Protokoll 1 (Wallner)
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Teilgel 2<br />
Modul Immunologie Januar 2013<br />
4. Gel läuft für etwa 40 Minuten bei 35 mA<br />
5. Entnahme des Gels<br />
6. Teilung des Gels (Teilgel 1, Teilgel 2)<br />
Teilgel 1: Einlegen in Coomassie-Blue für 45 Minuten auf Schüttler.<br />
Anschließend wird Gel mit Leitungswasser gewaschen und mit Papiertuch<br />
entfärbt<br />
Teilgel 2: Vorbereiten für Immunoblot<br />
7. Immunoblot aufbauen<br />
Gel in Transferpuffer einlegen<br />
Blotmembran und Filterpapiere in Transferpuffer einweichen (Handschuhe<br />
verwenden!)<br />
Filter in Petrischale legen, Membran darüber legen<br />
Gel auf Membran, Filter über Gel legen<br />
eventuelle Luftblasen mit befeuchteten Handschuhen herausstreichen<br />
8. Blotten für 45 Minuten bei 15 V<br />
9. Membran in Petrischale überführen<br />
10. Marker mit Kugelschreiber nachzeichnen und Farbigkeit festhalten<br />
11. Hinzugabe von 5ml Blocking buffer (Stop der Absorptionsreaktion der Membran)<br />
12. Nach etwa 1 Minute Einwirkzeit, Blocking buffer ableeren<br />
13. Zugabe von 5ml Antikörperlösung 1 (mit BIP-1 und monoklonalem Bet v 1 Antikörper<br />
im PBS)<br />
14. Inkubiaton bei 4°C bis Tag 4<br />
15. Waschen der Membran mit Blocking Buffer für 5 min am Schüttler (3 mal)<br />
16. Zugabe von 5ml Antikörperlösung (monoklonaler rabbit anti mouse), wurde auf<br />
1:10 000 vorverdünnt.<br />
17. Inkubation am Schüttler für eine Stunde.<br />
18. Waschen der Membran durch Zugabe von Blocking Buffer (3 mal)<br />
19. Äquilibrieren des pH mit 5ml AP- buffer (1 Minute)<br />
20. Farbreaktion NBT/ BCIP 5 ml, einwirken lassen<br />
21. Teilgel 1 aus Entfärbungsgefäß entfernt und mit Teilgel 2 gescannt<br />
Universität Salzburg 3 / 13
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