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Material und Methoden 39

Als Kontrollparameter wurden ebenfalls TA (Total activity), NSB (Non substrate binding),

B 0 (maximum binding) und Substrate blank bestimmt. Um die Empfindlichleit

des Systems zu erhöhen, wurden zu Beginn alle Proben und Standards acetyliert. Dies

geschah, indem zu jeweils 300 µl Standard bzw. Probe 15µl eines Gemisches aus 0,5ml

Acetic Anhydrid und 1ml Triethylamine gegeben und kurz geschüttelt wurde. Dann

wurden je 100µl pro Bestimmung der acetylierten Proben bzw. Standards in ein Well

der Mikrotiterplatte pipettiert und durch Zugabe von 50µl Neutralisationsreagenz neutralisiert.

Anschließend wurden je 50µl des cAMP – Konjugats und der Antikörperlösung

hinzugegeben. Es folgte eine zweistündige Inkubation bei Raumtemperatur unter

stetigem Schwenken. Anschließend wurde der Inhalt der Mikrotiterplatte dekantiert und

jedes Well 3 mal mit Waschpuffer gewaschen, um nichtgebundenes cAMP zu entfernen.

Nun wurden 200µl der Substratlösung in jedes Well gegeben und der Ansatz eine

weitere Stunde inkubiert. Dann wurde die Reaktion mit je 50 µl Stoplösung beendet

und der erfolgte Farbumschlag im Photometer bei einer Messwellenlänge von 405nm

und einer Referenzwellenlänge von 570nm quantifiziert. Von den gemessenen Werten

wurde der ermittelte durchschnittliche NSB – Wert abgezogen. Aus den resultierenden

Werten der Standards und den Logarithmen der zugehörigen Konzentrationen konnte

nun eine Standardkurve erstellt werden, mit deren Hilfe die cAMP -Konzentration der

Proben bestimmt werden konnte. Für die Berechnung der Standardkurve wurde Microsoft

Excel 2000 eingesetzt.

Abbildung 11: Verwendete cAMP - Standards

Pharmakologie, Signaltransduktion und physiologische Bedeutung von Kininrezeptoren in Peritubulärzellen

des Rattenhodens

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