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Material und Methoden 45

Reduzierung der Disulfidbrücken. Die resultierenden SH – Gruppen wurden anschließend

durch Alkylierung mit Iodo-acetamid stabilisiert. Um eine höhere Proteinkonzentration

zu erreichen, wurde das Lysat anschließend in Zentrifugenfilter (MG cut off:

10KDa) transferiert und für 15 Minuten bei 2000 x g und 4°C. zentrifugiert. Die konzentrierte

Proteinlösung wurde aliquotiert und bis zur Durchführung der Polyacrylamidgelelektrophorese

(=PAGE) bei –80°C gelagert.

2.2.2.4.2 Polyacrylamid – Gelelektrophorese (PAGE)

Bei einer SDS Polyacrylamidgelelektrophorese nach Laemmli (Laemmli, 1970) werden

Proteine durch Anlegen eines elektrischen Feldes dazu gebracht, durch eine poröse Polyacrylamidmatrix

zu wandern. Die Matrix wirkt dabei als Molekularsieb und hält die

Proteine abhängig von ihrem Stokes – Radius und damit von ihrem Molekulargewicht

unterschiedlich stark zurück, so dass große Proteine langsamer, kleine schneller durch

das Polyacrylamidgel wandern können. Die Polyacrylamidmatrix wird durch die radikalische

Polymerisation von Acrylamidmonomeren und quervernetzenden N,N´- Methylenbisacrylsäureamid

(Bis) aufgebaut. Die Porengröße und elastischen Eigenschaften

der Gele ergeben sich dabei aus der verwendeten Gesamtmonomerkonzentration

Acrylamid ( g)

+ Bis(

g )

%T(total monomer concentration =

Gesamtvolumen(

ml)

x100

) und aus dem Verhältnis von Acrylamid

zu Bis %C (crosslinking monomer concentration =

Bis(

g )

Acrylamid ( g ) + Bis(

g ) x100

). Da Proteine

mit der Detergenz SDS (Natriumdodecylsulfat) negativ geladene SDS – Protein –

Komplexe mit konstanter Nettoladung pro Masseneinheit bilden, kann ausgeschlossen

werden, dass die Bewegung der Proteine durch das Gel von der Proteineigenladung

beeinflusst wird. Zur Auftrennung der Zelllysate wurde eine diskontinuierliche SDS

PAGE durchgeführt, das heißt, die Proteine wurden zunächst in einem leicht sauren

Sammelgel mit großer Porenweite gesammelt, bevor sie in dem basischen Trenngel mit

hoher Acrylamidkonzentration aufgetrennt wurden. Für die vorliegende Fragestellung

zeigte es sich am günstigsten, Trenngele mit %T = 10% und %C = 2,67% zu verwenden.

Die genaue Zusammensetzung der verwendeten Gele war wie folgt:

Pharmakologie, Signaltransduktion und physiologische Bedeutung von Kininrezeptoren in Peritubulärzellen

des Rattenhodens

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