Teil 2

Bestimmung des Gesamtkohlenhydrat-
Gehalts in Lebensmitteln

Phenol-Schwefelsäure-Methode
Prinzip:
• Kohlenhydrate werden durch starke Säuren und/oder hohe
Temperaturen zerstört.
• Ablauf einer Reihe von komplexen Reaktionen Furanderivate
• Kondensation der Produkte braune und schwarze Substanzen
• Kondensation auch mit verschiedenen phenolischen Komponenten,
wie Phenol, Resorcinol , α-Naphthol, und mit verschiedenen
aromatischen Aminen gefärbte Verbindungen
Furan Phenol Resorcinol α-Naphthol

Phenol-Schwefelsäure-Methode
Durchführung
• Klare wässerige Lösung der Kohlenhydrate wird in ein Röhrchen
pipettiert.
• Zugabe von wässeriger Phenol-Lösung, schütteln
• Zugabe von heißer konz. Schwefelsäure, schütteln gelb-orange
gefärbte Substanzen gebildet.
• Messung der Extinktion bei 490 nm.
• Erstellung einer Kalibrierfunktion (optimal: Gemisch von Zuckern in
ähnlichem Verhältnis wie in der Probe. Falls nicht möglich: D-Glucose)

Lumineszenzmethoden
Lumineszenz:
Molekül wird angeregt, kehrt vom angeregten Zustand in den
Grundzustand zurück und emittiert dabei Strahlung.
Photolumineszenz:
Anregung eines Moleküls durch Absorption eines Photons
• Fluoreszenz
• Phosphoreszenz
Chemilumineszenz:
Anregung eines Moleküls durch eine chemische Reaktion
Wenn Reaktion in einem biologischen System abläuft: Biolumineszenz

Theorie der Fluoreszenz und Phosphoreszenz

Singulett / Triplett-Zustand

Theorie der Fluoreszenz und Phosphoreszenz
Desaktivierungsprozesse:
Schwingungsrelaxation
Interne Umwandlung

Theorie der Fluoreszenz und Phosphoreszenz
Desaktivierungsprozesse:
Fluoreszenz
Externe Umwandlung

Theorie der Fluoreszenz und Phosphoreszenz
Desaktivierungsprozesse:
Intersystem Crossing
Phosphoreszenz

Parameter, die die Fluoreszenz beeinflussen
1) Molekülstruktur
Die meisten nichtsubstituierten aromatischen Kohlenwasserstoffe
fluoreszieren in Lösung, wobei die Quantenausbeute, Φ, mit der Zahl
der Ringe und ihrem Kondensationsgrad zunimmt.
Quantenausbeute =
Zahl der als Fluoreszenz emittierten Photonen
Zahl der absorbierten Photonen

Parameter, die die Fluoreszenz beeinflussen
Einfluss struktureller Starrheit

Parameter, die die Fluoreszenz beeinflussen
2) Temperatur- und Lösungsmitteleffekte
Die Quantenausbeute nimmt für die meisten Moleküle mit zunehmender
Temperatur ab.
Die Quantenausbeute nimmt für die meisten Moleküle mit abnehmender
Viskosität ab.
3) Einfluss des pH-Wertes

Parameter, die die Fluoreszenz beeinflussen
4) Einfluss von sogenannten Löschmolekülen (Quenchern)
Die Energie des angeregten Zustands wird strahlungslos auf das
Löschmolekül übertragen.
2 Arten von Löschprozessen:
• dynamische Fluoreszenzlöschung
• statische Fluoreszenzlöschung
Einfluss von gelöstem Sauerstoff

Quantitative Analyse
I F = K I o Φ ε c d
I F ...Intensität der Fluoreszenzstrahlung
I o …Intensität des anregenden Lichtstrahls
Φ...Quantenausbeute
...molarer Extinktionskoeffizient
c…Konzentration der fluoreszierenden Substanz
d…Schichtdicke
K...Proportionalitätsfaktor (bei niedrigen Konzentrationen K=2.303)
Bei hohen Konzentrationen: Abweichungen von der Linearität
• Selbstlöschung
• Eigenabsorption

Anregungs- und Emissionsspektrum
Stokes Shift

Stärken der Fluoreszenzmethoden
1) sehr niedrige Nachweisgrenzen
Messung der Fluoreszenz
Intensität der Fluoreszenzstrahlung
kann unabhängig von I o gemessen
werden
Man misst I F gegen die Dunkelheit
auch niedrige I F kann gemessen
werden
Photometrische Messung
Erfordert sowohl die Messung
von I o als auch von I
Io E log cd
I
Bei niedrigen Konzentrationen:
I und I o hoch, kleiner
Unterschied schwierig zu
messen

Stärken der Fluoreszenzmethoden
1) sehr niedrige Nachweisgrenzen
Messung der Fluoreszenz
I F = K I o Φ ε c d
Photometrische Messung
Io E log cd
I
I F hängt von I o ab.
Durch Erhöhung von I o kann
das Fluoreszenzsignal verstärkt
und dadurch die Nachweisgrenze
gesenkt werden.
Eine Erhöhung von I o führt zu
einer proportionalen Erhöhung
von I, das Verhältnis I o / I ändert
sich nicht

Stärken der Fluoreszenzmethoden
2) Großer dynamischer Bereich
Im Vergleich zu Absorptionsmessungen wesentlich größerer
dynamischer Bereich (10 -7 – 10 -4 M).
Bei Konzentrationen > 10 -4 M verlaufen die Kalibrierfunktionen nicht
linear.
Ursache: Quencheffekte, Selbstabsorption
3) Hohe Selektivität
• Relativ wenige Substanzen fluoreszieren
• Wahl der Anregungs- und Emissionswellenlänge

Aufbau eines Fluorimeters

Fluoreszenzdetektor in der HPLC

Bestimmung von Aflatoxinen in Lebensmitteln

Grenzwerte/1

Allgemeines Problem
Problemanalyse
Analytisches Problem
(Festlegung des Probenguts)
Probenahme
Probenvorbereitung
Messung (Erzeugung und
Registrierung der Signale)
Auswertung der qualitativen und
quantitativen Informationsparameter
der Signale
Analysenbericht mit der
chemischen Information
und ihrer Interpretation
in Bezug auf das
allgemeine Problem

Ziel der Probenahme
aus dem zur Verfügung stehenden Probenmaterial eine Probe zu
ziehen, aus deren Analyse sich die chemische Information in der
benötigten Art und Qualität ermitteln lässt.
Probenmaterial
Urprobe
Vorbereitung
Analysenprobe
Die Urprobe soll repräsentativ sein.
repräsentativ:
Wenn die mittlere Konzentration in der Urprobe und in der
Analysenprobe gleich ist der mittleren Konzentration im zu
untersuchenden Probenmaterial.

Probenvorbereitung
Aufgaben und Ziele der Probenvorbereitung
• Homogenisierung
in Lösung bringen (Extraktion, Aufschluss der Probe)
Einstellen der Probe auf die Analysenbedingungen (Salzgehalt,
pH-Wert)
• Abreicherung der Matrix (Vorabtrennung zur Vereinfachung der
Probe)
• Anreicherung von Spurenkomponenten
• Vorreaktionen (Derivatisierung)
zur Erhöhung der Detektierbarkeit (Erniedrigung der
Nachweisgrenze)
zur Erhöhung der Selektivität