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Molekulare Methoden in der mikrobiologischen ... - BIOspektrum

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743 Nachweis von Infektionserregern Molekulare Methoden in der mikrobiologischen Diagnostik SÖREN SCHUBERT, ANDREAS WIESER MAX VON PETTENKOFER-INSTITUT FÜR HYGIENE UND MEDIZINISCHE MIKROBIOLOGIE, LMU MÜNCHEN Today molecular methods are indispensable in diagnostic microbiology. Several technologies aim to detect pathogens, virulence factor or resistance genes by identifying specific DNA/RNA sequences. Advantages compared to culture based methods are the comparatively short time to results, detection of non-culturable or slow growing pathogens, and specific detection of virulence marker genes. Drawbacks include falsenegative results due to variation of target structures and the relatively high costs. DOI: 10.1007/s12268-013-0386-x © Springer-Verlag 2013 ó Zentrales Ziel der mikrobiologischen Diagnostik ist es, in Patientenproben Infektionserreger nachzuweisen und Aussagen zu deren Resistenz gegen antimikrobielle Substanzen (Antibiotika, Antimykotika) zu machen, um eine gezielte, effektive Therapie zu ermöglichen. Von großer Bedeutung ist dabei die Schnelligkeit. Je früher Informationen über den Erreger vorliegen, desto eher kann von einer anfänglich kalkulierten und auf Erfahrungswerten basierenden Therapie auf eine gezielte umgestellt werden. Die klassische mikrobiologische Diagnostik, die auf dem kulturellen Nachweis von Infektionserregern beruht, kann dieser Forderung nur bedingt entsprechen. Die Kultur selbst von schnell wachsenden Bakterien nimmt acht bis zwölf Stunden in Anspruch, andere Infektionserreger sind schwierig oder gar nicht anzüchtbar. Auch ist in einigen Fällen der Nachweis spezifischer Virulenzeigenschaften der Erreger von Interesse. Mit molekularen Methoden gelingt es, direkt aus dem Probenmaterial innerhalb weniger Stunden Infektionserreger zu identifizieren oder spezifische Virulenz- bzw. Resistenzdeterminanten nachzuweisen [1–5]. Im Folgenden werden deshalb die heute zur Verfügung stehenden molekularen Methoden in der mikrobiologischen Diagnostik kurz vorgestellt (Tab. 1). Molekulare Verfahren in der mikrobiologischen Diagnostik Der erste Schritt fast aller molekularbiologischen Diagnostikverfahren ist die Aufreinigung von Nukleinsäuren aus dem Probenmaterial, auf welche der spezifische Erregernachweis folgt. Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist eine Methode zum spezifischen Nachweis von Nukleinsäuren. PCR-basierte Verfahren nutzen die spezifische komplementäre Bindung kurzer gegenläufiger Oligonukleotide (Primer) an die nachzuweisende DNA. Bei dieser Endpunkt-PCR müssen die DNA-Produkte nach der Amplifikation mittels Gelelektrophorese dargestellt werden. Für die Diagnostik sind nachfolgende Analysen der Produkte zur Sicherstellung der Spezifität erforderlich, wie Restriktionsverdau oder Hybridisierungsverfahren. Die Endpunkt-PCR ist ein relativ schnelles Verfahren, das aufgrund der hohen Spezifität und Sensitivität auch aus Direktmaterial Ergebnisse noch am gleichen Tag liefern kann. Es besteht außerdem die Möglichkeit, verschiedene, unterschiedlich lange Amplifikate parallel im gleichen Ansatz zu analysieren. Die Gelelektrophorese der Produkte und nachfolgende Spezifitätstests verzögern jedoch die Auswertung und begrenzen den Einsatz in der Routinediagnostik. Modernere PCR-Verfahren nutzen eine direkte Amplifikationsdetektion, meist mithilfe einer fluoreszenzmarkierten Sonde. Diese Real-Time-PCR-Verfahren sind spezifischer als Endpunkt-PCRs [6]. Ferner sinkt der Personalzeitaufwand pro Analyse, da mithilfe der Sonde die Amplifikation optisch direkt während der Reaktion gemessen werden kann. Das macht eine Gelelektrophorese am Ende der Reaktion überflüssig. Die meisten Real- Time-PCR-Verfahren basieren auf dem Einsatz einer mit zwei Farbstoffen, einem FRET(Förster-Resonanz-Energietransfer)-Paar, markierten Sonde. Ein Partner unterdrückt dabei die Fluoreszenz des anderen Farbstoffs, solange diese räumlich nahe zusammengelagert sind. Während der Amplifikation durch Abbau der Sonde oder durch Auflösung einer Stamm-Loop-Struktur der FRET wird diese räumliche Nähe aufgehoben. Zunehmende Fluoreszenzintensität repräsentiert daher eine fortscheitende Amplifikation (Abb. 1). Alternative Techniken messen nur das Entstehen größerer Mengen doppelsträngiger DNA mithilfe interkalierender Farbstoffe. Um Spezifität sicherzustellen, kann eine Schmelztemperaturkurve am Ende der Reaktion erstellt werden. Real-Time-PCRs sind sehr sensitiv und spezifisch und daher sehr gut geeignet, um Direktmaterial zu untersuchen. Die amplifizierten DNA-Fragmente und Zykluszeiten sind recht kurz, die Auswertung automatisierbar. Ein Ergebnis ist binnen weniger Stunden, mit geringem Arbeitsaufwand möglich. Diese Vorteile haben dazu geführt, dass Real-Time-PCR-Verfahren die molekulare Diagnostik in der Mikrobiologie dominieren. Ein spezielles PCR-Verfahren in der mikrobiologischen Diagnostik stellen die uni - versellen PCRs dar, die mit Primern gegen flankierende, konservierte Bereiche variabler Sequenzen diese Gene amplifizieren (16S-rDNA) [7]. Nachfolgend können die variablen Bereiche sequenziert und mit Datenbanken abgeglichen werden. Es ist möglich, die Primer so zu wählen, dass praktisch alle Bakterien oder Pilze detektiert und identifi- BIOspektrum | 07.13 | 19. Jahrgang

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