Protokoll 1 (Wallner)

Modul Immunologie Januar 2013
22. Überführen von je 50 µl Lösung pro well in das entsprechende well auf eine 2.
Mikrotiterplatte (Greiner BioOne). Durch leichtes schräg halten, kann die
Überführung von adherenten Zellen vermieden werden.
23. Lagerung der Greiner BioOne Mikrotiterplatte zugeklebt mit einer Folie (Nunc) bei
-70°C
24. 50µl Substratlösung (4-Nag) pro Well
25. Inkubation für 1 Stunde bei 37 °C
26. Reaktion mit 100 µl Glycinpuffer stoppen → kein Farbumschlag nach gelb trotz pHshift
Diskussion
Die Degranulation sollte über die β-Hexosaminidase nachgewiesen werden, ein Enzym,
welches von dem Substrat 4-NAG, die 4- Nitrophenylgruppe abspaltet. Bei basischem pH
entsteht 4-Nitrophenylat, welches für einen gelben Farbumschlag sorgt. Aufgrund eines
technischen Defekts beim CO 2 -Inkubator kam es allerdings nicht zu einem Farbumschlag. Es
wird vermutet, dass aufgrund zu hoher CO 2 -Konzentration der pH-Wert zu stark gesunken ist
und somit ein Großteil der Zellen abgestorben ist. Dieser Trend zeigte sich schon bei der
Zählung mit der Neubauerkammer und anschließender Verdünnung auf ein Mindestvolumen
von 2,5 ml. Die erzielte Zellzahl von 4x 10 5 Zellen für den RBL-Assay konnte nicht erreicht
werden.
Universität Salzburg 13 / 13