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Material und Methoden 55

Bei der Ermittlung der optimalen Anzahl von Waschschritten wurden alle Zellen 90

Minuten im Bindungsansatz inkubiert und anschließend verschieden oft (1-5mal) mit

eiskaltem PBS gewaschen. Die übrigen Schritte waren identisch.

Für die Auswertung der erhaltenen Daten wurde in beiden Fällen die Software Microsoft

Excel 2000 verwendet.

2.2.3.2 Sättigbarkeit der Bindung von Kininen am B 2 Rezeptor

Um die Sättigbarkeit der Bindung von Kininen am B 2 Rezeptor zu demonstrieren, wurden

Peritubulärzellen mit steigenden Konzentrationen von [ 3 H] Bradykinin inkubiert.

Der grundsätzliche Versuchsaufbau war identisch mit dem bei den Vorversuchen

(s.2.2.3.1) zur Pharmakologie: Adhärent gewachsene Peritubulärzellen in der zweiten

Passage wurden zunächst eine Stunde im Brutschrank bei 37°C mit Bindungspuffer

(s.2.2.3.1) equilibriert, bevor sie auf Eis gestellt und unter Schütteln mit dem Bindungsansatz

inkubiert werden konnten. Im Gegensatz zu den Vorversuchen, bei denen für alle

Zellen der gleiche Bindungsansatz verwendet worden war, kamen hier folgende [ 3 H]

Bradykininkonzentrationen zum Einsatz: 0,1nM; 0,5nM; 1nM; 2nM; 3nM; 5nM;

7,5nM; 10nM und 20nM. Die unspezifische Bindung wurde wieder in Gegenwart von

10µM unmarkiertem Bradykinin bestimmt. Gemäß den Ergebnissen aus den Vorversuchen

(s. 3.3.1) erfolgte die Inkubation über eine Stunde mit drei sich anschließenden

Spülgängen mit eiskaltem PBS (1,5ml pro Well). Anschließend konnten die Zellen, wie

bereits bei den Vorversuchen (2.2.3.1) beschrieben, lysiert und die Radioaktivität nach

Versetzung mit Szintillationscocktail im β - Szintillationszähler gemessen werden. Alle

Werte wurden auf die durchschnittliche Proteinkonzentration pro Well bezogen, die

durch die Bestimmung der Proteinmenge aus drei zufällig ausgewählten Wells mit dem

„DC Protein Assay“ von Bio Rad (s.2.2.2.1 cAMP) ermittelt wurde. Aus den erhaltenen

Daten wurde eine Sättigungskurve erstellt, aus der durch weitere Umformungen die

pharmakologischen Konstanten K d und B max bestimmt werden konnten (s.3.2.3.2 Ergebnisse).

Die Dissoziationskonstante K d erfasst die Affinität von Bradykinin zum B 2 Rezeptor

und B max beschreibt die Gesamtkonzentration an Bindungsstellen.

Pharmakologie, Signaltransduktion und physiologische Bedeutung von Kininrezeptoren in Peritubulärzellen

des Rattenhodens

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