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Material und Methoden 51

Vor Beginn der Nachweisreaktion mussten die überschüssigen Proteinbindungsstellen

auf der Nitrocellulosemembran abgesättigt werden, um eine unspezifische Bindung der

Antikörper zu minimieren. Nachdem sich die weit verbreitete Blockierung mit Trockenmilchpulver

als völlig untauglich für die verwendeten Antikörper erwiesen hatte

(vermutlich enthält Trockenmilch selber verschiedene phosphorylierte Proteine), wurde

eine Reihe andere Reagenzien ausprobiert. Das beste Ergebnis konnte bei der Verwendung

von 5% Teleostgelatine (Gelatine from cold water fish skin, Sigma) in T-TBS +

1% BSA bei Blockierung über Nacht bei 4°C erzielt werden. Wenn nicht anders angegeben,

wurden alle Wasch- und Inkubationsschritte auf der Diffusions - Entfärbe Apparatur

bei Raumtemperatur durchgeführt. Tabelle 7 beschreibt den genauen Ablauf bei

der Immunreaktion.

Tabelle 7: Protokoll der Immunreaktion zum Nachweis phosphorylierter Proteine

Behandlung Reagenz Dauer

Absättigen unspezifischer 5% Teleostgelatine in über Nacht bei 4°C

Bindungen

T-TBS

Waschen in Puffer T-TBS 2 x 1 Minute

Inkubation 1. Antikörper s. Tabelle 6 1 Stunde

Negativkontrolle nur T-TBS + 1% BSA 1 Stunde

Waschen in Puffer T-TBS 1 x 15 Minute +

3 x 5 Minuten

Inkubation 2. Antikörper s. Tabelle 6 1 Stunde

Waschen in Puffer T-TBS 1 x 15 Minute +

3 x 5 Minuten

Die gebundenen Antikörper wurden mit dem ECL System (Enhanced chemilumineszenz

System, Amersham Pharmacia Biotech) visualisiert (s. Abbildung 12). Dazu wurde

in einer Dunkelkammer die Proteinseite der Membran mit ECL Reagenz bedeckt und

für eine Minute inkubiert. Überschüssige Reagenz wurde entfernt, anschließend die

Membran in Klarsichtfolie verpackt und in eine Fotokassette gelegt. Nun konnte das

Photopapier (Hyperfilm ECL, Amersham Pharmacia Biotech) auf die Membran gelegt

und die Kassette geschlossen werden. Nach einer für jeden Antikörper empirisch bestimmten

Entwicklungszeit wurde die Kassette wieder geöffnet, der Film entnommen

Pharmakologie, Signaltransduktion und physiologische Bedeutung von Kininrezeptoren in Peritubulärzellen

des Rattenhodens

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