Dokument 1.pdf - Gießener Elektronische Bibliothek - Justus-Liebig ...

geb.uni.giessen.de

Dokument 1.pdf - Gießener Elektronische Bibliothek - Justus-Liebig ...

Material und Methoden 53

2.2.3 Pharmakologische Charakterisierung des B 2 Rezeptors in

Peritubulärzellen

Die pharmakologische Charakterisierung des B 2 Rezeptors in Peritubulärzellen wurde

an adhärent gewachsenen Zellen mit radioaktiv markiertem [ 3 H]-Bradykinin (Amersham

Pharmacia Biotech) durchgeführt. Die weitverbreitete Bestimmung von pharmakologischen

Daten an Membranpräparationen von Zellen erwies sich für uns als ungeeignet,

da es sich gezeigt hatte, dass eine große Menge Zellmaterial nötig gewesen wäre,

um die erforderliche Menge an Membransuspension herzustellen und somit sehr viele

Ratten hätten getötet werden müssen.

Verwendet wurden stattdessen in 6er Well Schalen kultivierte Peritubulärzellen in der 2.

Passage. Wie bei den Versuchen zur Signaltransduktion mussten die Zellen vor Versuchsbeginn

auf serumfreie Kulturbedingungen adaptiert werden, da möglicherweise

auch die pharmakologischen Eigenschaften des B 2 Rezeptors durch unbekannte Serumbestandteile

hätte beeinflusst werden können. Die Adaption geschah nach dem bereits

beschriebenen Protokoll (2.2.2.1).

2.2.3.1 Vorversuche zur Pharmakologie

Bevor die eigentliche Determination der pharmakologischen Parameter stattfinden

konnte, war es zum einen erforderlich, die nötige Inkubationszeit bis zum Erreichen des

Bindungsgleichgewichts zwischen Bradykinin und dem B 2 - Rezeptor zu ermitteln. Zum

anderen musste bestimmt werden, wie viele Waschschritte zur Elimination von nicht

gebundenem [ 3 H] - Bradykinin durchgeführt werden sollten, um ein möglichst optimales

Verhältnis zwischen spezifischer und unspezifischer Bindung zu erreichen. Um diese

zwei Versuchsparameter zu ermitteln, wurde nach Adaption der Zellen auf serumfreie

Bedingungen in beiden Fällen zunächst das Nährmedium abgesaugt und durch

Bindungspuffer (RPMI 1640 Medium; 4,6µM Captopril; 1,8µM Phosphoramidon; 1mM

σ - Phenanthroline; 1% BSA) ersetzt. Es folgte eine einstündige Inkubation im Brutschrank

bei 37°C, um die Zellen mit dem Bindungsansatz equilibrieren zu lassen. Die

Proteaseinhibitoren Captopril, Phosphoramidon und σ - Phenanthrolin im Puffer (s. Tabelle

8) hatten die Aufgabe, die verschiedenen Kininasen zu blockieren, die vermutlich

an die Membran von Peritubulärzellen gebunden sind und dort mit dem B 2 Rezeptor um

Pharmakologie, Signaltransduktion und physiologische Bedeutung von Kininrezeptoren in Peritubulärzellen

des Rattenhodens

Weitere Magazine dieses Users
Ähnliche Magazine