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Material und Methoden 40

2.2.2.1.1 Bestimmung der Proteinkonzentration

Des Weiteren wurde von jeder Probe die Proteinkonzentration bestimmt, so dass die

ermittelte cAMP Konzentration auf die Proteinmenge bezogen werden konnte. Auf diese

Weise wurde ausgeglichen, dass sich aufgrund von Wachstumsschwankungen nicht

exakt gleich viele Zellen pro Well befinden. Die Messung der Proteinkonzentration erfolgte

mit dem „DC Protein Assay“ von Bio-Rad, der eine modifizierte Form der Bestimmung

nach Lowry darstellt. Dabei wurden in einer Mikrotiterplatte zu je 5 µl Probe

nacheinander 25µl Reagenz A und 200µl Reagenz B pipettiert. Nach 15 Minuten Inkubationszeit

wurden die optischen Dichten der Proben bei einer Messwellenlänge von

750nm photometrisch bestimmt. Anhand der bei jedem Assay mitgeführten Standards

aus Rinderserumalbumin (BSA) in 0,1 normaler HCL wurde wieder eine Standardkurve

erstellt, mit deren Hilfe die Proteinkonzentrationen ermittelt werden konnten. Abgedeckt

wurde der Bereich von 1,5 bis 0,1 mg/ml.

2.2.2.2 cGMP

Die Versuche zur cGMP Produktion nach Stimulation des B 2 R wurden annähernd genauso

durchgeführt wie die cAMP – Untersuchungen (2.2.2.1). Da sich in den meisten

Geweben eine wesentlich geringere Konzentration an cGMP als an cAMP findet, war es

jedoch sinnvoll, die verwendeten Zellen hier statt in 6er Wellschalen in 75cm 2 Zellkulturflaschen

zu kultivieren. Auf diese Weise war es möglich, eine deutlich höhere Zellzahl

für jede Probe zu verwenden und so eine optimal im Messbereich des Assays liegende

Konzentration des Analyten zu erreichen. Die Zellen wurden hier aufgrund des

schnelllebigeren Charakters des NO / cGMP - Systems für nur 30 Sekunden, 5 Minuten

oder 15 Minuten stimuliert. Dafür wurden folgende Substanzen benutzt:

Pharmakologie, Signaltransduktion und physiologische Bedeutung von Kininrezeptoren in Peritubulärzellen

des Rattenhodens

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