zu erwarten<strong>de</strong>n Probenzahlen und <strong>de</strong>n<br />
Anfor<strong>de</strong>rungen <strong>de</strong>r Zukunft bisher<br />
technologisch nicht gewachsen. Eine<br />
automatische Handhabung von Kryoproben,<br />
Vereisungsfreiheit, nahezu<br />
absolute Verwechslungssicherheit und<br />
die optimierte Abkühlung bzw. Erwärmung<br />
sind unverkennbar Erfor<strong>de</strong>rnisse<br />
<strong>für</strong> eine breite Nutzung in Forschung,<br />
Wirtschaft und Medizin.<br />
Auch sind die Probenvolumina, die<br />
gegenwärtig noch abgelegt wer<strong>de</strong>n,<br />
<strong>für</strong> viele Zwecke unverhältnismäßig<br />
groß und ungünstig gewählt, was die<br />
Kosten in die Höhe treibt und die Kryolagerkapazität<br />
begrenzt. Die Bemühungen<br />
<strong>de</strong>s Fraunhofer-Instituts <strong>für</strong> Biomedizinische<br />
Technik zielen daher darauf<br />
ab, von <strong>de</strong>r Probennahme über die<br />
Zugabe von Kryoschutzmitteln sowie<br />
das Einfrieren bis zu <strong>de</strong>n Kryotanks<br />
und <strong>de</strong>r Entwicklung industriell skalierter<br />
Kryogroßbanken die technologischen<br />
und biophysikalischen Voraussetzungen<br />
<strong>für</strong> eine sichere und erweiterungsfähige<br />
Kryobiotechnologie zu<br />
schaffen.<br />
Kernelemente <strong>de</strong>r Fraunhofer-Kryotechnologie<br />
<strong>de</strong>s IBMT sind miniaturisierte<br />
und im tiefgekühlten Zustand<br />
fraktionierbare Kryosubstrate in fester<br />
Verbindung mit einem elektronischen<br />
Speicherchip, in <strong>de</strong>m neben einer<br />
Kennnummer <strong>de</strong>r gesamte Umfang<br />
<strong>de</strong>r Probenbeschreibung, die Rechtslage,<br />
die benutzten Datenformate bis<br />
hin zu Literaturdaten und Bildserien<br />
4<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik
Bei tiefen Temperaturen fraktionier- und stapelbares Well-Substrat mit tieftemperaturtauglichem elektronischen Memory-Chip <strong>für</strong> die Datenablage an <strong>de</strong>r Probe.<br />
gespeichert wer<strong>de</strong>n können. Die Verwechslungssicherheit<br />
und Versandfähigkeit<br />
von Proben sind ebenso optimiert,<br />
wie die automatische Aktualisierung<br />
<strong>de</strong>r zentralen Datenbank in ihrem<br />
Abgleich mit <strong>de</strong>n <strong>de</strong>zentral in <strong>de</strong>n<br />
Kryotanks befindlichen elektronischen<br />
Memory-Chips. Hinzu kommt <strong>de</strong>r<br />
Schutz <strong>de</strong>r Proben und <strong>de</strong>r Tanks vor<br />
Vereisung und Frem<strong>de</strong>inflüssen.<br />
Zur Demonstration <strong>de</strong>r technologischen<br />
Entwicklungen, zur Anlage von<br />
Kryoprobensammlungen aus allen<br />
Bereichen <strong>de</strong>r Forschung und Wirtschaft<br />
sowie zur Automatisierung, wie<br />
sie in Kryogroßbanken erfor<strong>de</strong>rlich sein<br />
wird, wur<strong>de</strong> eine <strong>de</strong>r größten Forschungskryobanken<br />
in Sulzbach im<br />
Saarland gebaut. In ihr können seit<br />
Mitte 2003 auf einer Fläche von mehr<br />
als 1 200 m 2 bis zu 150 Kryobehälter<br />
eines Fassungsvermögens von jeweils<br />
1 400 l installiert und <strong>de</strong>r Betrieb nach<br />
mo<strong>de</strong>rnsten Lagerkriterien <strong>de</strong>monstriert<br />
wer<strong>de</strong>n. In verschie<strong>de</strong>ne Kryobankabschnitte<br />
unterteilt, bietet die<br />
Demonstrationsbank Raum <strong>für</strong> die<br />
Anlage verschie<strong>de</strong>ner Teilbankbereiche,<br />
Zelle <strong>de</strong>s Immunsystems auf einem Substrat adhäriert, wie sie <strong>für</strong> die Zelltherapien <strong>de</strong>r zukünftigen Medizin vorrätig<br />
gehalten wer<strong>de</strong>n müssen (Foto H. Zimmermann & A. Katsen-Globa).<br />
von einer Hochsicherheitsbank bis zu<br />
Kleinbanken, wie sie in biologischen<br />
Laboren und kleineren medizinischen<br />
Einrichtungen auftreten und benötigt<br />
wer<strong>de</strong>n.<br />
Am Fraunhofer IBMT wer<strong>de</strong>n Kryobanken<br />
nach Vorgabe <strong>de</strong>r Kun<strong>de</strong>n und<br />
Bestimmung entworfen und mit <strong>de</strong>n<br />
Auftraggebern realisiert, die <strong>für</strong> alle<br />
Belange <strong>de</strong>r <strong>Biotechnologie</strong> und Medizin<br />
geeignet sind. Eine weltweite<br />
Gründungswelle von Kryobanken<br />
unterschiedlichster Bestimmung ist zu<br />
erkennen und bestätigt die eingeschlagene<br />
Forschungs- und Entwicklungsstrategie<br />
bereits.<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik 5
Drehstapel-Hybridsystem aus Silizium und beschichtetem Polyethylen <strong>für</strong> die miniaturisierte Kryokonservierung zur<br />
Ablage einzelner bis zu einigen tausend Zellen pro Well.<br />
Das vorliegen<strong>de</strong> Heft dient <strong>de</strong>r Information<br />
und Verbreitung <strong>de</strong>r Kryotechnologie,<br />
wie sie in <strong>de</strong>r Fraunhofer-<br />
Gesellschaft am IBMT in St. Ingbert<br />
und Sulzbach entwickelt wird und<br />
nunmehr <strong>für</strong> wissenschaftliche, öffentliche<br />
und industrielle Nutzer zur Verfügung<br />
steht. Potenziellen Anwen<strong>de</strong>rn<br />
und Forschungspartnern wollen wir in<br />
stark zusammengefasster Form <strong>de</strong>n<br />
Stand und die Perspektiven, in je<strong>de</strong>m<br />
Fall aber die Be<strong>de</strong>utung und Möglichkeiten<br />
<strong>de</strong>r Kryobiotechnologie vor<br />
Augen führen. Wir wür<strong>de</strong>n uns freuen,<br />
wenn Sie Kontakt zu unserer Einrichtung<br />
aufnehmen wür<strong>de</strong>n und stehen<br />
Zahl <strong>de</strong>r registrierten kommerziellen Nabelschnurblutbanken<br />
seit 1992.<br />
mit Experten zur Lösung Ihrer Probleme<br />
zur Verfügung.<br />
(Quelle:http://www.parentsgui<strong>de</strong>cordblood.com)<br />
Prof. Dr. Günter R. Fuhr<br />
Direktor<br />
6 Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik
Kryotechnologie am IBMT –<br />
Neue technologische Lösungen <strong>für</strong> die Kryokonservierung<br />
in <strong>de</strong>r <strong>Biotechnologie</strong> und Medizin<br />
Am Standort Sulzbach, Industriestraße<br />
5, einem Teil <strong>de</strong>s Fraunhofer-Instituts<br />
<strong>für</strong> Biomedizinische Technik (IBMT),<br />
wur<strong>de</strong> am 9. September 2003 durch<br />
<strong>de</strong>n Ministerpräsi<strong>de</strong>nten <strong>de</strong>s Saarlan<strong>de</strong>s,<br />
Herrn Peter Müller, <strong>de</strong>n Präsi<strong>de</strong>nten<br />
<strong>de</strong>r Fraunhofer-Gesellschaft, Herrn<br />
Professor Hans-Jörg Bullinger, im Beisein<br />
<strong>de</strong>s Bun<strong>de</strong>sministeriums <strong>für</strong> Bildung,<br />
Wissenschaft und Forschung auf<br />
Initiative <strong>de</strong>s Wirtschaftsministeriums<br />
<strong>de</strong>s Saarlan<strong>de</strong>s und <strong>de</strong>r Fraunhofer-<br />
Gesellschaft die <strong>Kryoforschungsbank</strong><br />
mit angeglie<strong>de</strong>rtem <strong>Zentrum</strong> <strong>für</strong> Kryobiotechnologie<br />
(eurocryoSaar) in<br />
Betrieb genommen. An diesem<br />
Industriestandort soll in <strong>de</strong>n nächsten<br />
Jahren ein neuer Zweig <strong>de</strong>r <strong>Biotechnologie</strong><br />
etabliert wer<strong>de</strong>n, <strong>de</strong>r als Tieftemperaturbiotechnologie<br />
bezeichnet wer<strong>de</strong>n<br />
kann.<br />
Geplant und errichtet wur<strong>de</strong> eine <strong>de</strong>r<br />
mo<strong>de</strong>rnsten Kryobanken <strong>für</strong> biologische,<br />
landwirtschaftliche und medizinische<br />
Proben, wie Zellsuspensionen,<br />
Einzelzellen und Gewebeproben,<br />
humanen, tierischen sowie pflanzlichen<br />
und bakteriellen Ursprungs, verknüpft<br />
mit einer <strong>für</strong> diese Zwecke<br />
neuartigen Datenbank, flankiert durch<br />
mo<strong>de</strong>rnste Laboratorien, in <strong>de</strong>nen<br />
neue Techniken und Verfahren <strong>de</strong>r<br />
molekularen und zellulären Kryokonservierung<br />
entwickelt, erprobt und<br />
industriell umgesetzt wer<strong>de</strong>n. Das Forschungsvorhaben<br />
entspricht nicht nur<br />
<strong>de</strong>m wissenschaftspolitischen Auftrag<br />
<strong>de</strong>r Fraunhofer-Gesellschaft, neue<br />
Technologiefel<strong>de</strong>r vorzubereiten und<br />
industriell nutzbar zu machen, son<strong>de</strong>rn<br />
auch <strong>de</strong>m Bestreben <strong>de</strong>r Saarländischen<br />
Regierung, die <strong>Biotechnologie</strong><br />
und in <strong>de</strong>ren Folge eine ortsansässige<br />
<strong>Biotechnologie</strong>industrie zu beför<strong>de</strong>rn.<br />
Die Frage, wozu diese Technologien<br />
benötigt wer<strong>de</strong>n, lässt sich folgen<strong>de</strong>rmaßen<br />
beantworten:<br />
Zum einen laufen alle Lebensprozesse<br />
unaufhaltbar auf molekularer und zellulärer<br />
Ebene ab. Alles verän<strong>de</strong>rt sich<br />
im biologischen System und altert<br />
dabei. Eine Grundvoraussetzung <strong>für</strong><br />
eine robuste und industriell umsetzbare<br />
<strong>Biotechnologie</strong> wird <strong>de</strong>shalb die Entwicklung<br />
von Prinzipien sein, die<br />
geeignet sind, diese Vorgänge befristet<br />
und kontrolliert anzuhalten, d.h. die<br />
Zwischenlagerung und massenhafte<br />
Verfügbarhaltung von leben<strong>de</strong>n Zellen<br />
<strong>de</strong>r unterschiedlichsten Herkunft, als<br />
auch die Fixierung künstlich und natürlich<br />
eingestellter Zellzustän<strong>de</strong> zu<br />
ermöglichen. Zum an<strong>de</strong>ren greift <strong>de</strong>r<br />
Mensch mit <strong>de</strong>r Erforschung <strong>de</strong>s eigenen<br />
Genoms, über molekularbiologische<br />
Pharmaentwicklungen, die zelluläre<br />
Medizin und die <strong>Biotechnologie</strong><br />
in völlig neuartiger Weise in die Natur<br />
ein, <strong>de</strong>ren Bestandteil er selbst ist. Eine<br />
<strong>de</strong>r Grundregeln muss <strong>de</strong>shalb lauten,<br />
von allem, bevor es verän<strong>de</strong>rt wird,<br />
eine Sicherheitskopie abzulegen, damit<br />
später durch uns o<strong>de</strong>r nachfolgen<strong>de</strong><br />
Generationen retrospektiv nachvollzogen<br />
wer<strong>de</strong>n kann, worin die Ursprünge<br />
bestan<strong>de</strong>n und was in welchen<br />
Schritten verän<strong>de</strong>rt wur<strong>de</strong>. Es ist <strong>de</strong>shalb<br />
ein Gebot <strong>de</strong>r Logik und eine<br />
Pflicht gegenüber <strong>de</strong>r Gesellschaft,<br />
frühzeitig Referenzbanken und Master-<br />
Zellbänke <strong>für</strong> alle Bereiche <strong>de</strong>r Lebenswissenschaften<br />
anzulegen.<br />
Des Weiteren wird die Medizin <strong>de</strong>r<br />
nächsten Deka<strong>de</strong>n und <strong>de</strong>r Zukunft<br />
mit hoher Wahrscheinlichkeit nach<br />
Prinzipien heilen, wie wir sie vom<br />
intakten Immunsystem bereits heute<br />
kennen, d.h. über makromolekulare<br />
Wechselwirkungen und spezifische,<br />
hochgenau agieren<strong>de</strong> Zellen. Es<br />
erscheint realistisch, Tumore in Zukunft<br />
durch speziell modifizierte, im günstigsten<br />
Fall körpereigene Zellen zu<br />
bekämpfen und physiologisch abzubauen.<br />
Es könnte <strong>de</strong>shalb in Kürze <strong>de</strong>r<br />
Fall sein, dass viele Bürger unseres Lan-<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik 7
Klassisches Kryoröhrchen <strong>für</strong> Zellsuspensionen (etwa<br />
Originalgröße).<br />
<strong>de</strong>s auf freiwilliger Basis einmalig o<strong>de</strong>r<br />
regelmäßig körpereigene Zellen hinterlegen<br />
wollen, auf die zu gegebener<br />
Zeit auch im Rahmen eines Generationenvertrages,<br />
in 10, 20, 40 o<strong>de</strong>r gar<br />
80 Jahren, zurückgegriffen wer<strong>de</strong>n<br />
kann und mit <strong>de</strong>nen eine medizinische<br />
Behandlung erfolgt, von <strong>de</strong>r wir heute<br />
noch keine vollständige Vorstellung<br />
entwickeln können.<br />
Die einzige Technologie, die sofort<br />
Lösungen <strong>für</strong> die genannten Fel<strong>de</strong>r<br />
anbietet, ist die Kryokonservierung.<br />
Dieses in seinen Grundprinzipien entwickelte<br />
Gebiet <strong>de</strong>r Zellaufbewahrung<br />
ist bereits Bestandteil sehr vieler medizinischer,<br />
biotechnologischer und pharmazeutischer<br />
Einrichtungen, jedoch<br />
technisch, logistisch und kapazitiv<br />
nicht <strong>für</strong> <strong>de</strong>n massenhaften Probenanfall<br />
gerüstet. Betrachtet man beispielhaft<br />
einmal nur <strong>de</strong>n diagnostisch-therapeutischen<br />
Teil <strong>de</strong>r Medizin und<br />
nimmt an, dass je<strong>de</strong>r fünfte Bürger<br />
Deutschlands ein Zell<strong>de</strong>pot aus 50 Einzelproben<br />
einer Größe von wenigen<br />
Kubikmillimetern <strong>für</strong> die Zukunft anlegen<br />
möchte, so entspricht das bei 80<br />
Millionen Deutschen einer Menge von<br />
800 Millionen Proben.<br />
Zurzeit erfolgt die Probenablage in 2<br />
bis 10 cm langen Plastikröhrchen o<strong>de</strong>r<br />
-beuteln, die in 1 bis 2 m großen Kryobehältern<br />
gelagert wer<strong>de</strong>n. Wollte<br />
man 800 Millionen Proben im Zeitraum<br />
von 5 Jahren ablegen (und das ist<br />
wahrscheinlich noch niedrig gegriffen),<br />
so benötigte man bei Beibehaltung <strong>de</strong>r<br />
Plastikröhrchentechnik eine Lagerfläche<br />
von mehreren Quadratkilometern<br />
und auf dieser einige Tausend<br />
etwa 2 m hohe Kryobehälter, die mit<br />
flüssigem Stickstoff als Kühlmittel permanent<br />
zu versorgen wären, was<br />
we<strong>de</strong>r technisch noch finanziell<br />
umsetzbar ist. Zu rechnen ist mit noch<br />
10- bis 100-mal höheren Probenzahlen,<br />
da hier nur die medizinische<br />
Anwendung und nicht die Proben <strong>de</strong>r<br />
<strong>Biotechnologie</strong>- und Pharmaindustrie,<br />
Veterinärmedizin, Landwirtschaft und<br />
<strong>de</strong>s Lebensmittelbereiches berücksichtigt<br />
wur<strong>de</strong>n.<br />
Es ist also unabdingbar, neue Wege<br />
und Lösungen <strong>de</strong>r Kryolagerhaltung zu<br />
suchen und kurzfristig umzusetzen.<br />
Einer <strong>de</strong>r Ansätze <strong>de</strong>s Fraunhofer-Instituts<br />
<strong>für</strong> Biomedizinische Technik basiert<br />
auf <strong>de</strong>r Miniaturisierung, da sich die<br />
Frage stellt, ob die Proben wirklich im<br />
Milliliter-Bereich liegen müssen. Wenn<br />
man berücksichtigt, dass <strong>für</strong> genetische<br />
Nachweise bereits heute einige<br />
hun<strong>de</strong>rt, in bestimmten Fällen nur eine<br />
einzige Zelle genügt und später die<br />
Zahl <strong>de</strong>r Zellen über In-vitro-Vermehrung<br />
ohnehin expandiert wer<strong>de</strong>n<br />
muss, benötigt man die großen Volumina<br />
<strong>für</strong> viele Anwendungen nicht.<br />
Für die gleiche Probenmenge, <strong>für</strong> die<br />
gera<strong>de</strong> noch eine quadratkilometergroße<br />
Fläche benötigt wur<strong>de</strong>, reicht<br />
bei reduzierter Probengröße eine Halle<br />
von 30 m x 50 m aus, wie sie am<br />
Standort Sulzbach zur Verfügung<br />
steht. Mehr noch, in Zukunft wer<strong>de</strong>n,<br />
wie bereits erläutert, <strong>für</strong> viele Zwecke<br />
(z.B. <strong>de</strong>r Analytik o<strong>de</strong>r Diagnostik) nur<br />
wenige Zellen erfor<strong>de</strong>rlich sein. In<br />
langjähriger Vorarbeit hat das Fraunhofer<br />
IBMT die notwendigen Basistechnologien<br />
nunmehr entwickelt und zum<br />
Patent angemel<strong>de</strong>t, so dass mit <strong>de</strong>r<br />
Umsetzung in industriellem Maßstab<br />
und einer Nutzung <strong>für</strong> die Forschung,<br />
<strong>de</strong>n Verbraucher- und Umweltschutz<br />
sowie die Medizin begonnen wer<strong>de</strong>n<br />
kann.<br />
Die Ablage von Proben mittels neuer<br />
Kryotechnologien ist es jedoch nicht<br />
allein, die am Standort Sulzbach<br />
erfolgt. Im tiefgekühlten Zustand lässt<br />
sich mit <strong>de</strong>n Zellen noch weitaus mehr<br />
anfangen. Sie sind zu Festkörpern<br />
erstarrt und als solche in vieler Hinsicht<br />
robuster als Zellen bei Normaltemperatur.<br />
Sie lassen sich auch bei Temperaturen<br />
weit unter <strong>de</strong>m Gefrierpunkt mit<br />
vielen gängigen Verfahren vermessen,<br />
sortieren und hochpräzise manipulieren.<br />
Genau das konnte in einem<br />
bereits abgeschlossenen Forschungsprojekt<br />
<strong>de</strong>s Bun<strong>de</strong>sministeriums <strong>für</strong> Bildung<br />
und Forschung von Wissenschaftlern<br />
und Technikern <strong>de</strong>s IBMT<br />
belegt wer<strong>de</strong>n.<br />
Was <strong>für</strong> die weitere Entwicklung dieses<br />
neuen <strong>Biotechnologie</strong>zweiges benötigt<br />
wird, ist vor allem Technologieerfahrung,<br />
wie sie in <strong>de</strong>r Fraunhofer-Gesellschaft<br />
und insbeson<strong>de</strong>re im Bereich<br />
<strong>de</strong>r Life Sciences am Fraunhofer-Institut<br />
<strong>für</strong> Biomedizinische Technik vorliegt.<br />
Hervorzuheben ist gleichermaßen<br />
die Mikrosystemtechnik-Kompetenz<br />
und <strong>de</strong>r Einstieg in die Nanobiotechnologie<br />
am IBMT. Des Weiteren ist eine<br />
hochkarätige Bioinformatik erfor<strong>de</strong>rlich,<br />
um die Fülle <strong>de</strong>r Daten effektiv<br />
und sicher zu verwalten, und <strong>de</strong>ren<br />
wissenschaftliche Inhalte rasch und<br />
kontrolliert weltweit über Jahrzehnte<br />
lesbar und verfügbar zu machen. Auch<br />
auf diesem Gebiet ist das Saarland<br />
inzwischen auf <strong>de</strong>m besten Weg in<br />
Deutschland und international eine<br />
führen<strong>de</strong> Position einzunehmen. Hinzu<br />
kommt die medizinische Anbindung<br />
und Relevanz <strong>de</strong>r Forschung, die ebenfalls<br />
in hervorragen<strong>de</strong>r Ausprägung am<br />
Universitätsstandort Homburg vertreten<br />
ist. Flankiert wird dies von einem<br />
sehr aufgeschlossenen interdisziplinären<br />
Feld <strong>de</strong>r Ingenieurwissenschaften,<br />
Humanbiologie, Chemie,<br />
Physik, Mathematik und Pharmazie an<br />
<strong>de</strong>n universitären und außeruniversitären<br />
Forschungseinrichtungen <strong>de</strong>r<br />
Saar-Lor-Lux-Region. Nicht zuletzt wird<br />
ein entwicklungsfähiger Standort<br />
8<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik
Bio-Informationstechnologie<br />
Tieftemperatur-<br />
Elektronik<br />
Datenbanken<br />
– 50 bis – 200 °C<br />
Zelluläre<br />
Kryobiologie<br />
F & E<br />
Konstruktion<br />
Service<br />
Industrielle Applikation /<br />
Dienstleistung<br />
Kryomechanik<br />
Kryorobotik<br />
Kryosubstrate<br />
Nanobiotechnologie<br />
Mikrosystemtechnik<br />
Neue Forschungsfel<strong>de</strong>r<br />
Forschung<br />
Kryogerätebau<br />
Kryobank<strong>de</strong>sign<br />
<strong>für</strong> Kliniken, Startups, medizinische<br />
und industrielle Zwecke<br />
Fel<strong>de</strong>r <strong>de</strong>r Kryo(bio)technologie<br />
am Fraunhofer IBMT.<br />
benötigt, <strong>de</strong>r schrittweise ausgebaut<br />
wer<strong>de</strong>n kann. Diese Randbedingungen<br />
erfüllt das Saarland und Sulzbach/<br />
St. Ingbert mit einem Industriegelän<strong>de</strong><br />
und <strong>de</strong>r Möglichkeit <strong>de</strong>r Ausgründung<br />
und Ansiedlung von Start-up-Firmen in<br />
bestmöglicher Ausprägung.<br />
Das Feld <strong>de</strong>r visionär entwickelten<br />
Kryobiotechnologie basiert auf <strong>de</strong>n<br />
langjährigen Erfahrungen <strong>de</strong>s Fraunhofer<br />
IBMT im biomedizinischen Bereich<br />
sowie <strong>de</strong>r breit gefächerten Grundlagen-<br />
und Anwendungsforschung in<br />
<strong>de</strong>n Biowissenschaften. Das Saarland<br />
und die Fraunhofer-Gesellschaft nutzen<br />
mit <strong>de</strong>r Gründung <strong>de</strong>r <strong>Kryoforschungsbank</strong><br />
eurocryoSaar die Chance,<br />
dieses international noch nicht<br />
besetzte Forschungs- und Wirtschaftsfeld<br />
frühzeitig zu gestalten. Ein Forschungsvorhaben<br />
dieser Größe und<br />
Ausrichtung kann von <strong>de</strong>r Fraunhofer-<br />
Gesellschaft nicht allein, son<strong>de</strong>rn nur<br />
in enger Abstimmung mit einem Bun<strong>de</strong>sland<br />
und auf Bun<strong>de</strong>sebene initiiert<br />
wer<strong>de</strong>n. Das IBMT steht in engem<br />
Kontakt zu <strong>de</strong>n Instituten <strong>de</strong>s Life<br />
Science-Verbun<strong>de</strong>s <strong>de</strong>r Fraunhofer-<br />
Gesellschaft, insbeson<strong>de</strong>re zum Fraunhofer<br />
IME mit langjährigen Erfahrungen<br />
mit <strong>de</strong>r Umweltbun<strong>de</strong>sbank in<br />
Schmallenberg, die ebenfalls eine<br />
Kryobank mo<strong>de</strong>rner Ausprägung ist.<br />
Die Gründung <strong>de</strong>r »<strong>Kryoforschungsbank</strong><br />
mit angeschlossenem <strong>Zentrum</strong><br />
<strong>für</strong> Kryobiotechnologie«<br />
eurocryoSaar ist somit <strong>de</strong>r Grundstock<br />
und <strong>de</strong>r Beginn <strong>für</strong> eine weitere<br />
saarlandspezifische Initiative im Feld<br />
<strong>de</strong>r Bio- und Ingenieurwissenschaften.<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik 9
Grundlagenforschung zur Kryokonservierung –<br />
Von <strong>de</strong>r Kryobiologie zur Kryotechnologie<br />
Bärtierchen im Mikroskop.<br />
Bärtierchen (Tardigradus spec.). Oben: von <strong>de</strong>r Seite,<br />
Länge: 0,9 mm; Unten eingekreist: Dauerform, Länge:<br />
0,3 mm, (sog. Tönnchenstadium) kann große Hitze<br />
sowie Kälte ohne Zugabe von Kryoprotektiva überstehen<br />
(Fotos: Dr. T. Fixemer, IBMT).<br />
200 µm<br />
Die Natur bietet <strong>für</strong> viele Fragestellungen<br />
<strong>de</strong>r Kryotechnologie unterschiedliche<br />
Lösungsansätze. So zeigt die Evolution<br />
mehrere Möglichkeiten <strong>de</strong>r<br />
Natur, das Leben auch unter ungünstigen<br />
Umstän<strong>de</strong>n aufrecht zu erhalten<br />
und sogar zur Vermehrung zu bringen.<br />
Überlebensstrategien wur<strong>de</strong>n von<br />
einer Vielzahl von Organismen entwickelt,<br />
um langen Kälteperio<strong>de</strong>n o<strong>de</strong>r<br />
extremer Hitze wi<strong>de</strong>rstehen zu können.<br />
Der kryobiologische Rekord wird<br />
bislang von Bakterien gehalten. Diese<br />
Einzeller können nicht nur unter extremen<br />
Bedingungen leben, nahezu vollständig<br />
austrocknen, son<strong>de</strong>rn auch aus<br />
<strong>de</strong>m Zustand <strong>de</strong>s Tiefgefrorenseins<br />
wie<strong>de</strong>r zum Leben erwachen. In Sibirien<br />
fan<strong>de</strong>n Wissenschaftler viele Meter<br />
unter <strong>de</strong>r Erdoberfläche Bakterien, die<br />
in einem min<strong>de</strong>stens drei Millionen<br />
Jahre währen<strong>de</strong>n Permafrosthorizont<br />
von –10 °C eingefroren gewesen sein<br />
sollen. Nach einigen Stun<strong>de</strong>n in <strong>de</strong>r<br />
Wärme (ca. 37 °C) sollen sie sich wie<strong>de</strong>r<br />
geteilt und vermehrt haben.<br />
Das Problem <strong>für</strong> Bewohner extrem kalter<br />
Habitate besteht darin, dass Lebewesen<br />
zum Großteil aus Wasser bestehen,<br />
das bei Kälte zu Kristallen gefriert,<br />
die irreparable Entmischungen und<br />
Zerstörungen im Zellinneren anrichten<br />
(vgl. Kapitel Molekulare Prozesse beim<br />
Einfrieren von Zellen). Während daher<br />
Säugetiere im Hochgebirge nur mit<br />
dichtem Winterfell, d.h. thermisch gut<br />
isoliert überleben, springt <strong>de</strong>r Gletscherfloh<br />
agil im Innern von Schneeund<br />
Eismassen umher. Das nur gera<strong>de</strong><br />
1,5 mm große Urinsekt ist perfekt an<br />
seinen extremen Lebensraum angepasst.<br />
Seine Körperflüssigkeit enthält<br />
diverse Zuckerarten, die <strong>de</strong>n Gefrierpunkt<br />
erniedrigen und Vorbil<strong>de</strong>r <strong>für</strong><br />
die Gefrierschutzmittel <strong>de</strong>r Kryobiologie<br />
abgeben. Bei starker Kälte wird<br />
außer<strong>de</strong>m <strong>de</strong>r Magen entleert, damit<br />
sich an <strong>de</strong>n Feststoffen kein Eiskristallwachstum<br />
einstellen kann. Spezielle<br />
Proteine vervollkommnen seine Kälteanpassung,<br />
in<strong>de</strong>m entstehen<strong>de</strong> Eiskristallkeime<br />
sofort molekular eingepackt<br />
wer<strong>de</strong>n und somit das Kristallwachstum<br />
gestoppt bzw. gesteuert<br />
wird. Mit diesen Schutzmechanismen<br />
ist es <strong>de</strong>m Gletscherfloh möglich,<br />
unterhalb seiner Vorzugstemperatur<br />
von ca. 0 °C, Temperaturen bis zu<br />
–16 °C in aktivem Zustand zu überdauern;<br />
in Ausnahmefällen und bei<br />
langsamer Anpassung überlebt er<br />
sogar Temperaturen bis unter –25 °C.<br />
Eine völlig an<strong>de</strong>re Strategie hat die<br />
Puppe <strong>de</strong>s Schwalbenschwanzes, einer<br />
auch in Mitteleuropa beheimateten<br />
Schmetterlingsart, realisiert. Dank <strong>de</strong>s<br />
klassischen Frostschutzmittels Glycerin<br />
übersteht sie in eingefrorenem Zustand<br />
Temperaturen bis zu –30 °C. Der<br />
Schutzeffekt <strong>de</strong>s dreiwertigen Alkohols<br />
Glycerin beruht auf <strong>de</strong>r Tatsache, dass<br />
Eiskristalle, die in hohen Glycerinkonzentrationen<br />
wachsen, kleiner und in<br />
<strong>de</strong>r Form günstiger <strong>für</strong> Zellen sind, so<br />
dass Zytoplasmastrukturen nicht zerstört<br />
wer<strong>de</strong>n. Neben Glycerin und <strong>de</strong>n<br />
»Icenucleating-Proteins« nutzen einige<br />
Tiere auch die oben erwähnten<br />
10<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik
Zuckerverbindungen wie Trehalose,<br />
Glukose und Fruktose, um das Einfrieren<br />
zu steuern und die Form <strong>de</strong>r entstehen<strong>de</strong>n<br />
Eiskristalle zu beeinflussen.<br />
Gera<strong>de</strong> die im Mittel 0,3 bis 1 mm langen<br />
moosbewohnen<strong>de</strong>n Bärtierchen<br />
(wiss. Name Tardigradus = Langsamgeher,<br />
engl. water bear) ersetzen das<br />
Wasser im Körperinneren durch Trehalose,<br />
so dass <strong>de</strong>r Feuchtigkeitsgehalt<br />
auf bis zu 2% gesenkt wer<strong>de</strong>n kann.<br />
In diesem ausgetrockneten Zustand<br />
können die Tiere jahrelang Hitze- und<br />
Kälteperio<strong>de</strong>n überstehen.<br />
Fische in <strong>de</strong>r Antarktis schützen sich<br />
ähnlich wie die bereits beschriebenen<br />
Frösche Alaskas vor <strong>de</strong>r Kälte mit<br />
zuckerhaltigen Glycoproteinen, die die<br />
Eisbildung in <strong>de</strong>n Zellen verhin<strong>de</strong>rn.<br />
Wie die meisten gefriertoleranten Tiere<br />
senken auch die Fische während <strong>de</strong>s<br />
Eingefrorenseins ihren Stoffwechsel<br />
radikal ab. Herz und Kreislauf stehen<br />
im Extremfall sogar ganz still, nur<br />
innerhalb <strong>de</strong>r Gewebe wird ein schwacher<br />
Stoffwechsel mit Hilfe von Stärkereserven<br />
aufrechterhalten. Auf diese<br />
Weise können sie tiefgekühlt Temperaturen<br />
bis –7 °C schadlos überstehen,<br />
die nordamerikanische Gallmücke<br />
Eurosta solidaginis sogar bis –50 °C bei<br />
65% gefrorener Körperflüssigkeit.<br />
Ganz gefrieren können all diese Tiere,<br />
wie bereits ausgeführt, lebend jedoch<br />
nicht.<br />
Bei einigen eisbewohnen<strong>de</strong>n Kieselalgen<br />
fand man heraus, dass die Algenzellen<br />
eine 50-mal höhere Konzentration<br />
an bestimmten Aminosäuren enthalten,<br />
als es normalerweise <strong>de</strong>r Fall<br />
ist. Diese Moleküle schützen ebenfalls<br />
die Zellstrukturen und fungieren als<br />
Frostschutzmittel. In an<strong>de</strong>ren Organismen<br />
übernehmen anorganische Ionen<br />
diese Funktion.<br />
Frühe embryonale Zellstadien, wie sie in <strong>de</strong>r Reproduktionsmedizin als Embryonen bezeichnet wer<strong>de</strong>n. Es han<strong>de</strong>lt sich<br />
dabei nicht um ausdifferenziertes Gewebe o<strong>de</strong>r Föten mit einem Blutkreislauf und einem ausgebil<strong>de</strong>ten Nervensystem.<br />
Letztere lassen sich bislang nicht kryokonservieren.<br />
(Foto mit freundlicher Genehmigung: Dr. Jan Meyer (www.meyweb.ch/froschnetz/)<br />
Die Abbildungen zeigen die frühen Entwicklungsstadien eines Froschembryos: 1 = eine befruchtete Eizelle;<br />
2 = Zweizellstadium; 4 = Vierzellstadium; 8 = Achtzellstadium; 16 = 16-Zellstadium; 8 000-16 000 Zellstadium =<br />
Blastula; Neur. = Neurulation - Entstehung <strong>de</strong>r Neuralleiste.<br />
Neben <strong>de</strong>n niedrigen Temperaturen<br />
stellt ein hoher Salzgehalt harte Anfor<strong>de</strong>rungen<br />
an Bewohner <strong>de</strong>s Meereises.<br />
Das Meereis selbst hat einen geringeren<br />
Salzgehalt als das Meerwasser, da<br />
es beim Gefrieren aussüßt. Die aktiven<br />
eisbewohnen<strong>de</strong>n Organismen halten<br />
sich in <strong>de</strong>n wenige Millimeter großen<br />
Laugenkanälen <strong>de</strong>s Eises auf, in <strong>de</strong>nen<br />
die Salzkonzentrationen ungleich<br />
höher sind. Enthält Meerwasser bis zu<br />
39 Promille Salz, so beträgt <strong>de</strong>r Salzgehalt<br />
in <strong>de</strong>n Kanälen bis zu 70 Promille,<br />
wenn die Temperaturen sehr niedrig<br />
sind, sogar bis zu 150 Promille. Die Eisorganismen<br />
müssen also bis zu viermal<br />
mehr Salz als im Meerwasser tolerieren.<br />
Dazu erhöhen sie das osmotische<br />
Potenzial ihrer Zellen zur Vermeidung<br />
einer massiven Dehydrierung.<br />
All diese Varianten <strong>de</strong>r Natur wer<strong>de</strong>n<br />
in <strong>de</strong>r In-vitro-Kryotechnologie seit langem<br />
kopiert und modifiziert. Nach <strong>de</strong>r<br />
revolutionieren<strong>de</strong>n Ent<strong>de</strong>ckung <strong>de</strong>r<br />
Gefrierschutzeigenschaften <strong>de</strong>s Glycerins<br />
vor über 50 Jahren (POLGE et al.<br />
1949), versuchten Wissenschaftler mit<br />
tiefgefrorenem Sperma von Bullen<br />
o<strong>de</strong>r an<strong>de</strong>ren Nutztieren vergleichbare<br />
Fruchtbarkeitsresultate zu erzielen, wie<br />
man sie bei <strong>de</strong>n Befruchtungen mit<br />
frisch übertragenem Sperma erhält.<br />
Heute wird die Kryokonservierung von<br />
Sperma und/o<strong>de</strong>r Embryonen im Rahmen<br />
<strong>de</strong>s Embryotransfers in <strong>de</strong>r Rin<strong>de</strong>rzucht<br />
routinemäßig angewen<strong>de</strong>t.<br />
1998 wur<strong>de</strong>n bereits mehr als 50%<br />
aller gewonnenen Rin<strong>de</strong>rembryonen<br />
(darunter sind nicht Feten zu verstehen,<br />
son<strong>de</strong>rn aus einer o<strong>de</strong>r wenigen<br />
Zellen bestehen<strong>de</strong> Frühformen <strong>de</strong>s<br />
Embryos) nach Tiefgefrierkonservierung<br />
übertragen (THIBIER 1999). Ziel<br />
<strong>de</strong>r Kryokonservierung ist dabei die<br />
unbefristete Lagerung <strong>de</strong>r Embryonen,<br />
ohne die Entwicklungsfähigkeit nach<br />
<strong>de</strong>m Auftauen zu beeinträchtigen.<br />
Beson<strong>de</strong>rs kritische Phasen <strong>für</strong> das<br />
Überleben <strong>de</strong>r Einzell- o<strong>de</strong>r Mehrzell-<br />
Embryonen sind das Einfrieren und das<br />
Auftauen mit <strong>de</strong>m anschließen<strong>de</strong>n<br />
Auswaschen <strong>de</strong>s Gefrierschutzmittels.<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik 11
Bereits 1953 gelang die erste Schwangerschaft<br />
einer Frau nach einer<br />
Befruchtung mit kryokonserviertem<br />
Sperma. Vergleichsweise einfach stellt<br />
sich heute die Konservierung <strong>de</strong>r relativ<br />
wi<strong>de</strong>rstandsfähigen Spermien dar.<br />
Die Protokolle, nach <strong>de</strong>nen Reproduktionszentren<br />
beim Konservieren von<br />
Sperma <strong>de</strong>rzeit arbeiten, weichen nur<br />
noch in Details voneinan<strong>de</strong>r ab - etwa<br />
darin, welches Gefrierschutzmittel man<br />
<strong>de</strong>m Ejakulat hinzugibt und wie schnell<br />
mit flüssigem Stickstoff auf unter<br />
–150 °C abgekühlt und später wie<strong>de</strong>r<br />
aufgetaut wird. Mit <strong>de</strong>r sorgfältig<br />
getesteten Gefrierflüssigkeit ist die<br />
Kryokonservierung eine sehr erfolgreiche<br />
Alternative <strong>für</strong> Menschen, <strong>de</strong>ren<br />
Fruchtbarkeit gefähr<strong>de</strong>t ist.<br />
Im Jahre 1971 gelang die erste erfolgreiche<br />
Kryokonservierung von Mäuseembryonen<br />
(WHITTINGHAM 1971),<br />
und zwei Jahre später wur<strong>de</strong> das erste<br />
leben<strong>de</strong> Kalb nach Transfer eines tiefgefrorenen<br />
Rin<strong>de</strong>rembryos geboren<br />
(WILMUT u. ROWSON 1973). Von<br />
einer praktischen Anwendung war<br />
man zu diesem Zeitpunkt jedoch noch<br />
weit entfernt. Viele grundlegen<strong>de</strong><br />
Arbeiten zur Kryokonservierung von<br />
Mäuseembryonen haben in <strong>de</strong>r Zwischenzeit<br />
wichtige Hinweise zur Entwicklung<br />
eines praxisnahen Tiefgefrierverfahrens<br />
geliefert (WHITTINGHAM<br />
1980).<br />
Fast 25 Jahre nach <strong>de</strong>r Geburt <strong>de</strong>s<br />
ersten Retortenbabys, Louise Brown,<br />
am 25. Juli 1978 in Oldham sind solche<br />
Behandlungen reine Routine.<br />
Allein in <strong>de</strong>r Schweiz wur<strong>de</strong>n seit<br />
1993, <strong>de</strong>r Einführung einer genauen<br />
Erfassung durch das Nationale Register<br />
FIVNAT-CH, rund 3 000 Kin<strong>de</strong>r mit Hilfe<br />
<strong>de</strong>r Reproduktionsmedizin geboren.<br />
Die I<strong>de</strong>e, Zellen und Gewebe vorsorglich<br />
aufzubewahren, ist nicht neu.<br />
Bereits 1975 begann Kurt Benirschke,<br />
Wissenschaftler und heutiger Vize-Präsi<strong>de</strong>nt<br />
<strong>de</strong>s San Diego Zoos, eine DNA-<br />
Bank mit Gewebeproben vom Aussterben<br />
bedrohter Tiere anzulegen. »Ich<br />
möchte die internationale Gemeinschaft<br />
liebend gerne dazu anregen, so<br />
viele Zellen wie möglich von so vielen<br />
Tieren wie möglich zu sichern«, erklärt<br />
Benirschke begeistert. Mit über 4 300<br />
Zelllinien verschie<strong>de</strong>ner Individuen, die<br />
von 370 Arten und Unterarten vorwiegend<br />
vom Aussterben bedrohter Tiere<br />
stammen, unterhält Benirschkes Team<br />
am Center for Reproduction of Endangered<br />
Species (CRES) <strong>de</strong>s San Diego<br />
Zoos die weltweit größte DNA-Bank<br />
dieser Art, inzwischen eine wertvolle<br />
Bioressource. Durch die Ablage von<br />
Stammzellen, ggf. adulte und embryonale,<br />
lässt sich <strong>de</strong>r Wert dieser Ablagen<br />
durch die Depothaltung von Lebendmaterial<br />
noch weiter erhöhen.<br />
Gemeinsam mit <strong>de</strong>m Neunkircher Zoopark<br />
wird am Fraunhofer IBMT gegenwärtig<br />
eine <strong>de</strong>rartige Pilotsammlung<br />
von Stammzellen seltener Tierarten<br />
angelegt.<br />
1984 wur<strong>de</strong> zum ersten Mal in Australien<br />
ein gesun<strong>de</strong>s Mädchen geboren,<br />
das aus einem tiefgefrorenen Embryo<br />
entstand. Viele Län<strong>de</strong>r erlauben seit<strong>de</strong>m<br />
die so genannte Kryokonservierung<br />
in frühen Embryonalstadien nach<br />
einer In-vitro-Fertilisation (IVF). Der<br />
Vorteil: Bleibt <strong>de</strong>r erste Versuch einer<br />
Schwangerschaft erfolglos, können die<br />
Frauen in <strong>de</strong>r Folge auf tiefgefrorene<br />
Embryonen zurückgreifen, was die Prozedur<br />
erheblich vereinfacht - und die<br />
Kosten <strong>de</strong>r Behandlung senkt. Überall<br />
auf <strong>de</strong>r Welt kommt heute keines <strong>de</strong>r<br />
Zentren, in <strong>de</strong>nen die IVF angeboten<br />
wird, ohne »Kühltruhe« und ohne flüssigen<br />
Stickstoff aus. Der Reproduktionsmediziner<br />
Martin Birkhäuser vom<br />
Inselspital in Bern: »Ohne Kryokonservierung<br />
wäre die IVF zwar <strong>de</strong>nkbar,<br />
aber die Erfolgsaussichten wären<br />
schlechter«. Dies dürfte <strong>für</strong> viele Berei-<br />
12<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik
che <strong>de</strong>r zukünftigen <strong>Biotechnologie</strong><br />
und Medizin zutreffen.<br />
Nach <strong>de</strong>m Embryonenschutzgesetz<br />
dürfen allerdings auch in <strong>de</strong>r Schweiz<br />
wie in Deutschland keine menschlichen<br />
Embryonen mehr tiefgefroren aufbewahrt<br />
wer<strong>de</strong>n. Gesetzlich erlaubt ist<br />
lediglich die Kryokonservierung von<br />
befruchteten Eizellen im Vorkernstadium.<br />
Die Samenzelle ist in diesem Stadium<br />
zwar schon in die Eizelle eingedrungen,<br />
das Erbgut bei<strong>de</strong>r Keimzellen<br />
jedoch noch nicht miteinan<strong>de</strong>r verschmolzen.<br />
Ein Ausweg liegt im Lagern von unbefruchteten<br />
Eizellen. Lei<strong>de</strong>r überleben<br />
unbefruchtete Eizellen eine Kryokonservierung<br />
bisher nur schlecht. Insgesamt<br />
gelang es bis 1998 weltweit nur<br />
achtmal, Schwangerschaften mit solchen<br />
Eizellen zu erzielen - vier davon<br />
en<strong>de</strong>ten mit vorzeitigem Abort. Das<br />
Risiko, dass die Kin<strong>de</strong>r Missbildungen<br />
aufweisen, ist zzt. noch hoch. Als einziges<br />
<strong>Zentrum</strong> in <strong>de</strong>r Schweiz bietet<br />
das Züricher Universitätsspital an, von<br />
Frauen Gewebeproben <strong>de</strong>r Eierstöcke<br />
einzufrieren. Damit aus <strong>de</strong>m kryokonservierten<br />
Gewebe reife Eizellen entstehen,<br />
muss es <strong>de</strong>r behan<strong>de</strong>lten Frau<br />
erneut rücktransplantiert wer<strong>de</strong>n.<br />
Frauen, <strong>de</strong>nen wegen einer Operation,<br />
einer Chemo- o<strong>de</strong>r Strahlentherapie<br />
<strong>de</strong>r Verlust <strong>de</strong>r Fruchtbarkeit droht,<br />
sollen so in Zukunft die Option erhalten,<br />
sich später <strong>de</strong>nnoch einen Kin<strong>de</strong>rwunsch<br />
erfüllen zu können.<br />
Doch die Transplantation von gespen<strong>de</strong>ten<br />
Eierstöcken gilt nur als erster<br />
Schritt: Das Ziel <strong>de</strong>r Mediziner ist die<br />
Lebendkonservierung von Eizellen im<br />
Gewebeverband. Weltweit forschen<br />
Wissenschaftler, wie sie Eierstöcke<br />
schützen, aufbewahren o<strong>de</strong>r ersetzen<br />
können. Beson<strong>de</strong>rs junge Krebspatientinnen,<br />
<strong>de</strong>ren Eierstöcke als Nebenwirkung<br />
einer Chemotherapie o<strong>de</strong>r<br />
Bestrahlung geschädigt o<strong>de</strong>r zerstört<br />
wur<strong>de</strong>n, könnten davon profitieren.<br />
Der Kryobiologie, <strong>de</strong>r Wissenschaft<br />
vom Verhalten <strong>de</strong>r Lebewesen und<br />
ihrer Bestandteile bei niedrigen Temperaturen,<br />
ist es zu verdanken, dass wir<br />
heute <strong>de</strong>n Prozess <strong>de</strong>r Kryokonservierung<br />
soweit kontrollieren können, dass<br />
einerseits <strong>de</strong>r Scha<strong>de</strong>n, <strong>de</strong>n die Zellen<br />
erlei<strong>de</strong>n, auf ein Minimum beschränkt<br />
bleibt, und an<strong>de</strong>rerseits die Wie<strong>de</strong>rverwendbarkeit<br />
stark verbessert ist. Als<br />
obligat hat sich <strong>de</strong>r Temperaturbereich<br />
unter –130 °C herausgestellt. Eine<br />
Langzeitlagerung bei ca. –150 °C in<br />
<strong>de</strong>r Gasphase <strong>de</strong>s flüssigen Stickstoffs<br />
scheint nach heutigem Ermessen<br />
sicher. Auch direkt im flüssigen Stickstoff<br />
(LN 2 ) können Proben in vollständiger<br />
Umhüllung abgelegt wer<strong>de</strong>n, wie<br />
einige Nabelschnurblutbanken zeigen.<br />
Doch vieles ist empirischer Natur und<br />
nur bedingt als optimiert zu betrachten.<br />
Mehr und mehr entwickelt sich<br />
die Kryobiophysik zu einer eigenständigen<br />
wissenschaftlichen Disziplin, die<br />
systematisch die Prozesse <strong>de</strong>r Abkühlung<br />
und Erwärmung erforscht.<br />
Auf <strong>de</strong>r Grundlage dieser Erkenntnisse<br />
versucht man seit einiger Zeit nicht nur<br />
Zellen o<strong>de</strong>r Zellsuspensionen, son<strong>de</strong>rn<br />
auch ganze Organe einzufrieren, um<br />
sie bei Bedarf <strong>für</strong> Transplantationen<br />
verwen<strong>de</strong>n zu können. Es wur<strong>de</strong>n<br />
bereits Experimente mit Rattenlebern<br />
durchgeführt, die man mit <strong>de</strong>m Antifrostprotein<br />
<strong>de</strong>r Fische und Glycerol<br />
behan<strong>de</strong>lte und die nach <strong>de</strong>m Auftauen<br />
und Auswaschen noch wesentliche<br />
Elemente <strong>de</strong>r natürlichen Funktion aufwiesen.<br />
Jetzt sollen sie in Ratten transplantiert<br />
wer<strong>de</strong>n. Knochen, Sehnen,<br />
Bän<strong>de</strong>r o<strong>de</strong>r Haut, gewonnen aus<br />
Gewebespen<strong>de</strong>n, bil<strong>de</strong>n die Grundlage<br />
<strong>für</strong> »Reparaturarbeiten«, die Leben<br />
erhalten und Defekte beseitigen sollen.<br />
Tumorpatienten, an <strong>de</strong>nen beispielsweise<br />
Amputationen vorgenommen<br />
wer<strong>de</strong>n mussten, könnte mit biologi-<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik 13
schen Transplantaten viel besser und<br />
nachhaltiger geholfen wer<strong>de</strong>n, als dies<br />
synthetische Hilfsmittel je vermögen.<br />
Bisher gelingt die reversible Kryokonservierung<br />
von Organen, ja selbst<br />
größerer Gewebestücke, noch nicht.<br />
In letzter Zeit sind Blutstammzellen<br />
(und Knochenmarkstammzellen) in <strong>de</strong>n<br />
Blickpunkt <strong>de</strong>r Kryokonservierung<br />
gerückt, da diese sich ohne Gefrierlagerung<br />
nicht länger als ein paar Stun<strong>de</strong>n<br />
o<strong>de</strong>r Tage lagern lassen bzw. unter<br />
aufwendigen Bedingungen und nicht<br />
immer erfolgreich permanent kultiviert<br />
wer<strong>de</strong>n müssten. Gegenwärtig wer<strong>de</strong>n<br />
diese sehr raren Zellen in Teflonbeuteln,<br />
die verschweißt und dann tiefgekühlt<br />
wer<strong>de</strong>n, abgelegt. Die beste<br />
Lagerung wird wie<strong>de</strong>rum bei ca.<br />
–150 °C in <strong>de</strong>r Gasphase <strong>de</strong>s flüssigen<br />
Stickstoffs o<strong>de</strong>r direkt in <strong>de</strong>r Flüssigphase<br />
erreicht. Auch hierbei wird <strong>de</strong>n<br />
Zellen ein Gefrierschutzmittel zugegeben.<br />
Nach Jahrzehnten im Kryotank sind<br />
Zellsuspensionen und Einzelzellen bzw.<br />
Stammzellen aus <strong>de</strong>m Nabelschnurblut<br />
von Neugeborenen noch lebensfähig.<br />
Die Zellen beginnen sich nach <strong>de</strong>m<br />
Auftauen zu vermehren und können<br />
auch in Versuchstieren funktionell eingebaut<br />
wer<strong>de</strong>n. Daher sind kryokonservierte<br />
Zellen vermutlich auch klinisch<br />
nutzbar. Mit <strong>de</strong>n im Nabelschnurblut<br />
enthaltenen Stammzellen<br />
sollen künftig Tumoren und Immunschwächekrankheiten<br />
behan<strong>de</strong>lt, ggf.<br />
sogar Gewebe regeneriert wer<strong>de</strong>n.<br />
Inwieweit die Kryoprotokolle diesbezüglich<br />
nochmals geprüft und optimiert<br />
wer<strong>de</strong>n müssen, ist bisher offen<br />
und ein Forschungsfeld <strong>de</strong>r nächsten<br />
Jahre auch am IBMT. Dies alles erfor<strong>de</strong>rt<br />
effektive und auf die biologischen<br />
Objekte abgestimmte Gerätesysteme<br />
und Verfahren.<br />
Die große Zeit <strong>de</strong>r Kryotechnologie<br />
steht daher noch vor uns. Die aufstreben<strong>de</strong><br />
<strong>Biotechnologie</strong> in Kombination<br />
mit <strong>de</strong>r zellbasierten Medizin wird in<br />
großem Umfang und hochparallel die<br />
Ablage von Proben erfor<strong>de</strong>rn. Be<strong>de</strong>nkt<br />
man, dass mehr als 100 000 tierische<br />
o<strong>de</strong>r menschliche Zellen in einem<br />
Lösungstropfen von nur einem Millimeter<br />
Durchmesser Platz haben, so<br />
bietet sich angesichts <strong>de</strong>r immer empfindlicher<br />
wer<strong>de</strong>n<strong>de</strong>n Analysetechniken<br />
eine hochgradige Miniaturisierung<br />
<strong>de</strong>r Kryosubstrate an. Den neuen<br />
Anfor<strong>de</strong>rungen wird man nur entsprechen<br />
können, wenn dabei ein hohes<br />
Maß an Standardisierung und Automatisierung<br />
<strong>de</strong>r Probengewinnung, <strong>de</strong>s<br />
Einfrierens, Ablagerns und <strong>de</strong>r Probenhandhabung<br />
erreicht wird.<br />
Nicht alle Zellen lassen sich gleichermaßen<br />
gut einfrieren und die bislang<br />
unvermeidlichen Kryoprotektiva müssen<br />
zumin<strong>de</strong>st reduziert wer<strong>de</strong>n. Es<br />
erstaunt schon, dass seit Jahrzehnten<br />
nahezu kein Fortschritt bei <strong>de</strong>r Suche<br />
nach biokompatiblen und medizinisch<br />
unkritischen Gefrierschutzmitteln zu<br />
verzeichnen ist. Dies alles sind Fel<strong>de</strong>r<br />
<strong>de</strong>r Kryoforschung, wie sie am Fraunhofer<br />
IBMT seit nunmehr vier Jahren<br />
im <strong>Zentrum</strong> <strong>für</strong> Kryobiotechnologie<br />
und in <strong>de</strong>r Abteilung Kryobiophysik &<br />
Kryotechnologie bearbeitet wer<strong>de</strong>n.<br />
14<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik
Anwendungsfel<strong>de</strong>r <strong>de</strong>r Kryotechnologie –<br />
Beispiel regenerative Medizin<br />
Entwicklung eines »organoi<strong>de</strong>n Gewebekörpers« (dunkler Bereich im <strong>Zentrum</strong>) aus Stammzellen einer<br />
adhärenten In-vitro-Kultur, die aus <strong>de</strong>m exokrinen Gewebe <strong>de</strong>s Pankreas eines Patienten isoliert wur<strong>de</strong>n.<br />
Stammzellen, aber auch Vorläuferzellen<br />
gehören wegen ihres enormen Entwicklungspotenzials<br />
zu <strong>de</strong>n Hoffnungsträgern<br />
in <strong>de</strong>r Medizin. Insbeson<strong>de</strong>re<br />
die autologen, aber auch allogenen<br />
Zelltherapien sind hierbei von<br />
beson<strong>de</strong>rem Interesse. Sie versprechen<br />
patientenverträgliche und sehr spezifische<br />
Behandlungen bei einer Vielzahl<br />
von Erkrankungen, da die Zellen bei<br />
<strong>de</strong>r autologen Verabreichung genau<br />
aus <strong>de</strong>m Patienten stammen, in <strong>de</strong>n sie<br />
auch wie<strong>de</strong>r implantiert wer<strong>de</strong>n.<br />
Man unterschei<strong>de</strong>t embryonale und<br />
adulte Stammzellen, d.h. die Quelle<br />
<strong>de</strong>r Stammzellen ist entwe<strong>de</strong>r eines<br />
<strong>de</strong>r frühen embryonalen Entwicklungsstadien<br />
o<strong>de</strong>r <strong>de</strong>r jugendliche bzw.<br />
adulte Organismus. Derartige Stammzellen<br />
sind weitgehend o<strong>de</strong>r vollständig<br />
undifferenziert und können sich in<br />
einige, eine Vielzahl o<strong>de</strong>r bei totipotenten<br />
Stammzellen in alle <strong>de</strong>r etwa<br />
220 verschie<strong>de</strong>nen Zelltypen entwickeln,<br />
aus <strong>de</strong>nen <strong>de</strong>r Mensch und<br />
die höheren Tiere bestehen. Die Zahl<br />
<strong>de</strong>r aus <strong>de</strong>m Organismus gewinnbaren<br />
Stammzellen ist in <strong>de</strong>r Regel (bis auf<br />
wenige Ausnahmen) zu gering <strong>für</strong> eine<br />
Charakterisierung, Verän<strong>de</strong>rung und<br />
Rückführung <strong>de</strong>r Zellen im Rahmen<br />
einer Behandlung. Es wer<strong>de</strong>n daher<br />
seit Jahren In-vitro-Verfahren getestet,<br />
die zur möglichst unbegrenzten Vermehrung<br />
<strong>de</strong>r Stammzellen auf und in<br />
Nährmedien geeignet sind. Des Weiteren<br />
ist die gezielte Differenzierung <strong>de</strong>r<br />
Stammzellen eine Grundvoraussetzung<br />
zur geordneten Erneuerung von<br />
<strong>de</strong>fektem o<strong>de</strong>r gealtertem Gewebe,<br />
wie es das Ziel <strong>de</strong>r regenerativen Medizin<br />
ist. Hierzu sind bisher weit mehr als<br />
100 Wachstums- und Differenzierungsfaktoren<br />
bekannt und in <strong>de</strong>r Erprobung.<br />
Bisher differenzieren die adulten<br />
Stammzellen noch nicht in <strong>de</strong>r Weise,<br />
z.B. zu Herzmuskel-, Nerven- o<strong>de</strong>r<br />
Bauchspeicheldrüsenzellen, wie dies<br />
bei embryonalen Stammzellen <strong>de</strong>r Fall<br />
und während <strong>de</strong>r Embryogenese gut<br />
nachvollziehbar ist. Dennoch wer<strong>de</strong>n<br />
ständig neue Erkenntnisse bekannt, die<br />
zeigen, dass das Potenzial <strong>de</strong>r adulten<br />
Stammzellen größer ist, als bisher<br />
angenommen wur<strong>de</strong>.<br />
Die Medizin sieht <strong>de</strong>rzeit drei Möglichkeiten<br />
Stammzellen zur Regeneration<br />
zu nutzen: 1. Entwicklung eines<br />
Embryos bis zum Blastozystenstadium,<br />
Zellentnahme und Installation einer<br />
embryonalen Stammzellkultur, 2. Aussortieren<br />
adulter Stammzellen aus <strong>de</strong>m<br />
Nabelschnurblut o<strong>de</strong>r Gewebeteilen<br />
<strong>de</strong>s jugendlichen o<strong>de</strong>r erwachsenen<br />
Organismus und 3. Redifferenzierung<br />
bereits spezialisierter Zellen aus <strong>de</strong>m<br />
Organismus in Stammzellen.<br />
Aus ethischen Grün<strong>de</strong>n wür<strong>de</strong> man<br />
gerne die Nutzung embryonaler<br />
Stammzellen vermei<strong>de</strong>n, was keinesfalls<br />
be<strong>de</strong>uten kann, jedwe<strong>de</strong> embryonale<br />
Stammzellforschung zu verbieten.<br />
Die gegenwärtige öffentliche Debatte<br />
über die Situation <strong>de</strong>r Stammzellforschung<br />
in Deutschland ist charakterisiert<br />
durch zwei Lager, das <strong>de</strong>r Be<strong>für</strong>worter<br />
und das <strong>de</strong>r Gegner <strong>de</strong>r embryonalen<br />
Stammzellforschung und -nutzung.<br />
Unter <strong>de</strong>n Wissenschaftlern herrscht<br />
nahezu einheitlich die Auffassung, dass<br />
sowohl die embryonale als auch die<br />
adulte Stammzellforschung notwendig<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik 15
Gewinnung und Anlage von Stammzellkulturen am Beispiel <strong>de</strong>r Ratte, <strong>de</strong>ren<br />
Differenzierung und Kultivierung bis zu »organoi<strong>de</strong>n Gewebekörpern« sowie<br />
Zelltypen aller drei Keimblätter führt.<br />
und zu för<strong>de</strong>rn ist, da man ansonsten<br />
im adulten Bereich nicht über die notwendigen<br />
Vergleiche verfügt. Was die<br />
Nutzung <strong>für</strong> therapeutische Zwecke<br />
betrifft, gehen die Meinungen auseinan<strong>de</strong>r<br />
und müssen komplexe ethischrechtliche<br />
Gesichtspunkte berücksichtigt<br />
wer<strong>de</strong>n. Das Klonen menschlicher Embryonalzellen<br />
ist nach <strong>de</strong>m Embryonenschutzgesetz<br />
in Deutschland verboten.<br />
Es steht außer Frage, dass ethischrechtliche<br />
Probleme weitgehend vermie<strong>de</strong>n<br />
wer<strong>de</strong>n könnten, wenn sich<br />
die klinische Nutzung auf adulte<br />
Stammzellen o<strong>de</strong>r redifferenzierte Zellen<br />
beschränken könnte. Diesem Feld<br />
gilt daher das beson<strong>de</strong>re Engagement<br />
<strong>de</strong>s Fraunhofer IBMT mit seiner externen<br />
Arbeitsgruppe »Zelldifferenzierung<br />
& Zelltechnologie« an <strong>de</strong>r Universität<br />
zu Lübeck und »Biohybri<strong>de</strong> Systeme«<br />
in St. Ingbert sowie »Zellmanipulation«<br />
an <strong>de</strong>r Humboldt-Universität zu Berlin<br />
(vgl. hierzu das nachfolgen<strong>de</strong> Kapitel<br />
»Adulte Stammzellisolate aus exokrinem<br />
Gewebe«).<br />
Bei allen adulten Stammzellen, die bisher<br />
aus <strong>de</strong>r Blutbahn, <strong>de</strong>m Knochenmark<br />
o<strong>de</strong>r einem an<strong>de</strong>ren Gewebe<br />
gewonnen wer<strong>de</strong>n, zeigt sich, dass mit<br />
wachsen<strong>de</strong>m Alter auch die Differenzierungspotenz<br />
und die Vermehrungsfähigkeit<br />
<strong>de</strong>r gewonnenen Stammzellen<br />
abnimmt. So konnte in <strong>de</strong>r IBMT-<br />
Arbeitsgruppe »Zelldifferenzierung &<br />
Zelltechnologie« unter <strong>de</strong>r Leitung von<br />
Privatdozent Dr. Charli Kruse in Lübeck<br />
aus Biopsiegewebe <strong>de</strong>s Pankreas eines<br />
74-jährigen Patienten zwar noch eine<br />
Stammzellkultur über fünf Passagen<br />
vermehrt wer<strong>de</strong>n, die Zellen stellten<br />
dann jedoch ihre Vermehrung ein.<br />
An<strong>de</strong>re Zellisolate aus <strong>de</strong>m exokrinen<br />
Pankreas hingegen teilen und vermehren<br />
sich seit mehr als 2 Jahren nun<br />
über mehr als 80 Passagen, was ein<br />
Beleg <strong>für</strong> eine stabile In-vitro-Kultur ist.<br />
Daraus muss abgeleitet wer<strong>de</strong>n, dass<br />
auch die Stammzellen im Körper einem<br />
Alterungsprozess unterworfen sind<br />
und es somit sinnvoll ist, möglichst<br />
jugendliche Stammzellen zu gewinnen<br />
und diese personenbezogen <strong>für</strong> einen<br />
späteren Bedarf abzulegen. Dies<br />
schließt <strong>de</strong>n Kreis zur Kryokonservierung<br />
und begrün<strong>de</strong>t die <strong>de</strong>rzeit weltweit<br />
im Entstehen befindlichen Nabelschnurblutbanken.<br />
Es wäre eine faszinieren<strong>de</strong><br />
Perspektive, wenn es gelänge<br />
die Ziele <strong>de</strong>r regenerativen Medizin<br />
mittels Stammzellen aus <strong>de</strong>m Nabelschnurblut<br />
zu realisieren, da dieses bisher<br />
ungenutzt in ausreichen<strong>de</strong>r Menge<br />
(beim Menschen etwa 150 ml) anfällt<br />
und eine <strong>de</strong>r frühesten gut verfügbaren<br />
Stammzellquellen darstellt. Die<br />
Zahl <strong>de</strong>r Stammzellen ist allerdings <strong>für</strong><br />
einen direkten Einsatz zu gering, so<br />
dass entwe<strong>de</strong>r vor <strong>de</strong>r Kryokonservierung<br />
o<strong>de</strong>r zum Zeitpunkt einer späteren<br />
Nutzung eine In-vitro-Vermehrung<br />
erfolgen muss. Man kann also entwe<strong>de</strong>r<br />
das Vollblut mit einem Gefrierschutzmittel<br />
o<strong>de</strong>r besser die daraus<br />
isolierten mononukleären Zellen o<strong>de</strong>r<br />
auch noch weiter fraktioniert Stammzellen<br />
<strong>für</strong> eine spätere Nutzung ablegen.<br />
Alle drei Varianten bedürfen <strong>de</strong>r<br />
Kryokonservierung und bei <strong>de</strong>n zu<br />
erwarten<strong>de</strong>n Probenzahlen <strong>de</strong>r hier<br />
diskutierten Kryotechnologie.<br />
Von ausschlaggeben<strong>de</strong>r Be<strong>de</strong>utung <strong>für</strong><br />
die Tieftemperaturlagerung von humanen<br />
Stammzellen ist die kontaminationsfreie<br />
und verlustfreie Ablage bei<br />
gleichzeitig höchster Überlebensrate<br />
nach <strong>de</strong>m Auftauen. Die am IBMT<br />
da<strong>für</strong> entwickelten Kryosubstrate bieten<br />
zu<strong>de</strong>m <strong>de</strong>n Vorteil einer Teilentnahme<br />
ohne Erwärmung <strong>de</strong>s Restbestan<strong>de</strong>s<br />
bei kleinstmöglichem Volumen.<br />
Eine regenerative Medizin ohne<br />
Kryobanken mit Lagerzeiten über Jahrzehnte<br />
ist daher nicht <strong>de</strong>nkbar und<br />
praktikabel.<br />
16<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik
Adulte Stammzellisolate aus exokrinem<br />
Gewebe aus kryotechnologischer<br />
Sicht<br />
Bislang wur<strong>de</strong>n adulte Stammzellen<br />
unter an<strong>de</strong>rem aus <strong>de</strong>m Knochenmark,<br />
<strong>de</strong>r Leber, <strong>de</strong>m Gehirn und <strong>de</strong>m Blut<br />
isoliert. Die IBMT-Arbeitsgruppe »Zelldifferenzierung<br />
& Zelltechnologie« an<br />
<strong>de</strong>r Universität zu Lübeck i<strong>de</strong>ntifizierte<br />
und publizierte eine alternative und<br />
neue Quelle <strong>für</strong> adulte Stammzellen,<br />
die exokrinen Drüsen entstammen und<br />
neben ihren Wachstums- und Differenzierungseigenschaften<br />
sehr gute<br />
Ergebnisse bei <strong>de</strong>r Kryokonservierung<br />
zeigen. Beson<strong>de</strong>rs differenzierungsfreudige<br />
Stammzellen wur<strong>de</strong>n aus exokrinen<br />
Gewebeteilen <strong>de</strong>r Bauchspeicheldrüse<br />
isoliert, die als Stammzellquellen<br />
bisher nicht in ausreichen<strong>de</strong>m<br />
Maße berücksichtigt wur<strong>de</strong>n. Die daraus<br />
isolierten Zellen zeigen jedoch, wie<br />
nachfolgend erläutert wird, überaus<br />
interessante Eigenschaften.<br />
Aus <strong>de</strong>n Primärkulturen über spontane Differenzierung sich entwickeln<strong>de</strong> Gewebekörper in einer Kulturschale (links)<br />
und im gefärbten Gewebeschnitt (rechts).<br />
Für die Ablage von Stammzellen und Gewebekörpern geeignete, miniaturisierte Substrate mit elektronischem Speicherchip,<br />
<strong>de</strong>nen im tiefgekühlten Zustand einzelne Depots (Wells von einigen µl ) entnommen wer<strong>de</strong>n können, ohne<br />
die Restprobe erwärmen zu müssen. Pro Well lassen sich bis zu 1 Million Zellen unterbringen.<br />
Die aus Ratten, Mäusen, aber auch<br />
menschlichem Gewebe isolierten Zellen<br />
wer<strong>de</strong>n seit mehr als 2 Jahren im<br />
Labor gezüchtet und bil<strong>de</strong>n unter<br />
beson<strong>de</strong>ren Bedingungen spontan<br />
gewebeähnliche Zellansammlungen<br />
aus, die als »organoi<strong>de</strong> Gewebekörper«<br />
zu bezeichnen sind. Fluoreszenzanalysen<br />
mittels markierter, hochspezifischer<br />
Moleküle und hochauflösen<strong>de</strong><br />
elektronenmikroskopische Schnitte<br />
wiesen darauf hin, dass sich Gewebetypen<br />
wie man sie in Nerven, Muskeln,<br />
Knorpeln, Drüsen und <strong>de</strong>r Haut<br />
fin<strong>de</strong>t herausbil<strong>de</strong>n. Das Beson<strong>de</strong>re an<br />
<strong>de</strong>n Zellen gegenüber an<strong>de</strong>ren adulten<br />
Stammzellkulturen ist ihre gute und<br />
stabile Kultivierbarkeit und ihre hervorragen<strong>de</strong><br />
Kryokonservierbarkeit ohne<br />
Einbuße <strong>de</strong>r Differenzierungspotenz.<br />
Viele Stammzelllinien än<strong>de</strong>rn ihr Verhalten<br />
nach einer Gefrierprozedur, so<br />
dass auch dieser Gesichtspunkt bezüglich<br />
eines späteren medizinischen Einsatzes<br />
berücksichtigt wer<strong>de</strong>n sollte.<br />
Ihre spontane Differenzierung im hängen<strong>de</strong>n<br />
Tropfen bis hin zu »organoi<strong>de</strong>n«<br />
Gewebeformationen von mehreren<br />
Millimetern Größe, in <strong>de</strong>nen sich<br />
Zelltypen aller drei Keimblätter und<br />
strukturierte Gewebebereiche ausbil<strong>de</strong>n,<br />
macht sie als Studienobjekt und<br />
alternative Stammzellquelle außeror<strong>de</strong>ntlich<br />
interessant.<br />
Es konnte darüber hinaus gezeigt wer<strong>de</strong>n,<br />
dass über geeignete Kultivierungs-<br />
und Differenzierungsschritte<br />
sehr <strong>de</strong>finiert die Differenzierung <strong>de</strong>r<br />
Zellen induziert wer<strong>de</strong>n kann. Wie<br />
sonst nur bei embryonalen Stammzellkulturen<br />
beobachtet, bil<strong>de</strong>n die Zellkulturen<br />
»dreidimensionale Gewebekörper«<br />
aus, die ihrerseits wie<strong>de</strong>r in stabile,<br />
sich selbst vermehren<strong>de</strong> Differenzierungskulturen<br />
überführt wer<strong>de</strong>n können.<br />
Auch diese immerhin mehrere<br />
Millimeter großen Gewebekörper lassen<br />
sich kryokonservieren und nach<br />
<strong>de</strong>m Auftauen in Oberflächenkulturen<br />
überführen, aus <strong>de</strong>nen sich weitere<br />
organoi<strong>de</strong>- und Gewebekörper herausbil<strong>de</strong>n.<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik 17
näher gekommen. Auch <strong>für</strong> das Tissue<br />
Engineering stehen damit in Kürze<br />
neue, adulte Stammzellkulturen und<br />
-linien verschie<strong>de</strong>nster Herkunft zur<br />
Verfügung.<br />
(a) Organoi<strong>de</strong>r Körper mit ekto<strong>de</strong>rmaler Stammzellmarkierung (Pax6 – rot, CD44 – grün), (b) Aus pankreatischen<br />
Stammzellen differenzierte Zellen mit zytoplasmatischen Strukturen in hoher lichtmikroskopischer Auflösung, die die<br />
gute Differenzierbarkeit belegen.<br />
Bemerkenswert ist, dass diese Gewebeschichtungen<br />
in <strong>de</strong>n Kulturschalen<br />
über Monate weiter wachsen und<br />
Gewebekomposite von einigen Millimetern<br />
Größe hervorbringen, in <strong>de</strong>nen<br />
sich Zellen und Zellformationen mit<br />
Eigenschaften <strong>de</strong>s Meso-, Ekto- und<br />
Endo<strong>de</strong>rms fin<strong>de</strong>n.<br />
Die Wachstums-, Differenzierungs- und<br />
Kryokonservierungsergebnisse besitzen<br />
Mo<strong>de</strong>llcharakter <strong>für</strong> die Stammzellforschung,<br />
da offensichtlich auch im<br />
adulten Stammzellbereich sehr differenzierungsfreudige<br />
und pluripotente<br />
Zelltypen gewonnen, kultiviert und<br />
gelagert wer<strong>de</strong>n können. Für eine spätere<br />
Nutzung spielt es eine untergeordnete<br />
Rolle, ob es sich dabei um einen<br />
Stammzelltyp o<strong>de</strong>r ein Gemisch verschie<strong>de</strong>ner<br />
Precursor-Zellen han<strong>de</strong>lt.<br />
Entschei<strong>de</strong>nd ist, dass man in viele Zelltypen<br />
aller drei Keimblätter differenzieren<br />
kann. Man ist <strong>de</strong>r Vision, von vielen<br />
Tieren, aber auch <strong>de</strong>m Menschen<br />
ein expandierbares Stammzell<strong>de</strong>pot<br />
ausreichen<strong>de</strong>r Größe <strong>für</strong> eine spätere<br />
landwirtschaftliche, biotechnologische<br />
bzw. individuell-medizinische Nutzung<br />
anlegen zu können, einen Schritt<br />
In <strong>de</strong>r Kryobank <strong>de</strong>s IBMT in Sulzbach<br />
als auch in einer in <strong>de</strong>r Entwicklung<br />
befindlichen Tochterbank in Lübeck<br />
befin<strong>de</strong>t sich ein wachsen<strong>de</strong>r Bestand<br />
an Stammzellen, wie er <strong>für</strong> die Forschung<br />
und industrielle Nutzung<br />
benötigt wird. Interessenten können<br />
Zellkulturen in tiefgefrorener Form<br />
über die angegebene Adresse erwerben.<br />
Ausstattung<br />
• Grundausrüstung zur Isolation und<br />
Anlage von beliebigen In-vitro-Kulturen<br />
• Differenzierung und Analyse adulter<br />
Stammzellen<br />
• Mikroinjektionstechnik<br />
• Mikrodissektionstechnik<br />
• Kryobank mit Stammzellsammlung<br />
Kontakt<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische<br />
Technik (IBMT)<br />
Zelldifferenzierung & Zelltechnologie<br />
Universität zu Lübeck<br />
MFC Innovationscampus 1<br />
Maria-Goeppert-Straße 1<br />
23538 Lübeck<br />
Priv.-Doz. Dr. Charli Kruse<br />
Telefon: 0451 / 2903-210<br />
Fax: 0451 / 2903-213<br />
charli.kruse@ibmt.fraunhofer.<strong>de</strong><br />
18<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik
Fraunhofer-Technologieplattform<br />
Kryobiophysik & Kryotechnologie –<br />
Forschung und Entwicklung am <strong>Zentrum</strong> <strong>für</strong> Kryobiotechnologie<br />
Eine <strong>de</strong>r faszinierendsten Möglichkeiten<br />
<strong>de</strong>r Kryokonservierung ist sicherlich<br />
die Option <strong>de</strong>r retrospektiven Analyse<br />
leben<strong>de</strong>n biologischen Materials, also<br />
eine Verlagerung von <strong>de</strong>r gegenwärtig<br />
praktizierten sofortigen o<strong>de</strong>r zeitnahen<br />
Stichprobenanalyse und nachfolgen<strong>de</strong>n<br />
Ablage <strong>de</strong>r Daten hin zu einer<br />
Speicherung <strong>de</strong>r Proben und einer<br />
nachgelagerten Analyse bei Bedarf.<br />
Neben <strong>de</strong>n ökonomischen und infrastrukturellen<br />
Vorteilen bietet sich damit<br />
die einzigartige Möglichkeit, im Nachhinein<br />
(theoretisch Jahrzehnte später)<br />
eine Fragestellung nach aktuellem Wissens-<br />
und Technologiestand zu beantworten.<br />
Die prophylaktische Probenablage<br />
in Bezug auf unbekannte Seuchen,<br />
wie sie mit BSE, HIV o<strong>de</strong>r SARS<br />
in <strong>de</strong>n letzten bei<strong>de</strong>n Jahrzehnten in<br />
Erscheinung getreten sind, macht <strong>de</strong>n<br />
Vorteil und die Notwendigkeit einer<br />
retrospektiven Analyse biologischer<br />
Individualdaten <strong>de</strong>utlich. Sinnvoll und<br />
sicher ist dies aber nur, wenn umfassend<br />
beprobt wird (im I<strong>de</strong>alfall eine<br />
vollständige statistische Gesamtheit an<br />
Stelle <strong>de</strong>r bisher meist üblichen Stichproben).<br />
Dabei muss berücksichtigt wer<strong>de</strong>n,<br />
dass Individuenzahlen (sei es im humanmedizinischen,<br />
veterinärmedizinischen<br />
o<strong>de</strong>r pharmazeutisch-technischen<br />
Bereich) zur Ablage kommen,<br />
Mikro-Kryocontainer aus Silizium zur Aufnahme und<br />
späteren Fraktionierung von Suspensionströpfchen mit<br />
Zellen. In einem solchen Tropfen befin<strong>de</strong>n sich immerhin<br />
einige tausend bis zu zehntausend Zellen.<br />
Adaptives, miniaturisiertes Kryosubstrat <strong>für</strong> ein breites biologisches Probenspektrum. Wesentliche Vorteile <strong>de</strong>s neuen<br />
Ablagesystems sind die hohe erreichbare Packungsdichte an biologischen Proben, die Modularisierung <strong>de</strong>s Trägersystems<br />
<strong>für</strong> eine nichtinvasive Entnahme von Einzelproben und die absolut ein<strong>de</strong>utige Zuordnung von Datensätzen<br />
durch physische Kopplung von elektronischen Memory-Chips an die biologische Probe. Die Kopplung <strong>de</strong>r einzelnen<br />
Trägersysteme erfolgt durch unterschiedliche, zum Patent angemel<strong>de</strong>te Verfahren (z.B. Schiebesystem wie in <strong>de</strong>r<br />
Abbildung o<strong>de</strong>r Drehachsen-Substratstapel). In die Mikrocontainer können Zellsuspensionen, bewachsene Gewebe<br />
aber auch Biosubstrate abgelegt wer<strong>de</strong>n (Kreisbil<strong>de</strong>r rechts).<br />
die bei konservativen Schätzungen im<br />
Bereich mehrerer Hun<strong>de</strong>rttausend bis zu<br />
Millionen liegen. Derartige Probenzahlen<br />
sind mit <strong>de</strong>r aktuellen Probenbehältertechnologie<br />
nicht zu bewältigen.<br />
Die sich daraus ergeben<strong>de</strong> zentrale<br />
Aufgabenstellung <strong>de</strong>r Forschung am<br />
<strong>Zentrum</strong> <strong>für</strong> Kryobiotechnologie ist es,<br />
Prinzipien und Vorrichtungen <strong>für</strong> das<br />
parallele und auch selektive Einfrieren,<br />
Langzeitlagern, Auftauen, <strong>de</strong>r Teilentnahme<br />
von Material und das Verwalten<br />
einer Vielzahl von biologischen<br />
Proben (insbeson<strong>de</strong>re Zellsuspensionen)<br />
zu entwickeln und damit im Saarland<br />
eine im europäischen Umfeld einzigartige<br />
Konstellation aus Forschung<br />
und Entwicklung in Form einer Referenz-<br />
als auch Evaluations-Kryobank<br />
aufzubauen.<br />
Arbeitsgebiete und Forschungsfel<strong>de</strong>r<br />
Die gestellte Aufgabe erfor<strong>de</strong>rt ein<br />
Um<strong>de</strong>nken in <strong>de</strong>r Kryobiologie. Mit <strong>de</strong>r<br />
seit über 20 Jahren unverän<strong>de</strong>rten Art<br />
<strong>de</strong>r Lagerung, nämlich <strong>de</strong>r Ablage von<br />
Proben in Volumina im Milliliter-Bereich<br />
und darüber, können die Lagererfor<strong>de</strong>rnisse<br />
<strong>de</strong>r mo<strong>de</strong>rnen <strong>Biotechnologie</strong>n<br />
nicht erfüllt wer<strong>de</strong>n. Die Abteilung<br />
»Kryobiophysik & Kryotechnologie«<br />
hat <strong>de</strong>shalb <strong>de</strong>n Fokus auf die Entwicklung<br />
eines Basissystems (Kryosubstrat<br />
<strong>für</strong> Zellsuspensionen) <strong>für</strong> eine grundlegend<br />
neue Art <strong>de</strong>r Lagerung biologischer<br />
Proben gerichtet.<br />
Diese neuen Kryosubstrate weisen folgen<strong>de</strong><br />
Vorteile auf:<br />
– Down-Scaling <strong>de</strong>r Probenablage in<br />
<strong>de</strong>n Mikroliter- und Sub-Mikroliter-<br />
Bereich<br />
– Entnahme von Teilproben ohne ein<br />
Auftauen <strong>de</strong>r Restproben<br />
– Physikalisch gekoppelte Aufbewahrung<br />
<strong>de</strong>r biologischen und nichtbiologischen<br />
Information, d.h. eine<br />
Integration von Probe und Daten<br />
– Verringerung <strong>de</strong>r Temperaturgradienten<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik 19
Gewebeebene. Sie beschäftigt sich mit<br />
<strong>de</strong>r Aufbewahrung und <strong>de</strong>n Eigenschaften<br />
von leben<strong>de</strong>m biologischem<br />
Material bei tiefsten Temperaturen.<br />
Hochauflösen<strong>de</strong> elektronenmikroskopische Aufnahmen von Schnitten durch eine Zelle (Fibroblast) auf einem Substrat.<br />
Oben: bei 37 °C, unten: im tiefgefrorenen Zustand. Die hellen Bereiche stellen Eisdomänen dar und belegen die weitgehen<strong>de</strong><br />
Entmischung <strong>de</strong>s Zytoplasmas. Die Prozesse <strong>de</strong>r Reorganisation <strong>de</strong>r Zellflüssigkeit nach <strong>de</strong>r Erwärmung sind<br />
noch weitgehend unbekannt und ein interessantes Gebiet <strong>de</strong>r Kryobiophysik.<br />
Die Abteilung hat bereits mehrere<br />
Systeme zur Kryokonservierung als<br />
Funktionsmuster vorgestellt (siehe<br />
Abbildungen). Die Systeme bestehen<br />
zum einen aus neuen Hightech-Kunststoffen,<br />
die <strong>für</strong> <strong>de</strong>n gesamten Temperaturbereich<br />
<strong>de</strong>r Probenlagerung<br />
(d.h. +130 °C <strong>für</strong> die Sterilisation bis<br />
–196 °C, also <strong>de</strong>r Sie<strong>de</strong>temperatur <strong>de</strong>s<br />
flüssigen Stickstoffs) geeignet sind.<br />
Zum an<strong>de</strong>ren wur<strong>de</strong>n siliziumbasierte<br />
Mikrosysteme (siehe Abbildung<br />
»Mikro-Kryocontainer aus Silizium«)<br />
entwickelt, mit <strong>de</strong>nen eine weitere<br />
drastische Miniaturisierung <strong>de</strong>r Probenvolumina<br />
möglich wird. Auch in diesen<br />
kleinsten Containern befin<strong>de</strong>n sich<br />
noch Tausen<strong>de</strong> von Zellen mit <strong>de</strong>r<br />
Potenz zur späteren Vermehrung o<strong>de</strong>r<br />
auch vollständigen Charakterisierung<br />
einer Zellart.<br />
Gekoppelt wer<strong>de</strong>n diese Substrate mit<br />
evaluiertem bzw. modifiziertem elektronischem<br />
Flash-Speicher, <strong>de</strong>r<br />
Datenmengen bis zu einem Gigabyte<br />
(d.h. die Datenmenge von zwei CD-<br />
ROMs) aufnehmen und damit alle nur<br />
<strong>de</strong>nkbaren Informationen, die die in<br />
<strong>de</strong>n Substraten abgelegten Proben<br />
charakterisieren und beschreiben können<br />
(z.B. mikroskopische Aufnahmen<br />
und Vi<strong>de</strong>osequenzen, aber auch hochstrukturierte<br />
Datensätze), speichern<br />
kann. Der offensichtliche Vorteil, <strong>de</strong>r<br />
sich dadurch ergibt, ist die absolut ein<strong>de</strong>utige,<br />
weil physische Verbindung<br />
zwischen Probe und Datensatz. Im<br />
Gegensatz zu allen herkömmlichen<br />
Ansätzen, die aus <strong>de</strong>r rein logischen<br />
Kopplung zwischen Probe und Daten<br />
durch eine ID (ein<strong>de</strong>utige I<strong>de</strong>ntifikationsnummer)<br />
besteht, ist die Zuordnung<br />
zwischen Probe und Daten bei<br />
<strong>de</strong>m hier realisierten System zu je<strong>de</strong>m<br />
Zeitpunkt (auch bei Transport <strong>de</strong>r<br />
Probe) und unabhängig von <strong>de</strong>r informationstechnischen<br />
Infrastruktur<br />
(Datenbank) <strong>de</strong>finiert und gegeben.<br />
Die technologische Herausfor<strong>de</strong>rung<br />
liegt allerdings darin, dass <strong>de</strong>r Speicher<br />
<strong>de</strong>n gleichen Temperaturen wie die<br />
Probe ausgesetzt ist und standhält.<br />
Diese Herausfor<strong>de</strong>rung wird mit <strong>de</strong>r<br />
Entwicklung von Hardware <strong>für</strong> <strong>de</strong>n<br />
Einsatz bei Temperaturen unter<br />
–130 °C, also einer Tieftemperatur-<br />
Elektronik, beantwortet.<br />
Neben <strong>de</strong>r elektronischen Seite <strong>de</strong>r<br />
Entwicklung ergeben sich neue Forschungs-<br />
und Entwicklungsfel<strong>de</strong>r aus<br />
<strong>de</strong>n oben angegebenen vorteilhaften<br />
Eigenschaften <strong>de</strong>r neuen Kryosubstrat-<br />
Technologien.<br />
(1) Untersuchung zellulärer<br />
Kryoprozesse<br />
Eines <strong>de</strong>r wichtigsten Gebiete <strong>de</strong>r<br />
Kryobiophysik ist das Studium <strong>de</strong>r Prozesse<br />
beim Einfrieren biologischer Materialien<br />
auf molekularer und zellulärer<br />
Die mo<strong>de</strong>rne <strong>Biotechnologie</strong> benötigt<br />
die Ablage <strong>de</strong>r Proben in Mikrovolumina,<br />
was die Entwicklung <strong>de</strong>r neuen<br />
mikrosystembasierten Kryosubstrate<br />
und entsprechen<strong>de</strong> programmgesteuerte<br />
Kryokonservierungsverfahren<br />
sowie die Forschung im Gebiet Kryonanobiotechnologie<br />
erfor<strong>de</strong>rt. Die Kryobiophysik<br />
ist ein Forschungsgebiet,<br />
das, obwohl seit mehr als 50 Jahren<br />
existent, seine Be<strong>de</strong>utung erst in <strong>de</strong>n<br />
nächsten Jahrzehnten voll entfalten<br />
und ausbil<strong>de</strong>n wird.<br />
(2) Tieftemperatur-Elektronik<br />
Elektronische Speichermedien, die <strong>für</strong><br />
eine Lagerung o<strong>de</strong>r sogar einen Zugriff<br />
unter kryogenen Temperaturen zertifiziert<br />
wer<strong>de</strong>n, sind auf <strong>de</strong>m freien<br />
Markt nicht erhältlich und mittelfristig<br />
auch nicht zu erwarten, da thermische<br />
Optimierung von Elektronik heute hin<br />
zu hohen Temperaturen erfolgt. Es war<br />
daher notwendig, Messtechniken zu<br />
evaluieren und zu modifizieren, um<br />
elektronische Speicherschaltkreise und<br />
die dazugehörige Schaltungsperipherie<br />
unter kryogenen Temperaturen zu<br />
untersuchen. Ein Beispiel <strong>für</strong> eine <strong>de</strong>rartige<br />
Messtechnik ist die nun in <strong>de</strong>r<br />
Abteilung verfügbare infrarotbasierte<br />
Echtzeit-Thermographie, die das Temperaturverhalten<br />
von Speichermedien<br />
und <strong>de</strong>n zugehörigen Schreib-/Lese-<br />
Einrichtungen mit einer Genauigkeit<br />
bis zu 0,1 °C bei gleichzeitiger mikroskopischer<br />
Auflösung abbil<strong>de</strong>n kann.<br />
Diese Messtechnik steht auch <strong>für</strong><br />
an<strong>de</strong>re Fragen aus <strong>de</strong>r Biologie, Medizin<br />
und Technik zur Verfügung. Flankiert<br />
wer<strong>de</strong>n diese Systeme durch<br />
Hochgeschwindigkeitskameras, die es<br />
erlauben <strong>de</strong>n Gefriervorgang auch bei<br />
<strong>de</strong>r Tropfen- und Schockkühlung zu<br />
erfassen.<br />
20<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik
(3) Kryobioinformatik<br />
Neben <strong>de</strong>r elektronischen Realisierung<br />
von tieftemperaturfähigen Speichereinheiten<br />
müssen seitens <strong>de</strong>r Informatik<br />
neue Prinzipien entwickelt wer<strong>de</strong>n, um<br />
die Datenmengen und Informationen<br />
sicher und datengeschützt handhaben<br />
zu können. Beispielhaft sei hier die<br />
Definition von langzeittauglichen<br />
Datenformaten, die Entwicklung neuer<br />
Mo<strong>de</strong>llierungstechniken <strong>für</strong> hoch<br />
<strong>de</strong>zentralisierte und evolutive Datenbanken<br />
o<strong>de</strong>r die Erprobung temperaturoptimierter<br />
Kommunikationsprotokolle<br />
genannt.<br />
(4) Kryoequipment & Kryorobotik<br />
Eine beson<strong>de</strong>re Stellung nimmt das<br />
Themenfeld und die Arbeitsgruppe<br />
»Kryoequipment & Kryorobotik« am<br />
IBMT ein. Sie stellt technisch und<br />
inhaltlich <strong>de</strong>n Anschluss <strong>de</strong>r neuen<br />
miniaturisierten Technologien an die<br />
»Makrowelt« einer Kryobank her,<br />
in<strong>de</strong>m bisher nicht erhältliche, aber<br />
notwendige Technologien und Komponenten<br />
zur Manipulation und Lagerung<br />
<strong>de</strong>r »Mikro-Kryosysteme« entwickelt<br />
und gefertigt wer<strong>de</strong>n.<br />
Technologie <strong>für</strong> das automatisierte Einfrieren von biologischen<br />
Proben. Im Hintergrund automatisierte Pipettierstation<br />
(GeSIM, Großerkmannsdorf) zur Befüllung<br />
<strong>de</strong>r Mikrowellsubstrate (im Vor<strong>de</strong>rgrund).<br />
Wir entwickeln preiswerte und hochgenau<br />
arbeiten<strong>de</strong> Einfrier- und Auftausysteme,<br />
wie sie in <strong>de</strong>n Laboren <strong>de</strong>r<br />
<strong>Biotechnologie</strong>, entsprechen<strong>de</strong>r Firmen<br />
und Klinika benötigt wer<strong>de</strong>n. Die<br />
Fraunhofer-Hauben- und N 2 -Inkubator-<br />
Technik verhin<strong>de</strong>rn die Eisbildung und<br />
Entstehung von O 2 -Flüssigablagerungen<br />
in <strong>de</strong>n Kryotanks vollständig. In<br />
<strong>de</strong>r Folge ist keine Umlagerung <strong>de</strong>r<br />
Proben mehr notwendig.<br />
Kryotank <strong>de</strong>r Firma Messer mit Entnahmeturm <strong>de</strong>s<br />
Fraunhofer IBMT, <strong>de</strong>r das Vereisen <strong>de</strong>r Proben und <strong>de</strong>s<br />
Innenraumes vermei<strong>de</strong>t und die zur Entnahme ausgewählten<br />
Proben über Stun<strong>de</strong>n gekühlt zugriffsbereit<br />
hält.<br />
Kontakt<br />
Prof. Dr. Heiko Zimmermann<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische<br />
Technik (IBMT)<br />
Kryobiophysik & Kryotechnologie<br />
Ensheimer Straße 48<br />
66386 St. Ingbert<br />
Telefon: 06894 / 980-257<br />
Fax: 06894 / 980-400<br />
heiko.zimmermann@ibmt.fraunhofer.<strong>de</strong><br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik 21
(1) Kryobiophysik<br />
Adhärente Zellen nach einem vollständigen Einfrier- und Die neu entwickelten Kryosubstrate<br />
Auftauvorgang (digital eingefärbte Aufnahme mit <strong>de</strong>m<br />
haben aufgrund ihrer Miniaturisierung<br />
Rasterelektronenmikroskop). Die rot eingefärbte Zelle<br />
weist <strong>de</strong>utliche, irreparable Kryoschä<strong>de</strong>n auf.<br />
an<strong>de</strong>re Einfrier-/Auftaueigenschaften<br />
als industriell hergestellte Kryoprobenbehälter.<br />
Die Kryobiophysik am IBMT<br />
beschäftigt sich daher mit <strong>de</strong>r Testung<br />
<strong>de</strong>r verschie<strong>de</strong>nen Kryosubstrate, <strong>de</strong>r<br />
Mo<strong>de</strong>llierung <strong>de</strong>s Einfrierprozesses, <strong>de</strong>r<br />
funktionellen zellspezifischen Charakterisierung<br />
<strong>de</strong>r kryokonservierten Zellen,<br />
<strong>de</strong>r Beobachtung <strong>de</strong>r Regenerations-<br />
und Wachstumsprozesse, aber<br />
auch <strong>de</strong>s Absterbens <strong>de</strong>r Zellen<br />
(Apoptose und Nekrose) nach <strong>de</strong>m<br />
Auftauen. Die bisherigen Ergebnisse<br />
haben eine wesentliche Vermin<strong>de</strong>rung<br />
22 Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik<br />
<strong>de</strong>r z.T. toxischen Kryoprotektiva (z.B.<br />
<strong>de</strong>s bewährten DMSO) mit gleichzeitigem<br />
raschem Wachstum <strong>de</strong>r kryokonservierten<br />
Zellen nach <strong>de</strong>m Auftauen<br />
ermöglicht. Diese Art <strong>de</strong>r kryobiophysikalischen<br />
Forschung eröffnet neue und<br />
breite Anwendungsfel<strong>de</strong>r, insbeson<strong>de</strong>re<br />
<strong>für</strong> die Transplantations- und<br />
Stammzellmedizin. Die kryobiologische
Forschung in <strong>de</strong>r Abteilung Kryobiophysik<br />
& Kryotechnologie konzentriert<br />
sich auf die folgen<strong>de</strong>n Schwerpunkte:<br />
• Forschung und Entwicklung im<br />
Bereich <strong>de</strong>r Kryobiotechnologie<br />
• Entwicklung von kun<strong>de</strong>nspezifischen<br />
Kryoprozeduren<br />
• Kryokonservierung von biotechnologisch<br />
und medizinisch relevanten Zellen<br />
• Optimierung von Kryosubstraten<br />
• Strukturelle und funktionelle Charakterisierung<br />
<strong>de</strong>r kryokonservierten Zellen<br />
mithilfe von kombinierten mikroskopischen<br />
Verfahren: Lichtmikroskopie<br />
(inklusive Fluoreszenz-, Stereofluoreszenz-<br />
und Immunofluoreszenzmikroskopie),<br />
Raster- (REM) und<br />
Transmissionselektronenmikroskopie<br />
(TEM) <strong>de</strong>r gleichen Zellen<br />
• Zellspezifische Testung auf Bio- und<br />
Kryokompatibilität<br />
• Tieftemperaturelektronik<br />
• Informatik/Bioinformatik<br />
• Hochgeschwindigkeitsprozesse<br />
• Verkapselungsanlagen<br />
• Immunisolierte Alginatverkapselung<br />
Ausstattung<br />
• Tieftemperatur-Lagersystem mit<br />
medizinischer Zulassung<br />
• Programmierbare Einfrierautomaten<br />
• Thermographiesystem<br />
• Nano-Plotter zur Befüllung von<br />
Mikro-Kryosubstraten<br />
• Kryomikroskop<br />
• Stereofluoreszenz- und Durchlichtfluoreszenzmikroskop<br />
• Zugang zu REM und TEM<br />
• Zellbiologische Labore<br />
Optimiertes Kryoprotokoll (Graphoptimaler Temperaturverlauf zum Einfrieren tierischer und humaner Zellen). Hintergrund:<br />
Einzelzelle auf einem Substrat mit mo<strong>de</strong>raten Kryoschä<strong>de</strong>n.<br />
Kontakt<br />
Dr. Alisa Katsen-Globa /<br />
Prof. Dr. Heiko Zimmermann<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische<br />
Technik (IBMT)<br />
Kryobiophysik & Kryotechnologie<br />
Ensheimer Straße 48<br />
66386 St. Ingbert<br />
Telefon: 06894 / 980-259<br />
Fax: 06894 / 980-400<br />
alisa.katsen@ibmt.fraunhofer.<strong>de</strong><br />
Dipl.-Biol. Frie<strong>de</strong>rike Ehrhart /<br />
Prof. Dr. Heiko Zimmermann<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische<br />
Technik (IBMT)<br />
Kryobiophysik & Kryotechnologie<br />
Ensheimer Straße 48<br />
66386 St. Ingbert<br />
Telefon: 06894 / 980-258<br />
Fax: 06894 / 980-400<br />
frie<strong>de</strong>rike.ehrhart@ibmt.fraunhofer.<strong>de</strong><br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik 23
Molekulare Prozesse beim Einfrieren von Zellen<br />
1 4 7 10 13<br />
2 5 8 11 14<br />
3 6 9 12 15<br />
Beispiel <strong>für</strong> das Auftreffen (2), die nachfolgen<strong>de</strong> Bewegung<br />
(3-14) und das Gefrieren (15) eines Suspen-<br />
Von entschei<strong>de</strong>n<strong>de</strong>r Be<strong>de</strong>utung <strong>für</strong> die<br />
Entwicklung von Gefrier- und Auftauprozeduren<br />
sind die physikalischen und<br />
sionstropfens auf einer tiefgekühlten (–40 °C) Oberfläche.<br />
Wie man <strong>de</strong>r Bildfolge entnehmen kann, erfolgt<br />
das Gefrieren nicht sofort, son<strong>de</strong>rn erst nach einem<br />
biochemischen Prozesse innerhalb und<br />
sehr dynamischen Prozess <strong>de</strong>r Tropfenverformung, <strong>de</strong>n<br />
man <strong>für</strong> die Kryokonservierung von Zellsuspensionen außerhalb <strong>de</strong>r Zellen. Sie sind zwar in<br />
nutzen kann, weil er sehr <strong>de</strong>finiert abläuft (Fotoserie S. ihren Einzelheiten seit mehr als 50 Jahren<br />
gut untersucht, die Komplexität<br />
Schelenz, R. Hagedorn, Humboldt-Universität zu Berlin).<br />
<strong>de</strong>s Zytoplasmas als eine makromolekülreiche<br />
Gel-Sol-Elektrolytlösung<br />
verhin<strong>de</strong>rt bislang jedoch ein umfassen<strong>de</strong>s<br />
Gesamtverständnis. Im Folgen<strong>de</strong>n<br />
sollen kurz die wesentlichen Vorgänge<br />
ver<strong>de</strong>utlicht wer<strong>de</strong>n. Sehr gut<br />
lassen sich <strong>de</strong>rartige Prozesse beim<br />
<strong>de</strong>finierten Auftreffen von Flüssigkeitstropfen<br />
auf kalte Oberflächen untersuchen<br />
und beeinflussen, weshalb am<br />
IBMT umfangreiche Technik zur<br />
Mikrotropfenerzeugung und Hochgeschwindigkeitsaufnahme<br />
<strong>de</strong>r Tropfenbewegungen<br />
und <strong>de</strong>s Gefrierprozesses<br />
installiert wur<strong>de</strong>.<br />
24 Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik<br />
Die Prozesse innerhalb und um eine<br />
Zelle beim Einfrieren lassen sich entsprechend<br />
<strong>de</strong>n dargestellten Abbildungen<br />
in sechs Phasen einteilen.<br />
Phase 1 (Bild 1, Seite 25) zeigt eine<br />
tierische Zelle schematisch im physiologischen<br />
Temperaturbereich zwischen<br />
37 und 20 °C. Innen und außen erfolgen<br />
die Prozesse <strong>de</strong>r Signalankopplung<br />
und chemischen Bindung wohlabgestimmt.<br />
Phase 2 (Bild 2, Seite 25) zeigt die<br />
Zelle in einem Temperaturbereich<br />
zwischen 20 und –2 °C. Die Funktionsfähigkeit<br />
ist stark eingeschränkt. Stoffwechselvorgänge<br />
laufen wesentlich<br />
langsamer ab bzw. wer<strong>de</strong>n von <strong>de</strong>n<br />
Zellen abgeschaltet. Dieses Temperaturintervall<br />
ist daher zur Vorbereitung<br />
<strong>de</strong>s Einfrierens einer Zelle von hoher<br />
Be<strong>de</strong>utung.
Phase 3 (Bild 3) zeigt die Verhältnisse<br />
im Temperaturbereich zwischen –2 und<br />
–15 °C. Die Eisbildung beginnt in <strong>de</strong>r<br />
Regel an Nukleationskeimen in <strong>de</strong>r<br />
Außenlösung. Dies hat zur Folge, dass<br />
das Wasser aus <strong>de</strong>r Zelle herausgezogen<br />
wird (osmotische Effekte), was zu<br />
einer Zell<strong>de</strong>hydrierung und ihrem<br />
Schrumpfen führt. Wer<strong>de</strong>n mehr als<br />
30% <strong>de</strong>s Wassers entzogen, treten<br />
Schädigungen <strong>de</strong>r Zelle auf, die in <strong>de</strong>r<br />
Regel nicht vollständig reversibel sind.<br />
Durch die Wahl <strong>de</strong>r Medien und die<br />
Abkühlgeschwindigkeit kann dieser<br />
Prozess beeinflusst wer<strong>de</strong>n, woraus<br />
sich die zelltypischen Gefrierprotokolle<br />
ergeben.<br />
1<br />
2<br />
4<br />
5<br />
In Phase 4 (Bild 4) setzt bei einer Temperatur<br />
zwischen –15 und –25 °C die<br />
Eisbildung in <strong>de</strong>r Zelle ein. Es bil<strong>de</strong>n<br />
sich auch hier Eiskristalle, die zu einer<br />
Entmischung und Delokalisierung <strong>de</strong>r<br />
Zytoplasmabestandteile führen. Die<br />
Zugabe von Kryoschutzmitteln beeinflusst<br />
die Wasserstruktur und führt zur<br />
Bildung vieler kleiner statt weniger<br />
großer Eisbereiche, was sich als günstiger<br />
<strong>für</strong> die Kryokonservierung erweist.<br />
Das Volumen <strong>de</strong>r Eiskristalle ist um<br />
1/11 größer als das <strong>de</strong>r vorherigen<br />
Wasserphase, was zu mechanischem<br />
Stress führt. Die aufkonzentrierten<br />
Ionen an <strong>de</strong>n Eisfronten können zu<br />
beträchtlichen Potenzialgradienten<br />
führen, die ebenfalls schädigen<strong>de</strong><br />
Wirkungen zeigen können (Workman-<br />
Reynold-Effekt, dielektrischer Durchbruch<br />
<strong>de</strong>r Biomembran).<br />
3<br />
Schematische Darstellung <strong>de</strong>r wesentlichen Prozesse beim Einfrieren einer Zelle (rot) in einer Umgebungslösung (grün).<br />
1. Zelle unter Normaltemperatur (Rezeptorfunktion mit zytoplasmatischer Signaltransduktion).<br />
2. Zelle bei einer Temperatur zwischen 10 und – 0 °C. Reduzierter Stoffwechsel, kein Signaltransfer mehr.<br />
3. –2 bis –15 °C, extrazelluläre Eisbildung und Entwässerung <strong>de</strong>r Zelle.<br />
4. –15 bis –25 °C, intrazelluläre Eisbildung, Entmischung <strong>de</strong>s Zytoplasmas.<br />
5. –25 bis –130 °C, migratorisches Wachstum <strong>de</strong>r Eiskristalle.<br />
6. < –130 °C, Zelle als Festkörper ohne nennenswerte Verän<strong>de</strong>rung über lange Zeiträume.<br />
6<br />
Phase 5 (Bild 5) umfasst <strong>de</strong>n Temperaturbereich<br />
zwischen –25 und –130 °C.<br />
Sie ist geprägt durch das migratorische<br />
Wachstum großer Eiskristalle auf<br />
Kosten <strong>de</strong>r kleineren. Dieser Prozess<br />
<strong>de</strong>r Umkristallisation hat fatale Folgen,<br />
auch wenn er mit niedriger wer<strong>de</strong>n<strong>de</strong>r<br />
Temperatur immer langsamer abläuft.<br />
Trotz <strong>de</strong>r tiefen Temperaturen können<br />
Wassermoleküle aufgrund <strong>de</strong>r thermischen<br />
Stöße entsprechend k*T (wobei<br />
k die Boltzmann-Konstante und T die<br />
Temperatur ist) noch immer ihre Position<br />
wechseln, wodurch die großen Eisdomänen<br />
wachsen. Auch das schädigt<br />
die Zellen und ist <strong>de</strong>r Grund, warum<br />
man eine Kryoprobe nicht über Monate<br />
bei –80 °C aufbewahren sollte. Dieser<br />
Temperaturbereich ist daher rasch<br />
zu durchlaufen.<br />
In Phase 6 schließlich (Bild 6) kommen<br />
diese Prozesse unterhalb –130 °C<br />
nahezu vollständig zum Erliegen. Die<br />
Probe ist nun <strong>für</strong> Jahrzehnte und länger<br />
sicher. Daher erfolgen die Langzeitlagerung<br />
von Lebendproben bei –150<br />
°C und die Nutzung <strong>de</strong>s flüssigen<br />
Stickstoffs mit –196 °C als Kühlmittel.<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik 25
Lei<strong>de</strong>r kehren sich diese Prozesse beim<br />
Auftauen nicht um, son<strong>de</strong>rn laufen in<br />
und um die Probe erneut in <strong>de</strong>r bereits<br />
erläuterten Form ab. Dadurch erhöht<br />
sich die Belastung <strong>de</strong>r Zellen nochmals.<br />
Bei weitem sind noch nicht alle Effekte<br />
bekannt und eine Reihe von Zellen entzieht<br />
sich einer Kryokonservierung bis<br />
heute vollständig (z.B. große Eizellen,<br />
eine Reihe vakuolenhaltiger pflanzlicher<br />
Zellen). Dies alles zeigt, wie komplex<br />
und wichtig kryobiophysikalische<br />
Untersuchungen sind. Ohne eine fundierte<br />
Grundlagenforschung, die teils<br />
biologisch-biochemisch, teils physikochemischer<br />
Natur ist, lässt sich eine<br />
<strong>de</strong>finierte und automatisierte Kryokonservierung<br />
wohl nicht erreichen. Da die<br />
Größe und Beschaffenheit <strong>de</strong>r Zellen<br />
eine große Rolle spielen, muss <strong>für</strong> je<strong>de</strong><br />
Zellart ein <strong>für</strong> sie optimiertes Kryoprotokoll<br />
erarbeitet wer<strong>de</strong>n. In <strong>de</strong>r Abteilung<br />
Kryobiophysik & Kryotechnologie<br />
stehen Experten und Geräte <strong>für</strong> nahezu<br />
alle Aufgabenstellungen zur Verfügung.<br />
Neue Substrate <strong>für</strong> die Kryokonservierung. Test mit adhärent wachsen<strong>de</strong>n Zellen auf strukturierten<br />
Siliziumsubstraten (Kooperation mit Forschungszentrum Karlsruhe, Bil<strong>de</strong>r: A. Katsen-Globa, A. Welle).<br />
Kontakt<br />
Oben: Überblick über einen etwa 500 µm breiten Ausschnitt mit Zellen, die nur auf vorgegebenen,<br />
quadratischen Fel<strong>de</strong>rn anhaften können.<br />
Prof. Dr. Heiko Zimmermann<br />
Unten: Die Vorgabe <strong>de</strong>rartiger Anhaftbereiche <strong>de</strong>finiert die Zahl und Form <strong>de</strong>r Zellen.<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische<br />
Technik (IBMT)<br />
Kryobiophysik & Kryotechnologie<br />
Ensheimer Straße 48<br />
66386 St. Ingbert<br />
Telefon: 06894 / 980-257<br />
Fax: 06894 / 980-400<br />
heiko.zimmermann@ibmt.fraunhofer.<strong>de</strong><br />
26 Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik
(2) Tieftemperaturelektronik<br />
Kälteausbreitung an einem Mikrocontroller, bei Anlegen eines Temperaturgradienten (rot warm, blau kalt).<br />
Wärmeübertragung von einem Mikrocontroller auf die gekoppelten biologischen Proben. Deutlich erkennt man die<br />
Erwärmung durch die Wärmekapazität <strong>de</strong>s elektronischen Chips (rote Fläche unter <strong>de</strong>n Wells (blau)). Auch wenn es<br />
sich nur um wenige Grad o<strong>de</strong>r Bruchteile davon han<strong>de</strong>lt, müssen <strong>de</strong>rartige Gradienten eliminiert wer<strong>de</strong>n. Ein Echtzeit-Infrarot-Bolometer-System<br />
erlaubt dies in bildgeben<strong>de</strong>r Weise.<br />
Die Entwicklung eines intelligenten<br />
Kryosubstrats <strong>für</strong> ein neuartiges Kryobankkonzept<br />
stellt eine interdisziplinäre<br />
Herausfor<strong>de</strong>rung dar. Ziel ist es, ein<br />
Vertauschen <strong>de</strong>r Proben zu verhin<strong>de</strong>rn<br />
und eine sich selbst optimieren<strong>de</strong>, auf<br />
die Belange <strong>de</strong>r Kryokonservierung<br />
ausgerichtete Datenverwaltung zu<br />
ermöglichen. Die Hauptaufgabe im<br />
Bereich <strong>de</strong>r Tieftemperaturelektronik<br />
besteht in <strong>de</strong>r Entwicklung eingebetteter<br />
elektronischer Systeme, die als Einheit<br />
mit <strong>de</strong>n Probensubstraten eingefroren<br />
und dauerhaft unter Kryobedingungen<br />
eingelagert wer<strong>de</strong>n können.<br />
Neben einem Betriebstemperaturbereich<br />
von –130 °C bis hinunter zu<br />
–196 °C müssen die elektronischen<br />
Komponenten extreme Temperaturzyklen<br />
aushalten und in <strong>de</strong>r Lage sein,<br />
die aufkommen<strong>de</strong>n Daten zuverlässig<br />
und sicher zu speichern.<br />
Elektronische Speichermedien, die <strong>für</strong><br />
eine Lagerung o<strong>de</strong>r sogar einen Zugriff<br />
unter diesen Umgebungsbedingungen<br />
spezifiziert sind, wer<strong>de</strong>n im kommerziellen<br />
Sektor nicht angeboten. Für die<br />
Modifizierung und Evaluierung kommerzieller<br />
Elektronik unter tiefen Tem-<br />
peraturen wur<strong>de</strong> am IBMT umfangreiches<br />
Testequipment entwickelt und<br />
eingesetzt. Die entsprechen<strong>de</strong> Arbeitsgruppe<br />
verfügt über Tieftemperaturlagersysteme<br />
(bis –196 °C) mit medizinischer<br />
Zulassung, in <strong>de</strong>nen Langzeituntersuchungen<br />
durchgeführt wer<strong>de</strong>n<br />
können. Mit eigens modifizierten, programmgesteuerten<br />
Einfrierautomaten<br />
(bis –180 °C) wer<strong>de</strong>n Stressbelastungen<br />
simuliert und temperaturabhängige<br />
physikalische und funktionale<br />
Eigenschaften von elektronischen Bauteilen<br />
erforscht. Die messtechnische<br />
Ausstattung <strong>de</strong>r Labore umfasst Gerä-<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik 27
te zur digitalen und analogen Signalanalyse<br />
sowie zur Generierung von<br />
Testvektoren auf Hardwareebene. Ein<br />
Thermographiesystem (bis –40 °C)<br />
kommt bei <strong>de</strong>r Untersuchung <strong>de</strong>r sich<br />
negativ auswirken<strong>de</strong>n Wärmeübertragung<br />
von <strong>de</strong>r Elektronik auf das biologische<br />
Substrat zum Einsatz. Selbst<br />
entwickelte Heiz-/Kühltische (Peltierund<br />
Stickstoffkühlung) halten die Kryosubstrate<br />
während <strong>de</strong>r Messung unter<br />
<strong>de</strong>r Infrarotkamera auf niedriger Temperatur<br />
und lassen programmierte T-<br />
Verläufe zu. Ausgehend von <strong>de</strong>n Resultaten<br />
<strong>de</strong>r Evaluierung wird eine Modifizierung<br />
und spätere Zertifizierung von<br />
elektronischen Komponenten <strong>für</strong> <strong>de</strong>n<br />
Kryobereich möglich gemacht.<br />
Platine mit elektronischen Speicherchips im vollen<br />
Lese-/Schreib-Modus eingetaucht in <strong>de</strong>n flüssigen Stickstoff<br />
(–196 °C) eines durchsichtigen Dewargefäßes. Die<br />
blaue Leuchtdio<strong>de</strong>, ebenfalls im Stickstoff, zeigt <strong>de</strong>n<br />
gera<strong>de</strong> angesteuerten Memory-Chip an.<br />
Kontakt<br />
Dipl.-Ing. Frank Ihmig /<br />
Prof. Dr. Heiko Zimmermann<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische<br />
Technik (IBMT)<br />
Kryobiophysik & Kryotechnologie<br />
Ensheimer Straße 48<br />
66386 St. Ingbert<br />
Telefon: 06894 / 980-258<br />
Fax: 06894 / 980-400<br />
frank.ihmig@ibmt.fraunhofer.<strong>de</strong><br />
28 Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik
(3) Kryobioinformatik / ChameleonLab<br />
Die Fortschritte in <strong>de</strong>r Tieftemperaturelektronik<br />
ermöglichen mittlerweile die<br />
uneingeschränkte Funktion von Speicherchips<br />
unter Kryobedingungen.<br />
Damit ist es möglich, je<strong>de</strong>n Probenträger<br />
mit einem elektronischen Speicher<br />
zu versehen, <strong>de</strong>r die zu einer Probe<br />
gehören<strong>de</strong>n Daten enthält, und dieses<br />
intelligente Kryosubstrat in einem<br />
Kryotank <strong>für</strong> lange Zeit zu lagern.<br />
Probe und Information wer<strong>de</strong>n also<br />
physikalisch miteinan<strong>de</strong>r verbun<strong>de</strong>n<br />
gelagert. Diese Form <strong>de</strong>r Datenablage<br />
gewährleistet die Verwechslungssicherheit<br />
von Probe und Information und<br />
wird es notwendig machen, bereits in<br />
<strong>de</strong>n nächsten Jahren Millionen von<br />
<strong>de</strong>zentralen Datenträgern zu verwalten,<br />
die unterschiedliche Informationsstrukturen<br />
tragen können, abhängig<br />
von Zelltyp und jeweiliger Informationsanfor<strong>de</strong>rung<br />
zum Zeitpunkt <strong>de</strong>r<br />
Probenablage. Schwerpunkt <strong>de</strong>r Kryobioinformatik<br />
ist die Entwicklung adaptiver<br />
Datenbanken und adaptiver Softwaresysteme,<br />
die sich als <strong>für</strong> das<br />
Datenhandling in Kryobanken und<br />
Kryolabors erfor<strong>de</strong>rlich herausgestellt<br />
haben, weil sie die evolutiven Vorgänge<br />
in <strong>de</strong>n Informationsanfor<strong>de</strong>rungen<br />
adäquat umsetzen können.<br />
Vor diesem Hintergrund ist ChameleonLab<br />
entstan<strong>de</strong>n. In Zukunft wer<strong>de</strong>n<br />
Labore eine stets wachsen<strong>de</strong><br />
Anzahl verschie<strong>de</strong>nster Arbeitsabläufe<br />
(Workflows) beherrschen müssen, die<br />
teils aus neuen wissenschaftlichen<br />
Erkenntnissen hervorgehen wer<strong>de</strong>n<br />
und teils aus neuen Anwendungsgebieten<br />
<strong>für</strong> kryokonservierte Zellen<br />
resultieren wer<strong>de</strong>n. Labore wer<strong>de</strong>n<br />
Proben in einem bisher nicht gekannten<br />
Maß austauschen müssen, woraus<br />
sich die Notwendigkeit <strong>de</strong>r Austauschbarkeit<br />
und Kompatibilität von Workflow-Definitionen<br />
ergibt, aber auch ein<br />
hohes Verwechslungsrisiko entstehen<br />
kann. Austauschbarkeit von Workflow-<br />
Definitionen erfor<strong>de</strong>rt Unabhängigkeit<br />
von einem bestimmten Labor. Neben<br />
<strong>de</strong>m Austausch von Proben und Workflow-Definitionen<br />
spielt <strong>de</strong>r Austausch<br />
Vergleich von konventioneller Kryotechnologie und <strong>de</strong>r vom Fraunhofer IBMT neu entwickelten Kryotechnologie.<br />
Während ein durchschnittliches Zellvolumen in <strong>de</strong>r Größenordnung Picoliter liegt, fassen die kleinsten han<strong>de</strong>lsüblichen<br />
Kryoröhrchen Volumina im Milliliterbereich. Um das zukünftige Aufkommen an Zellproben zu bewältigen, ist<br />
eine Volumenreduktion <strong>de</strong>r Probengröße erfor<strong>de</strong>rlich und zu<strong>de</strong>m biologisch sinnvoll. Das gezeigte IBMT-Kryosubstrat<br />
enthält 30 Probentöpfchen zu jeweils 25 µl auf einer Grundfläche von 4 x 3 cm. In konventioneller Technologie wer<strong>de</strong>n<br />
die zu einer Probe gehören<strong>de</strong>n Daten in einer externen Datenbank gespeichert und über eine entsprechen<strong>de</strong> Probenbeschriftung,<br />
beispielsweise einen Barco<strong>de</strong>, referenziert. Im Gegensatz dazu wird an je<strong>de</strong>s IBMT-Kryosubstrat ein<br />
Speicherchip angekoppelt, <strong>de</strong>r gegenwärtig eine Kapazität bis zu einem Gigabyte erreichen kann. Sämtliche Probendaten,<br />
Vorgaben zu <strong>de</strong>n Arbeitsabläufen und Dokumentationsdaten wer<strong>de</strong>n auf diesem Chip gespeichert und können<br />
immer ein<strong>de</strong>utig <strong>de</strong>r angekoppelten Probe zugeordnet wer<strong>de</strong>n.<br />
Schematische Ansicht <strong>de</strong>r ChameleonLab-Prinzipien. Die Ansicht zeigt einen Probe-Chip-Verbund und eine Zellprobe<br />
mit einem zugehörigen Arbeitsablauf (»Workflow«). Die bei <strong>de</strong>r Probe auf <strong>de</strong>m Chip gespeicherte Workflow-Definition<br />
diktiert das »Verhalten« <strong>de</strong>s adaptiven Labors. Vor <strong>de</strong>r Prozessausführung wird das Labor gemäß <strong>de</strong>n Informationen<br />
auf <strong>de</strong>m Chip konfiguriert und initialisiert. Das Labor wird dabei von einem »Standby«-Zustand »LABOR« zu<br />
einem <strong>de</strong>finierten Zustand »LABOR*« hin umkonfiguriert. Eine Kryoprobe mit Chip kann also ein ChameleonLab-<br />
Labor spezifisch verän<strong>de</strong>rn und steuern. Effizienz und Probensicherheit wer<strong>de</strong>n signifikant erhöht.<br />
von Labor-Dokumentationsdaten eine<br />
weitere wesentliche Rolle.<br />
ChameleonLab ist ein adaptives<br />
Labormanagementsystem, das sich<br />
je<strong>de</strong>r beliebigen Probe anpasst, in<strong>de</strong>m<br />
sich das Labor gemäß <strong>de</strong>r Workflow-<br />
Definition konfiguriert. Die Ausführung<br />
<strong>de</strong>r Workflows wird durch ChameleonLab<br />
vollständig gesteuert und<br />
überwacht. ChameleonLab basiert<br />
auf <strong>de</strong>n folgen<strong>de</strong>n drei Prinzipien:<br />
– Die einer Probe zugeordneten Workflow-Definitionen<br />
wer<strong>de</strong>n bei <strong>de</strong>r<br />
Probe gespeichert, konkret beispiels-<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik 29
Bildschirmfoto <strong>de</strong>s ChameleonLab-Servers.<br />
weise auf <strong>de</strong>m angekoppelten Speicherchip.<br />
– Anstatt eine Referenz auf eine existieren<strong>de</strong><br />
Workflow-Definition (beispielsweise<br />
in einer Datenbank) zu<br />
sein, ist die Workflow-Definition eine<br />
<strong>de</strong>taillierte Definition aller Schritte<br />
<strong>de</strong>s Probenworkflows. Das be<strong>de</strong>utet,<br />
dass je<strong>de</strong>s Labor, das Chameleon-<br />
Lab verwen<strong>de</strong>t, auch solche Workflows<br />
ausführen kann, die <strong>de</strong>m Labor<br />
vor Ankunft einer Probe mit <strong>de</strong>r entsprechen<strong>de</strong>n<br />
Definition völlig unbekannt<br />
waren. Die Workflow-Definition<br />
ist so aufgebaut, dass sie auch <strong>für</strong><br />
direkte Geräteansteuerung verwen<strong>de</strong>t<br />
wer<strong>de</strong>n kann. Die Probe steuert<br />
somit das Verhalten <strong>de</strong>s Labors, von<br />
rein manuellen Labors bis hin zu vollautomatisierten<br />
Labors.<br />
– Die Dokumentationsdaten je<strong>de</strong>r<br />
Workflow-Durchführung wer<strong>de</strong>n bei<br />
<strong>de</strong>r Probe gespeichert.<br />
ChameleonLab ist seit Herbst 2003 in<br />
<strong>de</strong>r Forschungs-und Demonstrationskryobank<br />
<strong>de</strong>r Fraunhofer-Gesellschaft<br />
eurocryoSaar im Einsatz. Alle Kryolaboratorien<br />
wer<strong>de</strong>n von Chameleon-<br />
Lab auf die jeweils aktuelle Probe<br />
adaptiert und vollständig während<br />
eines Workflows gesteuert. Eine webbasierte<br />
Probendatenbank ist mit<br />
ChameleonLab verbun<strong>de</strong>n und synchronisiert,<br />
die das Definieren von<br />
Workflows erlaubt und Tieftemperatur-Speicherchips<br />
initialisieren kann.<br />
Bildschirmfoto eines ChameleonLab-Clients (hier<br />
Nanoplotter <strong>für</strong> DMSO-Zugabe).<br />
Kontakt<br />
Dipl.-Inform. Christopher Durst /<br />
Prof. Dr. Heiko Zimmermann<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische<br />
Technik (IBMT)<br />
Kryobiophysik & Kryotechnologie<br />
Ensheimer Straße 48<br />
66386 St. Ingbert<br />
Telefon: 06894 / 980-258<br />
Fax: 06894 / 980-400<br />
christopher.durst@ibmt.fraunhofer.<strong>de</strong><br />
30<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik
Kryoequipment & Kryorobotik<br />
Das Konzept <strong>de</strong>r <strong>Kryoforschungsbank</strong><br />
am IBMT öffnet neue Wege <strong>de</strong>r individuellen<br />
als auch massenhaften Kryokonservierung<br />
von Zellen. Die Qualität<br />
und Zahl <strong>de</strong>r Zellproben stellen neue<br />
Anfor<strong>de</strong>rungen an die Kryotechnik.<br />
Das im Vergleich zu konventionellen<br />
Banken geringe Volumen und beson<strong>de</strong>rs<br />
die hohe Zahl <strong>de</strong>r Proben machen<br />
automatisiertes Probenhandling unerlässlich<br />
<strong>für</strong> einen wirtschaftlichen<br />
Betrieb <strong>de</strong>r Bank. Gleichzeitig wird die<br />
Prozessqualität <strong>de</strong>r Probenlagerung<br />
gesteigert.<br />
Die gegenwärtig genutzten Techniken<br />
stammen häufig aus <strong>de</strong>m klinischen<br />
Bereich o<strong>de</strong>r <strong>de</strong>r Forschung. Sie sind<br />
personalintensiv und nicht geeignet <strong>für</strong><br />
die Bewältigung hoher Probenzahlen.<br />
Die Verfügbarkeit von Automatisierungslösungen<br />
in diesem Bereich stellt<br />
die Basistechnologie <strong>für</strong> eine Vielzahl<br />
neuer Automatisierungsmo<strong>de</strong>lle in <strong>de</strong>r<br />
Tieftemperatur-<strong>Biotechnologie</strong> dar.<br />
Die Weiterentwicklung von Kryoequipment<br />
unter diesen Gesichtspunkten<br />
schlägt technologisch die Brücke zwischen<br />
<strong>de</strong>n biophysikalischen Anfor<strong>de</strong>rungen<br />
und <strong>de</strong>n produktiven Rahmenbedingungen<br />
einer mo<strong>de</strong>rnen Kryobank.<br />
Angefangen von Einfrier-/Auftaugeräten<br />
<strong>für</strong> parallelen und hohen<br />
Probendurchsatz bis hin zu automatisierten<br />
Entnahmesystemen reicht die<br />
Palette <strong>de</strong>r IBMT-Entwicklungen, die<br />
<strong>für</strong> einen wirtschaftlichen und sicheren<br />
Betrieb einer Zellbank notwendig sind.<br />
Die Geräte müssen präzise unter Temperaturen<br />
funktionieren, die bisher<br />
allenfalls <strong>für</strong> seltene Anwendungsfälle<br />
wie die Supraleitung o<strong>de</strong>r die Satellitentechnik<br />
erfor<strong>de</strong>rlich waren. Die<br />
heute am Markt verfügbare Technologie<br />
im Bereich Robotik o<strong>de</strong>r Automatisierung<br />
ist <strong>für</strong> Temperaturen unterhalb<br />
–130 °C nicht einsetzbar und muss an<br />
entschei<strong>de</strong>n<strong>de</strong>n Stellen von Grund auf<br />
neu entwickelt wer<strong>de</strong>n. Beson<strong>de</strong>re<br />
Rahmenbedingungen sind hierbei zum<br />
Beispiel <strong>de</strong>r völlige Verzicht auf flüssige<br />
Schmiermittel und die Berücksichtigung<br />
<strong>de</strong>r unterschiedlichen physikalischen<br />
und elastischen Eigenschaften<br />
von Stoffen, z.B. Aus<strong>de</strong>hnungskoeffizient<br />
und Versprödung, bei extremen<br />
Temperaturän<strong>de</strong>rungen.<br />
Personalintensives Arbeiten mit <strong>de</strong>n<br />
Proben ist aufwendig und risikoreich,<br />
insbeson<strong>de</strong>re was die Verwechslungssicherheit<br />
betrifft. Roboter und Automation<br />
verhin<strong>de</strong>rn in einer kalten Stickstoffatmosphäre<br />
kritische Erwärmung<br />
und Kontamination und sichern die<br />
Qualität <strong>de</strong>r Prozesse im Umgang mit<br />
<strong>de</strong>n Proben in dokumentierbarer<br />
Weise.<br />
»Klassische« Probenentnahme mit über die Monate<br />
akkumulativer Eisbildung auf Oberflächen (Substrat,<br />
Container, Tankinneres) und Unterbrechung <strong>de</strong>r Kühlkette.<br />
CAD-Entwicklung eines Entnahmeturms (gekühlt mit<br />
»trockener« Stickstoffatmosphäre) mit Schleusenfunktion<br />
zur Verhin<strong>de</strong>rung <strong>de</strong>r Eisbildung bei <strong>de</strong>r gekühlten<br />
Probenentnahme. Im ersten Automatisierungsschritt auf<br />
einem Kryo-Lagertank.<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik 31
Über <strong>de</strong>r interdisziplinären Beantwortung<br />
Lösungselemente / Angebote<br />
32 Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik aller ingenieurwissenschaftlichen<br />
• Einfrier- und Befüllsysteme wie<br />
Pipettierer <strong>für</strong><br />
– Zellsuspensionen (Einbringung in<br />
unterschiedliche Substratformen<br />
(Schlauch, Töpfchen,...))<br />
und physikalischen Fragestellungen<br />
stehen die biologischen Anfor<strong>de</strong>rungen<br />
und damit das Ziel die Zellen mit<br />
optimalen Überlebensraten an die Nutzer<br />
zu übergeben.<br />
– Kryosubstrate zur Probenaufnahme<br />
aus unterschiedlichen Materialien<br />
wie Silizium und geeigneten Kunststoffen<br />
• Vereinzelungssysteme <strong>für</strong> die Probenseparierung<br />
aus <strong>de</strong>n Substraten bei<br />
tiefen Temperaturen<br />
• Kryotankequipment wie Schleusensysteme<br />
Das IBMT bietet seinen Partnern aus<br />
Wissenschaft und Industrie Erfahrung<br />
und Kompetenz in <strong>de</strong>n Bereichen<br />
Kryoprozesstechnik und Kryoequipment<br />
(selbstverständlich auch über <strong>de</strong>n<br />
Einsatz in <strong>de</strong>r <strong>Kryoforschungsbank</strong> hinaus)<br />
an.<br />
o<strong>de</strong>r Entnahmeturm zur<br />
Aufnahme und Bearbeitung <strong>de</strong>r Probensubstrate<br />
Angebote sind:<br />
in <strong>de</strong>r kalten Gasphase<br />
<strong>de</strong>s inerten Stickstoffgases (Abbildung)<br />
• Intelligente Storage-Systeme zum<br />
sicheren Transport <strong>de</strong>r Probe mit<br />
Flüssigstickstoffkühlung inhouse,<br />
aber auch zum Versand mit öffentlichen<br />
Verkehrsmitteln und Speditionen/Paketdiensten<br />
• Haubensysteme zur Sicherung <strong>de</strong>r<br />
Kühlkette und zur Verhin<strong>de</strong>rung von<br />
Reif- und Eisnie<strong>de</strong>rschlägen auf <strong>de</strong>n<br />
tiefkalten Oberflächen <strong>de</strong>r Kryoproben<br />
und -tanks<br />
• IT-Systeme zur Datenkommunikation<br />
• Entwicklung kryotechnologischer<br />
Prozesse im Temperaturbereich<br />
–196 °C bis +40 °C<br />
• Entwicklung von Kryoequipment<br />
im Temperaturbereich –196 °C bis<br />
–130 °C<br />
• Entwicklung von Sensorik zur<br />
Prozessüberwachung (Temperatur,<br />
Luftfeuchtigkeit,...) im Temperaturbereich<br />
–196 °C bis –130 °C<br />
• Prozessentwicklung <strong>für</strong> Probenlogistik<br />
• IT-Systeme zur Ablage und Kontrolle<br />
<strong>de</strong>r Probendaten<br />
mit <strong>de</strong>n tieftemperaturfesten Speicherchips<br />
Forschungs- und Entwicklungslabore<br />
• 160 m 2 Laborräume<br />
• Stickstoffanlagentechnik<br />
In <strong>de</strong>r Projektdurchführung sind die<br />
Mitarbeiter ein eingespieltes Team, eingebun<strong>de</strong>n<br />
in leistungsfähige, interne<br />
Instituts-Arbeitsgruppen wie:<br />
• Elektronikentwicklung<br />
• Werkstatt mit durchgängiger<br />
CAD/CAM-Struktur<br />
• Informationstechnologie und Softwareentwicklungsgruppe<br />
Serienmuster eines Entnahmeturms zur manuellen Entnahme.<br />
Über thermisch isolierte Handschuheingriffe<br />
kann auf tiefgekühlte Substratcontainer zugegriffen<br />
wer<strong>de</strong>n, ohne dass diese mit feuchter Atmosphäre in<br />
Berührung kommen o<strong>de</strong>r in un<strong>de</strong>finierter Weise<br />
erwärmt wer<strong>de</strong>n. Es muss darauf hingewiesen wer<strong>de</strong>n,<br />
dass bei einer Langzeitlagerung bereits eine Erwärmung<br />
über –80 °C zu zellschädigen<strong>de</strong>n Umkristallisierungen<br />
führt, Proben also auch bei kurzzeitiger Erwärmung im<br />
Gefrierbereich Verän<strong>de</strong>rungen unterliegen.<br />
Aus einem Liter flüssigen Stickstoffs bil<strong>de</strong>n sich bei <strong>de</strong>r<br />
Verdampfung einige hun<strong>de</strong>rt Liter Stickstoffgas. Dieser<br />
Effekt wird zur Erzeugung einer Stickstoffatmosphäre<br />
benutzt, in<strong>de</strong>m ein Flüssigreservoir an LN 2 <strong>für</strong> permanente<br />
Kühlung und Stickstoffgasproduktion sorgt, so<br />
dass die Hauben nicht gasdicht und <strong>de</strong>nnoch als Steril-<br />
Inkubatoren genutzt wer<strong>de</strong>n können. Das System ist<br />
über Schleusen von <strong>de</strong>r Seite o<strong>de</strong>r oben be- und entsorgt.
Doppelwandige<br />
Haube<br />
Isolierter<br />
Container<br />
Temperaturkontrollierter<br />
Arbeitsbereich von<br />
+30 °C bis zu – 196 °C<br />
eurocryo-Einfrierautomat unter Verwendung <strong>de</strong>r Haubentechnologie zur Vermeidung<br />
von Reif- und Oberflächeneisbildung <strong>für</strong> Temperaturregelungen bis 0,1 °C Genauigkeit.<br />
Haubentechnologie zum kontaminationsfreien Arbeiten bei frei wählbaren Temperaturen<br />
in gut isolierten Kryoboxen ohne Beschlagen <strong>de</strong>r Proben und Nebelbildung, eine<br />
Entwicklung <strong>de</strong>s IBMT. Die Hauben-Kühlbox-Systeme können entwe<strong>de</strong>r manuell o<strong>de</strong>r<br />
automatisch mit flüssigem Stickstoff in einer saugfähigen Matrix über Stun<strong>de</strong>n gekühlt<br />
wer<strong>de</strong>n. Vom Bo<strong>de</strong>n zur Haube entwickelt sich rasch ein stabiler Temperaturgradient<br />
von –196 °C unten zu +20 °C oben. Auf Ablagen in verschie<strong>de</strong>ner Höhe können auf<br />
diese Weise Zellproben bei je<strong>de</strong>r gewünschten Temperatur gelagert und bearbeitet<br />
wer<strong>de</strong>n. Das System ist preiswert und lässt sich zu einem parallelen Gefrier-/Auftauautomaten<br />
erweitern. Es stellt damit ein Grundgerät zukünftiger Kryolabore in <strong>Biotechnologie</strong><br />
und Medizin dar.<br />
Kontakt<br />
Dipl.-Phys. Uwe Schön<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische<br />
Technik (IBMT)<br />
Kryoequipment & Kryorobotik<br />
Industriestraße 5<br />
66280 Sulzbach<br />
Telefon: 06897 / 9071-30<br />
Fax: 06897 / 9071-99<br />
uwe.schoen@ibmt.fraunhofer.<strong>de</strong><br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik 33
Kryoforschungs- und Demonstrationsbank –<br />
Langzeitlagerung leben<strong>de</strong>r Zellproben<br />
kontaminationsfrei gelagert wer<strong>de</strong>n.<br />
Dabei kommen mo<strong>de</strong>rnste Datenverarbeitungstechnologien<br />
zum Einsatz, die<br />
alle Auflagen <strong>de</strong>s Datenschutzes (z.B.<br />
im Zusammenhang mit <strong>de</strong>m Umgang<br />
mit Patientendaten) erfüllen und einen<br />
schnellen und sicheren Proben- und<br />
Datenzugriff ermöglichen.<br />
Ein Blick in die Kryolagerhalle. Je<strong>de</strong>r Kryo-Lagertank ist an die automatische Versorgung mit flüssigem Stickstoff angeschlossen.<br />
Kryolagerbehälter mit Tankcomputer-Grun<strong>de</strong>inheit <strong>de</strong>r<br />
Kryobanken. Hierin lagern tausen<strong>de</strong> kryokonservierter<br />
Zellproben wie in einer überdimensionalen Thermoskanne<br />
bei Temperaturen unter –130 °C in <strong>de</strong>r Gasphase.<br />
Sollten sich die regenerative Medizin<br />
und die sich aus diesem Ansatz entwickeln<strong>de</strong>n<br />
Behandlungsmetho<strong>de</strong>n in<br />
<strong>de</strong>r Weise entwickeln, wie es sich<br />
gegenwärtig abzeichnet, wird – wie<br />
bereits erläutert – in naher Zukunft ein<br />
enormer Bedarf an vorübergehen<strong>de</strong>r<br />
als auch langfristiger Lagerung leben<strong>de</strong>r<br />
Zellen in Form von Zellsuspensionen<br />
und Gewebesegmenten bestehen.<br />
Neben <strong>de</strong>r medizinischen Nutzung<br />
wird unverän<strong>de</strong>rtes Zellmaterial <strong>für</strong><br />
Forschungszwecke, <strong>für</strong> kommerzielle<br />
Nutzungen und <strong>für</strong> hoheitliche Aufgaben<br />
(z.B. Gesundheits<strong>für</strong>sorge), zur<br />
Erfassung von Verän<strong>de</strong>rungen im<br />
Genom und letztendlich <strong>de</strong>r durch <strong>de</strong>n<br />
Menschen beeinflussten Umwelt<br />
benötigt. Auf Basis <strong>de</strong>r am Fraunhofer<br />
IBMT auf diesem Gebiet entwickelten<br />
Technologie können in kurzer Zeit,<br />
standardisiert und mit höchster Qualität<br />
Kryobanken aufgebaut und mit<br />
Referenz zum <strong>Zentrum</strong> <strong>für</strong> Kryobiotechnologie<br />
(eurocryoSaar) betrieben<br />
wer<strong>de</strong>n. Nur auf diese Weise kann die<br />
enorme Zahl miniaturisierter Einzelproben<br />
nach mo<strong>de</strong>rnsten Richtlinien verarbeitet<br />
und verwechslungs- sowie<br />
Ohne die Kryokonservierung von Zellund<br />
Gewebeproben, d.h. die Lagerung<br />
leben<strong>de</strong>r Proben, ist die Anwendung<br />
einer molekularen o<strong>de</strong>r zellulären <strong>Biotechnologie</strong><br />
im großindustriellen Maßstab<br />
riskant, wahrscheinlich sogar<br />
unmöglich. Das Fraunhofer IBMT mit<br />
seinem <strong>Zentrum</strong> <strong>für</strong> Kryobiotechnologie<br />
ist gegenwärtig weltweit die einzige<br />
Forschungseinrichtung, die Tieftemperatur-Technologien<br />
im industriellen<br />
Maßstab <strong>für</strong> die <strong>Biotechnologie</strong> und<br />
Medizin entwickelt. eurocryoSaar, die<br />
Kryobank am Fraunhofer IBMT, fungiert<br />
als Referenz-, Forschungs- und<br />
Rückstellprobenbank sowie Technologiedrehscheibe<br />
<strong>für</strong> die Forschung und<br />
Wirtschaft in Deutschland und Europa.<br />
Kryotechnologische Neuerungen, die<br />
in <strong>de</strong>r Abteilung Kryobiophysik & Kryotechnologie<br />
am Fraunhofer IBMT entwickelt<br />
wer<strong>de</strong>n, können sofort und im<br />
industriellen Maßstab in <strong>de</strong>r Kryobank<br />
in Sulzbach erprobt und <strong>für</strong> Nutzer<br />
modifiziert wer<strong>de</strong>n. Die Forschungsbank<br />
trägt neben <strong>de</strong>r Funktion als<br />
Bioressource <strong>de</strong>n Charakter einer<br />
Mo<strong>de</strong>ll- und Demonstrationsbank.<br />
Ausstattung <strong>de</strong>r Kryobank<br />
Aufgrund <strong>de</strong>r erfor<strong>de</strong>rlichen Lagertemperatur<br />
unter –130 °C ist die Kälteerzeugung<br />
aus elektrischer Energie ökologisch<br />
und ökonomisch gegenwärtig<br />
weniger günstig im Vergleich zur Kühlung<br />
mit flüssigem Stickstoff. Die Zellproben<br />
dürfen allerdings aus Grün<strong>de</strong>n<br />
<strong>de</strong>r Kontaminationsgefahr nicht ohne<br />
dichte Umhüllung in <strong>de</strong>n flüssigen<br />
Stickstoff eintauchen. Alternativ wer<strong>de</strong>n<br />
die Proben im Gasraum über<br />
einem See aus flüssigem Stickstoff in<br />
großen, aus E<strong>de</strong>lstahl gefertigten<br />
34<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik
Behältnissen, <strong>de</strong>n Kryolagerbehältern,<br />
aufbewahrt.<br />
In <strong>de</strong>r Fraunhofer-Kryobank eurocryo-<br />
Saar fin<strong>de</strong>n Kryolagerbehälter auf<br />
über 1 200 m 2 Stellfläche Platz. Die<br />
Behälter sind in eine vollautomatische,<br />
mehrfach abgesicherte Flüssigstickstoffversorgung<br />
eingebun<strong>de</strong>n. Ein<br />
zweifach redundantes System verhin<strong>de</strong>rt<br />
die unerwünschte Überfüllung <strong>de</strong>r<br />
Behälter. Alle stickstoffführen<strong>de</strong>n<br />
Gefäße, das sind <strong>de</strong>r große Stickstoffvorratsbehälter<br />
vor <strong>de</strong>r Halle, die Stickstoffzuleitungen<br />
und die Kryolagerbehälter,<br />
sind vakuumisoliert, was <strong>de</strong>n<br />
Verbrauch an Flüssigstickstoff und <strong>de</strong>n<br />
Kälteeintrag in die Kryohalle niedrig<br />
hält. Damit ist eine kostengünstige und<br />
kühlmitteloptimierte Lagerung ein Vorteil<br />
<strong>de</strong>r Sulzbacher Kryobank und ein<br />
Angebot <strong>für</strong> Fremdnutzer zur temporären<br />
Auslagerung von Proben.<br />
In <strong>de</strong>r Kryohalle ist eine Lüftungsanlage<br />
installiert, die pro Stun<strong>de</strong> viermal<br />
das gesamte Luftvolumen <strong>de</strong>r Halle<br />
austauscht. Dies ist erfor<strong>de</strong>rlich, da die<br />
Kryolagerbehälter aufgrund <strong>de</strong>s eingesetzten<br />
Kühlverfahrens mit Flüssigstickstoff<br />
beständig gasförmigen Stickstoff<br />
abgeben.<br />
Im normalen Betriebszustand ist dies<br />
völlig unproblematisch, da unsere<br />
Atemluft zu 78% aus Stickstoff<br />
besteht. Alle Räumlichkeiten, in <strong>de</strong>nen<br />
Flüssigstickstoff zum Einsatz kommt,<br />
sind mit einer Sauerstoffmangel-Überwachungsanlage<br />
ausgestattet. Sollte<br />
bei einem i. d. R. äußerst unwahrscheinlichen<br />
Störfall vermehrt Stickstoff<br />
freigesetzt wer<strong>de</strong>n und somit<br />
durch die damit verbun<strong>de</strong>ne Volumenverdrängung<br />
<strong>de</strong>r Atemluft <strong>de</strong>r Sauerstoffgehalt<br />
in einen <strong>für</strong> das Bedienungspersonal<br />
gesundheitskritischen<br />
Bereich absinken, wird die Lüftungsanlage<br />
auf <strong>de</strong>n doppelten bis vierfachen<br />
Luftdurchsatz geschaltet und die Stickstoffversorgung<br />
unterbrochen. Gleichzeitig<br />
gibt das Sicherheitssystem ein<br />
optisches und akustisches Warnsignal.<br />
Die Temperaturverläufe an <strong>de</strong>n Proben<br />
wer<strong>de</strong>n <strong>für</strong> <strong>de</strong>n Nutzer protokolliert.<br />
Für eine qualitätvolle Lagerung von<br />
Lebendproben <strong>für</strong> medizinische<br />
Anwendungen sind auch über Jahrzehnte<br />
lückenlose Temperatur-Zeitprofile<br />
zu for<strong>de</strong>rn, da auch eine kurzzeitige<br />
Erwärmung <strong>de</strong>n Verlust <strong>de</strong>r Zellvitalität<br />
und die Wertlosigkeit <strong>de</strong>r Probe<br />
zur Folge haben kann.<br />
Das Fraunhofer IBMT besitzt umfangreiche<br />
Erfahrung bei <strong>de</strong>r Konzeption<br />
und <strong>de</strong>r Baubegleitung von Kryobanken,<br />
wie sie an medizinischen Einrichtungen,<br />
biologischen Instituten, in <strong>de</strong>r<br />
Pharma- und <strong>Biotechnologie</strong>industrie,<br />
<strong>für</strong> kommerzielle Kryobanken sowie im<br />
Bereich öffentlicher Sammlungen<br />
benötigt wer<strong>de</strong>n.<br />
Laboreinrichtung<br />
Für alle im Umfeld <strong>de</strong>r Kryotechnologie<br />
erfor<strong>de</strong>rlichen Anwendungszwecke<br />
sind an die Kryobank angeglie<strong>de</strong>rte<br />
Labore erfor<strong>de</strong>rlich. Das sind zum Beispiel<br />
Labore zur Präparation medizinischer<br />
Proben und Labore <strong>für</strong> kontaminierte<br />
Zellsuspensionen. Hierzu entwickelt<br />
das IBMT Mustereinheiten, in<br />
<strong>de</strong>nen Neuentwicklungen verifiziert<br />
und <strong>für</strong> <strong>de</strong>n wissenschaftlichen und<br />
industriellen Einsatz angepasst wer<strong>de</strong>n.<br />
In <strong>de</strong>n modularen Laboreinheiten fin<strong>de</strong>n<br />
GMP-Standards und an<strong>de</strong>re Regelungen<br />
beim Umgang mit humanem<br />
und tierischem Material Berücksichtigung.<br />
Die eigentliche Behandlung <strong>de</strong>r Zellproben<br />
erfolgt in <strong>de</strong>n biologischen<br />
Laboren mit S1- bis S2-Sicherheitsstandard.<br />
In eigens da<strong>für</strong> entwickelten<br />
Laboreinheiten lassen sich Proben charakterisieren,<br />
Kryoprozeduren erproben,<br />
die Zellen hinsichtlich ihrer Vitalität<br />
und an<strong>de</strong>rer biologischer und<br />
medizinisch relevanter Parameter<br />
untersuchen und <strong>für</strong> die Tieftemperaturkonservierung<br />
vorbereiten.<br />
Vorratsbehälter <strong>für</strong> flüssigen Stickstoff (25 000 Liter) als<br />
Zentralversorgung <strong>für</strong> industriell skalierte Kryobanken.<br />
Vergleich <strong>de</strong>r kleinen herkömmlichen Kryoproberöhrchen<br />
mit <strong>de</strong>n am IBMT entwickelten miniaturisierten und<br />
Memory-Chip-kombinierten Substraten.<br />
Datenbanksystem<br />
Das zu erwarten<strong>de</strong> Probenaufkommen<br />
ist ohne die Hilfe eines außeror<strong>de</strong>ntlich<br />
flexiblen und sich selbst optimieren<strong>de</strong>n<br />
(evolutiven) Datenbanksystems nicht<br />
handhabbar. Einerseits müssen die Proben<br />
in <strong>de</strong>n Kryolagerbehältern systematisch<br />
eingelagert und in kürzester<br />
Zeit wie<strong>de</strong>rgefun<strong>de</strong>n wer<strong>de</strong>n. An<strong>de</strong>rerseits<br />
müssen auch die Daten, die an<br />
<strong>de</strong>n Proben gespeichert sind, aktualisiert<br />
und in einer externen Datenbank<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik 35
Steuerzentrale <strong>de</strong>r <strong>Kryoforschungsbank</strong> mit automatischer Überwachung und<br />
Versorgung von Kryobehältern.<br />
gespiegelt wer<strong>de</strong>n, damit ein schneller<br />
Zugriff und eine höchsten Anfor<strong>de</strong>rungen<br />
genügen<strong>de</strong> Datensicherheit<br />
gewährleistet wer<strong>de</strong>n können.<br />
Angebote<br />
• Einlagerung von biologischem Material<br />
<strong>für</strong> Forschungszwecke<br />
• Erprobung von kun<strong>de</strong>nspezifisch entwickeltem<br />
Kryoequipment (Substrate,<br />
Heiz-/Kühltische, Mikroskope etc.)<br />
• Erprobung von Kryoprozeduren<br />
• Design und Konzeption von Kryobanken<br />
• Beratung bei <strong>de</strong>r Mo<strong>de</strong>rnisierung<br />
vorhan<strong>de</strong>ner Kryobanken<br />
• Erprobung von Kryobankkonzepten<br />
Ausstattung<br />
• Mehr als 1 200 m 2 Stellplatz <strong>für</strong><br />
Kryobehälter<br />
• 25 000 l Vorratstank <strong>für</strong> Flüssigstickstoff<br />
• Vollautomatisches Nachfüllsystem <strong>für</strong><br />
Flüssigstickstoff<br />
• Sauerstoffmangelüberwachung<br />
• Vollautomatische Lüftungsanlage<br />
• Notstromversorgung<br />
• Einbruchmel<strong>de</strong>anlage mit GSM-<br />
Benachrichtigung<br />
• Mehrere physikalische und biologische<br />
Labore (Vorbereitung bis Sicherheitsstufe<br />
S2)<br />
• Vorbereitung <strong>für</strong> Laborcontainer (bei<br />
Bedarf höherer Sicherheitsstufen)<br />
Kontakt<br />
Dr. Frank Obergrießer<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische<br />
Technik<br />
<strong>Kryoforschungsbank</strong><br />
Industriestraße 5<br />
66280 Sulzbach<br />
Telefon: 06897 / 9701-90<br />
Fax: 06897 / 9071-99<br />
frank.obergriesser@ibmt.fraunhofer.<strong>de</strong><br />
36<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik
Historie<br />
Startschuss <strong>für</strong> die Kryo-<strong>Biotechnologie</strong><br />
im Saarland<br />
Am 29. Oktober 2002 wur<strong>de</strong> mit <strong>de</strong>r<br />
»Trilateralen Initiative <strong>für</strong> die <strong>Biotechnologie</strong>«<br />
ein Forschungsbündnis zwischen<br />
<strong>de</strong>r Universität <strong>de</strong>s Saarlan<strong>de</strong>s,<br />
<strong>de</strong>r Hochschule <strong>für</strong> Technik und Wirtschaft,<br />
<strong>de</strong>r saarländischen Lan<strong>de</strong>sregierung<br />
und <strong>de</strong>m Fraunhofer IBMT ins<br />
Leben gerufen, das die För<strong>de</strong>rung <strong>de</strong>r<br />
molekularen und zellulären <strong>Biotechnologie</strong><br />
zum Ziel hat. Im Rahmen dieser<br />
Forschungskooperation erhielt auch<br />
die Kryotechnologie maßgebliche<br />
Impulse.<br />
Bereits vor <strong>de</strong>m offiziellen Start dieser<br />
Initiative wur<strong>de</strong> vom Wirtschaftsministerium<br />
<strong>de</strong>s Saarlan<strong>de</strong>s am Fraunhofer<br />
IBMT die Einrichtung einer Kryobank<br />
durch <strong>de</strong>n Ausbau <strong>de</strong>s Standortes Sulzbach<br />
geför<strong>de</strong>rt.<br />
Vom Möbellager zum hochmo<strong>de</strong>rnen<br />
Zellsafe<br />
Vom Beginn <strong>de</strong>r Planung bis zur Einlagerung<br />
<strong>de</strong>r ersten Kryotestproben vergingen<br />
nur 15 Monate. In dieser Zeit<br />
wur<strong>de</strong> ein ehemaliges Möbellager in<br />
eine hochmo<strong>de</strong>rne und bisher weltweit<br />
einzigartige Kryobank umgestaltet.<br />
Von <strong>de</strong>r alten Halle sind nur das<br />
Stahlskelett und die innere Dachfläche<br />
erhalten. Das Dach, die Außenhaut,<br />
<strong>de</strong>r Bo<strong>de</strong>n und die gesamten gebäu<strong>de</strong>technischen<br />
Installationen wur<strong>de</strong>n<br />
durch zeitgemäße Materialien ersetzt.<br />
Vor <strong>de</strong>r Halle wur<strong>de</strong> ein großer Vorratsbehälter<br />
<strong>für</strong> Flüssigstickstoff errichtet,<br />
<strong>de</strong>r wegen <strong>de</strong>r technisch einfacheren<br />
Flüssigstickstoffversorgung auf<br />
einem Beton-Stahlfundament in vier<br />
Metern Höhe steht. Diese Mo<strong>de</strong>rnisierungsmaßnahmen<br />
und die zentraleuropäische<br />
Lage mit guter Anbindung<br />
an drei Autobahnen, <strong>de</strong>n Flughafen<br />
und das Eisenbahnnetz bieten eine<br />
i<strong>de</strong>ale Voraussetzung, die Funktion<br />
einer technologischen Drehscheibe<br />
auch auf europäischer Ebene zu<br />
spielen.<br />
Unterschrift unter <strong>de</strong>n Vertrag <strong>de</strong>r »Trilateralen Initiative« zur Entwicklung <strong>de</strong>r <strong>Biotechnologie</strong> im Saarland am 29.<br />
Oktober 2002 in <strong>de</strong>r saarländischen Staatskanzlei. Zwischen <strong>de</strong>r Fraunhofer-Gesellschaft, <strong>de</strong>n Hochschulen <strong>de</strong>s Saarlan<strong>de</strong>s,<br />
vertreten durch die Universität <strong>de</strong>s Saarlan<strong>de</strong>s und die Hochschule <strong>für</strong> Wirtschaft und Technik, sowie <strong>de</strong>r Lan<strong>de</strong>sregierung<br />
wur<strong>de</strong>n die För<strong>de</strong>rung <strong>de</strong>r Nanobiotechnologie und auch <strong>de</strong>r weitere Ausbau <strong>de</strong>r in Sulzbach befindlichen<br />
Kryobiotechnologie-Einrichtung beschlossen.<br />
(v.l.n.r. Professor Wolfgang Cornetz (Rektor <strong>de</strong>r Hochschule <strong>für</strong> Technik und Wirtschaft), Jürgen Schreier (Minister <strong>für</strong><br />
Bildung, Wissenschaft und Kultur <strong>de</strong>s Saarlan<strong>de</strong>s), Professor Hans-Jürgen Warnecke (Alt-Präsi<strong>de</strong>nt <strong>de</strong>r Fraunhofer-<br />
Gesellschaft), Doktor Hanspeter Georgi (Wirtschaftsminister <strong>de</strong>s Saarlan<strong>de</strong>s), Professor Margret Wintermantel (Präsi<strong>de</strong>ntin<br />
<strong>de</strong>r Universität <strong>de</strong>s Saarlan<strong>de</strong>s).<br />
Am 9. September 2003 stand die Kryohalle<br />
mit einer Vielzahl neu entwickelter<br />
Kryogerätschaften zur Nutzung<br />
bereit. Die Kryobank wur<strong>de</strong> in einem<br />
Festakt vom saarländischen Ministerpräsi<strong>de</strong>nten,<br />
Peter Müller, vom Präsi<strong>de</strong>nten<br />
<strong>de</strong>r Fraunhofer-Gesellschaft,<br />
Professor Hans-Jörg Bullinger, und <strong>de</strong>m<br />
Leiter <strong>de</strong>r Abteilung Gesundheit, Biowissenschaften<br />
und Nachhaltigkeit im<br />
Bun<strong>de</strong>sministerium <strong>für</strong> Bildung und<br />
Forschung, Ministerialdirektor Reinhard<br />
Junker, eröffnet.<br />
Bereits im ersten Jahr <strong>de</strong>r Nutzung<br />
besuchten namhafte Wissenschaftler<br />
und Politiker die Demonstrationsbank,<br />
um sich ein Bild von <strong>de</strong>r am IBMT entwickelten<br />
Technologie zu machen.<br />
Einen weiteren Höhepunkt in <strong>de</strong>r kurzen<br />
Geschichte <strong>de</strong>r Kryobank stellte<br />
<strong>de</strong>r Besuch <strong>de</strong>s Bun<strong>de</strong>spräsi<strong>de</strong>nten,<br />
Professor Horst Köhler, am 18. Dezember<br />
2004 dar. Über einen Vortrag und<br />
einen Rundgang in Begleitung <strong>de</strong>r<br />
Lan<strong>de</strong>sregierung <strong>de</strong>s Saarlan<strong>de</strong>s sowie<br />
lokaler politischer Vertreter ließ sich<br />
<strong>de</strong>r Bun<strong>de</strong>spräsi<strong>de</strong>nt die Anfor<strong>de</strong>rungen<br />
<strong>de</strong>r zukünftigen <strong>Biotechnologie</strong><br />
und <strong>de</strong>r erwarteten regenerativen<br />
Medizin erläutern und <strong>de</strong>monstrieren.<br />
Er würdigte <strong>de</strong>n fortschrittlichen <strong>Biotechnologie</strong>standort<br />
Saarland und die<br />
Technologieplattform <strong>de</strong>s Fraunhofer<br />
IBMT.<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik 37
Kryohalle während <strong>de</strong>r Sanierungsarbeiten <strong>de</strong>r Außenwän<strong>de</strong><br />
und <strong>de</strong>s Halleninnenbereichs.<br />
Außenansicht <strong>de</strong>r Kryoforschungs- und Demonstrationsbank eurocryoSaar <strong>de</strong>r Fraunhofer-Gesellschaft am Standort<br />
Sulzbach/Saar nach <strong>de</strong>r Fertigstellung.<br />
Die <strong>Kryoforschungsbank</strong> eurocryoSaar am Fraunhofer<br />
IBMT. Von <strong>de</strong>r Planung über die Realisierung ein Beispiel<br />
gelebten Technologietransfers von <strong>de</strong>r Forschung bis in<br />
die Praxis.<br />
38 Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik
Symbolischer Knopfdruck zur Inbetriebnahme <strong>de</strong>r <strong>Kryoforschungsbank</strong> im Rahmen <strong>de</strong>r<br />
Einweihungsfeier am 9. September 2003 durch <strong>de</strong>n Ministerpräsi<strong>de</strong>nten <strong>de</strong>s Saarlan<strong>de</strong>s,<br />
Herrn Peter Müller, <strong>de</strong>n Präsi<strong>de</strong>nten <strong>de</strong>r Fraunhofer-Gesellschaft, Herrn Professor<br />
Hans-Jörg Bullinger, und <strong>de</strong>n Leiter <strong>de</strong>r Abteilung Gesundheit, Biowissenschaften und<br />
Nachhaltigkeit im Bun<strong>de</strong>sministerium <strong>für</strong> Bildung und Forschung, Herrn Ministerialdirektor<br />
Reinhard Junker.<br />
Besuch von Professor Sir George Radda (MRC, CBE, FRS), Universität Oxford, am<br />
3. September 2004, <strong>de</strong>r in einem Vortrag die Be<strong>de</strong>utung <strong>de</strong>r Stammzellablage und die<br />
Organisation <strong>de</strong>r Britischen Stammzellbank erläuterte (v.l.n.r.: <strong>de</strong>r Ministerpräsi<strong>de</strong>nt <strong>de</strong>s<br />
Saarlan<strong>de</strong>s, Peter Müller, <strong>de</strong>r Gründungsdirektor <strong>de</strong>s IBMT, Professor Klaus Gerson<strong>de</strong>,<br />
Sir George Radda und die Präsi<strong>de</strong>ntin <strong>de</strong>r Universität <strong>de</strong>s Saarlan<strong>de</strong>s, Professor Margret<br />
Wintermantel).<br />
Besuch <strong>de</strong>s Bun<strong>de</strong>spräsi<strong>de</strong>nten, Professor Horst Köhler, in Begleitung <strong>de</strong>r saarländischen Lan<strong>de</strong>sregierung, am 18. Dezember 2004 in <strong>de</strong>r <strong>Kryoforschungsbank</strong>. Das Bild einer Größe<br />
von 2,5 MByte wur<strong>de</strong> während <strong>de</strong>s Besuches aufgenommen und zur Demonstration <strong>de</strong>r Tieftemperaturtauglichkeit <strong>de</strong>r am Fraunhofer IBMT entwickelten Elektronik fünfzig Mal in<br />
elektronische Speicherchips, die sich im flüssigen Stickstoff befan<strong>de</strong>n, abgelegt und wie<strong>de</strong>r ausgelesen. Wie das Bild zeigt, blieb die Datenmenge und damit die Qualität <strong>de</strong>s Bil<strong>de</strong>s<br />
unverän<strong>de</strong>rt.<br />
(v.l.n.r.: Jürgen Schreier (Minister <strong>für</strong> Bildung, Wissenschaft und Kultur <strong>de</strong>s Saarlan<strong>de</strong>s), Hans-Werner Zimmer (Bürgermeister <strong>de</strong>r Stadt Sulzbach), Professor Günter Fuhr (Direktor<br />
<strong>de</strong>s Fraunhofer IBMT), Frau Eva Luise Köhler, Professor Horst Köhler (Bun<strong>de</strong>spräsi<strong>de</strong>nt), Frau Astrid Gerke-Müller, Peter Müller (Ministerpräsi<strong>de</strong>nt <strong>de</strong>s Saarlan<strong>de</strong>s), Hans Ley (Präsi<strong>de</strong>nt<br />
<strong>de</strong>s saarländischen Landtages).<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik 39
Ausstattung, Angebote & Produkte<br />
Kryobiophysik & Kryotechnologie<br />
Ausstattung & Angebote<br />
• Tieftemperatur-Lagersysteme (bis<br />
– 196 °C) mit medizinischer Zulassung<br />
• Mikrokryosysteme<br />
• Modifizierte, programmierbare Einfrier-Automaten<br />
<strong>für</strong> biologische,<br />
materialwissenschaftliche und elektronische<br />
Applikationen<br />
• Zellbiologisches Labor<br />
• Modifizierte Forschungsmikroskope<br />
• Invertiertes Kryomikroskop (Eigenentwicklung,<br />
Peltier-basiert)<br />
• Kombiniertes Reflexions-/Rasterkraftmikroskop<br />
<strong>für</strong> Messungen biologischer<br />
Objekte in wässriger Umgebung<br />
• Test-Equipment (digital/analog) <strong>für</strong><br />
Tieftemperatur-Elektronik<br />
• Tieftemperatur-Messkammer <strong>für</strong><br />
Elektronik-/Materialtests<br />
• Thermographiesystem (Temperaturmessbereich<br />
–20 °C bis 250 °C)<br />
• Mikropipettiersystem/Automatisierungsplattform<br />
• »ChameleonLab«-basiertes Labormanagement<br />
• Hochgeschwindigkeitskamerasystem<br />
<strong>für</strong> mikrotropfenbasiertes Einfrieren<br />
• Infrarotlasersystem<br />
• Standard-Kryomikroskope<br />
• Tieftemperaturtaugliche Flash-<br />
Speichersysteme (lieferbar)<br />
Elektronik zum multiplen Betrieb von tieftemperaturtauglichen<br />
elektronischen Speichersystemen. Die Abbildung<br />
zeigt einen Zugriff auf Flash-Speicher, die im flüssigen<br />
Stickstoff (–196 °C) betrieben wer<strong>de</strong>n können.<br />
Das IBMT bietet <strong>de</strong>rartige Memory-Chips auch <strong>für</strong><br />
an<strong>de</strong>re Anwendungen an.<br />
Verschweißgerät <strong>für</strong> Proben. Das Gerät verschließt die<br />
mit einer Folie o<strong>de</strong>r einem Deckel verschlossenen Substrate<br />
dauerhaft und robust durch thermisches Verschweißen,<br />
ohne die Proben stärker als ein Grad zu<br />
erwärmen.<br />
Biomedizinische Ultrahochgeschwindigkeitsfotografie<br />
zur Optimierung von Schutzverkapselungen <strong>für</strong> Zellen<br />
<strong>für</strong> die Kryokonservierung.<br />
Neuartige, platzsparen<strong>de</strong> Kryosubstrate.<br />
Tieftemperatur-Messtechnik und Teststation <strong>für</strong> Tieftemperaturspeicher.<br />
40<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik
Kryoequipment & Kryorobotik<br />
Ausstattung & Angebote<br />
• Computergesteuerte Einfrier-Automaten<br />
• Kryotank-Entnahmesysteme<br />
• Probenhandling und Schleusensysteme<br />
• Kaltgasgeräte<br />
• Kryotransportbehälter<br />
(Eigenentwicklungen)<br />
• 20-Kanal-Kryo-Temperaturmesssysteme<br />
• Kryoroboter zum Probenhandling<br />
• LN 2 -Füllstand-Ultraschall-Messsysteme<br />
Universelle Haubentechnik zum Arbeiten unter trockener<br />
Stickstoffatmosphäre und im Temperaturintervall<br />
zwischen –196 °C und +40 °C. Low-Cost-Gefrierautomat.<br />
Am IBMT entwickelter Einfrierautomat zum computergesteuerten<br />
Einfrieren und Auftauen von Proben. Das<br />
System ist hochgenau, arbeitet leise und ist auf die<br />
Erfor<strong>de</strong>rnisse <strong>de</strong>r miniaturisierten Proben optimal<br />
angepasst.<br />
Nachwuchsgruppe »Kryo-Nanobiotechnologie« <strong>de</strong>s BMBF<br />
Ausstattung & Angebote<br />
• Mikroverkapselungsanlage (Crystal-<br />
Gun-Prinzip)<br />
• »Freezing-Spin-Coater« <strong>für</strong> das Frieren<br />
ultradünner Schichten (Eigenentwicklung)<br />
• Infrarotlasersystem <strong>für</strong> das hochlokalisierte<br />
und hoch<strong>de</strong>finierte Erwärmen<br />
dünner Schichten<br />
Verkapselungsanlage mit Crystal-Gun <strong>für</strong> die Alginat-<br />
Verkapselung als extrazelluläres Kryoprotektivum.<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik 41
<strong>Kryoforschungsbank</strong><br />
Ausstattung & Angebote<br />
Die Forschungs- und Demonstrationskryobank<br />
ist durch die folgen<strong>de</strong>n Ausstattungsmerkmale<br />
gekennzeichnet:<br />
• Tieftemperaturlagersysteme (–130<br />
bis –196 °C) mit medizinischer Zulassung<br />
• Programmierbare Einfrierautomaten<br />
• Zellbiologisches Labor<br />
• CO 2 -Inkubator<br />
• Nanoplotter<br />
• Ultratiefkühltruhe mit Kohlendioxid-<br />
Notkühlung<br />
• Sterilwerkbank<br />
• Zellkulturmikroskop <strong>für</strong> Hellfeld-,<br />
Phasenkontrast und variablen Reliefkontrast<br />
sowie Fluoreszenz<br />
• Hochsicherheitscontainer<br />
• Fileserver mit RAID-System<br />
• Test- und Entwicklungsserver<br />
• Datenbankserver mit RAID-Systemen<br />
und LTO-Bandlaufwerk<br />
• Sauerstoffmangelüberwachung<br />
• Einbruchmel<strong>de</strong>anlage<br />
• Notstromaggregat 15kVA<br />
• Vorratstank <strong>für</strong> 25 000 Liter Flüssigstickstoff<br />
Konzeption und Design von Kryokleinstbanken <strong>für</strong> biologische<br />
und medizinische Anwendungen.<br />
Konzeption und Design von industriell skalierten<br />
Kryobanken.<br />
Die gesamte Kryobank wird von einer Zentrale aus<br />
überwacht. Hier laufen alle Signale <strong>de</strong>r Kryolagerbehälter,<br />
<strong>de</strong>r Alarmanlage, <strong>de</strong>r Vi<strong>de</strong>oüberwachung und <strong>de</strong>r<br />
Lüftungsanlage zusammen.<br />
Die Kryolagertanks befin<strong>de</strong>n sich in einem Sicherheitsbereich.<br />
Nur wenige Mitarbeiter haben hier Zugang.<br />
Die Kryolagerbehälter sind in ein vollautomatisches<br />
Überwachungs- und Befüllsystem eingebun<strong>de</strong>n. Je<strong>de</strong>r<br />
Kryolagerbehälter ist mit einem Überwachungs-PC ausgestattet.<br />
42<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik
In <strong>de</strong>n biologischen Universallaboren wer<strong>de</strong>n die Zellproben<br />
unter sterilen Bedingungen in die Lagergefäße<br />
verfüllt und versiegelt.<br />
Der Aufbau <strong>de</strong>s Kryolabors orientiert sich am Durchlauf<br />
<strong>de</strong>r Proben in <strong>de</strong>r Kryobank. Somit kann ein hoher Probendurchsatz<br />
erreicht wer<strong>de</strong>n.<br />
Für die manuelle o<strong>de</strong>r auch automatische Befüllung <strong>de</strong>r<br />
Kryolagergefäße stehen Sterilbänke und Prozessautomaten<br />
zur Verfügung.<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik 43
Zusammenfassung <strong>de</strong>r Dienstleistungen am<br />
<strong>Zentrum</strong> <strong>für</strong> Kryobiotechnologie<br />
1. Kontrollierte und dokumentierte Ablage von Proben<br />
Sie besitzen eine eigene Kryobank. Dringend erfor<strong>de</strong>rliche<br />
Kapazitäten wer<strong>de</strong>n durch wenig genutzte Backups o<strong>de</strong>r<br />
Reserveproben blockiert. Wir lagern <strong>für</strong> Sie in einer <strong>de</strong>r<br />
mo<strong>de</strong>rnsten Kryobanken, in Ihren o<strong>de</strong>r in unseren Behältern,<br />
Ihre Proben ein. Sie erhalten eine vollständige Dokumentation<br />
und Überwachungsprotokolle bei garantiert sachgemäßer<br />
und zugangsreglementierter Handhabung und<br />
lückenloser Verwaltung.<br />
2. Anlage eines Sicherheits<strong>de</strong>pots<br />
Sie besitzen beson<strong>de</strong>rs wertvolle, nicht ersetzbare Bioproben.<br />
Die Lagerung an einem Ort wird mit steigen<strong>de</strong>r Probenzahl<br />
immer riskanter. Wir legen <strong>für</strong> Sie eine Sicherheitsbank, ggf.<br />
in einer Hochsicherheitstankkonfiguration an. Sie haben<br />
je<strong>de</strong>rzeit Zugriff und datengeschützten Zugang über unsere<br />
Kun<strong>de</strong>ndatenbank. Das IBMT ist führend auf <strong>de</strong>m Gebiet <strong>de</strong>s<br />
geschützten Datentransfers im Bereich <strong>de</strong>r ambulanten und<br />
klinischen Medizin. Eine Expertise, die wir in die Kryotechnologie<br />
einbringen. Unser Markenzeichen ist PaDok ® .<br />
3. Mo<strong>de</strong>rnisierung einer vorhan<strong>de</strong>nen Kryobank<br />
Sie besitzen eine Kryobank konventioneller Technologie und<br />
wollen diese mo<strong>de</strong>rnisieren. Wir bieten Ihnen vorhan<strong>de</strong>ne als<br />
auch spezifisch <strong>für</strong> Ihre Anwendung zu entwickeln<strong>de</strong> Kryosubstrate,<br />
Kryoequipment, Kryoautomaten und Kryodatenbanken<br />
an. Wir schaffen durch <strong>de</strong>n Einsatz miniaturisierter Substrate<br />
mit integrierten elektronischen Speicherchips freie Kapazität,<br />
Verwechslungssicherheit <strong>de</strong>r Proben und raschen Zugriff.<br />
4. Aufbau einer eigenen Kryobank<br />
Sie haben sich entschlossen, eine eigene Kryobank aufzubauen<br />
und benötigen sachkundige Unterstützung bei <strong>de</strong>r<br />
Planung, <strong>de</strong>m Bau und <strong>de</strong>r Entwicklung <strong>de</strong>r Bank an Ihrem<br />
Standort. Wir betreuen Sie aus technischer, administrativer,<br />
biologischer und medizinischer Sicht. Auf Wunsch erstellen<br />
wir Ihnen spezifische Pläne <strong>für</strong> Ihre Fragestellungen und<br />
erläutern Ihnen die Vorteile <strong>de</strong>r am Fraunhofer IBMT entwickelten<br />
Kryotechnologie vom zerlegbaren Substrat über<br />
die <strong>de</strong>finierte Temperaturprofilerfassung bis zum Auftauen<br />
<strong>de</strong>r Zellen. Ihre Bank wird <strong>für</strong> längere Zeit zu <strong>de</strong>n mo<strong>de</strong>rnsten<br />
<strong>de</strong>r Welt gehören. Unser Angebot reicht von <strong>de</strong>r Kleinbank<br />
im ambulanten Bereich über Forschungsbanken bis zu<br />
industriellen Großbanken.<br />
5. Anlage einer Sammlung<br />
Sie wollen eine Sammlung anlegen, scheuen jedoch die<br />
kostenintensive Installation und <strong>de</strong>n permanenten Betrieb<br />
einer Kryobank. Wir stellen Ihnen Fläche und Behälter zur<br />
exklusiven Nutzung zur Verfügung. Wenn Sie es wünschen,<br />
übernehmen wir auch Ihre Kryotanks komplett. Wir installieren<br />
Ihnen eine problembezogene Datenbank mit kun<strong>de</strong>nspezifischer<br />
Verwaltung, Suchportal etc.<br />
6. Lösung kryomedizinischer und kryobiologischer<br />
Aufgaben<br />
Sie wollen ein bestimmtes Zellmaterial lebend ablegen.<br />
Dabei treten technische o<strong>de</strong>r biologische Schwierigkeiten<br />
auf. Wir stellen Ihnen hochqualifiziertes, interdisziplinär<br />
geschultes Personal zur Verfügung. Über das IBMT-<strong>Zentrum</strong><br />
<strong>für</strong> Kryobiotechnologie und das Kompetenzzentrum MOTIV<br />
suchen wir im Rahmen schrittweise zu absolvieren<strong>de</strong>r Forschungs-<br />
und Entwicklungsprojekte nach einer Lösung <strong>für</strong><br />
Sie.<br />
7. Referenzen<br />
Sie benötigen eine sachkundige, neutrale Bewertung Ihrer<br />
Proben o<strong>de</strong>r Verfahren mit Bezug zur Kryotechnologie. Wir<br />
testen und prüfen Ihre Proben, Metho<strong>de</strong>n und Verfahren<br />
nach <strong>de</strong>n höchsten verfügbaren Standards und erstellen<br />
Prüfberichte, auf die Sie sich stützen können. Sie erhalten<br />
Hinweise über Probleme und, wenn möglich, Lösungsvorschläge.<br />
8. Datenbankentwicklung und –anpassung<br />
Sie benötigen <strong>für</strong> <strong>de</strong>n Auf- o<strong>de</strong>r Umbau Ihrer Kryobank ein<br />
adäquateres und flexibleres Datenbanksystem, das <strong>de</strong>n<br />
Anfor<strong>de</strong>rungen hinsichtlich eines schnellen, datengeschützten<br />
und verwechslungssicheren Zugriffs genügt. Wir entwickeln<br />
in Zusammenarbeit mit Ihnen und/o<strong>de</strong>r externen<br />
Partnern ein auf Ihre Bedürfnisse zugeschnittenes Datenbanksystem.<br />
9. Öffentlichkeit und wissenschaftliche Kontakte<br />
Die Fraunhofer-Gesellschaft hat einen hohen gesellschaftlichen<br />
und wissenschaftlichen Stellenwert sowie internationale<br />
Kontakte zur Industrie und Forschung in allen Kontinenten.<br />
Als Partner <strong>de</strong>r Fraunhofer-Gesellschaft beweisen Sie<br />
nicht nur Ihr Engagement <strong>für</strong> Wissenschaft und Forschung,<br />
son<strong>de</strong>rn erhalten Kontakte und Informationen, die ansonsten<br />
nur schwer zu bekommen sind. Mit über 11 000 Angestellten,<br />
Ingenieuren und Wissenschaftlern ist die Fraunhofer-Gesellschaft<br />
ein wichtiger Wirtschaftsfaktor. Über uns<br />
haben Sie hohe Kontaktchancen zu Entwicklern und potenziellen<br />
Kun<strong>de</strong>n.<br />
44<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik
Fraunhofer-Kryotechnologieplattform<br />
Kryobiophysik Kryosubstrate Kryoequipment Kryobank-Design<br />
Verständnis<br />
Optimierung<br />
Dokumentation<br />
<strong>de</strong>r Einfrier- und<br />
Auftauprozesse<br />
fraktionierbar<br />
miniaturisiert<br />
verwechslungssicher<br />
automatisierbar<br />
intelligent<br />
Befüllsysteme<br />
Heiz-Kühltische<br />
Kryomikroskope<br />
Transportbehälter<br />
Kryotanks<br />
Konzeption<br />
Automatisierung<br />
Datenbanken<br />
Probenverwaltung<br />
Sicherheit<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong><br />
Biomedizinische Technik (IBMT)<br />
Direktor<br />
Prof. Dr. Günter R. Fuhr<br />
Kryobiophysik & Kryotechnologie<br />
Prof. Dr. Heiko Zimmermann<br />
eurocryoSaar<br />
Dr. Frank Obergrießer<br />
Ensheimer Straße 48<br />
66386 St. Ingbert<br />
Telefon 0 68 94/980-100<br />
Fax 0 68 94/980-110<br />
Telefon 0 68 94/980-257<br />
Fax 0 68 94/980-400<br />
Industriestraße 5<br />
66280 Sulzbach<br />
guenter.fuhr@ibmt.fraunhofer.<strong>de</strong><br />
http://www.ibmt.fraunhofer.<strong>de</strong><br />
heiko.zimmermann@<br />
ibmt.fraunhofer.<strong>de</strong><br />
Telefon 0 68 97/9071-90<br />
Fax 0 68 97/9071-99<br />
frank.obergriesser@<br />
ibmt.fraunhofer.<strong>de</strong><br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik 45
Möglichkeiten <strong>de</strong>r Unterstützung gemeinnütziger<br />
Sammlungen – Kryotankspen<strong>de</strong> & Patenschaft<br />
Bereits über Tankspen<strong>de</strong>n finanzierte 1 400 l-Kryotanks in <strong>de</strong>r <strong>Kryoforschungsbank</strong> in Sulzbach. Auf Basis <strong>de</strong>r neuen<br />
Technologie können mehr als 100 000 Lebendproben isolierter Zellen in einem Tank abgelegt wer<strong>de</strong>n.<br />
Eine <strong>de</strong>r wichtigsten Aufgaben unserer<br />
Generation ist die Anlage von Lebendsammlungen<br />
zur Bewahrung und<br />
unverfälschten Weitergabe <strong>de</strong>r vorgefun<strong>de</strong>nen<br />
einzigartigen biologischen<br />
Artenvielfalt an unsere Kin<strong>de</strong>r und Kin<strong>de</strong>skin<strong>de</strong>r.<br />
Neben <strong>de</strong>r Technologieentwicklung<br />
und Erarbeitung kryobiophysikalischer<br />
Grundlagen legt das Fraunhofer<br />
IBMT daher auch wissenschaftliche<br />
Sammlungen gefähr<strong>de</strong>ter o<strong>de</strong>r seltener<br />
Organismen an. Diese Aktivität<br />
können Sie durch eine Spen<strong>de</strong> o<strong>de</strong>r die<br />
Finanzierung eines Kryotanks unterstützen.<br />
Zellsammlungen <strong>für</strong> die Zukunft<br />
Wir können nicht alles, was die Natur<br />
bietet und <strong>de</strong>r Mensch verän<strong>de</strong>rt, <strong>für</strong><br />
die nachfolgen<strong>de</strong>n Generationen<br />
dokumentieren und archivieren. Der<br />
Weg in das Zeitalter <strong>de</strong>r Genetik und<br />
<strong>de</strong>r autologen Medizin erfor<strong>de</strong>rt<br />
jedoch eine möglichst lückenlose Erfassung<br />
<strong>de</strong>r Biosphäre, einmal aus wissen-<br />
46 Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik<br />
schaftlicher Sicht sowie aus Sicherheitsgrün<strong>de</strong>n,<br />
zum an<strong>de</strong>ren als Reserve,<br />
aber auch als Lebendablage <strong>für</strong><br />
spätere Nutzungen. Die vollständige<br />
Datenerfassung eines noch so kleinen<br />
Organismus ist bisher noch nicht möglich.<br />
Sie gelingt zur Zeit nur, wenn<br />
repräsentative leben<strong>de</strong> Zellen, isoliert<br />
aus <strong>de</strong>m Gewebe o<strong>de</strong>r <strong>de</strong>m Blut unter<br />
Aufrechterhaltung <strong>de</strong>r Vitalität eingefroren<br />
wer<strong>de</strong>n. Die am Fraunhofer<br />
IBMT entwickelte, mikrosystembasierte<br />
Kryotechnologie in einer industriell<br />
skalierten Musterforschungsbank<br />
ermöglicht es nun, Lebend-Zellsammlungen<br />
in Form von Zellsuspensionen<br />
und kleinsten Gewebeteilen von<br />
erheblichem Wert <strong>für</strong> uns und künftige<br />
Generationen anzulegen und kostengünstig<br />
zu verwalten. Mit Hilfe <strong>de</strong>rartiger<br />
Lebendproben sind Verän<strong>de</strong>rungen<br />
im Erbgut, <strong>de</strong>r molekularen Ausstattung<br />
von Zellen, an Organellen o<strong>de</strong>r<br />
auch <strong>de</strong>r Ursprung von Krankheiten<br />
<strong>de</strong>s Menschen, <strong>de</strong>r Tiere o<strong>de</strong>r Pflanzen<br />
zurückverfolgbar und somit wesentlich<br />
schneller und effektiver erkenn- und<br />
korrigierbar. Auch die durch Wissenschaftler<br />
verän<strong>de</strong>rten Zellen können so<br />
bewahrt, hinterlegt und weltweit verfügbar<br />
gehalten wer<strong>de</strong>n. Die Kryobank-Technologie<br />
wird ohne Zweifel<br />
einen <strong>de</strong>r Grundpfeiler <strong>de</strong>r zukünftigen<br />
<strong>Biotechnologie</strong>, <strong>de</strong>r Pharmakologie<br />
und <strong>de</strong>r Medizin und damit <strong>de</strong>s Wohlstan<strong>de</strong>s<br />
und <strong>de</strong>r Sicherheit unseres<br />
Lan<strong>de</strong>s bil<strong>de</strong>n.<br />
Trotz <strong>de</strong>r enormen Kostenreduktion<br />
durch <strong>de</strong>n Einsatz mikrosystemgestützter,<br />
intelligenter Kryosubstrate und<br />
automatisierbarer Kryobankabläufe<br />
wirft <strong>de</strong>r parallele Aufbau <strong>de</strong>rartiger<br />
unikaler, <strong>für</strong> spätere Generationen<br />
essenzieller Lebendzellsammlungen<br />
Initialkosten auf, die von einem gemeinnützigen<br />
Forschungsinstitut wie<br />
<strong>de</strong>m IBMT nicht vollständig alleine<br />
getragen wer<strong>de</strong>n können.<br />
Zur Anlage von Bioressourcen <strong>de</strong>r<br />
Zukunft rufen wir Unternehmen,<br />
Organisationen – aber auch Privatper-
sonen – auf, einen Beitrag zur För<strong>de</strong>rung<br />
<strong>de</strong>r Biowissenschaften, insbeson<strong>de</strong>re<br />
im Bereich <strong>de</strong>r molekularen und<br />
zellulären <strong>Biotechnologie</strong>, <strong>de</strong>r Medizin,<br />
<strong>de</strong>s Umweltschutzes und <strong>de</strong>r Dokumentation<br />
<strong>de</strong>r Biosphäre <strong>für</strong> unsere<br />
Kin<strong>de</strong>r zu leisten. Engagieren Sie sich<br />
<strong>für</strong> die Biowissenschaften <strong>de</strong>s Saarlan<strong>de</strong>s.<br />
Legen Sie durch eine Tankspen<strong>de</strong><br />
<strong>de</strong>n Grundstock <strong>für</strong> eine Lebendsammlung,<br />
wer<strong>de</strong>n Sie Kryotankpate!<br />
Behälterpatenschaft:<br />
Je<strong>de</strong>r Kryotankpate erhält eine Spen<strong>de</strong>nbescheinigung<br />
<strong>de</strong>r Fraunhofer-<br />
Gesellschaft und eine Gründungsplakette<br />
<strong>de</strong>r Forschungskryobank <strong>de</strong>s<br />
Fraunhofer IBMT. Die Spen<strong>de</strong> ist einmalig,<br />
Folgekosten entstehen <strong>für</strong> Sie<br />
nicht. Außer<strong>de</strong>m wird im Besucherflur<br />
<strong>de</strong>r Kryobank eine Messingplakette mit<br />
<strong>de</strong>m Namen bzw. <strong>de</strong>r Firma <strong>de</strong>s Spen<strong>de</strong>rs<br />
angebracht.<br />
(Hin<strong>de</strong>rgrund: Konservierte Amphibien in <strong>de</strong>r Kunst- und Naturalienkammer, Franckesche Stiftungen zu Halle an <strong>de</strong>r<br />
Saale © Klaus E. Göltz, Halle.)<br />
Folgen<strong>de</strong> Tankfinanzierungen wer<strong>de</strong>n<br />
empfohlen:<br />
gesamter Behälter 20.000,00 €<br />
1/2 Behälter 10.000,00 €<br />
1/4 Behälter 5.000,00 €<br />
Zu je<strong>de</strong>m Behälter, <strong>de</strong>n Sie finanzieren,<br />
trägt das Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische<br />
Technik weitere 30 % <strong>de</strong>r<br />
Kosten <strong>für</strong> <strong>de</strong>n sofortigen Anschluss<br />
und die Nutzung in <strong>de</strong>r Kryobank bei.<br />
Kryosammlungen dieser Art stehen<br />
in direkter Traditionsfolge mit <strong>de</strong>n<br />
»Wun<strong>de</strong>rkammern« <strong>de</strong>r Renaissance,<br />
<strong>de</strong>n Naturkun<strong>de</strong>museen und<br />
<strong>de</strong>n zoologischen Gärten. Leisten<br />
Sie einen wichtigen Beitrag zur För<strong>de</strong>rung<br />
<strong>de</strong>r Forschung und zum<br />
Aufbau wertvoller Zellsammlungen,<br />
<strong>de</strong>n Bioressourcen <strong>de</strong>r<br />
Zukunft, durch Ihre Beteiligung an<br />
einer Lebendsammlung neuer<br />
Dimension.<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik 47
Danksagung<br />
Wir danken <strong>de</strong>n folgen<strong>de</strong>n Organisationen<br />
und Einrichtungen <strong>für</strong> Projektför<strong>de</strong>rung<br />
und Unterstützung:<br />
• Lan<strong>de</strong>sregierung <strong>de</strong>s Saarlan<strong>de</strong>s<br />
• Ministerium <strong>für</strong> Wirtschaft <strong>de</strong>s Saarlan<strong>de</strong>s<br />
• Ministerium <strong>für</strong> Bildung, Kultur und<br />
Wissenschaft <strong>de</strong>s Saarlan<strong>de</strong>s<br />
• Bun<strong>de</strong>sministerium <strong>für</strong> Bildung und<br />
Forschung (BMBF)<br />
• Deutsche Forschungsgemeinschaft<br />
(DFG)<br />
• Fraunhofer-Gesellschaft zur För<strong>de</strong>rung<br />
<strong>de</strong>r angewandten Forschung<br />
e.V.<br />
• Verbund Life Sciences <strong>de</strong>r Fraunhofer-Gesellschaft<br />
• Industrielle Partner<br />
48<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong> Biomedizinische Technik
So fin<strong>de</strong>n Sie uns<br />
Prof. Dr. Günter R. Fuhr<br />
Direktor<br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong><br />
Biomedizinische Technik (IBMT)<br />
Ensheimer Straße 48<br />
66386 St. Ingbert<br />
Telefon: 06894 / 980-100<br />
Fax: 06894 / 980-110<br />
guenter.fuhr@ibmt.fraunhofer.<strong>de</strong><br />
http://www.ibmt.fraunhofer.<strong>de</strong><br />
Fraunhofer-Institut <strong>für</strong><br />
Biomedizinische Technik (IBMT)<br />
Kryobiophysik & Kryotechnologie<br />
Ensheimer Straße 48<br />
66386 St. Ingbert<br />
Prof. Dr. Heiko Zimmermann<br />
Telefon: 06894 / 980-257<br />
Fax: 06894 / 980-400<br />
heiko.zimmermann@<br />
ibmt.fraunhofer.<strong>de</strong><br />
http://www.ibmt.fraunhofer.<strong>de</strong><br />
Auto<br />
Autobahn A 6 / Ausfahrt<br />
St. Ingbert-West, links abbiegen in<br />
Richtung Flughafen Saarbrücken-<br />
Ensheim, nach <strong>de</strong>r Ampel links<br />
abbiegen in Richtung St. Ingbert-<br />
Süd (Ensheimer Straße), nach ca.<br />
1,5 km liegt das Institut auf <strong>de</strong>r<br />
linken Seite<br />
Autobahn A 1 / bis Autobahnkreuz<br />
Saarbrücken, weiter Richtung<br />
Karlsruhe/Mannheim auf <strong>de</strong>r A 8<br />
bis Autobahnkreuz Neunkirchen,<br />
weiter in Richtung Saarbrücken auf<br />
<strong>de</strong>r A 6<br />
Autobahn A 8 / bis Autobahnkreuz<br />
Neunkirchen, weiter in Richtung<br />
Saarbrücken auf <strong>de</strong>r A 6<br />
Autobahn A 4 / bis Autobahndreieck<br />
Saarbrücken, weiter in Richtung<br />
Mannheim auf <strong>de</strong>r A 6<br />
Bahn<br />
ab Saarbrücken-Hbf. mit <strong>de</strong>m Taxi<br />
ca. 15 Minuten; mit <strong>de</strong>m Bahnbus<br />
o<strong>de</strong>r mit <strong>de</strong>m Zug bis Bahnhof<br />
St. Ingbert, von dort mit <strong>de</strong>m Taxi<br />
ca. 1 Minute o<strong>de</strong>r<br />
zu Fuß ca. 5 Minuten<br />
Flugzeug<br />
ab Flughafen Saarbrücken-Ensheim<br />
mit <strong>de</strong>m Taxi 5-10 Minuten
So fin<strong>de</strong>n Sie uns<br />
eurocryoSaar<br />
Industriestraße 5<br />
66280 Sulzbach<br />
Dr. Frank Obergrießer<br />
Telefon: 06897 / 9071-90<br />
Fax: 06897 / 9071-99<br />
frank.obergriesser@<br />
ibmt.fraunhofer.<strong>de</strong><br />
http://www.ibmt.fraunhofer.<strong>de</strong><br />
http://www.eurocryo.<strong>de</strong><br />
Auto<br />
Aus Richtung Köln / Koblenz / Trier<br />
über die Autobahn A 1<br />
Aus Richtung Frankreich (Paris /<br />
Metz) über die Autobahn A 6<br />
Aus Richtung Luxemburg über die<br />
Autobahn A 623<br />
Aus Richtung Mannheim / Kaiserslautern<br />
/ Karlsruhe über die Autobahn<br />
A 6<br />
Aus Richtung Zweibrücken / Pirmasens<br />
über die Autobahn A 8<br />
Autobahn A 6 Richtung Saarbrücken,<br />
Ausfahrt St. Ingbert-West,<br />
Hinweisschild: Richtung Sulzbach<br />
(ca. 6 km) folgen, vor Sulzbach<br />
Abfahrt „Industriegebiet Neuweiler“<br />
nehmen, <strong>de</strong>m Hinweisschild<br />
„Fraunhofer-Institut“ folgend unter<br />
<strong>de</strong>r Brücke durchfahren, erste<br />
Möglichkeit rechts, Hinweisschild<br />
„Fraunhofer-Institut“, nach 10 m<br />
rechts abbiegen, rechter Hand: Einfahrt<br />
durch blaues Doppelflügeltor<br />
Bahn<br />
ab Saarbrücken-Hbf. mit <strong>de</strong>m Taxi<br />
ca. 20 Minuten<br />
Flugzeug<br />
ab Flughafen Saarbrücken-Ensheim<br />
mit <strong>de</strong>m Taxi 10 Minuten