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Material und Methoden 37

2.2.2 Untersuchungen zur Signaltransduktion des B 2 Rezeptors

2.2.2.1 cAMP

Für die Versuche zur cAMP Produktion nach Aktivierung des B 2 R wurden in 6er Well

Schalen (Primaria) kultivierte Peritubulärzellen in der zweiten Passage eingesetzt. 24

Stunden vor Versuchsanfang wurde begonnen, die Zellen auf serumfreie Bedingungen

zu adaptieren, da die genaue Zusammensetzung von FCS (fetales Kälberserum) nicht

bekannt ist, und nicht ausgeschlossen werden kann, dass es störende Substanzen, wie

z.B. auch Bestandteile des Kallikrein – Kinin Systems enthält. Dazu wurde das serumhaltige

Nährmedium abgesaugt und durch dasselbe Nährmedium mit geringerem Serumanteil

ersetzt. Die einzelnen Verdünnungsschritte sind Tabelle 3 zu entnehmen.

Tabelle 3: Adaption an serumfreie Kulturbedingungen

Medium

Dauer

RPMI 1640 + 10% FCS 1 Stunde

RPMI 1640 + 5% FCS 1 Stunde

RPMI 1640 + 2,5% FCS 1 Stunde

RPMI 1640 + 1% FCS über Nacht

RPMI 1640 ohne FCS eine Stunde

Nach der Adaption wurden die Zellen eine weitere Stunde mit RPMI 1640 Medium,

dem 0,5mM 3-Isobutyl-1-Methylxanthin (IBMX) zugesetzt war, inkubiert. IBMX ist

ein unspezifischer Inhibitor der cAMP und cGMP Phosphodiesterasen und wurde eingesetzt,

um einen schnellen Abbau des generierten cAMP zu verhindern und so eine

Aktivitätsänderung der Adenylatcyclase deutlicher erfassen zu können (Bascands et al.,

1993) Anschließend wurde das Medium wieder abgesaugt und es erfolgte die Stimulation

der Zellen. Dazu wurden folgende Lösungen verwendet:

Pharmakologie, Signaltransduktion und physiologische Bedeutung von Kininrezeptoren in Peritubulärzellen

des Rattenhodens