Dokument 1.pdf - Gießener Elektronische Bibliothek - Justus-Liebig ...

geb.uni.giessen.de

Dokument 1.pdf - Gießener Elektronische Bibliothek - Justus-Liebig ...

Material und Methoden 42

2ml der Suspension in ein 15ml Falconröhrchen gegeben und ins Schüttelwasserbad bei

37°C gestellt. Dort wurden die Zellen eine Stunde geschüttelt, um auszuschließen, dass

die zu messenden Effekte durch die Trypsinbehandlung beeinflusst werden. Danach

wurden die Zellen stimuliert, indem in jedes Röhrchen 2ml 37°C warme Stammlösung

der jeweiligen zur Stimulation verwendeten Reagenzien gegeben wurde. Auf diese Weise

kamen folgende Endkonzentrationen zum Einsatz:

• RPMI 1640 Medium ohne weiter Zusätze als Kontrolle

• RPMI 1640 Medium + 10nM Bradykinin

• RPMI 1640 Medium + 100nM Bradykinin

• RPMI 1640 Medium + 10mM Acetylcholin als Positivkontrolle

Aufgrund der schnellen und transienten Natur der IP 3 - Kaskade wurden mit 5, 30 oder

300 Sekunden sehr kurze Inkubationszeiten gewählt. Nach Ablauf der Zeit wurden die

Röhrchen mit 10ml eiskaltem RPMI 1640 Medium aufgefüllt und eine Minute bei

1800xg und 4°C zentrifugiert. Alle weiteren Schritte wurden ab diesem Zeitpunkt auf

Eis durchgeführt. Das Medium wurde vorsichtig dekantiert und das resultierende Pellet

in 600µl eiskalter Perchlorsäure (4%) lysiert. Es folgte eine 15 minütige Zentrifugation

bei 2000 x g und 4°C, damit sich die durch die Perchlorsäure ausgefallenen Proteine

absetzen konnten. Von dem Überstand wurden 500µl abgenommen, mit 3 Tropfen pH -

Indikator (FLUKA) versetzt und mit eiskalter KOH + 60mM Hepespuffer bis zu einem

pH – Wert von 7,5 titriert. Dabei wurde für die grobe Annäherung 10 normale KOH, für

die Feineinstellung 1 normale KOH verwendet.

Das bei der Neutralisation entstandene Kaliumperchlorat wurde durch eine weitere

Zentrifugation bei 2000 x g und 4°C sedimentiert. Vom Überstand wurden 300µl abpipettiert

und bis zur Untersuchung bei –80°C. gelagert.

Die IP 3 Konzentration wurde durch die Verwendung eines kommerziell erhältlichen

RIA Kits (Amersham Buchler, Braunschweig) bestimmt. Das Funktionsprinzip dieses

Kits ist mit den ELISA Systemen bei cAMP bzw. cGMP vergleichbar. Das IP 3 aus den

Pharmakologie, Signaltransduktion und physiologische Bedeutung von Kininrezeptoren in Peritubulärzellen

des Rattenhodens

Weitere Magazine dieses Users
Ähnliche Magazine