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Tierärztliche Hochschule Hannover

Einfluss unterschiedlicher

Progesteronkonzentrationen auf

die Maturation boviner Oozyten

in vivo und in vitro

INAUGURAL - DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin

der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae -

( Dr. med. vet. )

vorgelegt von

Nicole Schlüter

Münster

Hannover 2013


Wissenschaftliche Betreuung:

Prof. Dr. Christine Wrenzycki

Klinik für Rinder,

Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken

jetzt: Justus-Liebig-Universität Gießen

Klinik für Geburtshilfe, Gynäkologie und Andrologie

der Groß- und Kleintiere mit Tierärztlicher Ambulanz,

Professur für Molekulare Reproduktionsmedizin

1. Gutachterin Prof. Dr. Christine Wrenzycki

2. Gutachter Prof. Dr. Burkhard Meinecke

Tag der mündlichen Prüfung: 30.09.2013

Die vorliegende Arbeit wurde gefördert durch den Förderverein Biotechnologie Forschung e.V.

(FBF e.V.) Bonn.


Meinen Großvätern


Inhalt

1 Einleitung 1

2 Literatur 5

2.1 Gewinnung von Kumulus-Oozyten-Komplexen (KOK) mit der Ovum-Pick-Up

(OPU)-Methode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

2.1.1 Die Entwicklung des OPU . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

2.1.2 Vergleich des OPU mit anderen Methoden zur Gewinnung von Eizellen

bzw. Embryonen beim Rind . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

2.2 Einfluss des OPU auf die Gesundheit des Donortieres . . . . . . . . . . . . . . 7

2.3 Einfluss des OPU auf den ovariellen Zyklus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

2.4 Einflüsse des Zyklusstandes auf die Ergebnisse des OPU . . . . . . . . . . . . 8

2.5 Einfluss des Zyklusstandes auf die Qualität der KOK . . . . . . . . . . . . . . 9

2.6 Beurteilung der Entwicklungskompetenz boviner Oozyten . . . . . . . . . . . 10

2.7 Einfluss des Zyklusstandes auf die Entwicklungskompetenz boviner KOK . . . 12

2.8 Beeinflussung der follikulären Reifungsvorgänge durch peripheres Progesteron 14

2.9 In-vitro-Maturation (IVM) boviner Oozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

2.10 Beeinflussung der Eizell- und Embryonenqualität . . . . . . . . . . . . . . . . 16

2.11 Einfluss der Maturationsbedingungen auf die Eizell- und Embryonenqualität . . 17

2.12 Einfluss der Steroidsupplementation während der IVM . . . . . . . . . . . . . 19

2.13 MessengerRNA-Expression entwicklungsrelevanter Gene in bovinen Oozyten

und Embryonen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

2.13.1 Growth and Differentiation Factor 9 (GDF9) . . . . . . . . . . . . . . 22

2.13.2 Bone Morphogenetic Protein 15 (BMP15) . . . . . . . . . . . . . . . . 23

2.13.3 Glukosetransporter 1 (SLC2A1) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

2.13.4 Hypoxia Inducible Factor 2α (HIF2α) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

2.14 MessengerRNA-Expression von Progesteronstoffwechsel-relevanten Genen in

Oozyten und Embryonen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

2.14.1 Progesteronrezeptoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

2.14.2 Progestin und AdipoQ Rezeptor 5 (PAQR5) . . . . . . . . . . . . . . . 27

2.15 Ziel des Projektes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

3 Material und Methoden 29

3.1 Ovum Pick-Up (OPU) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

3.1.1 Auswahl der Versuchstiere und Feststellung des Versuchsbeginns . . . 29

3.1.2 Gewinnung von Kumulus-Oozyten-Komplexen im OPU-Verfahren . . . 30

3.1.3 Blutentnahme und Konservierung der Blutproben . . . . . . . . . . . . 33

3.1.4 Bestimmung der Progesteronkonzentration im Blut . . . . . . . . . . . 34

3.2 In-vitro-Produktion boviner Embryonen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

V


Inhalt

3.2.1 Herkunft der Ovarien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

3.2.2 Vorbereitung und Selektion der Kumulus-Oozyten-Komplexe . . . . . 35

3.2.3 In-vitro-Maturation (IVM) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

3.2.4 Progesteronbestimmung im Reifungsmedium und Einteilung der Versuchsgruppen

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

3.2.5 Reifungskontrolle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

3.2.6 In-vitro-Fertilisation (IVF) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

3.2.7 In-vitro-Kultur (IVC) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

3.2.8 Beurteilung der Embryonen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

3.2.9 Archivierung von gereiften Oozyten für die mRNA-Analyse . . . . . . 39

3.3 mRNA-Analyse der Oozyten zur Darstellung qualitätsanzeigender Gentranskripte 40

3.3.1 Aufbereitung der Proben zur Isolierung der mRNA . . . . . . . . . . . 40

3.3.2 Reverse Transkription (RT) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

3.3.3 Quantitative Polymerase Kettenreaktion (qPCR) . . . . . . . . . . . . 41

3.4 Auswertung der Daten und statistische Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

4 Ergebnisse 45

4.1 OPU . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

4.1.1 Zyklusverhalten und Gelbkörpereigenschaften . . . . . . . . . . . . . 47

4.1.2 Follikelpunktion, Eizellausbeute und Oozytenqualität . . . . . . . . . . 48

4.2 Progesteronsupplementation während der In-vitro-Maturation . . . . . . . . . . 50

4.2.1 Progesteronanalyse im Medium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

4.2.2 In-vitro-Produktion nach Progesteronzusatz im Reifungsmedium . . . . 51

4.3 mRNA-Expression verschiedener Gene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

4.3.1 mRNA-Expression in OPU-KOK verschiedener Zyklusphasen . . . . . 53

4.3.2 mRNA-Expression in gereiften Oozyten nach IVM mit P4-Zusatz . . . 54

5 Diskussion 57

5.1 Zyklusverhalten während der OPU-Versuchsphase . . . . . . . . . . . . . . . . 57

5.1.1 Zwischenbrunsten und Bildung gelbkörperähnlicher Strukturen . . . . 57

5.1.2 Eigenschaften der gelbkörperähnlichen Gebilde . . . . . . . . . . . . . 59

5.2 Follikeleigenschaften, Eizellausbeute und Oozytenqualität . . . . . . . . . . . 61

5.3 MessengerRNA-Häufigkeiten in den OPU-Oozyten . . . . . . . . . . . . . . . 62

5.4 Progesteronsupplementation während der Eizellreifung . . . . . . . . . . . . . 64

5.4.1 Einfluss der Progesteronsupplementation auf die Genexpression . . . . 65

5.5 Einfluss des Progesterons auf die Eizellqualität in vivo und in vitro . . . . . . . 67

5.6 Schlussfolgerungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

5.7 Kritische Würdigung der Arbeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

6 Zusammenfassung 69

VI


7 Summary 71

A Medien und Chemikalien 73

A.1 Medien für das OPU . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

A.2 Medien für die IVP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

A.3 Medien für die Reifungskontrolle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77

A.4 Medien für den Radioimmunoassay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

A.5 Medien für die RT-qPCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

B Verzeichnis der Gesamtdaten 81

B.1 Daten aus dem OPU-Versuch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81

B.1.1 Näherungsfunktionen und Berechnungen für den Verlauf des Serumprogesteronwertes

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97

B.1.2 Progesteronverläufe der Einzeltiere . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97

B.1.3 Berechnungen aus den Funktionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99

B.2 Daten aus dem IVM-Versuch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100

B.2.1 IVP-Durchgänge der Versuchsgruppen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100

B.2.2 P4 im IVM-Medium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105

B.2.3 Reifungskontrollen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107

B.3 Daten aus der RT-qPCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109

B.3.1 OPU-Oozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109

B.3.2 IVM-Versuch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110

Abbildungen 113

Tabellen 115

Literaturverzeichnis 119

Abkürzungsverzeichnis 159

VII


text


1 Einleitung

Die erfolgreiche Weiterentwicklung der In-vitro-Produktion (IVP) von Rinderembryonen, bestehend

aus den drei methodischen Schritten der In-vitro-Maturation (IVM), In-vitro-Fertilisation

(IVF) und In-vitro-Kultur (IVC) hat in den letzten Jahren Embryonen in großer Zahl verfügbar

gemacht. Bei Verwendung von Kumulus-Oozyten-Komplexen (KOK) aus Schlachthofovarien

liegen die Effizienzen für die einzelnen Schritte bei 60-95 % für die IVM (ADONA

et al. 2008), 70-90 % für die IVF (WRENZYCKI et al. 2007) und 25-40 % für die IVC (KES-

KINTEPE und BRACKETT 1996, RIZOS et al. 2003). In Kombination mit der Ovum-Pick-Up

(OPU)-Technologie zur Gewinnung von Eizellen von lebenden Tieren liegen die Entwicklungsraten

zu einem transfertauglichen Embryo an Tag 7 ebenfalls bei 25-40 %. Somit steht

mit der kombinierten OPU-/IVP-Technologie ein alternatives Verfahren zu den klassischen

MOET-Programmen (Multiple Ovulation and Embryo Transfer, Superovulation mit anschließendem

Embryotransfer) zur Verfügung (PIETERSE et al. 1991b). Nach dem Transfer von IVP-

Embryonen auf Empfängertiere werden bei frisch transferierten Embryonen Trächtigkeitsraten

von ca. 50 % (WRENZYCKI 2007) erziehlt, beim Transfer tiefgefrorener Embryonen durchschnittlich

40 % (GALLI et al. 2001, LAZZARI et al. 2002, WRENZYCKI 2007).

Trotz der enormen Verbesserung der IVP-Systeme weisen in vitro produzierte Embryonen

nach wie vor eine schlechtere Qualität auf als in vivo gewonnene (NIEMANN et al. 2002, RI-

ZOS et al. 2002). Während die Qualität der Oozyte sich hauptsächlich auf die Anzahl der sich

entwickelnden Blastozysten auswirkt (RIZOS et al. 2002), beeinflussen die Kulturbedingungen

die Blastozysten hinsichtlich ihrer Genexpressionsmuster (WRENZYCKI et al. 2007, GAD

et al. 2012), ihrer Fähigkeit, eine Trächtigkeit zu induzieren und ihrer Gefriertauglichkeit (LO-

NERGAN et al. 2001, RIZOS et al. 2003).

Die für die IVP verwendeten KOK werden routinemässig aus Schlachthofovarien oder durch

die transvaginale, ultraschallgeleitete Follikelpunktion (OPU) gewonnen und nach morphologischen

Kriterien ausgewählt. Die Entwicklungskompetenz der Oozyten bis zur Blastozyste ist

hierbei durch den Zyklusstand des Tieres, die follikuläre Entwicklungsphase sowie die Follikelgröße

beeinflusst. Im Gegensatz zu fertilen Schlachttieren haben OPU-Spendertiere aufgrund

des ein bzw. zwei Mal wöchentlich durchgeführten OPU keinen physiologischen Zyklus (GIB-

1


1 Einleitung

BONS et al. 1994, BONI et al. 1997, PETYIM et al. 2003). Die Entfernung der antralen Follikel

auf dem Ovar induziert eine neue Follikelwelle, es erfolgt jedoch keine natürliche Ovulation.

Je nach Punktionsintervall unterbleibt auch die Ausbildung eines dominanten Follikels (GIBB-

ONS et al. 1994, GARCIA und SALAHEDDINE 1998, CARLIN et al. 1999, PETYIM et al. 2003,

LOPES et al. 2006). Somit sind auch die mit diesen Prozessen einhergehenden hormonellen

Veränderungen beeinflusst. Aus diesem Grund kann die Situation der Follikel auf den Ovarien

von Tieren, bei denen OPU angewendet wird, nicht mit denen von zyklischen Tieren verglichen

werden. Es konnte bereits ein Zusammenhang zwischen dem Gehalt an Progesteron in

der Follikelflüssigkeit mit sowohl der Morphologie als auch der Entwicklungskompetenz der

aus dem Follikel gewonnenen Eizelle hergestellt werden (HAZELEGER et al. 1995). Um die

OPU-/IVP-Technologie weiter zu verbessern, ist es deshalb notwendig, mehr über die Zusammenhänge

zwischen den hormonellen Veränderungen und der Eizellqualität sowie die Rolle des

hormonellen Umfeldes während der Eizellreifung zu erfahren.

Zur Verbesserung der IVP von Rinderembryonen wurden in den letzten Jahren verschiedenste

Versuche bezüglich der Supplementation der Medien der einzelnen Produktionsschritte durchgeführt.

Steroidhormone als natürliche Sexualhormone, deren Konzentration sich während des

natürlichen Zyklus und damit auch während des Heranreifens von Oozyten in vivo ständig verändert

(SCHAMS und BERISHA 2002), spielten dabei immer wieder eine Rolle (FUKUI et al.

1982, SIROTKIN 1992, RYAN et al. 1999, SILVA und KNIGHT 2000, MINGOTI et al. 2002). Bisher

konnten jedoch keine eindeutigen Ergebnisse bezüglich deren Einfluss gewonnen werden.

Der Wechsel vom dominierenden Estradiol zur Progesterondominanz im Follikel im Zeitraum

zwischen LH-Peak und Ovulation (DIELEMAN et al. 1983) sowie die Expression der Progesteronrezeptoren

in Oozyte und Kumuluszellen (APARICIO et al. 2011) lassen eine Rolle von

Progesteron bei der Eizellreifung vermuten (LONERGAN 2011, FAIR und LONERGAN 2012).

Nach wie vor ist diese Rolle von Progesteron jedoch nicht ausreichend definiert (LONERGAN

2011, FAIR und LONERGAN 2012). Es ist außerdem ungeklärt, ob die Beeinflussung der Oozyte

durch Steroide, insbesondere Progesteron, auf direktem oder indirektem Wege erfolgt.

Die Darstellung der mRNA-Expression bei Rinderembryonen ist in den letzten Jahren ein viel

beachtetes Thema geworden (NIEMANN und WRENZYCKI 2000). Frühe kritische Schritte der

Entwicklung, wie Zeitpunkt der ersten Teilung, Aktivierung des embryonalen Genoms, Kompaktierung

und Blastozystenbildung und -expansion können durch die Kulturmedien und die

In-vitro-Bedingungen sowie durch die Produktionsverfahren selbst in erheblichem Maße beeinflusst

werden. Diese Veränderungen betreffen sowohl eine signifikante Hoch- oder Herrunterregulation

sowie die De novo-Induktion oder Abschaltung von Genen, die für eine ungestörte embryonale,

fetale und neonatale Entwicklung von Bedeutung sind. Es konnte gezeigt werden, daß

sich das höhere Entwicklungspotenzial von in vivo gereiften Eizellen im Gegensatz zu dem in

vitro gereifter Oozyten auch auf molekularer Ebene wiederspiegelt (WRENZYCKI et al. 2007).

Obwohl die Ausgangsqualität die wohl entscheidene Rolle für die Genexpressionsmuster darstellt,

haben Untersuchungen des Einflusses der Follikelumgebung bzw. der IVM-Bedingungen

auf bovine Oozyten und die darauf folgenden embryonalen Entwicklungsstadien bis zur Blastozyste

auf molekularer Ebene bisher erst in den letzten Jahren stattgefunden [eine Übersicht

der Arbeiten findet sich bei FAIR und LONERGAN (2012)].

In dieser Arbeit soll nicht nur der Einfluss der sich ändernden peripheren Progesteronkonzentration

durch ein Corpus luteum während des natürlichen Zyklus auf die reifende Eizelle in vivo

2


untersucht werden, sondern auch die Effekte verschiedener Progesteronkonzentrationen als Zusatz

zum IVM-Medium. Dabei sollen anhand von Genexpressionsmustern die Veränderungen

auf molekularer Ebene Beachtung finden. Der Fokus liegt jedoch nicht nur auf qualitätsanzeigenden

Gentranskripten, sondern auch auf der mRNA-Expression der Progesteronrezeptoren.

3


2 Literatur

2.1 Gewinnung von Kumulus-Oozyten-Komplexen (KOK) mit der

Ovum-Pick-Up (OPU)-Methode

Das OPU ist eine flexibel einsetzbare und wiederholbare Technik, um Eizellen für die In-vitro-

Produktion (IVP) von Embryonen vom lebenden Tier zu gewinnen. Bereits 1991 wurde die Methode

als Alternative zum konventionellen Multiple Ovulation and Embryo Transfer (MOET)

bezeichnet (PIETERSE et al. 1991b).

2.1.1 Die Entwicklung des OPU

Gegen Ende der 1980er Jahre wurde das für den Menschen entwickelte OPU-Verfahren an

das Rind adaptiert (PIETERSE et al. 1988) und die Technik in den darauf folgenden Jahren

kontinuierlich verbessert. Das beinhaltete unter anderem Versuche mit verschiedenen Punktionskanülen.

Die Verwendung zweilumiger Kanülen, bei denen das eine Lumen der Entfernung

des Follikelinhaltes, das andere Lumen zur Zufuhr von Spülflüssigkeit diente, lieferte allerdings

widersprüchliche Ergebnisse (FRY et al. 1994, SASAMOTO et al. 2003). Die Verwendung von

Einmalkanülen, die nach jeder Punktion gewechselt werden, bietet sowohl aus hygienischer als

auch ökonomischer Sicht ein praktikables Handling (BOLS et al. 1995). Auch der Durchmesser

sowie die Länge des Anschliffes sind wichtige Parameter bei der Eizellgewinnung (BOLS et al.

1997, LOPES et al. 2006). Ebenso beeinflusst das Aspirationsvakuum die Ergebnisse des OPU,

insbesondere hinsichtlich der Wiederfindungsraten (BOLS et al. 1995, 1997), aber auch bezüglich

der Qualität der gewonnenen KOK (BOLS et al. 1995, 1996, WARD et al. 2000, LOPES et al.

2006). In Bezug auf die Anzahl der Kumuluszellagen kann neben der Anpassung des Aspirationsdruckes

auch die Veränderung des Durchmessers der Punktionskanüle eine Optimierung

bewirken (HASHIMOTO et al. 1999, SASAMOTO et al. 2003).

5


2 Literatur

2.1.2 Vergleich des OPU mit anderen Methoden zur Gewinnung von Eizellen

bzw. Embryonen beim Rind

Für die Gewinnung von KOK zur anschließenden IVP von Embryonen gibt es verschiedene

Verfahren. Aus Ovarien vom Schlachthof können KOK mittels Aspiration der Follikel (WARE

et al. 1989) oder durch Slicing der Ovarien (XU et al. 1992) gewonnen werden. Am lebenden

Tier wurden die transvaginale endoskopische Follikelpunktion (REICHENBACH et al. 1994),

die ultraschallgeleitete Follikelpunktion über die sakroischiale Region (CALLESEN et al. 1987)

und die transvaginale, ultraschallgeleitete Follikelpunktion [OPU; PIETERSE et al. (1988)] entwickelt.

Eine Gewinnung von in vivo produzierten Embryonen ist mittels Spülung des Uterus

möglich (HAHN 1978), was im MOET-Verfahren Anwendung findet. Über einen endoskopischen

Eingriff können tubale Embryonalstadien entnommen werden (BESENFELDER et al.

2001). Im Nachfolgenden sollen lediglich die meistgenutzten Verfahren (Gewinnung von KOK

aus Schlachthofovarien, MOET) mit der OPU-Methode verglichen werden.

Der große Vorteil des OPU gegenüber der Separation von Eizellen aus Schlachthofmaterial

ist die mehrfach mögliche Anwendung bei wertvollen Tieren (BOLS et al. 1995). Jedoch ist die

Qualität der Eizellen aus Schlachthofovarien in der Regel höher, da bei ihnen der sogenannte

„post-mortem-Effekt“ eintritt (BLONDIN et al. 1997), der eine verbesserte Entwicklungskompetenz

bedingt, und die Anzahl der Kumuluszelllagen durchschnittlich höher ist (BUNGARTZ

et al. 1995). Ein weiterer Nachteil beim OPU ist die begrenzte Anzahl an KOK, die eine Selektion

bezüglich der Qualität oft nicht zulässt (MERTON et al. 2003, CHAUBAL et al. 2006).

Vorteilhaft gegenüber dem MOET ist, dass die OPU-Technik auch bei graviden Tieren angewandt

werden kann (RYAN et al. 1990, MERTON et al. 2003). Dies bedingt nicht nur eine erhebliche

Verkürzung des Generationsintervalls (MERTON et al. 2003), sondern auch eine höhere

Anzahl von Embryonen pro Zeiteinheit (GOODHAND et al. 1999, MERTON et al. 2003). Obwohl

die Fähigkeit, eine Trächtigkeit hervorzurufen bei IVP-Embryonen gegenüber der in vivo

generierter Embryonen geringer ist (MERTON et al. 2003), ermöglicht das OPU mit anschließender

IVP die Produktion von über 50 Kälber pro Donortier im Jahr (VAN WAGTENDONK-DE

LEEUW 2006). Auch kann bei der IVP Sperma verschiedener Bullen eingesetzt werden (GALLI

et al. 2001, MERTON et al. 2003). Ferner kann im Gegensatz zum MOET beim OPU vollständig

auf den Einsatz von Hormonen verzichtet werden (BUNGARTZ et al. 1995, GALLI et al.

2004, CHAUBAL et al. 2006). Weiterhin ist eine schnelle Rückkehr der Tiere in den normalen

Zyklus nach OPU belegt (PIETERSE et al. 1991b). Es ist allerdings zu beachten, dass beim

OPU ein intensiveres „Tier-Handling“ mit entsprechenden Fähigkeiten bei der Manipulation des

Genitaltraktes, die Bereitstellung des kostenintensiven OPU-Equipments sowie entsprechender

Laboreinrichtungen für die anschließende IVP Vorraussetzung sind (BROADBENT et al. 1997).

Dies bedingt einen höheren Kostenaufwand als beim MOET (BROADBENT et al. 1997, GALLI

et al. 2004, VAN WAGTENDONK-DE LEEUW 2006). Beim OPU besteht weiterhin ein höheres

Risiko der Übertragung von infertilen Haplotypen in die Folgegeneration, da durch OPU Fertilitätsstörungen

des Donortieres in stärkerem Maße als beim MOET umgangen werden können

(VAN WAGTENDONK-DE LEEUW 2006).

6


2.2 Einfluss des OPU auf die Gesundheit des Donortieres

2.2 Einfluss des OPU auf die Gesundheit des Donortieres

Wie jeder Eingriff, sei er noch so minimal, ist auch das OPU nicht ohne Auswirkungen auf die

betroffenen Tiere. So können zum Beispiel in seltenen Fällen bedingt durch die Epiduralanästhesie

Veränderungen im Bereich der Injektionsstelle beobachtet werden, die sich in Form von

Neovaskularisation und Knorpelmetaplasie an den Intervertebralscheiben darstellen (MCEVOY

et al. 2006). Eine Beeinträchtigung der Allgemeingesundheit (SANTL et al. 1998, PETYIM et al.

2003), der Fertilität (ALLER et al. 2010) sowie der Gravidität bis zum dritten Trächtigkeitsmonat

(MEINTJES et al. 1993) scheinen jedoch nicht aufzutreten. Ebenso bleiben die Milchproduktion

sowie die somatischen Zellzahlen in Milch und Blutplasma unbeeinflusst (CHASTANT-

MAILLARD et al. 2003). Eine Rückkehr zum physiologischen Zyklus ca. 3-4 Tage nach der

letzten Punktion (CHASTANT-MAILLARD et al. 2003) mit physiologischem Verhalten (PETY-

IM et al. 2007) sowie die Möglichkeit, das MOET-Verfahren anzuwenden (BROADBENT et al.

1997), ist gegeben.

Grundsätzlich wird durch OPU der physiologische Zyklus gestört (STUBBINGS und WAL-

TON 1995, BONI et al. 1997, BOLS et al. 1998, PETYIM et al. 2000). Durch die Aspiration

der Follikel wird der Interöstrus verlängert (STUBBINGS und WALTON 1995), da die jeweils

abgesaugten Follikel durch eine neue Follikelwelle ersetzt werden müssen. Dies deckt sich mit

der Beobachtung verspäteter oder gestörter Brunsten bei OPU während der Lutealphase von

TAKUMA et al. (2010). Der Zeitpunkt des OPU, aber auch das Punktionsintervall sind wesentliche

Faktoren, die auf den Zyklus Einfluss nehmen. So konnten Bage et al. (BAGE et al. 2003)

bei einem diskontinuierlichen OPU-Regime mit Punktionen lediglich bis zum 12. Zyklustag

keine Auswirkungen auf den Zyklus beobachten. Auch die Arbeitsgruppe von PIETERSE et al.

(1991a) konnte bei OPU-Sitzungen an Tag 4, 10 und 16 des Zyklus eine normale Zyklusaktivität

feststellen. Kontinuierliche, einmal wöchentlich stattfindende OPU-Sitzungen führen dagegen

zu irregulären Zykluslängen (KLOSSOK et al. 1997), setzen die Zyklusaktivität aber nicht aus

(GIBBONS et al. 1994, BONI et al. 1997, GALLI et al. 2001, PETYIM et al. 2003). Bei zwei wöchentlichen

Follikelpunktionen sind die Beobachtungen nicht einheitlich. PETYIM et al. (2000)

beschreiben gelegentlich auftretende Zyklusaktivität und Brunsten mit regulärer Zykluslänge,

Östruslänge und physiologisch ablaufender Brunst. In den Untersuchungen der Arbeitsgruppen

um BONI et al. (1997) und GIBBONS et al. (1994) zeigte sich dagegen keine Zyklusaktivität.

2.3 Einfluss des OPU auf den ovariellen Zyklus

In Bezug auf das Ovar konnten keine wesentlichen, makroskopisch erkennbaren Veränderungen

festgestellt werden (PETYIM et al. 2007), jedoch verändert sich die Struktur des Ovars

(PETYIM et al. 2001). In einigen Fällen können Vernarbungen und Verhärtungen der Ovarien

auftreten. Verdickungen der Tunica albuginea (VAN DER SCHANS et al. 1991, PETYIM et al.

2001) sowie Fibrosierungen und hämatomartige Follikel wurden beobachtet (PIETERSE et al.

1988, VAN DER SCHANS et al. 1991, PETYIM et al. 2000). Jedoch sind jegliche Veränderungen

8 Monate nach der letzten Follikelpunktion nicht mehr sichtbar (CHASTANT-MAILLARD

et al. 2003), so dass langfristig kein negativer Effekt auf die follikuläre und luteale Aktivität des

Ovars besteht (PETYIM et al. 2000, MCEVOY et al. 2002). Eine Beeinflussung der Ovarfunktion

während längerer Zeiträume kontinuierlichen OPUs ist belegt (CARLIN et al. 1999). So

7


2 Literatur

führt das Absaugen aller Follikel zur Auslösung einer neuen Follikelwelle und kann diese sogar

synchronisieren (GARCIA und SALAHEDDINE 1998). Dies geschieht auch, wenn lediglich

die Follikel eines der beiden Ovarien abgesaugt werden (TAKUMA et al. 2008). Ein zweimal

wöchentliches OPU-Regime erhöht die Follikelwellenfrequenz (BONI et al. 1997), wobei eine

neue Follikelwelle innerhalb von 2 (GARCIA und SALAHEDDINE 1998) bzw. 3 (BONI et al.

1997) Tagen entsteht. BONI et al. (1997) beschreiben ferner einen Anstieg der Follikelzahl über

die ersten drei Monate und ein anschließendes Absinken im 4.-6. Monat.

Auf ein bestehendes Corpus luteum (C.l.) gibt es anscheinend keinen Einfluss (PIETERSE

et al. 1991a). Die Bildung C.l.-ähnlicher Strukturen aus punktierten Follikeln wird unter anderem

durch PETYIM et al. (2000) beschrieben. Für eine östrusnahe Punktion von Follikeln ist die

Bildung physiologischer Gelbkörper (PETYIM et al. 2001, 2003) beschrieben, wohingegen die

östrusferne Punktion von Follikeln zu kleineren C.l.-ähnlichen Strukturen führt, deren Progesteronproduktion

und Lebensdauer geringer ist (GIBBONS et al. 1994, PETYIM et al. 2001, 2003).

HAYASHI et al. (2006) konnten hingegen keine C.l.-Bildung bei der Punktion eines dominanten

Follikels vor dem LH-Peak beobachten. Eine Punktion nach dem LH-Peak führte in dieser

Studie zu normalen C.l.. Zusammen mit dem Zyklus werden auch die damit einhergehenden

Hormonprofile, insbesondere von Progesteron (P4), durch fehlende bzw. unzureichende Gelbkörperbildung,

Luteinisierendem Hormon (LH) und Follikel stimulierendem Hormon (FSH)

beeinflusst (CARLIN et al. 1999). In Bezug auf FSH konnte eine vermehrte Ausschüttung am

Tag nach der Follikelpunktion festgestellt werden (PETYIM et al. 2001).

2.4 Einflüsse des Zyklusstandes auf die Ergebnisse des OPU

Die Ergebnisse des OPU in Bezug auf die Anzahl der punktierten Follikel und die Eizellausbeute

werden durch vielfältige Faktoren beeinflusst. So sind das jeweils punktierte Individuum

(LANSBERGEN et al. 1995, BONI et al. 1997, GALLI et al. 2001, MERTON et al. 2003, TA-

MASSIA et al. 2003), die Ernährung des Tieres (DOMINGUEZ 1995), das Alter (SU et al. 2012)

bezogen auf den körperlichen Entwicklungsstand (GALLI et al. 2001), eine etwaige Trächtigkeit

(MORENO et al. 1993, DOMINGUEZ 1995) und die Zeit seit dem letzten Partus (RIZOS et al.

2005) von Bedeutung. Nicht auszuwirken scheint sich hingegen die Anzahl der vorangegangenen

Kalbungen (LANSBERGEN et al. 1995). Von technischer Seite aus können die Modalitäten

des Ultraschallequipments Einfluss nehmen (MERTON et al. 2003). Einfluss auf die Anzahl der

KOK besteht einerseits von Seiten des Durchführenden (LANSBERGEN et al. 1995, MERTON

et al. 2003), andererseits auch durch technische Modalitäten. So konnten etwa der Aspirationsdruck

und der Nadeldurchmesser (HASHIMOTO et al. 1999) als Faktoren benannt werden.

Die Berichte über den Einfluss des Zeitintervalls zwischen den OPU-Sitzungen sind nicht

einheitlich. So konnten VAN DER SCHANS et al. (1991), GARCIA und SALAHEDDINE (1998),

GOODHAND et al. (1999), CHAUBAL et al. (2006) und HANSTEDT (2009) bei zweimal wöchentlich

stattfindenden OPU-Sitzungen mehr Follikel aspirieren als bei einmal wöchentlicher

Punktion. Die Forschungsgruppe um RAMOS et al. (2010) punktierte im einmal wöchentlichen

Rhythmus mehr Follikel als bei zweimal wöchentlichen Sitzungen. Bezüglich der Eizellausbeute

wirkt sich ein 2-Tages-Intervall des OPU offenbar ungünstig aus, jedoch sind bei 4-5-Tages-

8


2.5 Einfluss des Zyklusstandes auf die Qualität der KOK

Intervallen anteilig mehr große Follikel vorhanden (BONI et al. 1997), welche eine schlechtere

Qualität der KOK aus den subordinaten Follikeln bewirken.

Bezüglich hormoneller Beeinflussung scheint sich die Gabe von FSH positiv auf die Follikelzahl

auszuwirken (DE ROOVER et al. 2008, ALLER et al. 2010). Auch eine Erhöhung der

Eizellausbeute ist durch hormonelle Gaben (FSH, GnRH) möglich (BORDIGNON et al. 1997,

ALLER et al. 2010).

Die Anzahl der vorhergehenden OPU-Sitzungen ist ebenfalls von Bedeutung. So ist die Follikelzahl

bei Tieren, die vorher nie der OPU-Prozedur unterzogen wurden, größer (BOLS et al.

1998). Weiterhin scheint die Follikelzahl über längere Punktionszeiträume zunächst anzusteigen,

um dann nach 4-6 Monaten wieder abzufallen (BONI et al. 1997).

Über den Einfluss des Zyklusstandes gibt es keine einheitlichen Erkenntnisse. PETYIM et al.

(2000) beobachteten eine geringere Anzahl an Follikeln bei Tieren, die ein C.l. aufwiesen, BOE-

DIONO et al. (1995) und DOMINGUEZ (1995) konnten dies jedoch nicht bestätigen.

2.5 Einfluss des Zyklusstandes auf die Qualität der KOK

Bei der Beeinflussung der Eizellqualität sind zunächst einmal technische Parameter zu nennen.

So ist belegt, dass ein hohes Vakuum einerseits zu weniger Kumuluszellen an den KOK

führt (BOLS et al. 1995) und andererseits auch die Entwicklungsraten zur Blastozyste negativ

beeinflusst (BOLS et al. 1996, WARD et al. 2000).

Hinsichtlich des Punktionsintervalles ist zu berücksichtigen, dass bei einmal wöchentlichen

Punktionen dominante Follikel ausgebildet werden können (GARCIA und SALAHEDDINE 1998,

PETYIM et al. 2003, LOPES et al. 2006). Bei einem Intervall von 3-4 Tagen entwickelt sich

kein Follikel mit ausgeprägter Dominanz, was den potenziell negativen Effekt auf die Entwicklungskompetenz

der subordinaten Follikel fehlen lässt (GIBBONS et al. 1994, BUNGARTZ et al.

1995). HENDRIKSEN et al. (2004) erhielten bei Punktionsintervallen von 2-5 Tagen mehr IVPtaugliche

KOK als bei 7-Tages-Intervallen. Im Gegensatz dazu konnte HANSTEDT (2009) keinen

Einfluss des Punktionsintervalles auf die KOK-Qualität, die IVP-Tauglichkeit sowie die

Teilungs- und Entwicklungsraten feststellen. In dieser Studie wurde ein 7-tägiges Intervall mit

3- bis 4-tägigen Punktionsabständen verglichen.

Beim 3- bis 4-Tages-Intervall liegt auch eine reduzierte Inzidenz von Atresie vor, da die Follikel

bereits vor der Atresieinduktion, welche sich am fünften Tag der Follikelwelle strukturell

manifestiert (ASSEY et al. 1994), entfernt werden (GARCIA und SALAHEDDINE 1998, GAL-

LI et al. 2001, LOPES et al. 2006). Während der Follikelatresie kommt es zu degenerativen

Prozessen, welche mit dem Schrumpfen der Eizelle und der Granulosazellen bis zum völligen

Verschwinden einhergeht (SCHNORR und KRESSIN 2001). Oozyten aus früh-atretischen Follikeln

zeigten in einigen Studien ein gutes Entwicklungspotential (BLONDIN und SIRARD 1995,

DE WIT et al. 2000), was vermutlich darauf zurückzuführen ist, dass die ersten atretischen Veränderungen

denen der Eizellreifung ähneln (ASSEY et al. 1994).

Während in einer Untersuchung keine Unterschiede in den Teilungs-und Entwicklungsraten

von KOK aus ein- bzw. zweimal wöchentlich durchgeführtem OPU beobachtet werden

konnten (CHAUBAL et al. 2006), schlossen andere Autoren in ihren Veröffentlichungen, dass

9


2 Literatur

die Teilungs- und Entwicklungsraten von aus OPU-KOK entstandenen Embryonen durch die

Dauer des Punktionsintervalles beeinflusst werden (HANENBERG und VAN WAGTENDONK-DE

LEEUW 1997, LOPES et al. 2006). So zeigten KOK aus zweimal wöchentlich durchgeführtem

OPU höhere Entwicklungsraten als solche aus einmal wöchentlichen Punktionen (LOPES et al.

2006). Einige Autoren folgern daraus, dass ein einmal wöchentliches OPU-Regime für kommerzielle

Embryotransfer-Programme inadäquat ist (LOPES et al. 2006).

2.6 Beurteilung der Entwicklungskompetenz boviner Oozyten

Grundlage einer erfolgreichen Produktion von Embryonen ist die Qualität bzw. die Entwicklungskompetenz

der in der IVP eingesetzten Oozyten. Diese wird meist funktionell definiert

und über die Fähigkeit zum Meioseabschluss, zur Befruchtung und anschließenden Teilung,

der Entwicklung zur Blastozyste, der Fähigkeit der Induktion und Erhaltung einer Trächtigkeit,

der Erhaltung der Gesundheit des Feten und schließlich der Geburt eines gesunden und fertilen

Kalbes gemessen (LONERGAN et al. 2001, SIRARD et al. 2006, ANGUITA et al. 2007). Dementsprechend

kann die Entwicklung zur Blastozyste auch als Maß für die Qualität der eingesetzten

KOK herangezogen werden. GILCHRIST und THOMPSON (2007) bezeichnen bereits die Fähigkeit

der Eizelle, über Sezernierung bestimmter Faktoren ihre Umgebung zu beeinflussen als

Teil ihrer Entwicklungskompetenz.

Eine vollständige Beurteilung der Entwicklungskompetenz bis hin zur Geburt eines vitalen

Kalbes ist in Versuchen kaum möglich. Optimal für die Effizienz der IVP wäre eine Beurteilung

der KOK schon vor ihrer Gewinnung. Aus bisherigen Untersuchungen konnten beim Rind

jedoch keine verlässlichen Indikatoren gefunden werden, um die Qualität von Eizellen aus Follikeln

bestimmter Größe vorauszusagen (KENDRICK et al. 1999). Zwar stellten PAVLOK et al.

(1992) bei Eizellen aus Follikeln der Größen >2 mm bis 8 mm keine Unterschiede der Blastozystenraten

fest, bei zwei Dritteln der eingesetzten Eizellen traten jedoch Unregelmäßigkeiten

bei Fertilisation und Entwicklung zur Blastozyste auf. Die Autoren führen dies auf atretische

Vorgänge in den Follikeln, denen diese Eizellen entstammten, zurück. Dies deckt sich mit früheren

Untersuchungen von SCARAMUZZI et al. (1980) und MCNATTY et al. (1984), die jeweils

eine höhere Inzidenz von Atresie in Follikeln < 5 mm festgestellt hatten. Auch Arbeiten von

FAIR (2003) ergaben, dass die Entwicklungskompetenz zur Blastozyste erst ab einer Follikelgröße

von 3 mm gegeben ist, da die Eizelle dann die Größe von 120 µm und somit meiotische

Kompetenz (FAIR et al. 1995, ANGUITA et al. 2007) sowie die Fähigkeit der Entwicklung bis

zur Blastozyste (OTOI et al. 1997) erreicht hat.

Eine Beurteilung der KOK hinsichtlich ihrer Qualität findet daher in der Regel nach ihrer

Gewinnung statt. Eine Einteilung aufgrund von morphologischen Kriterien zeigte sich als geeigneter

Indikator (HAZELEGER et al. 1995, BONI et al. 2002). Dabei gilt die Größe der Eizelle

als Indikator für die meiotische Kompetenz (siehe oben). Die Anzahl der Kumuluszellen sowie

die Beschaffenheit des Cumulus oophorus (MADISON et al. 1992), aber auch Anzeichen von

Degeneration der KOK wie Expansion der äußeren Kumuluszellagen und eine leichte Granulierung

des Ooplasmas werden zur Beurteilung genutzt (BLONDIN und SIRARD 1995). Ebenso

konnte inhomogenes und helles Ooplasma mit geringeren Entwicklungsraten in Zusammenhang

gebracht werden (HAZELEGER et al. 1995). Kritiker führen jedoch den limitierten Erfolg

10


2.6 Beurteilung der Entwicklungskompetenz boviner Oozyten

dieser Methode an (COTICCHIO et al. 2004). So könne anhand der genutzten Kriterien keine

endgültige Aussage über die Entwicklungskompetenz gemacht werden (HAGEMANN 1999,

MERMILLOD et al. 1999). Zum Beispiel zeigen morphologisch gute KOK aus atretischen Follikeln

eine geringere Entwicklungskompetenz als morphologisch ähnliche aus gesunden Follikeln

(JEWGENOW et al. 1999, FENG et al. 2007). Auch die Expansion des Cumulus oophorus

wird als unzuverlässiges Kriterium beschrieben (RUSSELL et al. 2006). Insbesondere vor dem

Schritt der In vitro-Reifung können Eizellen mit In vitro-Entwicklungskompetenz morphologisch

stark variieren (DE LOOS et al. 1992).

SANTOS et al. (2008) nahmen eine Einschätzung der Entwicklungskompetenz über die Anzahl

der Poren in der Zona pellucida sowie deren Durchmesser vor. Andere Autoren zogen die

Dichte der Granulosazellen in der Follikelflüssigkeit (FENG et al. 2007), den Gehalt an Wachstumshormonen

(MODINA et al. 2007), Aminosäuren (SINCLAIR et al. 2008) oder Progesteron

(HAZELEGER et al. 1995) in der Follikelflüssigkeit oder die Aktivität des Enzyms Glucose-

6-Phosphatdehydrogenase mittels Brilliant-Kresyl-Blau-Färbung (BHOJWANI et al. 2007) für

die Beurteilung heran. Während der IVP können die Formung (DOMINKO und FIRST 1992)

des Polkörpers und eine frühe Vollendung der Kernreifung während der IVM (DOMINKO und

FIRST 1997) sowie das Auftreten der Furchung nach der Fertilisation (WARD et al. 2001) als

Hinweise auf die Entwicklungskompetenz dienen.

Die Entwicklungskompetenz basiert auf multiplen Faktoren, von denen viele auf zellulärer

bzw. molekularer Ebene angesiedelt sind und deshalb nur invasiv gemessen werden können

(COTICCHIO et al. 2004). Methoden zur Beurteilung der Kompetenz auf zellulärer und molekularer

Ebene gehen zumeist mit der Zerstörung der Eizelle einher. Sie geben jedoch die

Möglichkeit, objektive Parameter zur Beurteilung der Oozytenqualität zu finden (COTICCHIO

et al. 2004). Zur Umgehung dieser destruktiven Prozesse muss eine Korrelation zwischen invasiven,

zerstörenden Methoden und nichtinvasiven, erhaltenden Methoden gefunden werden

(ANGUITA et al. 2007).

Eine gute Methode, ein weites Spektrum von Daten bezüglich der Eizellqualität zu erfassen,

stellt die Analyse der MessengerRNA(mRNA)-Expression dar (LECHNIAK 2002). Jedoch

bedingt eine erhöhte mRNA-Expression bestimmter Gene nicht immer auch erhöhte Proteingehalte

(GYGI et al. 1999), und Proteine sind nicht immer enzymatisch aktiv (SUMNER et al.

2003). Es wird deshalb nach Korrelationen zwischen der Kompetenz und den in der Follikelflüssigkeit

bzw. dem IVM-Medium zu findenden Proteinen (ELLEDEROVA et al. 2004, GUPTA

et al. 2009) und Metaboliten (SINGH und SINCLAIR 2007) gesucht.

Mit der vollständigen Sequenzierung des bovinen Genoms entstand auch die Möglichkeit

der globalen Analyse des Transkriptoms mit Hilfe von Microarray-Techniken. Im Gegensatz

zur einzelnen Analyse der Gentranskripte mittels RT-qPCR kann hier eine Vielzahl von Genen

gleichzeitig betrachtet werden. Globale Transkriptomanalysen boviner MII-Oozyten (MI-

SIRLIOGLU et al. 2006, KUES et al. 2008) sowie vergleichende Analysen reifer und unreifer

Eizellen (MAMO et al. 2011) lieferten neue Informationen über die molekularen Veränderungen

während der Eizellreifung und konnten das Vorhandensein aktiver Transkription während

der Eizellreifung belegen (MAMO et al. 2011). O’SHEA et al. (2012) gelang über eine Meta-

Analyse veröffentlichter Microarray-Daten die Identifizierung 63 potenzieller Markergene für

die Entwicklungskompetenz boviner Oozyten.

11


2 Literatur

2.7 Einfluss des Zyklusstandes auf die Entwicklungskompetenz boviner

KOK

Es gibt Hinweise auf den Einfluss des individuellen Tieres (TAMASSIA et al. 2003, GALLI et al.

2004), der Rasse (LOPES et al. 2006), des Alters (SU et al. 2012) bezogen auf die Adoleszenz

(PALMA et al. 1993, STEEVES und GARDNER 1999, RIZOS et al. 2005, MALHI et al. 2007)

und die damit verbundene Steroidbalance (SU et al. 2009), der Fütterung (DOMINGUEZ 1995,

KENDRICK et al. 1999, ADAMIAK et al. 2005), des Laktationsstatus (BUNGARTZ et al. 1995),

insbesondere bei Hochleistung (LEROY et al. 2008), und einer etwaigen Trächtigkeit (MORENO

et al. 1993) auf die Kompetenz der KOK (siehe auch 2.1). Auch die Herkunft und die Methode

der Gewinnung der KOK wirkt sich auf die Entwicklungsrate zur Blastozyste aus (GAD et al.

2012). Bei der Gewinnung von KOK aus Schlachthofovarien prägten BLONDIN et al. (1997)

den Begriff des „post-mortem-Effektes“. Diese Autoren stellten fest, dass die Zeitspanne vom

Tod des Tieres bis zur eigentlichen Eizellgewinnung über Veränderungen im follikulären Mikromilieu

die Entwicklungskompetenz der Oozyten beeinflusst.

Einer der Hauptfaktoren, die die Qualität von Eizellen beeinflussen, stellt das follikuläre

Entwicklungsstadium dar. So besteht ein deutlicher Zusamenhang zwischen Follikelgröße und

Entwicklungskompetenz der Oozyte. Eizellen aus kleinen Follikeln mit einem Durchmesser

< 3 mm haben demnach ein signifikant geringeres Entwicklungspotential als solche aus größeren

Follikeln (TAN und LU 1990, PAVLOK et al. 1992, LONERGAN et al. 1994, BLONDIN

und SIRARD 1995, RIZOS et al. 2002). Weiterhin ist die Entwicklungsrate bei Oozyten aus

nicht-atretischen, intermediären und leicht atretischen Follikeln gleich (BLONDIN und SIRARD

1995). DE WIT et al. (2000) stellten sogar mit steigender Atresie ein zunehmendes Entwicklungspotential

fest. ASSEY et al. (1994) prägten 1994 hierfür den Begriff der „Pseudomaturation“.

Lediglich hoch atretische Follikel enthalten Oozyten mit herabgesetzter Kompetenz

(DE WIT et al. 2000). Im Zusammenhang mit dem Follikelstadium wurde auch das hormonelle

Umfeld der Eizelle im Follikel betrachtet. HAZELEGER et al. (1995) fanden dabei heraus,

dass sich eine hohe Progesteronkonzentration in der Follikelflüssigkeit ungünstig auf die Eizellqualität

auswirkt. Dies deckt sich mit den Erkenntnissen von BELLIN und AX (1984), die

mit steigender Atresie höhere Progesterongehalte in der Follikelflüssigkeit nachweisen konnten.

Weiterhin ist bekannt, dass ein dominanter Follikel, insbesondere im späten Dominanzstadium,

negativ auf die Qualität der Eizellen aus den subordinaten Follikeln einwirkt (HENDRIK-

SEN et al. 2004, CHAUBAL et al. 2006). Auch bezüglich der Entwicklungskompetenz kann

daher der Zeitpunkt bzw. das Intervall der Eizellgewinnung bedeutsam sein (siehe Kap. 2.2.3).

Je länger die Dominanzphase, desto mehr degenerierte Oozyten und Embryonen treten auf (AH-

MAD et al. 1995, REVAH und BUTLER 1996, CERRI et al. 2009). REVAH und BUTLER (1996)

vermuten, das eine verfrühte nukleare Reifung der Eizellen dafür verantwortlich sei. Die Beobachtung

von vermehrter Follikelatresie bei verlängerter Dominanzphase durch OUSSAID et al.

(2000) stützt diese These. Auch andere Autoren konnten höhere Teilungs- und Entwicklungsraten

während der Wachstums- im Vergleich zur Dominanzphase feststellen (HAGEMANN 1999,

MACHATKOVA et al. 2004, NEMCOVA et al. 2006). Daher vermuten CERRI et al. (2009) einen

starken Einfluss der Länge der Dominanz auf die Entwicklungskompetenz bis Tag 6 der frühen

Embryonalentwicklung. Ein weiterer Faktor, dem ein Einfluss auf die Entwicklungskompetenz

zugeschrieben wird, ist die Anzahl der Follikel mit einer Größe von 2-5 mm auf dem Ovar.

12


2.7 Einfluss des Zyklusstandes auf die Entwicklungskompetenz boviner KOK

Befinden sich demnach weniger als 10 Follikel der Größe 2-5 mm auf dem Ovar, so sind die

Teilungs- und Entwicklungsraten zur Blastozyste der dort gewonnenen KOK deutlich verringert

(GANDOLFI et al. 1997, MODINA et al. 2007).

Bezüglich der C.l.-Präsenz zum Zeitpunkt der Eizellgewinnung gibt es keine eindeutigen

Erkenntnisse. Einige Autoren beschreiben einen Einfluss des C.l. auf die Eizellqualität (BOE-

DIONO et al. 1995, LANSBERGEN et al. 1995, STUBBINGS und WALTON 1995), PETYIM et al.

(2003) und VASSENA et al. (2003) konnten dies jedoch nicht bestätigen. Auch in den Untersuchungen

von DE WIT et al. (2000) wurde kein Einfluss des Zyklusgeschehens beobachtet.

Weiterhin wurde der gezielte Einsatz von Hormonen zur Verbesserung der Entwicklungskompetenz

untersucht. Dabei stellten BORDIGNON et al. (1997) einen positiven Effekt von GnRH

fest. Auch die Gonadotropine FSH und eCG wirken sich auf die Entwicklungsraten zu Embryonen

aus (WANG et al. 1988, SENDAG et al. 2008). Eine Aufstellung der untersuchten Parameter

und deren Einfluss auf die Entwicklungskompetenz boviner Oozyten findet sich in Tabelle 2.1.

13


2 Literatur

Tabelle 2.1: Untersuchungen zu verschiedenen Parametern und deren Einfluss auf die

Entwicklungskompetenz boviner Oozyten

Autor Parameter Kriterium Ergebnis

PLOURDE et al. (2012) Herkunft der KOK ER in vivo ER↑

in vivo vs. p. mortem

LOPES et al. (2006) Rasse Morphologie bei Holstein Qualität↑

PALMA et al. (1993) Alter Morphologie bei Adulten Qualität↑

TR, ER

TR↑, ER↑

SU et al. (2012) Alter TR, ER bei 1 Jahr alten

1 vs. 7-8 Jahre, TR↓ ,ER↓

RIZOS et al. (2005) Färse, Kuh ER bei Kühen ER↑

DOMINGUEZ (1995) Energiebilanz Morphologie Defizit Qualität↓

KENDRICK et al. (1999)

ADAMIAK et al. (2005) ER Überversorgung ER↓

BUNGARTZ et al. (1995) Reproduktionsphase Morphologie, ER während Laktation

Qualität↑, TR↑

TAN und LU (1990) TR, ER < 2 mm TR↓, ER↓

> 6 mm TR↓, ER↓

PAVLOK et al. (1992) Follikelgröße TR < 2mm TR↓

LONERGAN et al. (1994) Morphologie, ER < 2 mm Qualität↓, ER↓

BLONDIN und SIRARD (1995) ER < 2mm ER↓

DE WIT et al. (2000) Atresie ER ER↑

HAZELEGER et al. (1995) P4 in FF Morphologie hohes P4 Qualität↓

HANSTEDT (2009) foll. Blutfluss Morphologie erkennbarer Blutfluss

TR, ER Qualität↑, TR↑, ER↑

MACHATKOVA et al. (2004)

HENDRIKSEN et al. (2004) Morphologie, ER Qualität↓, ER↓

CHAUBAL et al. (2006) DF ER ER↓

NEMCOVA et al. (2006)

CERRI et al. (2009)

BOEDIONO et al. (1995) C.l. TR, ER TR↑, ER↑

DE WIT et al. (2000) ER frühe Lutealphase ER ↑

PETYIM et al. (2003) Morphologie keiner

VASSENA et al. (2003) ER keiner

BORDIGNON et al. (1997) GnRH ER ER↑

SENDAG et al. (2008) FSH, eCG Morphologie FSH Qualität↑

ER=Entwicklungsrate zur Blastozyste, TR=Teilungsrate, ↑= erhöht, ↓=verringert

2.8 Beeinflussung der follikulären Reifungsvorgänge durch peripheres

Progesteron

Nach wie vor gibt es keine klaren Beweise über den Effekt des peripher zirkulierenden Progesterons

auf die Follikelentwicklung, die Fertilisation und die frühe Embryonalentwicklung

(CERRI et al. 2011b).

14


2.9 In-vitro-Maturation (IVM) boviner Oozyten

Durch die Studien von SANGSRITAVONG et al. (2002) wurde bekannt, dass die hohe Futteraufnahme

während der Hochlaktation zu einem erhöhten Leberblutfluss sowie einer hohen

Stoffwechselaktivität führt und sich dadurch die Menge an zirkulierendem P4 und E2 verringert.

Den schnelleren metabolischen Abbau von P4 und E2 sehen die Autoren als Ursache für

die herabgesetzte Fertilität hochleistender Milchkühe.

WILTBANK et al. (2006) beobachteten Veränderungen im Follikelwellenmuster infolge niedriger

P4-Konzentrationen im Blut. Ausserdem scheint eine kurze P4-Exposition in kleineren

ovulatorischen Follikeln zu resultieren, ohne dabei die Trächtigkeitsraten oder die Embryonenqualität

zu beeinflussen (CERRI et al. 2011b, DIAS et al. 2012). Zunehmend häufen sich die Hinweise,

dass sowohl Zeitpunkt und Konzentration der P4-Exposition für die Beeinflussung der

Fertilität insbesondere auf Follikel-/Eizellebene die entscheidende Rolle spielen (WILTBANK

et al. 2011). So assoziierten CERRI et al. (2011a) Veränderungen in der Follikelflüssigkeitskomposition,

der C.l.-Lebensdauer sowie eine geringere Fertilität mit niedrigen P4-Konzentrationen

während der follikulären Entwicklung. Dabei waren die Estradiolgehalte der Follikelflüssigkeit

des dominanten Follikels deutlich erhöht, während IGF-1 in geringeren Mengen enthalten war.

Auch SHAHAM-ALBALANCY et al. (2001) und FORTUNE et al. (2001) stellten erhöhte E2-

Konzentrationen in der Follikelflüssigkeit nach niedrigen Blut-P4-Gehalten fest.

Viele Autoren vermuten den Effekt des peripheren P4 in der Beeinflussung der LH-Ausschüttung

(CERRI et al. 2011b,a, RIVERA et al. 2011, PURSLEY und MARTINS 2011). Schon IRE-

LAND und ROCHE (1982) entdeckten erhöhte LH-Pulsfrequenzen bei niedrigem Blut-P4. Spätere

Arbeiten von ROBERSON et al. (1989), SIROIS und FORTUNE (1990), CERRI et al. (2011b),

RIVERA et al. (2011) bestätigen dies. Eine hohe LH-Pulsfrequenz beschleunigt laut FORTUNE

et al. (2001) das Follikelwachstum und wird mit einer verfrühten Eizellreifung im Follikel (RE-

VAH und BUTLER 1996) und dementsprechend einer verminderten Eizellqualität (REVAH und

BUTLER 1996, DENICOL et al. 2012) sowie einer schlechteren frühen Embryonalentwicklung

(AHMAD et al. 1995, CERRI et al. 2011b,a, RIVERA et al. 2011) in Verbindung gebracht.

In der follikulären Wachstumsphase und während der Selektion des dominanten Follikels

scheinen sich hohe periphere P4-Konzentrationen positiv auf die Entwicklungsraten und die

Fertilität auszuwirken (CUNHA et al. 2008, BISINOTTO et al. 2010, BISINOTTO und SANTOS

2011, NASSER et al. 2011, RIVERA et al. 2011, WILTBANK et al. 2011, PURSLEY und MAR-

TINS 2011). Ein möglicher Einfluss des zirkulierenden P4 auf später ablaufende Vorgänge der

frühen Embryonalentwicklung wird daher diskutiert (CERRI et al. 2009, NASSER et al. 2011,

RIVERA et al. 2011).

2.9 In-vitro-Maturation (IVM) boviner Oozyten

Grundsätzlich besteht die IVP aus drei methodischen Schritten (siehe Abbildung 2.1). Zuerst die

In-vitro-Reifung oder -Maturation (IVM), danach die In-vitro-Fertilisation oder -Befruchtung

(IVF) und schlussendlich die mehrtägige In-vitro-Kultur [IVC; WRIGHT und BONDIOLI (1981),

BALL et al. (1984), NIEMANN und MEINECKE (1993), WARD et al. (2002), SIRARD et al.

(2006)]. An dieser Stelle soll lediglich auf die Reifung (IVM) der Oozyten eingegangen werden.

15


2 Literatur

Abbildung 2.1: Schematische Darstellung der IVP beim Rind; modifiziert nach NIEMANN

und MEINECKE (1993)

Mittels OPU-Technik am lebenden Tier oder aus Schlachthofovarien post mortem per Aspiration

oder Schneidemethode [Slicing, ECKERT und NIEMANN (1995)] gewonnene KOK werden

anhand morphologischer Kriterien in IVP-taugliche und nicht-IVP-taugliche eingeteilt. IVPtaugliche

KOK zeichnen sich durch mindestens eine vollständige Lage kompakten Kumulus

und ein homogen dunkles Ooplasma aus (NIEMANN und MEINECKE 1993). Die Kumuluszellen

sind wichtig für die Herstellung eines Mikromilieus aus Stoffwechselprodukten und Sekretionsprodukten,

welches letzlich für die Penetration durch das Spermium wichtig ist (TANGHE et al.

2003). Eine Entfernung der Kumuluszellen vor der IVF wirkt sich negativ auf die Befruchtung

der Eizellen aus (FATEHI et al. 2002). Im Anschluss an die Selektion der KOK beginnt die 24-

stündige IVM. Während dieser Zeit wird die zuvor im Ovar arretierte Prophase beendet und die

meiotische Teilung fortgesetzt (NIEMANN und MEINECKE 1993, RÜSSE und SINOWATZ 1994,

SIRARD et al. 2006, SIRARD und COENEN 2006). Je nach Zustand der Eizellen und Mediumkomposition

sind Maturationsraten von 66-95 % der eingesetzten Oozyten möglich (ADONA

et al. 2008).

2.10 Beeinflussung der Eizell- und Embryonenqualität

Ein wesentlicher Beitrag zum Erfolg der IVP wird durch die Qualität der eingesetzten KOK geleistet

(siehe Kap. 2.2.3). Während die Eizellqualität die Ausbeute an Embryonen bestimmt, ist

die Embryonenqualität unter anderem von den in den einzelnen Schritten eingesetzten Medien

16


2.11 Einfluss der Maturationsbedingungen auf die Eizell- und Embryonenqualität

abhängig. Anfangs wurden komplexe Medien wie das Tissue Culture Medium 199 (TCM199)

mit dem Zusatz von undefinierten Stoffen wie zum Beispiel Serum, semidefinierten Stoffen wie

Bovines Serum Albumin (BSA) oder definierten Stoffen wie das Makromolekül Polyvinylalkohol

(PVA) verwendet (EYESTONE und FIRST 1989). Obwohl diese Medien erfolgreich in

der IVP eingesetzt wurden, erfolgte eine Weiterentwicklung der Kultursysteme, um die Embryonenqualität

zu verbessern. Dies diente besonders dem Ziel, die Problematik des Large Offspring

Syndromes (LOS) zu lösen. Das LOS wird durch signifikant höheres Geburtsgewicht,

Polyhydramnion, Hydrops fetalis, verändertes Organwachstum, Defekte von Plazenta, Skelett

und Immunsystem sowie eine hohe perinatale Mortalität charakterisiert (WALKER et al. 1996,

KRUIP und DEN , DAAS 1997, YOUNG et al. 1998, RENARD et al. 1999, SINCLAIR et al. 2000).

Deshalb wurden einfache Medien entwickelt, die häufig auf Modifikationen des Synthetic Oviduct

Fluid (SOF)-Mediums (TERVIT et al. 1972) basieren, bei denen Polyvinylpyrrolidon (PVP)

oder PVA zugesetzt werden (KESKINTEPE und BRACKETT 1996). Auch das Hamster Embryo

Culture Medium (HECM) zählt zu diesen einfachen Medien. Bei Verwendung von TCM199,

SOF oder HECM können Entwicklungsraten von mehr als 40 % erreicht werden (KESKINTEPE

und BRACKETT 1996, KRISHER et al. 1999, FERGUSON et al. 2004). Es konnte gezeigt werden,

dass die Entwicklungsraten in definierten Medien niedriger sind als bei der Verwendung

semidefinierter (mit BSA-Zusatz) oder undefinierter (mit Serum-Zusatz) Medien (ECKERT und

NIEMANN 1995, KESKINTEPE und BRACKETT 1996, WRENZYCKI et al. 1999). Trotz dieser

Verbesserungen ist die Qualität in vitro produzierter Embryonen immer noch deutlich schlechter

als die in vivo gewonnener (NIEMANN et al. 2002, RIZOS et al. 2002). So können nach

dem Transfer von IVP-Embryonen Trächtigkeitsraten von 30-40 % erziehlt werden, nach Embryotransfer

oder nach künstlicher Besamung (KB) 50-70 % (MOORE und THATCHER 2006).

Im Allgemeinen wird auch von höheren Verlusten während der Trächtigkeit berichtet (HASLER

et al. 1995, GALLI et al. 2001). MARQUANT-LE GUIENNE et al. (1989) stellten eine geringere

Anzahl an Zellen der Inner Cell Mass (ICM) bei IVP-Embryonen im Vergleich zu in vivo

generierten fest. Die Qualität eines Embryos zeichnet sich nicht nur durch die Fähigkeit, eine

Trächtigkeit zu induzieren und zu erhalten aus. Auch Parameter wie die Morphologie, die zeitliche

Abfolge der Entwicklung sowie die Kryotoleranz sind qualitätsanzeigend (WRENZYCKI

et al. 2005a). Eine langsamere Entwicklung in vitro (BARNES und EYESTONE 1990, GRIS-

ART et al. 1994) sowie eine geringere Kryotoleranz (RORIE et al. 1990, VOELKEL et al. 1992)

konnten schon in den 1990er Jahren belegt werden. JIANG et al. (1992) zeigten in ihrer Arbeit,

dass die Gesamtzellzahl des Trophoblasten ein gutes Kriterium zur Beurteilung der Qualität

darstellt. Andere Autoren konnten einen Zusammenhang der Qualität mit der Fähigkeit zum

Glukosestoffwechsel nachweisen (KRISHER et al. 1999, STEEVES und GARDNER 1999, HER-

RICK et al. 2006). Auf molekularer Ebene konnte die Expression bestimmter Gentranskripte als

Indikator für die Embryonenqualität identifiziert werden (WRENZYCKI et al. 2007).

2.11 Einfluss der Maturationsbedingungen auf die Eizell- und Embryonenqualität

Wie vorhergehend angedeutet, nehmen die IVP-Bedingungen entscheidenden Einfluss auf die

sich entwickelnden Embryonen und ihre spätere Güte. So kann allein die Dauer der Reifung die

Ergebnisse bezüglich der Teilungs- und Entwicklungsraten wesentlich verändern (WARD et al.

17


2 Literatur

2002, PARK et al. 2005, AGUNG et al. 2006). Allgemein hat sich dabei herausgestellt, dass eine

Reifungszeit von 18-24 h optimal ist. Längere Reifungszeiten führen zu einer sich negativ

auswirkenden „Überreife“ (HYTTEL et al. 1986). Auch die Sauerstoffkonzentration während

der Reifung wurde hinsichtlich ihres Einflusses untersucht. Die Ergebnisse differieren stark.

Während HASHIMOTO et al. (2000) höhere Entwicklungsraten bei 5 % O 2 erzielten, wirkte

sich die gleiche Sauerstoffkonzentration in Versuchen von PINYOPUMMINTR und BAVISTER

(1995) und OYAMADA und FUKUI (2004) negativ aus. Die Untersuchungen von ABELE et al.

(2012) konnten hinsichtlich der Teilungs- und Entwicklungsraten und der Embryonenmorphologie

keinen Unterschied zwischen bei 20 % O 2 gereiften und bei 5 % O 2 gereiften KOK feststellen.

Allerdings ist die Sauerstoffkonzentration wohl durchaus im Zusammenhang mit der

Glukoseverfügbarkeit zu untersuchen. HASHIMOTO et al. (2000) konnten bei sinkendem O 2

und gleichzeitig steigender Glukosekonzentration erhöhte Entwicklungsraten beobachten.

Die Komposition des IVM-Mediums kann die Entwicklungskompetenz boviner Oozyten ebenfalls

beeinflussen. So verändert der Gehalt an Serum (KORHONEN et al. 2010), Wachstumsfaktoren

(IZADYAR et al. 1998) oder Leptin (PAULA-LOPES et al. 2007) im Reifungsmedium die

Ergebnisse hinsichtlich der Teilungs- und Entwicklungsraten. In den letzten Jahren wurden verschiedene

Stoffe hinsichtlich ihres Einflusses auf die IVM geprüft. Die Tabelle 2.2 gibt eine

Übersicht der untersuchten Zusätze und deren Effekt.

18


2.12 Einfluss der Steroidsupplementation während der IVM

Tabelle 2.2: Effekte verschiedener Zusätze zum IVM-Medium auf die Entwicklungsraten

in der IVP boviner Embryonen

Autor Substrat Effekt

LONERGAN et al. (1994) Follikelflüssigkeit (FF) keiner

ALI et al. (2004) FF kompetenter Follikel positiv

TAKAGI et al. (1998) FF aus Zysten positiv

KONISHI et al. (1996) Granulosazellen positiv

IZADYAR et al. (1998) FSH, Wachstumshormone positiv

FUKUI (1989) FSH, LH, Estradiol (E2) keiner

BOEDIONO et al. (1994) LH keiner

LU et al. (1987), ECS positiv

XU et al. (1988)

HARPER und BRACKETT (1993) EGF positiv

LONERGAN et al. (1996)

SALHAB et al. (2011)

MAILLARD et al. (2010) Adiponectin keiner

PAULA-LOPES et al. (2007) Leptin positiv

ARIAS-ALVAREZ et al. (2011) Leptin negativ bei 100 ng/ml

CORDOVA et al. (2011) Leptin keiner

ADONA et al. (2011) Leptin keiner

Cysteamin

keiner

BDNF

keiner

DE WIT und KRUIP (2001) Harnstoff negativ

JORRITSMA et al. (2004) ungesättigte FS negativ

VAN HOECK et al. (2011)

KORHONEN et al. (2010) FS-freie IVM negativ

KORHONEN et al. (2010) Protein- und Hormon-freie IVM negativ

KORHONEN et al. (2010) Serum-freie IVM negativ

WARZYCH et al. (2007) Polyvinylpyrrolidon (PVP40) negativ

BOEDIONO et al. (1994) Glukose, FS, Cholesterol niedriger Gehalt positiv

2.12 Einfluss der Steroidsupplementation während der IVM

Aufgrund ihrer ständigen Präsenz im Organismus während des Sexualzyklus sowie der sich

verändernden Konzentrationen in der Follikelflüssigkeit, rückten auch die Sexualsteroide Progesteron

(P4), Testosteron (T) und Estradiol (E2) in den Fokus der Forschung. Die Erkenntnisse

an verschiedenen Spezies liefern dabei wertvolle Hinweise auf deren Wirkungen, sind aber offenbar

in Abhängigkeit von der Spezies sehr unterschiedlich.

Bei Amphibien konnte mit Hilfe von markiertem Progesteron eine die meiotische Reifung

auslösende Steroid-Eizell-Interaktion nachgewiesen werden (BANDYOPADHYAY et al. 1998).

MOOR et al. (1980) stellten in ihren Studien an Schafoozyten fest, dass Änderungen im follikulären

Steroidprofil während der Reifung zu Abnormalitäten führen, die sich besonders auf die

IVF auswirken. Ein Zusatz von Steroiden zum Reifungsmedium von Schweinen ist offenbar

nicht erforderlich, da laut DODE und GRAVES (2002) die essentiellen Steroide durch die KOK

19


2 Literatur

selbst sezerniert werden. Bei Zusatz von 100 µM Progesteron zum Reifungsmedium von Kaninchenoozyten

findet eine reversible Blockade wesentlicher Reifeschritte statt, 10 µM scheinen

dagegen keinen Effekt zu haben (SMITH et al. 1978).

Beim Rind konnten bisher jedoch noch keine eindeutigen Aussagen über Beziehungen zwischen

den Teilungs- und Entwicklungsraten oder der Embryonenqualität und der Präsenz dieser

Hormone bzw. deren Konzentrationen im Reifungsmedium gemacht werden. Der Nachweis

von Progesteronrezeptoren (PGR) an bovinen KOK gibt jedoch Hinweise auf eine Beteiligung

von P4 bei Reifungsprozessen und der Erlangung der Entwicklungskompetenz (APARICIO et al.

2011). Eine Übersicht der Arbeitsgruppen, die den Einfluss verschiedener Steroide während der

IVM von Rinder-KOK untersucht haben sowie deren Ergebnisse findet sich in Tabelle 2.3.

Tabelle 2.3: Effekte verschiedener Steroidsupplementationen im IVM-Medium für

Rinder-KOK

Autor Hormon Konzentration Effekt

(µmol/l)

FUKUI et al. (1982) P4 3,2 keiner

E2 3,2 positiv

RYAN et al. (1999) P4 0,32-3,2 positiv mit Gonadotropinen

E2 0,32-3,2 negativ

SIROTKIN (1992) P4 0,16/0,8/3,2/16 positiv

E2 0,016/0,16/0,32/1,6/3,2/16 stimuliert Reinitiation

T 0,032/0,32/3,2/16 keiner

SILVA und KNIGHT (2000) P4 0,3 negativ

T 0,1 keiner

MINGOTI et al. (2002) P4 3,2/8/16/32 erhöht E2-Gehalt

T 3,2/8/16/32 erhöht E2-Gehalt

E2 3,2/8/16/32 erhöht P4-Gehalt

Einige Autoren (SILVA und KNIGHT 2000) orientieren sich dabei an physiologisch in der

Follikelflüssigkeit vorkommenden Konzentrationen. In Bezug auf den Steroidgehalt der Follikelflüssigkeit

sind je nach Zeitpunkt der Entnahme im Zyklus (KRUIP und DIELEMAN 1985,

WISE 1987, EISSA 1996), aber auch abhängig von der Größe der Follikel (KRUIP und DIELE-

MAN 1985, WISE 1987, DE LOS REYES et al. 2006, MONNIAUX et al. 2008) sehr unterschiedliche

Werte gemessen worden. Der Entwicklungsstand des einzelnen Follikels (wachsend, statisch,

Atresiegrad, Dominanz) führt ebenfalls zu unterschiedlichen Steroidnachweisen (KRUIP

und DIELEMAN 1985, MARTIN et al. 1991, TAKAGI et al. 1993, PRICE et al. 1995). FORTUNE

und HANSEL (1985) untersuchten sogar lediglich die Follikelflüssigkeit von präovulatorischen

Follikeln im Zeitraum vom Proöstrus bis 24 h nach dem Östrus. DIELEMAN et al. (1983) teilten

die Zeit vom Beginn des Östrus bis zur Ovulation anhand des LH-Peaks ein. Sie fanden

dabei heraus, dass die Zeit vor dem LH-Peak durch hohe E2-Konzentrationen (6,05 µmol/l)

gekennzeichnet ist und P4 erst nach dem LH-Peak ansteigt (P4 vor LH-Peak 0,39 µmol/l, nach

LH-Peak 0,73 µmol/l). Alle untersuchten Steroidhormone (E2, P4, T) verringern sich im Zeitraum

6-12 h nach dem LH-Peak. Für E2 und T hält dies bis zur Ovulation an. Für P4 konnte

allerdings ein massiver Anstieg in der Zeit 20 h nach LH-Peak (0,39 µmol/l) bis zur Ovulation

20


2.13 MessengerRNA-Expression entwicklungsrelevanter Gene in bovinen Oozyten und

Embryonen

(1,51 µmol/l) gemessen werden. Geht man davon aus, dass physiologischerweise die Eizelle in

der Zeit des Östrus bis zur Ovulation ihre zweite Reifeteilung vollzieht, so ist dieser Vorgang

offensichtlich in ein Milieu mit wechselnden Steroidkonzentrationen eingebettet.

In Bezug auf die Kultur der fertilisierten Oozyten gibt es ebenfalls Hinweise auf Beeinflussungen

der präimplantatorischen Embryonalentwicklung durch Steroide, insbesondere P4

(REGGIO et al. 1997, GOFF und SMITH 1998, SHIMADA und TERADA 2002, FERGUSON et al.

2004, MERLO et al. 2006). Auch diesbezüglich sind die Ergebnisse allerdings nicht einheitlich

und werden kontrovers diskutiert.

2.13 MessengerRNA-Expression entwicklungsrelevanter Gene in

bovinen Oozyten und Embryonen

Der Begriff Transkription bezeichnet die durch verschiedene regulierende Mechanismen gesteuerte

Synthese von RNA nach Vorlage der DNA. So entstehende mRNA dient als Matrize

für die Proteinsynthese. Die jeweilige mRNA wird abhängig vom Wachstum und dem zeitlichen

Entwicklungsverlauf in speziesspezifischen Mustern exprimiert (NIEMANN und WRENZYCKI

2000).

Die präimplantatorische Embryonalentwicklung beruht auf der korrekten Umsetzung des genetischen

Programms der Eizelle bzw. des Embryos in Form einer gut abgestimmten Expression

maternaler bzw. maternaler und embryonaler Gene (KIDDER 1992) in einem geeigneten Umfeld.

Der Embryo durchläuft während dieser frühen Entwicklungsphase die ersten Teilungen,

die (Haupt-)Aktivierung des embryonalen Genoms im 8- bis 16-Zell-Stadium, die Kompaktierung

zur Morula sowie die Ausbildung der Blastozyste und die damit verbundene erste Differenzierung

der embryonalen Zellen in die ICM und das Trophektoderm (TE). Es ist bekannt, dass

sich die Expression entwicklungsrelevanter Gentranskripte bei in vivo und in vitro generierten

Embryonen deutlich unterscheidet (WRENZYCKI et al. 1998, KEPKOVA et al. 2011, PLOUR-

DE et al. 2012). Die Veränderungen in den Genexpressionsmustern können sich als Hoch- oder

Herunterregulierung, De novo-Induktion oder Stillegung von Genen äußern (WRENZYCKI et al.

2005b). Dies kann eine verringerte Qualität der Embryonen bedingen, die sogar die Überlebensfähigkeit

der Nachkommen nach einem Transfer beeinflussen könnte (WRENZYCKI et al. 2007)

und zu abnormalen Entwicklungen, wie sie zum Beispiel unter dem Begriff des zuvor bereits

erwähnten LOS zusammengefasst werden, führen (WRENZYCKI et al. 2005b). Dementsprechend

können die den Veränderungen unterliegenden Transkripte als Marker für die Qualität

und Entwicklungskompetenz angesehen werden (LEQUARRE et al. 1997, WRENZYCKI et al.

1999, 2001, NEMCOVA et al. 2006).

In der IVP können die einzelnen Schritte der präimplantatorischen Embryonalentwicklung

durch die Maturations- und Kulturbedingungen über eine veränderte Expression wichtiger Gentranskripte

wesentlich beeinflusst werden (WRENZYCKI et al. 1999, NIEMANN und WRENZY-

CKI 2000, LONERGAN et al. 2001, WRENZYCKI et al. 2001, NIEMANN et al. 2002, WREN-

ZYCKI et al. 2004, SAGIRKAYA et al. 2006, DRIVER et al. 2012, GAD et al. 2012). Dabei wird

die Reichhaltigkeit an bestimmten Gentranskripten nicht nur durch das Basismedium, sondern

auch durch Proteinsupplementation (WRENZYCKI et al. 1999, 2001, SAGIRKAYA et al. 2006,

WRENZYCKI et al. 2007) oder Makromoleküle (WARZYCH et al. 2007) beeinflusst. Insbeson-

21


2 Literatur

dere die Präsenz exogener Proteine scheint einen stadienabhängigen Einfluss auf den Zeitpunkt

und die Schwere der Veränderungen in den Genexpressionsmustern zu haben (WRENZYCKI

et al. 1999).

Bisher gibt es nur lückenhafte Erkenntnisse über den Effekt der Reifungsumgebung auf die

Genexpression. Dabei sind die während der Reifung ablaufenden Schritte der Polyadenylation

der RNA, der Spindelformation sowie Anordnung und Trennung der Chromosomen besonders

störanfällig (FAIR 2010). Längere Zeit wurde davon ausgegangen, dass während der Reifungsphase

kaum aktive Translation stattfindet (FAIR et al. 1995), sondern vielmehr ein während der

Wachstumsphase angelegter Vorrat an Transkripten die Entwicklung bis zur Aktivierung des

embryonalen Genoms vorantreibt. MAMO et al. (2011) entdeckten in einer Studie, dass der angelegte

Vorrat an Transkripten während der Reifung zwar schrumpfte, gleichzeitig aber eine

Überexpression bestimmter Gene stattfand, die das Vorhandensein von Transkription vermuten

lässt, welche offenbar den schwindenden Vorrat ergänzt bzw. aufstockt. Dies lässt Spekulationen

über Einflüsse der Reifungsumgebung auf die Genexpression zu, wie sie auch schon durch

andere Autoren vermutet wurden (WRENZYCKI et al. 1999, WATSON et al. 2000, LONERGAN

et al. 2003a,b, HUMBLOT et al. 2005, WARZYCH et al. 2007). KUES et al. (2008) und KATZ-

JAFFE et al. (2009) wiesen einen Unterschied in den Genexpressionsmustern zwischen in vivo

und in vitro gereiften Oozyten im Meiose-II-Stadium nach. In den Studien von HANSTEDT

(2009) zeigten Oozyten, die mittels der OPU-Technik in einem Intervall von 7 Tagen gewonnen

wurden, eine Herrunterregulation von 4 qualitätsanzeigenden Genen gegenüber Eizellen, die im

3- bis 4-Tages-Intervall gewonnen wurden. WATSON et al. (2000) zeigten eine Beeinflussung

der mRNA-Mengen durch die Komposition des IVM-Mediums. Supplementation des Reifungsmediums

mit Serum (WRENZYCKI et al. 1999, CALDER et al. 2001, 2005, SAGIRKAYA et al.

2007, WARZYCH et al. 2007), Makromolekülen [PVA; WRENZYCKI et al. (1999)] oder Leptin

(PAULA-LOPES et al. 2007) wirkt sich ebenfalls deutlich auf die Transkription aus. Eine detaillierte

Darstellung der einzelnen Supplemente sowie der beeinflussten Transkripte findet sich in

dem Übersichtsartikel von WRENZYCKI et al. (2007).

Im Folgenden sollen einige entwicklungsrelevante Gene, die sich als von äußeren Faktoren

beeinflusst gezeigt haben [eine Übersicht der Veröffentlichungen findet sich bei WRENZYCKI

et al. (2007)], näher beschrieben werden. Sie gelten als Markergene zur Einschätzung der Eizellbzw.

Embryonenqualität bezüglich ihrer Herkunft bzw. der angewandten biotechnischen Verfahren.

Davon sind Growth and Differentiation Factor 9 (GDF9) und Bone Morphogenetic Protein

15 (BMP15) an der Follikulogenese beteiligt, Hypoxia Inducible Faktor 2-α (HIF2α) an

der Stressprotektion und der Glukosetransporter 1 (SLC2A1) am Energiestoffwechsel.

2.13.1 Growth and Differentiation Factor 9 (GDF9)

Beim Growth and Differentiation Factor 9 (GDF9) handelt es sich um ein Polypeptid der Transforming

Growth Factor (TGF)-β-Superfamilie. Von anderen Mitgliedern dieser Familie unterscheidet

es sich durch Unterschiede im COOH-Terminus und durch das Fehlen des vierten und

siebten der sieben Cysteine im Bereich des COOH-Endes (MCPHERRON und LEE 1993). Die

Sequenz für GDF9 wurde zuerst bei der Maus entdeckt (MCPHERRON und LEE 1993). Ein

Knockout dieses Gens führt bei weiblichen Mäusen zu kompletter Infertilität, da die Follikel-

22


2.13 MessengerRNA-Expression entwicklungsrelevanter Gene in bovinen Oozyten und

Embryonen

entwicklung nur bis zum Primärfollikel stattfindet (DONG et al. 1996). Auch eine Follikelatresie

findet bei solchen Mäusen nicht statt. Dies lässt vermuten, dass der Block der Follikelentwicklung

vor der Erlangung der Atresie-Fähigkeit stattfindet (DONG et al. 1996). Bei Rindern

führte die Immunisierung gegen GDF9 zu einer veränderten Follikelentwicklung bezüglich Anzahl

und Größe der Follikel und teils erhöhten, teils verringerten Ovulationsraten (JUENGEL

et al. 2009). Über die Regulation von Schlüsselfunktionen der Granulosazellen ist GDF9 an der

Proliferation selbiger beteiligt (SPICER et al. 2006). Weiterhin ist es mitverantwortlich für die

Kumuluszell-Expansion und die Erhaltung des die Eizelle umgebenden Mikromilieus (ELVIN

et al. 1999). Bisher wurde vermutet, dass GDF9 ausschliesslich von Eizellen sezerniert wird

(ERICKSON und SHIMASAKI 2000). Neuere Untersuchungen von HOSOE et al. (2011) konnten

die Expression von GDF9 jedoch auch in Kumuluszellen nachweisen. Die mRNA von GDF9

ist ab dem Primordialfollikel (BODENSTEINER et al. 1996) über die Reifung und Fertilisation

bis zum 5- bis 8-Zell-Stadium nachweisbar (SENDAI et al. 2001, PENNETIER et al. 2004). In

Studien von SOMFAI et al. (2011) verringerte sich der Gehalt von GDF9 in der Oozyte während

der IVM unabhängig von der Medienkomposition. Eizellen aus Follikeln mit einer Größe

von ≥5 mm enthalten deutlich mehr Transkripte von GDF9 als solche aus Follikeln ≤2 mm

(DONNISON und PFEFFER 2004). Bei der Eizellgewinnung mit dem OPU-Verfahren hat sich

gezeigt, dass bei einer Punktion im 7-Tages-Intervall die Transkriptmenge von GDF9 in den

Oozyten signifikant geringer ist als beim 3- bis 4-Tages-Intervall (HANSTEDT 2009). Neuere

Untersuchungen von CHU et al. (2012) zeigten eine höhere GDF9-Expression in 2-6 h vor dem

LH-Peak gewonnenen Oozyten gegenüber 22 h nach dem LH-Peak. Beim Vergleich in vivo gereifter

Eizellen mit in vitro gereiften ist eine deutliche Herunterregulierung des Gens festzustellen

(LONERGAN et al. 2003a). HUSSEIN et al. (2006) zeigten, dass ein Zusatz von GDF9 zum

In vitro-Reifungsmedium die Blastozystenrate tendenziell, in Kombination mit BMP15 signifikant

erhöht. Eine Antagonisierung von GDF9 und/oder BMP15 senkte die Blastozystenrate in

selbiger Studie deutlich herab. HOSOE et al. (2011) fanden heraus, dass in Ovarien von Kälbern

wesentlich weniger GDF9-Transkripte vorhanden sind als in Eierstöcken adulter Tiere. Diese

Autoren sehen hier einen möglichen Grund für die geringere Entwicklungskompetenz von Oozyten

aus Kälberovarien. Auch GENDELMAN et al. (2010) stellen eine Verbindung zwischen

Entwicklungskompetenz und GDF9-Expression her. Diese Arbeitsgruppe stellte eine saisonal

unterschiedliche Transkriptmenge in Zweizellembryonen fest und sehen hier den Grund für die

geringere Entwicklungskompetenz von Eizellen, die in der heißen Jahreszeit gewonnen werden.

2.13.2 Bone Morphogenetic Protein 15 (BMP15)

Auch das Protein BMP15 gehört zur TGF-β-Superfamilie. Es unterscheidet sich von anderen

Familienmitgliedern durch das Fehlen des vierten der sieben Cysteine in der COOH-terminalen

Region, welches die kovalente Bindung von Dimeren bedingt (DUBE et al. 1998). Das Gen,

auf dem BMP 15 kodiert, ist hochkonserviert und befindet sich auf dem X-Chromosom (DUBE

et al. 1998). Bei Mäusen wird BMP15 nur in Oozyten beginnend im Primärfollikel bis über die

Ovulation hinaus exprimiert (DUBE et al. 1998). Beim Rind konnten Transkripte für BMP15

von der Oozyte bis ins Blastozystenstadium hinein nachgewiesen werden (EL-SAYED et al.

2006). Dies deutet auf eine sowohl maternale als auch embryonale Expression hin. Neuere

23


2 Literatur

Untersuchungen konnten auch die mRNA-Expression des Gens in Kumuluszellen darstellen

(HOSOE et al. 2011).

Versuche mit BMP15-Knockout-Mäusen ergaben eine Subfertilität bei weiblichen Mäusen,

wohingegen die Fertilität männlicher Mäuse nicht beeinträchtigt schien. An den weiblichen

Tieren konnten minimale histopathologische Defekte an den Ovarien, weniger Ovulationen und

geringere Fertilisationsraten beobachtet werden (YAN et al. 2001). Eine zusätzliche partielle

Ausschaltung des GDF9-Gens bewirkte weitere Veränderungen in Form von geschwächten

Oozyten-Kumuluszell-Bindungen und einem Verbleiben der Eizelle im Follikel nach der Ovulation.

Eine zusätzliche völlige Ausschaltung von GDF9 führte zu vermehrter ein- bzw. beidseitiger

Zystenbildung (YAN et al. 2001).

Eine kurzzeitige Immunisierung gegen BMP15 und GDF9 bewirkt bei Schafen eine erhöhte

Ovulationsrate, die scheinbar ohne negative Effekte auf die Fertilisation, die embryonale

und fetale Entwicklung oder die Trächtigkeitserhaltung vonstatten geht (JUENGEL et al. 2004).

Auch gibt es bei Schafen natürliche Mutationen des BMP15-Gens, welche sich dosisabhängig

in erhöhten Ovulationsraten oder infertilen Phänotypen zeigen (GALLOWAY et al. 2000).

In der IVM bewirkt der Zusatz von BMP15 eine geringere Kumuluszellapoptose (HUSSEIN

et al. 2006). Dies führte zu der Hypothese, dass BMP15 in vivo eventuell als antiatretischer Faktor

auf die Follikel wirkt. Weiterhin verbessert der Zusatz von BMP15 die Entwicklungsraten

zur Blastozyste, wohingegen ein Antagonist während der Reifungsphase die spätere Blastozystenformation

hemmt (HUSSEIN et al. 2006). HOSOE et al. (2011) wiesen einen geringeren

Gehalt an BMP15-Transkripten in weniger entwicklungskompetenten Oozyten aus Kälbern gegenüber

kompetenten Oozyten aus adulten Tieren nach. Dies lässt einen Zusammenhang zwischen

der BMP15-Expression und der Entwicklungskompetenz boviner Eizellen vermuten. Andere

Autoren (HANSTEDT 2009) konnten zeigen, dass BMP15 in im 7-Tages-Intervall per OPU

gewonnenen Eizellen gegenüber der Gewinung im 3- bis 4-Tages-Intervall herunter reguliert

ist.

2.13.3 Glukosetransporter 1 (SLC2A1)

Der Glukosetransporter 1 wurde erstmals durch MUECKLER et al. (1985) beschrieben und gehört

zur Familie der Solute Carrier (SLC). Beim Rind sind 13 verschiedenen Isoformen bekannt,

die sich alle durch ihre kinetischen Charakteristika, ihre gewebespezifische Verteilung

sowie ihre Empfindlichkeit gegenüber hormonellen und anderen Stimuli unterscheiden (JOOST

et al. 2002). Es handelt sich um Na + -unabhängige Membranproteine mit einer transmembranalen

Helix, einer intrazellulären Schleife, einem extrazellulären Element sowie einem intrazellulären

C- und N-Terminus (MUECKLER et al. 1985). Die Glukosetransporter transportieren

Glukose entlang eines Konzentrationsgradienten und regulieren den Transport zwischen intraund

extrazellulärer Matrix (OLSON und PESSIN 1996), wobei die Glukoseaufnahme durch eine

wachstumsfaktorabhängige Rekrutierung der intrazellulären SLC2A1-Moleküle reguliert wird.

Der SLC2A1 wird hauptsächlich an basolateralen Membranen wie an Blutgefäßen oder der

Blut-Hirn-Schranke exprimiert (OLSON und PESSIN 1996), konnte jedoch auch in unreifen Oozyten

und allen Embryonalstadien nachgewiesen werden (WRENZYCKI et al. 1998, AUGUSTIN

24


2.13 MessengerRNA-Expression entwicklungsrelevanter Gene in bovinen Oozyten und

Embryonen

et al. 2001). In der Entwicklung von der Oozyte zur Blastozyste wurde eine Abnahme der

Expression während Reifung und Fertilisation und eine konstante Expression während des 2-

bis 8-Zellstadiums (LEQUARRE et al. 1997) beobachtet. Dem entsprechend zeigten verschiedene

Studien der Stoffwechselaktivität während der frühen Embryonalentwicklung einen ersten

Anstieg des Glucosemetabolismus im 8- bis 16-Zellstadium sowie einen weiteren Anstieg

im Morulastadium bzw. bei der Blastulation (JAVED und WRIGHT 1991, RIEGER et al. 1992,

KHURANA und NIEMANN 2000b). Dies deutet auf einen erhöhten Glukoseumsatz zum Zeitpunkt

der Aktivierung des embryonalen Genoms und der Kompaktierung hin. Weiterhin wurde

herausgefunden, dass die Expression des SLC2A1 sich je nach verfügbarer Glukosemenge verändert

und bei Glukosemangel steigt (GARDNER und KAYE 1995).

LOPES et al. (2007) konnten einen Zusammenhang zwischen der SLC2A1-Expression und

der Embryonenqualität in der Weise herstellen, dass eine hohe Transkriptmenge für eine gute

Qualität spricht. In Versuchen von KNIJN et al. (2005) zeigten Embryonen aus in vitro gereiften

Oozyten eine deutlich geringere SLC2A1-Expression als nach in vivo-Reifung. Auch andere

Arbeitsgruppen konnten eine geringere Transkriptmenge von SLC2A1 in In vitro-produzierten

Embryonen gegenüber In vivo-Embryonen feststellen (WRENZYCKI et al. 1999, LAZZARI et al.

2002, BALASUBRAMANIAN et al. 2007, RHO et al. 2007). Demgegenüber fanden PURPERA

et al. (2009) eine höhere Transkriptmenge in in vitro produzierten Blastozysten als in in vivo

produzierten. JIANG et al. (2011) konnten in in vitro produzierten, auf ein Empfängertier

übertragenen Feten am 180. Trächtigkeitstag eine deutliche Herunterregulierung gegenüber in

vivo erzeugten Feten nachweisen. Auch die Medienkomposition hat Einfluss auf die Transkriptmenge.

So konnten SAGIRKAYA et al. (2007) zeigen, dass ein Zusatz von fetalem Kälberserum

(Fetal Calf Serum, FCS) im IVM-Medium zu einer höheren Genexpression bezüglich SLC2A1

führt als synthetischer Serumersatz (Synthetic Serum Substitue, SSS). Der Zusatz von ungesättigten

Fettsäuren (Non-Esterified Fatty Acids, NEFAs) während der IVM zeigte denselben

Effekt (VAN HOECK et al. 2011). Bei der Supplementation des IVC-Mediums konnte beim

Zusatz von Serum eine höhere Menge von SLC2A1 im Vergleich zu PVA detektiert werden

(WRENZYCKI et al. 1999), eine Supplementation mit IGF-1 zeigte hingegen keine veränderte

Expression von SLC2A1 (BLOCK et al. 2008).

2.13.4 Hypoxia Inducible Factor 2α (HIF2α)

Bei den Hypoxia Inducible Transkriptionsfaktoren (HIF) handelt es sich um heterodimere DNA-

Bindungskomplexe (HARVEY et al. 2004), die aus zwei Komponenten (HIFα und HIFβ) bestehen.

Die Stabilität der HIFα-Untereinheit ist dabei abhängig vom Sauerstoffgehalt, Zytokinen

und anderen Stimuli (WANG et al. 1995, SEMENZA 2001). Die HIFα-Untereinheit kommt in

drei Formen [HIF1α (WANG et al. 1995), HIF2α (EMA et al. 1997, FLAMME et al. 1997,

HOGENESCH et al. 1997, TIAN et al. 1997) und HIF3α (GU et al. 1998)] vor, wovon HIF1α

erstmals durch WANG et al. (1995) am 3´Hypoxyresponsive-Element im Erythropoetin-Gen

entdeckt wurde. HIF1α und HIF2α ähneln sich in ihrer Struktur. Sie besitzen eine Helix-Loop-

Helix-Domäne und ein Prolin-aktives Ende am N-Terminus sowie zwei transkriptaktivierende

und eine inhibitorische Domäne am C-Terminus.

25


2 Literatur

HIF regulieren adaptative Antworten auf Sauerstoffveränderungen und modulieren die Expression

verschiedener Gene (SEMENZA 1998) für Angiogenese, Energiestoffwechsel, Zellproliferation

und Vaskularisation (COVELLO et al. 2005, HARVEY et al. 2007). Sie konnten in

alveolärem Lungenepithel, Gehirn, Herz, Leber und Niere nachgewiesen werden (EMA et al.

1997, FLAMME et al. 1997).

In in vitro produzierten Blastozysten konnte die mRNA sowohl von HIF1α als auch HIF2α

nachgewiesen werden, als Protein jedoch nur HIF2α (HARVEY et al. 2004). HIF2α lokalisiert

hauptsächlich in den Nuclei der ICM und dem TE (HARVEY et al. 2004).

Eine veränderte Expression HIF-regulierter Gene (SLC2A1) wurde in in vitro produzierten

Blastozysten festgestellt (WRENZYCKI et al. 1998, 2001). Auch HARVEY et al. (2007) beschrieben

eine höchstwahrscheinlich durch HIF2 regulierte Veränderung der Genexpression in

Blastozysten. Für die Expression von SLC2A1 ist die Regulation durch HIF belegt (HARVEY

et al. 2004). Die Expression von HIF2α selbst ist redox-reguliert (HARVEY et al. 2004)

2.14 MessengerRNA-Expression von Progesteronstoffwechsel-relevanten

Genen in Oozyten und Embryonen

Im Folgenden sollen einige für die Wirkung von Progesteron relevante Gentranskripte näher

beschrieben werden. Der Fokus liegt dabei auf den Progesteronrezeptoren (nPGR, PGRMC1,

PGRMC2) sowie dem Progestin und AdipoQ Rezeptor 5 (PAQR5).

2.14.1 Progesteronrezeptoren

Bei den Progesteronrezeptoren unterscheidet man die nuklearen Rezeptoren (nPGR) und die

membranständigen Rezeptoren (mPGR). Es gibt drei Isoformen des nuklearen Rezeptors (A, B,

C), die alle einen N-Terminus, eine DNA-Bindungsdomäne sowie eine C-Anschluss-Liganden-

Bindungsdomäne besitzen.

Der nPGR ist in Milchdrüse (KARIAGINA et al. 2007), Ovidukt (GAVA et al. 2004) und Ovar

(GAVA et al. 2004, D’HAESELEER et al. 2007) verschiedener Spezies belegt. Seine Expression

im Ovar ist zellspezifisch und hormonell reguliert (PARK und MAYO 1991, NATRAJ und

RICHARDS 1993, APARICIO et al. 2011). Dieser Rezeptor findet sich sowohl im C.l. (DUFFY

et al. 1997, RUEDA et al. 2000) als auch in Granulosazellen (SHAO et al. 2006), im periovulatorischen

Follikel (CASSAR et al. 2002) und Oozyten von Schwein (SHIMADA et al. 2004) und

Rind (D’HAESELEER et al. 2007). PÖSCHKE und KÖLLE (2009) wiesen den Rezeptor per immunzytochemischem

Nachweis in unreifen, reifen und fertilisierten bovinen KOK nach. Auch

APARICIO et al. (2011) konnten das Vorhandensein des nPGR in KOK bestätigen. Während der

IVM beobachteten SALHAB et al. (2011) nach 10stündiger Reifung eine Überexpression des

nuklearen Progesteronrezeptors in den bovinen Kumuluszellen. Daraus kann auf eine eventuelle

Beteiligung an der Regulation des Übergangs von der Metaphase I (MI) in die Metaphase

II (MII) geschlossen werden. LUCIANO et al. (2010) hingegen halten die nPGR´s für die meiotische

Teilung und Mitose für unbedeutend und schreiben dem Rezeptor eine wichtige Rolle

bei der Blastulation zu. Aus der Studie von APARICIO et al. (2011) lässt sich schliessen, dass

26


2.14 MessengerRNA-Expression von Progesteronstoffwechsel-relevanten Genen in Oozyten

und Embryonen

die Wirkung von P4 während der IVM hauptsächlich durch die Rezeptorisoformen A und B

vermittelt wird. Ausserdem konnten diese Autoren eine veränderte Rezeptorexpression bei der

Supplementation von LH, FSH und P4 feststellen.

Die Transkription in Embryonen von Mäusen (HOU und GORSKI 1993), Schweinen (YING

et al. 2000), Pferden (RAMBAGS et al. 2008) und Rindern (CLEMENTE et al. 2009) ist ebenfalls

belegt. CLEMENTE et al. (2009) fanden heraus, dass der Rezeptor in allen Embryonalstadien

ausser dem Morulastadium exprimiert wird und die Transkriptmenge in der Oozyte am höchsten,

im 2- bis 4-Zellstadium und im 16-Zellstadium am geringsten ist.

Bei den membranständigen Progesteronrezeptoren gibt es die Isoformen PGRMC1 und 2. Sie

haben eine Größe von 28 kDA (FALKENSTEIN et al. 2001) und können Polymere von 140 kDa

und größer bilden (LÖSEL et al. 2005). Sie zeichnen sich durch eine kurze extrazelluläre Domäne

am N-Terminus, einzelne Transmembrandomänen und ein zytoplasmatisches Ende aus (LÖ-

SEL et al. 2005). Membranständige PGR sind in der Leber (FALKENSTEIN et al. 1996, MEYER

et al. 1996, SELMIN et al. 1996, NOLTE et al. 2000), im Hypothalamus (KREBS et al. 2000)

und im Linsenepithel (CENEDELLA et al. 1999, ZHU et al. 2001) vorhanden. Ausserdem konnte

das Vorkommen des Rezeptors im C.l. (BRAMLEY 2003, KOWALIK und KOTWICA 2008)

und in Granulosazellen (PARK und MAYO 1991, NATRAJ und RICHARDS 1993, SHAO et al.

2003) bestätigt werden. Dabei scheint die Expression im bovinen C.l. nicht nur während der

Lutealphase zu variieren, sondern auch signifikant mit der Menge des gebildeten P4 zu korrelieren

(KOWALIK und KOTWICA 2008). Auch LUCIANO et al. (2010) stellten eine Variation des

PGRMC1-Vorkommens fest. Immunhistochemische Studien dieser Arbeitsgruppe zeigten zyklusabhängig

unterschiedliche Lokalisationen im C.l.. NILSSON und SKINNER (2009) gelang

der Nachweis im fetalen Ovar, APARICIO et al. (2011) belegten sein Vorkommen in bovinen

KOK.

Auch die Untersuchungen von LUCIANO et al. (2010) weisen auf eine Rolle des PGRMC1

in der Oozytenmaturation hin. Diese Autoren konnten eine unterschiedliche Lokalisation des

Rezeptors während verschiedener Reifungsstadien beobachten und vermuten eine Beteiligung

an der Trennung der Chromosomen. Im bovinen Embryo werden beide Isoformen des mPR

exprimiert (DODE et al. 2006). Dabei ist die Transkriptmenge in unreifen Oozyten offenbar

am höchsten und im 2- bis 4-Zellstadium sowie im 16-Zellembryo am niedrigsten (CLEMENTE

et al. 2009).

Studien verschiedener Forschergruppen (LUCIANO und PELUSO 1995, PELUSO et al. 2001,

CRUDDEN et al. 2006) zeigten eine antiapoptotische und antimitotische Wirkung des PGRMC1

auf Granulosazellen. Weiterhin scheinen die Progesteronrezeptoren an der Regulation verschiedener

Gene, unter anderem HIF1α und HIF1β, beteiligt zu sein (KIM et al. 2009).

2.14.2 Progestin und AdipoQ Rezeptor 5 (PAQR5)

Bei den Progestin und AdipoQ Rezeptoren handelt es sich um eine Familie G-Protein-gekoppelter

Membranproteine mit sieben transmembranalen Domänen (ZHU et al. 2003a), die nach

den ersten beiden beschriebenen Liganden (Progestin und AdipoQ) benannt wurden (CAHILL

2007). Es handelt sich um eine hochkonservierte Proteinfamilie, deren Mitglieder sich schon

27


2 Literatur

bei Eukaryoten und Eubakterien finden (TANG et al. 2005). Bei Säugern existieren insgesamt

11 verschiedene Rezeptoren dieser Art, die sich in die Untergruppen α, β und γ einteilen lassen

(ZHU et al. 2003a). Die einzelnen Familienmitglieder sind entweder ubiquitär anzutreffen

(PAQR1, 2, 11) oder sehr organspezifisch (PAQR10). Ihre Expression unterliegt hormoneller

Regulation (ZHU et al. 2003a, CAI und STOCCO 2005). Auch PAQRs vermitteln nichtgenomische

Progesteroneffekte, sind aber weder mit den nPR noch mit den mPR verwandt

(ZHU et al. 2003b).

PAQR5 gehört zur γ-Subfamilie und konnte in Lunge und Leber (NUTU et al. 2007), Nieren,

Nervengewebe sowie weiblichen und männlichen Reproduktionsgeweben (ZHU et al. 2003a,

DRESSING et al. 2011) nachgewiesen werden. PAQR5 zeichnet sich durch eine hohe Bindungsaffinität

zu P4 mit begrenzter Kapazität und die γ-Subtyp-spezifische Progestinbindung aus

(ZHU et al. 2003a).

Es konnte eine Beteiligung des Rezeptors an der Reifung von Fisch- (ZHU et al. 2003b),

Amphibien- (THOMAS et al. 2002) und Säugeroozyten (QIU et al. 2008) nachgewiesen werden.

2.15 Ziel des Projektes

Die Rolle von Progesteron in der Eizellreifung ist nach wie vor unzureichend definiert (FAIR

und LONERGAN 2012). In dieser Arbeit soll der Einfluss des Steroidhormons Progesteron auf

die reifende Eizelle insbesondere im Hinblick auf molekulare Veränderungen untersucht werden.

Der direkte Vergleich von in vivo gereiften, durch die OPU-Methode gewonnenen Oozyten

und in vitro unter dem Einfluss verschiedener Progesteronkonzentrationen gereiften Eizellen

soll eventuelle Veränderungen in der Genexpression bezüglich qualitätsanzeigender Gentranskripte

deutlich machen. Die Analyse der Expression der Progesteronrezeptoren gibt Aufschluss

über die Rolle von Progesteron während der Reifung. Somit könnte diese Arbeit ein wertvoller

Beitrag zum besseren Verständnis der Wirkung von Progesteron auf die reifende Eizelle sein.

28


3 Material und Methoden

Die genaue Zusammensetzung der in den Versuchen eingesetzten Medien und Chemikalien ist

in Anhang A beschrieben.

3.1 Ovum Pick-Up (OPU)

Die Abbildung 3.1 zeigt die einzelnen Arbeitsschritte des OPU-Versuchsteiles. Die Gewinnung

von Kumulus-Oozyten-Komplexen (KOK) erfolgt mittels OPU ab dem siebten Tag nach der

Brunst (Brunst=Tag 0). Bei jeder OPU-Session erfolgt eine Blutprobenentnahme für die spätere

Ermittlung des Serumprogesterongehaltes. Weiterhin werden morphologische Eigenschaften

der C.l. sowie Anzahl und Größen der punktierten Follikel erfasst. Nach jeder OPU-Session

erfolgt die Entfernung der Kumuluszellen und die Konservierung der Oozyten für die spätere

RT-qPCR. Die einzelnen Arbeitsschritte sollen im Folgenden ausführlich erläutert werden.

3.1.1 Auswahl der Versuchstiere und Feststellung des Versuchsbeginns

Die Versuchstiergruppe bestand aus insgesamt drei trockenstehenden Kühen sowie sechs Färsen

der Rasse Deutsche Holstein, die alle einen physiologischen Zyklus aufwiesen. Durch routinemäßige

tägliche Brunstkontrolle erfolgte zunächst eine Bestimmung des Zyklusstandes. Ab dem

siebten Tag (±1) nach Brunst (= Tag 0) wurden die Tiere dann über einen Zeitraum von 5-6 Wochen

regelmäßig dem OPU-Verfahren unterzogen. Im erstem Durchgang mit zweimal wöchentlichen

OPU-Sitzungen bestand die Versuchsgruppe aus sechs Tieren, davon je drei Kühe und

Färsen. Aufgrund auftretender Zwischenbrunsten wurde bei zwei Tieren der Punktionsdurchlauf

an Tag 21 des Zyklus abgebrochen und nach erneuter natürlicher Brunst neu begonnen.

Ein erneuter Durchgang des OPU-Versuches mit vier Tieren des ersten Durchganges erfolgte

nach einer zweimonatigen Ruhepause. Bei zwei Tieren fand die Punktion zweimal wöchentlich

statt, bei zwei Tieren dreimal. Drei Tiere, die vor Versuchsbeginn noch keiner OPU-Sitzung

unterzogen worden waren, bildeten den dritten Versuchsdurchgang mit zweimal wöchentlichen

Punktionen.

29


3 Material und Methoden

Abbildung 3.1: Schematische Darstellung des Arbeitsablaufs der OPU-Versuche

3.1.2 Gewinnung von Kumulus-Oozyten-Komplexen im OPU-Verfahren

Das Equipment für das OPU bestand aus einem Ultraschallgerät, einem Sondenträger mit Nadelführung,

einer Vakuumpumpe mit angeschlossenem Schlauchsystem mit Auffanggefäß sowie

einem Wasserbad (Abbildung 3.2). Die ultraschallgeleitete Follikelpunktion wurde mit Hilfe

eines Ultraschallgerätes der Marke GE Logiq Book XP und einer 7,5 MHz-Konvexsonde

(Modell 8C-RS, Fa. GE, München) durchgeführt. Die Einstellungen des GE Ultraschallgerätes

finden sich im Anhang. Der Sondenträger aus PVC wurde durch die Feinmechanik-Werkstatt

des Institutes für Nutztiergenetik des Friedrich-Löffler-Institutes in Mariensee in Zusammenarbeit

mit der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover gebaut. Dabei

war die Ultraschallsonde in leicht geneigtem Winkel zur Nadelführung eingebettet, um den toten

Winkel der Sonde im Bereich der Punktionslinie zu minimieren. Oberhalb der Sonde befand

sich eine Führungsrinne für das Edelstahlrohr, welches die Nadelführung bildet. An dessen einem

Ende war ein einschraubbarer Adapter angebracht, an dem die Punktionsnadel sowie am

anderen Ende ein Schlauch zum Abführen des Punktates befestigt wurden.

Der ableitende Schlauch aus Polyethylen mit einem Innendurchmesser von 0,6 mm mündete

nach Durchtritt durch einen Silikonstopfen in einem 50 ml Röhrchen (Fa. Greiner Bio-One,

Frickenhausen), welches als Auffanggefäß fungierte und in einem Wasserbad mit einer Temperatur

von 39 ◦ C warm gehalten wurde. Zum Abführen des Punktates wurde mittels einer über ein

Fußpedal bedienten Pumpe (Fa. Cook, Mönchengladbach) ein Vakuum von -75 mmHg generiert

und über einen handelsüblichen PVC-Schlauch (Aussendurchmesser 8 mm, Innendurchmesser

5 mm) zugeführt. Der Durchfluss betrug durchschnittlich ca. 22 ml pro Minute. Zur Punktion

wurden handelsübliche Einmalkanülen der Firma Braun aus Melsungen der Größe 20 G x 2“

(0,9 mm x 50 mm) und einem kurzen Anschliff verwendet. Der kurze Anschliff sollte hierbei

30


3.1 Ovum Pick-Up (OPU)

Abbildung 3.2: OPU-Equipment: (1) Vakuumpumpe, (2) Ultraschallgerät, (3) Sondenträger;

Wasserbad, Schlauchsystem und Auffanggefäß nicht abgebildet;

Abbildung nach HANSTEDT (2009)

gewährleisten, dass die Öffnung der Kanüle vollständig auch in kleineren Follikeln verborgen

ist, um Druck- und Flüssigkeitsverluste beim Absaugen zu verhindern.

Zu Beginn jeder OPU-Sitzung wurde der Punktionsschlauch mehrfach intensiv mit ca. 10 ml

PBS Complete gespült, um eine Verunreinigung des Punktates mit Rückständen von Reinigungsmitteln

auszuschliessen. Ein erneutes Spülen nach dem Anbringen der Punktionsnadel

sollte gewährleisten, dass sich der kapillare Spalt zwischen Nadel und Schlauchadapter schloss.

Weitere Spülungen des Schlauchsystems erfolgten jeweils nach dem Absaugen aller Follikel

eines Ovars bzw. nach Bedarf. Nach Applikation von 4 ml des Lokalanästhetikums Procainhydrochlorid

ohne Sperrkörper (Procasel 2 % der Fa. Selectavet, Weyarn-Holzolling) in den

epiduralen Spalt zwischen dem letzten Sakral- und dem ersten Schwanzwirbel wurde die Vulva

trocken gereinigt und das Punktionsgerät vaginal eingeführt. Auf die rektale Exploration

folgte eine transrektale Positionierung des jeweiligen Ovars vor der Ultraschallsonde, um das

Ovar und seine Funktionskörper darzustellen. Die Größe der Follikel sowie Lokalisation (linkes

oder rechtes Ovar), Größe und Beschaffenheit (Homogenität, Vorhandensein eines Hohlraumes

und dessen Größe) des Gelbkörpers wurden ermittelt und protokolliert. Ein Absaugen des Inhaltes

der Follikel ab einer Größe von 3 mm folgte. Das gewonnene, im Wasserbad bei 39 ◦ C

warmgehaltene Punktat wurde zunächst mit Hilfe von warmer PBS Complete-Lösung durch ein

Analysensieb mit einer Maschenweite von 50 µm gespült. Es erfolgte eine Überführung der auf

dem Sieb verbliebenen KOKs und Zellbestandteile mittels PBS Complete in eine Petrischale

der Größe 94 x 16 mm (Fa. Greiner Bio-One, Frickenhausen) um die KOKs unter einem Stereomikroskop

(Fa. Olympus, Hamburg, Modell SZX-ILLK200) mit Wärmeplatte (Fa. Minitüb,

Modell HAT 200) in einer 20fachen Vergrößerung herauszusuchen.

31


3 Material und Methoden

Abbildung 3.3: OPU-Sondenträger mit Nadelführung sowie Vergrößerung des vorderen

Teiles; Abbildung nach HANSTEDT (2009)

Abbildung 3.4: Schematische Darstellung der Follikelpunktion;

Abbildung nach HANSTEDT (2009)

Nach erneuter Überführung der KOKs mit Hilfe einer 0,25 µl Glaspipette (Fa. Hirschmann,

Eberstadt) und eines Pipettierhelfers (Fa. Brand, Wertheim) in eine 2 ml TCM air enthaltende

Petrischale der Größe 35 x 10 mm (Fa. Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen) fand eine

Beurteilung der KOK hinsichtlich ihrer Qualität sowie eine Einteilung in 5 Kategorien (siehe

Tabelle 3.1) statt.

Tabelle 3.1: Klassifizierungsschema für bovine KOK

Klasse Mindestanzahl an Kumulus- Zytoplasma

Kumuluszelllagen beschaffenheit

1 3 Lagen keine Expansion homogen

2 1 Lage keine Expansion homogen

3 einzelne Zellen keine Expansion homo-/heterogen

4 keine Zellen keine Expansion homo-/heterogen

5 keine/einzelne Zellen expandiert homo-/heterogen

leere Zonae

deformiert

32


3.1 Ovum Pick-Up (OPU)

Abbildung 3.5: Apparatur zur Separation von KOK aus Follikelpunktaten;

Abbildung nach HANSTEDT (2009)

Abbildung 3.6: IVP-taugliche bovine Kumulus-Oozyten-Komplexe, 50fache Vergrößerung

Kumulus-Oozyten-Komplexe der Kategorien 1-3 wurden tierindividuell in auf 37 ◦ C temperierte

PBS Complete-Lösung mit Zusatz von 0,1 % Hyaluronidase (Sigma-Aldrich, H 3506) und

0,1 % Bovinem Serum Albumin (BSA-FAF, Sigma-Aldrich) gegeben und für 5 Min. inkubiert.

Darauf folgte eine mechanische Entfernung der Kumuluszellen mittels eines Strippers (The

Stripper, MXL3-STR, Mid Atlantic Diagnostics, Inc., Mount Laurel, USA) und einer Stripper-

Spitze (Stripper Tip, Mid Atlantic Diagnostics, Inc., Mount Laurel, USA) mit einem Durchlass

von 135 bzw. 125 µm. Nach dreimaligem Pipettieren durch Polyvinylalkohol (PVA 0,1 %) wurden

die denudierten Oozyten einzeln in 0,5 ml fassende, nicht-DNA-bindende Reaktionsgefäße

(Fa. Eppendorf, Hamburg) verbracht und bei -80 ◦ C eingefroren.

3.1.3 Blutentnahme und Konservierung der Blutproben

Nach jeder OPU-Sitzung wurde den Tieren je ein Serumröhrchen (Fa. Sarstedt, Sarstedt) sowie

ein EDTA-Röhrchen (Fa. Sarstedt, Sarstedt) Blut entnommen. Die Entnahme erfolgte aus der

Vena bzw. Arteria coccygea mittels einer handelsüblichen Einmalkanüle der Größe 18 G x 1,5 “.

Die Blutproben wurden innerhalb von 2 h bei 2000 x g und 4 ◦ C für 15 Min zentrifugiert

(Hettich Zentrifuge Universal 30RF, Fa. Andreas Hettich GmbH u. Co. KG, Tuttlingen). Je

33


3 Material und Methoden

1 ml Serum bzw. EDTA-Plasma wurde in 2 ml fassenden Reaktionsgefäßen (Fa. Eppendorf,

Hamburg) bei -20 ◦ C asserviert.

3.1.4 Bestimmung der Progesteronkonzentration im Blut

Die Bestimmung des Serumprogesterongehaltes erfolgte mittels Radioimmunoassay (RIA Progesteron

PITKPG-9, Fa. Siemens Healthcare Diagnostics GmbH, Eschborn). Das Prinzip des

Verfahrens beruht auf der kompetitiven Bindung des P4 in der zu analysierenden Probe und

einer mit 125 I radioaktiv markierten Variante von P4 an spezifische Antikörper, die an die Wandung

eines Reaktionsgefäßes aufgebracht waren (Festphasen-Immunoassay). Die Menge des

P4 in der Probe lässt sich anhand der Verdrängung des radioaktiven P4 mit Hilfe eines Gamma-

Counts ermitteln, wobei die Anzahl der gemessenen Counts umgekehrt proportional zur eingesetzten

Konzentration ist. Durch den Vergleich mit den eingesetzten Standards kann dann die

Progesteronkonzentration der Proben aus der Standardkurve ermittelt werden.

Zuerst wurden die asservierten Serumproben bei Raumtemperatur aufgetaut. Die Messung

erfolgte routinemäßig als Doppelbestimmung. Für die Messung wurde eine Standardreihe mit

0, 0,1, 0,5, 2, 10, 20 und 40 ng/ml Progesteron angelegt und je 100 µl der Standards sowie

100 µl der zu analysierenden Proben in Antikörper-beschichtete Röhrchen pipettiert. Nach Zugabe

von 1,0 ml des radioaktiv markierten Progesterons ( 125 I Progesteron) in jedes Röhrchen

erfolgte eine 3stündige Inkubation bei Raumtemperatur (15-28 ◦ C). Anschließend wurde die

Flüssigkeit in den Röhrchen dekantiert und die Röhrchen für eine Minute zur Messung in den

Gamma-Counter (LKB 1272 Clinigamma, Fa. Perkin-Elmer, Monza, Italien) verbracht. Anhand

der gemessenen Counts pro Minute (cpm) der Standardreihe erfolgte die Erstellung einer Standardkurve

und die Berechnung der Progesteronkonzentration der Proben anhand dieser Kurve.

Der Interassayvariationskoeffizient betrug 3,9 % und der Intraassayvariationskoeffizient 3,5 %.

Die Spezifität des Antikörpers für Progesteron wurde vom Hersteller mit 100 % angegeben. Die

vom Hersteller angegebenen Kreuzreaktivitäten des Antikörpers sind in Tabelle 3.2 aufgeführt.

34


3.2 In-vitro-Produktion boviner Embryonen

Tabelle 3.2: Kreuzreaktivität des im RIA genutzten Antikörpers

Substrat Kreuzreaktivität in %

Kortikosterone 0,9

Kortisol 0,03

Danazol 0,006

11-Deoxykortikosteron 2,2

11-Deoxycortisol 0,01

DHEA-SO 4 0,002

20alpha-Dihydroprogesteron 0,2

17alpha-Hydroxyprogesteron 3,4

Medroxyprogesteron 0,3

5beta-Pregnen-3alphaol-20-one 0,05

5alpha-Pregnan-3,20-dione 9,0

5beta-Pregnan-3,20-dione 3,2

Pregnenolon 0,1

5-Pregnen-3beta-ol-20-one-sulfat 0,05

Testosteron 0,1

3.2 In-vitro-Produktion boviner Embryonen

Der in Abbildung 3.7 dargestellte Arbeitsablauf wird im Folgenden ausführlich erläutert.

3.2.1 Herkunft der Ovarien

Einmal wöchentlich wurden Ovarien frisch geschlachteter Tiere an einem Schlachthof gesammelt,

wobei Ovarien von Tieren, deren Schlachtkörper sichtbare krankhafte Veränderungen aufwiesen,

ausschieden. Weiterhin beschränkte sich die Auswahl auf Ovarien von Tieren, die weder

trächtig noch juvenil waren und an deren Ovarien keine zystischen Veränderungen sichtbar waren.

Die Lagerung der Ovarien nach dem Abschneiden bis zur weiteren Bearbeitung erfolgte in

37 ◦ C warmem PBS Complete in einem Thermobehälter.

3.2.2 Vorbereitung und Selektion der Kumulus-Oozyten-Komplexe

Zuerst fand eine dreimalige Spülung der Ovarien mit je 350 ml Natrium-Chlorid (NaCl)-Komplett-Lösung,

die zuvor im Wasserbad auf 37 ◦ C erwärmt worden war, statt. Zur Isolation der

Oozyten aus den Ovarien fand die Slicing-Methode (NIEMANN und MEINECKE 1993) Anwendung.

Hierbei wird das mit einer Arterienklemme fixierte Ovar in eine Petrischale mit ca.

100 ml PBS Complete getaucht. Das Schneiden erfolgt dann mit einem Block bestehend aus

zehn parallel im Abstand von 3-5 mm zueinander befestigten Rasierklingen. Auf diese Weise

werden oberflächliche und tiefe Follikel eröffnet und die KOK zusammen mit der Follikelflüssigkeit

herausgespült. Anschließend giesst man die so gewonnene Flüssigkeit gemeinsam mit

35


3 Material und Methoden

KOK aus Schlachthofovarien

Selektion nach morpholog. Kriterien

IVM +/-Progesteron

RT-qPCR

IVM-Medium

gereifte KOK

Denudierung

P4-Analyse

IVF

Reifungskontrolle

IVC

Morulae/Blastozysten an Tag 7 und 8

Beurteilung der Teilungs-und Entwicklungsraten

Abbildung 3.7: Schematische Darstellung des IVP-Versuchsteils

dem bereits in der Petrischale enthaltenen PBS Complete durch ein herkömmliches Sieb in ein

Becherglas, um überschüssige Gewebestücke zu entfernen. Die Petrischale und das Sieb werden

noch zweimal mit je ca. 50 ml PBS Complete gespült, um noch eventuell in der Petrischale

vorhandene KOK zu erhalten. Dann erfolgt eine 10minütige Sedimentation der Flüssigkeit im

Becherglas. Um ein Auskühlen der Flüssigkeit zu verhindern bzw. zu verlangsamen, steht das

Becherglas auf Styropor. Nach dem Absaugen des Flüssigkeitsüberstandes bis auf ca. 100 ml

mit einer herkömmlichen Vakuumpumpe erfolgt eine gleichmäßige Verteilung des Sediments

auf Falconröhrchen (Fa. Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen) mit je 15 ml Fassungsvermögen

und eine erneute 10minütige Sedimentation auf einer Wärmeplatte mit einer Temperatur

von 37 ◦ C. Das Sediment in jedem Reagenzgefäß wird nun mittels einer Pasteurpipette abgesaugt,

in eine Petrischale überführt und auf ca. 80 ml mit PBS Complete aufgefüllt. Das

Heraussuchen der KOK aus dem verdünnten Sediment erfolgt unter einem Stereomikroskop

(Fa. Olympus, Hamburg, Deutschland) mit Wärmeplatte (Fa. Minitüb, Modell HAT 200) bei

20facher Vergrößerung.

Nach Durchsicht aller Reagenzgefäße und Überführung der KOK mit Hilfe einer 0,25 µl

fassenden Glaspipette und eines Pipettierhelfers in 2 ml TCM air erfolgte die Selektion der

KOK bezüglich ihrer Qualität. Eine Übersicht der Klassifizierungskriterien ist in Tabelle 3.1 zu

sehen. Als für die In-vitro-Produktion taugliche KOK wurden solche der Kategorien 1, 2 und 3

angesehen.

36


3.2 In-vitro-Produktion boviner Embryonen

3.2.3 In-vitro-Maturation (IVM)

Zunächst wurde eine 40 µM Progesteronstocklösung aus Progesterone minimum 99 % (Fa.

Sigma) und unvergälltem Ethanol (EtOH; Rotipuran ≥ 99,8 %, Fa. Carl Roth GmbH + Co.

KG, Karlsruhe) hergestellt und aliquotiert. Dem Reifungsmedium des jeweiligen Versuchsdurchlaufes

wurde die Progesteronlösung zugesetzt, sodass die Endkonzentrationen im Reifungsmedium,

in Anlehnung an DIELEMAN et al. (1983), 0,16 µM, 0,48 µM, 0,95 µM oder

1,4 µM betrugen. Um während der In-vitro-Reifung der Oozyten den Einfluss verschiedener

Progesteronkonzentrationen zu ermitteln, erfolgte eine Modifizierung des konventionellen Invitro-Maturationssystems

mit Ölüberschichtung. Ein Diffundieren des lipophilen Progesterons

in die Ölphase wurde verhindert, indem einzelne, mit 200 µl Reifungsmedium gefüllte Wells

einer 96-Well-Plate (Fa. Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen) ohne Ölüberschichtung Anwendung

fanden. Je zwei Wells standen in einer Petrischale. Die Petrischale enthielt ca. 10 ml

destilliertes Wasser, um Verdunstungsverluste gering zu halten. Der aufgelegte Deckel der Petrischale

diente der Vermeidung von Schmutzeinträgen in die Kultur.

Die Kontrollwells enthielten Reifungsmedium ohne jeglichen Zusatz (Normalkontrolle) sowie

Reifungsmedium mit 2 µl, 4 µl oder 8 µl unvergälltem Ethanol ≥ 99,8 % (Alkoholkontrolle).

Die Medien wurden für mindestens eine Stunde im Brutschrank (HeraCell, Fa. Heraeus,

Thermo Fisher Scientific, USA) bei 39 ◦ C und 5 % CO 2 und gesättigter Feuchtigkeit äquilibriert.

Als IVP-tauglich angesehene KOK wurden in Gruppen zu 30-40 KOK durch je eine Reihe mit

3 Tropfen aus 100 µl Reifungsmedium ohne Zusatz, die mit Siliconöl (Fa. Serva, Deutschland)

überschichtet waren (sogenannte „Waschdrops“), pipettiert (nachfolgend "waschen"genannt)

und in die Gefäße mit dem Reifungsmedium überführt. Die Maturation erfolgte für 24 h bei

39 ◦ C, 5 % CO 2 und feuchtigkeitsgesättigter Atmosphäre im Brutschrank. Der Zeitraum von

der Entnahme der Ovarien am Schlachthof bis zum Beginn der In-vitro-Reifung betrug maximal

6 h.

3.2.4 Progesteronbestimmung im Reifungsmedium und Einteilung der

Versuchsgruppen

Zur Kontrolle der eingesetzten Progesteronzugaben zum Reifungsmedium wurde das Medium

nach der Entnahme der gereiften KOK zunächst in 0,5 ml fassenden Reaktionsgefäßen (Fa. Eppendorf,

Hamburg) bei -20 ◦ C asserviert. Die Bestimmung des Progesterongehaltes im Medium

erfolgte wie bei den Blutproben (siehe Kapitel 3.1.4) mittels Radioimmunoassay. Da jedoch die

zugegebenen Progesteronmengen den Messbereich des Assays überschritten, war eine Verdünnung

der Proben (1:5, 1:10, 1:20) mit Boratpuffer erforderlich. Um etwaige Veränderungen des

Progesterongehaltes im Medium durch die KOK oder das Milieu im Brutschrank zu detektieren,

wurden auch Medienansätze ohne KOK (Leerkontrollen) in den Brutschrank verbracht,

dort für 24 Stunden inkubiert und dann asserviert. Zusätzlich fand auch eine Analyse von reinem,

nicht inkubiertem Reifungsmedium statt, um Kontaminationen der Medienkomponenten

mit Progesteron auszuschließen. Die endgültige Einteilung der einzelnen IVP-Durchgänge in

die Versuchsgruppen erfolgte anhand der im Medienansatz und den Leerkontrollen gemessenen

37


3 Material und Methoden

Progesterongehalte in die Gruppen < 50 ng/ml, 150 ng/ml, 300 ng/ml und 450 ng/ml, entsprechend

0,16 µM, 0,48 µM, 0,95 µM und 1,43 µM.

3.2.5 Reifungskontrolle

An einer repräsentativen Anzahl an KOK fand eine Kontrolle der Reifung nach der IVM statt.

Nach Verbringen der KOK auf einen Objektträger mit vorsichtig angedrücktem Deckgläschen

erfolgte eine Fixierung in Essiglösung (Fixierlösung) für 24 h. Danach wurde die Färbelösung

(Lacmoid-Arbeitslösung) eingebracht und nach 10 Min mit Fixierlösung wieder entfernt. Die

Beurteilung des Kernreifestadiums erfolgte unter dem Mikroskop (Zeiss, Axiostar plus, Carl

Zeiss, Jena) bei 40facher Vergrößerung unter Einsatz eines Phasenkontrastfilters 2. Oozyten,

welche das Meiosestadium II (MII), erkennbar an Metaphasenplatte und ausgeschleustem Polkörperchen

erreicht hatten, galten als gereift, solche, die in der Meiosephase I (MI) verblieben

waren, galten als unreif.

3.2.6 In-vitro-Fertilisation (IVF)

Die gereiften KOK wurden dreimal in 100 µl Waschdrops aus FertTALP-Gebrauchslösung gewaschen

und anschließend in Gruppen von 15-20 KOK in die Fertilisationstropfen pipettiert.

In einer Petrischale mit dem Durchmesser von 35 mm waren jeweils vier Tropfen von 100 µl

aufgebracht und mit Silikonöl überschichtet. Die Fertilisationstropfen waren zur Äquilibrierung

mindestens eine Stunde vor dem Umsetzen der KOK bei 39 ◦ C und 5 % CO 2 in den Brutschrank

verbracht worden. Das Tiergefriersperma eines IVF-gestesteten Bullen wurde für die Fertilisation

zunächst 10 Sekunden lang in 30 ◦ C warmem Wasser aufgetaut. Direkt nach dem Auftauen

erfolgte eine Überprüfung der Motilität der Spermien und danach die Zentrifugation für 16 Min

bei 380 x g in einer Zentrifuge (Mini Spin plus, Fa. Eppendorf, Hamburg) mit einem 90 %igen

Gradienten aus Sperm Filter R○ (Gynemed GmbH und Co., Lensahn) und FertTALP-Lösung in

einem Eppendorfgefäß. Der Überstand wurde nach Ende der Zentrifugation bis auf 50 µl abgenommen

und verworfen. Das im Eppendorfgefäß verbliebene Pellet wurde in 750 µl FertTALP-

Gebrauchslösung resuspendiert und erneut für 3 Min bei 380 x g zentrifugiert. Daraufhin wurde

der Überstand wieder bis auf 50 µl abgesogen und verworfen. Eine erneute Resuspendierung

erfolgte mit 750 µl HHE-Lösung. Abschließend wurden die Spermien nochmals bei 380 x g

zentrifugiert. Der Überstand wurde nun bis auf 100 µl abgenommen und die Spermatozoen im

offenen Eppendorfgefäß im Brutschrank bei 39 ◦ C und 5 % CO 2 und feuchtigkeitsgesättigter

Atmosphäre aufbewahrt. Schließlich wurde die Dichte der Spermiensuspension mittels einer

Thomakammer ermittelt. Anhand der Dichte wurde die erforderliche Menge der Spermalösung

errechnet, um pro Fertilisationsdrop mit 20 KOK 100 000 Spermien zuzugeben. Der Zusatz der

Spermien erfolgte 24 h nach Maturationsbeginn direkt in die Fertilisationstropfen mit den KOK.

Es folgte eine 19stündige Kokultur von Spermien und KOK in einem Brutschrank (HeraCell,

Fa. Heraeus, Thermo Fisher Scientific, USA) mit 39 ◦ C und 5 % CO 2 in feuchtigkeitsgesättigter

Atmosphäre.

38


3.2 In-vitro-Produktion boviner Embryonen

3.2.7 In-vitro-Kultur (IVC)

Die vermeintlichen Zygoten wurden 19 h nach Beginn der Fertilisation in eine Petrischale mit

35 mm Durchmesser mit 2 ml auf 37 ◦ C erwärmten TCM air verbracht und die Kumuluszellen

mittels eines Strippers (The Stripper, MXL3-STR, Mid Atlantic Diagnostics, Inc.) und einer

Stripper-Spitze (Stripper Tip, Mid Atlantic Diagnostics, Inc.) mit einem Durchlass von 135 bzw.

125 µm mechanisch unter stereomikroskopischer Sichtkontrolle bei 20facher Vergrößerung entfernt.

Zur Temperaturerhaltung des Mediums wurde auf einer Wärmebank (Modell HAT 200,

Fa. Minitüb GmbH, Tiefenbach) bei einer Temperatur von 37 ◦ C gearbeitet. Die von den Kumuluszellen

vollständig befreiten Zygoten wurden nach drei Medienausdünnungsschritten in

Gruppen à sechs Stück in 30 µl Tropfen SOFaa-Kulturmedium unter Öl (Fa. Serva, Heidelberg)

bei 39 ◦ C, 5 % CO 2 , 5 % O 2 , 90 % N 2 und feuchtigkeitsgesättigter Atmosphäre für insgesamt

sieben Tage (= 8 Entwicklungstage) kultiviert.

3.2.8 Beurteilung der Embryonen

An Tag 7 und 8 (IVF = Tag 0, Beginn der IVC = Tag 1) erfolgten die Kontrollen hinsichtlich der

Teilungs- und Entwicklungsrate. Die Teilungsrate bezeichnet den Anteil (in %) der gefurchten

Embryonen an den in die In-vitro-Kultur eingebrachten vermeintlichen Zygoten, die Entwicklungsrate

ergibt sich dementsprechend aus dem Anteil (in %) der Embryonen im Morula- oder

Blastozystenstadium an den in die Kultur eingesetzten vermeintlichen Zygoten.

Abbildung 3.8: a: 8-Zell-Embryo, b: Morula, c: expandierte Blastozysten, d: geschlüpfte

Blastozysten

3.2.9 Archivierung von gereiften Oozyten für die mRNA-Analyse

Jeweils 3-5 Oozyten der einzelnen Gruppen der IVP-Durchgänge wurden vor dem Umsetzen in

das Fertilisationsmedium entnommen und in eine Petrischale (35 mm Durchmesser) mit vorgewärmtem

TCM air verbracht. Diese KOK wurden dann unter dem Stereomikroskop auf einer

Wärmeplatte mechanisch mit Hilfe eines Strippers denudiert, dreimal in PVA 0,1 % gewaschen

und einzeln in 0,5 ml nicht-DNA-bindenden Eppendorf-Cups bei -80 ◦ C eingefroren.

39


3 Material und Methoden

3.3 mRNA-Analyse der Oozyten zur Darstellung qualitätsanzeigender

Gentranskripte

3.3.1 Aufbereitung der Proben zur Isolierung der mRNA

Zur Analyse der Transkripte aus den einzelnen Eizellen wurde der Dynabeads mRNA DIRECT

Micro Kit (Fa. Invitrogen, Karlsruhe) verwendet. Zuerst erfolgte ein Prewash der Dynabeads-

Lösung mit entsprechender Separation von Flüssigkeit und Dybnabeads im Magnetic Particle

Concentrator (MPC). Jeder zu analysierenden Eizelle wurden 150 µl des Lysis/Binding-Puffers

sowie 1 µl Kaninchen-Globin-mRNA (1 pg/µl ) zugegeben. Die Kaninchen-Globin-mRNA

dient als externer Standard. Die Proben wurden nun für 10 Sekunden gevortext, zentrifugiert

und 10 Min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden jeder

Probe 10 µl der vorher gewaschenen, in Lysis/Binding-Puffer befindlichen Dynabeads zugegeben

und erneut für 5 Min bei Raumtemperatur auf einem Thermoblock unter leichtem Schütteln

inkubiert. Während dieser Zeitspanne erfolgte die Bindung des PolyA-Endes der mRNA an die

Dynabeads. Als nächstes wurden die Proben erneut im MPC separiert, und nach Verwerfen des

Überstandes ausserhalb der MPC mit 100 µl Washing- Buffer A (Dynabeads mRNA Micro Kit,

Fa. Invitrogen, Karlsruhe) resuspendiert. Nach einer erneuten Separation und Entfernung des

Überstandes wurde mit 100 µl Washing-Buffer B resuspensiert und dieser Vorgang ein weiteres

Mal durchgeführt. Nach einem letzten Separationsvorgang wurde mit 11 µl sterilem H 2 O

(Ampuwa, Fa. Fresenius, Bad Homburg) resuspensiert. Die Trennung der mRNA von den Dynabeads

erfolgte in einem Thermomixer (Fa. Eppendorf, Hamburg) bei 65 ◦ C für 3 Min. Im

Anschluss wurden die Proben auf Eis in den MPC verbracht. Nach Abnahme des Überstandes

erfolgte sofort die Reverse Transkriptase Reaktion.

3.3.2 Reverse Transkription (RT)

Für die Reaktion der Reversen Transkriptase wurde ein Endvolumen von 20 µl verwendet.

Es wurden ein Globinstandard, eine Negativ-Kontrolle des Standards, eine Negativ-Kontrolle

der Probe, die Probe selbst sowie eine Negativ-Kontrolle mit sterilem Wasser (Ampuwa, Fa.

Fresenius, Bad Homburg) anstelle von mRNA mitgeführt, um Kontaminationen der Reaktionsansätze

ausschließen zu können. Der Master-Mix (MM) wurde für alle Proben gemeinsam

angesetzt (Zusammensetzung siehe Anhang A.33). Diesem wurden 11 µl mRNA aus der vorhergehenden

mRNA-Isolierung zugegeben, die Negativkontrollen wurden mit sterilem Wasser

(Ampuwa, Fa. Fresenius, Bad Homburg) auf dieses Volumen aufgefüllt. Im PCR-Cycler (IQ

Multicolor Real-Time PCR Detection System, Fa. Bio-Rad, München) wurde daraufhin die in

den Proben vorhandene mRNA in cDNA umgewandelt. Dabei fand zunächst eine 10minütige

Inkubation bei 25 ◦ C statt. Dann erfolgte die Reverse Transkription der mRNA in cDNA bei

42 ◦ C für 60 Min. Zur Denaturierung verblieben die Proben dann noch 5 Min bei 99 ◦ C, um

danach sofort bis zur Polymerase-Kettenreaktion auf Eis verbracht zu werden.

40


3.3 mRNA-Analyse der Oozyten zur Darstellung qualitätsanzeigender Gentranskripte

3.3.3 Quantitative Polymerase Kettenreaktion (qPCR)

Die in Tabelle 3.4 aufgelisteten Gene wurden in der RT-qPCR auf die Intensität ihrer mRNA-

Expression hin untersucht. Die Selektion der Primer erfolgte mit Hilfe der Software Primer3

unter Vorgabe der Amplifikatgröße (150-250 bp), des GC-Gehaltes (40-60 %) und der Annealingtemperatur

(59,5-60,5 ◦ C). Die Quantifizierung der Gentranskripte fand in der RT-qPCR

durch die Sichtbarmachung der Fragmente mittels Fluoreszenzen statt. Die eingesetzten Embryonenäquivalente

variieren je nach untersuchtem Gentranskript, wobei ein Embryonenäquivalent

20 µl des Reaktionsansatzes entspricht (siehe Tabelle 3.3).

Das Endvolumen für die PCR betrug 20 µl. Dabei bestand jeder Ansatz aus dem kommerziell

erhältlichen Reaktionsmix, den jeweilig benötigten 5´- und 3´-Primern für die zu untersuchenden

Transkripte sowie der cDNA aus der RT und sterilem Wasser (Ampuwa, Fa. Fresenius, Bad

Homburg).

Für alle Ansätze erfolgte zunächst eine 10minütige Denaturierung bei 95 ◦ C. Danach fanden

43 Zyklen mit folgendem Aufbau statt [vgl. auch HANSTEDT (2009), KUZMANY et al. (2011),

BEILBY et al. (2011), STINSHOF et al. (2012)]:

- Spaltung der cDNA für 15 Sekunden bei 95 ◦ C (Denaturierung)

- Anlagerung der Primer für 30 Sekunden bei 60 ◦ C (Annealing)

- Extension für 30 Sekunden bei 72 ◦ C (Verlängerung)

Anschließend wurde eine Schmelzkurve zur Verifikation der PCR-Fragmente durch eine schrittweise

Erhöhung um 0,5 ◦ C alle zehn Sekunden erstellt. Die Starttemperatur betrug hierbei 55 ◦ C

und die Endtemperatur 95 ◦ C. Die Verifizierung der Größe der spezifischen Fragmente wurde

mittels Agarosegelelektrophorese in einem 2 %igen Agarosegel in TBE-Puffer (90 mM Tris,

90 mM Borsäure, 2 mM EDTA, pH=8,3), welches mit 2 µl Ethidiumbromid gefärbt war, durchgeführt.

Die Auftrennung der PCR-Produkte erfolgte für 4 min bei 100 Volt und anschließende

35 min bei 80 Volt.

Tabelle 3.3: Eingesetzte Oozyten- bzw. Embryonenäquivalente (EÄ; 1 EÄ ˆ= 20 µl des

Reaktionsansatzes) für die jeweiligen Gentranskripte

Gen EÄ

GDF9 0,05

BMP15 0,0125

HIF2α 0,05

SLC2A1 (GLUT1) 0,1

PGR 0,1

PGRMC1 0,025

PGRMC2 0,025

PAQR5 0,05

Globin 0,05

41


3 Material und Methoden

3.4 Auswertung der Daten und statistische Analyse

Alle Daten sind, soweit nicht anders angegeben, als arithmetisches Mittel mit Standardabweichung

(¯n± SD) bzw. Standardfehler (± SEM) dargestellt.

Die Erstellung der Kurven zum Progesteronverlauf der einzelnen Tiere erfolgte unter Verwendung

von Gnuplot 4.4.3 für Windows. Aufgrund des physiologischerweise zyklischen Verlaufes

liegt eine Sinusfunktion zugrunde, deren Verlauf durch die Manipulationen des Versuches

(OPU) exponentiell abfällt. Die Startparameter für den Least Square Fit (LSF) wurden anhand

der Daten so gewählt, dass die Konvergenz des Algorithmus gewährleistet war. Anhand der erstellten

Funktion der Form f(x) = a·(sin((x+b)·c)+1)·exp −d·x erfolgte dann eine Berechnung

der Maxima (Max) und Minima (Min) sowie der Punkte mit y=1 (entspricht P4=1 ng/ml) im

Bereich -5 ≥ x ≤ 52.

Die statistische Analyse der Daten erfolgte mit dem Computerprogramm SigmaStat 2.0 der

Fa. Jandel Scientific, San Rafael, USA. Die Analyse der Daten aus dem OPU und der IVP

fand mittels ANOVA und Tukey Test statt. Alle Daten wurden mittels Komolgorow-Smirnow-

Test auf Normalverteilung geprüft. Die anschließende Varianzanalyse wurde mit dem Levene

Median Test durchgeführt. Unterschiede von P ≤ 0,05 galten als statistisch signifikant.

42


3.4 Auswertung der Daten und statistische Analyse

Tabelle 3.4: Verwendete Primer

Gen Primersequenz Primer- Amplifikat- Datenbankvom

5´- zum 3´-Ende position größe (bp) Nr.

GDF9 F:TCC TTT GGT TTT GCT GCT TT 57 204 NM_174681

R:GTT CCC TGT GCC CAT CAT AC 260

BMP15 F:GCA GCC AAG AGG TAG TGA GG 634 194 DQ463368

R:CAA TAC TGC CTG CTT GAC GA 827

HIF2α F:GCG ACG ACA GAA TCA CAG AA 1043 194 AB018399

R:TGT CTC CAG CCA CAC ATA GC 1236

SLC2A1 F:CAG GAG ATG AAG GAG GAG AGC 894 256 M60448

(Glut1) R:CAC AAA TAG CGA CAC GAC AGT 1151

PGR F:TAC CTT AGG CCG GAT TCA GA 1570 197 NM_001205356

R:CAA TCG TTT CTT CCA GCA CA 1766

PGRMC1 F:GGA AGA GAT GCA TCC AGA GG 425 207 NM_001075133.1

R:TGG CTC CTC CTT GTC TGA GT 631

PGRMC1 F:AGT CAG GGG CCT TCA GAA CTG CA 693 207 NM_001099060.1

R:TCA GGA TGA AGC CCC ACC AGA CAT T 899

PAQR5 F:ACA CCT TCA GCT CCA TGT CC 327 203 XM_605853

R:GTA GCA GGA GAG CCA GAT GC 529

Globin F:GCA GCC ACG GTG GCG AGT AT 241 257 X04751

R:GTG GGA CAG GAG CTT GAA AT 555*

*Intron an Position 281-357

43


3 Material und Methoden

44


4 Ergebnisse

4.1 OPU

Da alle sechs Tiere im ersten Versuch nach Regression des bestehenden, nach der natürlichen

Brunst gebildeten Gelbkörpers [nachfolgend „natürliches C.l.“(nat. C.l.) genannt] Zwischenbrunsten

und daran anschließend die Bildung von Gelbkörpern [im Folgenden „induziertes

C.l.“(ind. C.l.) genannt] während des OPU-Zeitraumes zeigten, wurde der Versuch über die

geplanten 5-6 Wochen durchgeführt, sodass die Datenerhebungen zwei nahezu vollständige

Zyklen wiederspiegeln. Ein Tier wurde aufgrund von Zystenbildung aus der Auswertung ausgeschlossen.

Im zweiten Versuch fand die OPU-Prozedur an vier der bereits im ersten Durchlauf genutzten

Tieren statt, wobei zwei Tiere zweimal und zwei Tiere dreimal wöchentlich der OPU-Prozedur

unterzogen wurden. Bei den zweimal wöchentlich punktierten Tieren wurde eines aufgrund

falscher Zyklusbeobachtung und daraus resultierendem falschen Versuchsstart ausgeschlossen.

Ein Tier der dreimal wöchentlich Punktierten zeigte einen persistierenden Gelbkörper mit P4

≥ 3 ng/ml über den gesamten Punktionszeitraum und ging deshalb ebenfalls nicht in die Auswertung

ein. Das zweite Tier der dreimal wöchentlich punktierten zeigte ebenso wie alle zweimal

punktierten eine Zwischenbrunst mit physiologischer Zykluslänge. In die weiteren Auswertungen

der Daten ging dieses Tier jedoch nicht ein, da aufgrund der methodischen Abweichung

(dreimal wöchentliche Punktion statt zweimal) bei nur einem Tier die Vergleichbarkeit der Daten

fraglich ist.

Im dritten Versuchsdurchlauf erfolgte die OPU-Prozedur zweimal wöchentlich an drei nie

zuvor punktierten Tieren. Eines dieser Tiere zeigte weder Zwischenbrunst noch die Bildung

eines ind. C.l.s und wurde daher aus den weiteren Auswertungen ausgeschlossen.

Die Ergebnisse beziehen sich daher auf 7 Tiere und 8 OPU-Durchgänge (ein Tier zweimal

genutzt, siehe auch Tabelle 4.1). Die Gesamtdaten der OPU-Versuche aller Tiere finden sich in

Anhang B.1 Tabellen B.1 -B.32.

45


4 Ergebnisse

Tabelle 4.1: Tiernutzung und Auswertung im OPU-Versuchsteil

OPU-Sessions eingefrorene

Versuch Tier Bezeichnung Datum

(Anzahl) Oozyten

1

2

3

Bemerkung

Betty Betty1 28.01.-25.02.10 9 11 Versuchsstart falsch; nicht gewertet

Crazy Crazy1 25.01.-25.02.10 10 19

Frieda Frieda1a 18.02.-15.03.10 8 19 Zyste; nicht gewertet

Frieda1b 25.03.-29.04.10 11 27

Hera Hera1a 01.02.-15.02.10 5 9 Versuch abgebrochen; nicht gewertet

Hera1b 15.03.-22.04.10 12 39

Queen Queen1a 22.02.-08.03.10 5 9 Versuch abgebrochen; nicht gewertet

Queen1b 15.03.-22.04.10 12 32

Rosa Rosa1 11.02.-11.03.10 9 24

Hera Hera2 31.05.-15.07.10 14 59 Versuchsstart falsch; nicht gewertet

Queen Queen2 07.06.-15.07.10 12 46

Crazy Crazy2 04.06.-09.07.10 15 53 3x wöchentl. OPU;

persistierendes C.l.; nicht gewertet

Rosa Rosa2 02.06.-09.07.10 17 49 3x wöchentl. OPU; nicht gewertet

Stella Stella3 28.10.-09.12.10 13 61

Tiffy Tiffy3 25.10.-29.11.10 11 52

UFO UFO3 25.10.-09.12.10 14 58 kein ind. C.l.; nicht gewertet

46


4.1 OPU

4.1.1 Zyklusverhalten und Gelbkörpereigenschaften

Da alle Tiere während der OPU-Versuchsphase regelmäßig Brunsten zeigten, wurde der Punktionszeitraum

anhand der Serumprogesteronwerte in verschiedene Phasen eingeteilt. Als Grenzwert

für ein funktionelles C.l. wurde dazu 1 ng/ml (SRIKANDAKUMAR et al. 1986) angenommen.

So ergaben sich für jedes Tier eine Lutealphase des nach der natürlichen Brunst entstandenen

C.l., eine daran anschließende Follikelphase sowie eine weitere Lutealphase (ind. C.l.),

die an die während des OPU aufgetretene Brunst anschloss. Ein Beispiel für die mittels Gnuplot

4.4.3 erstellte Funktion ist in Abbildung 4.1 zu sehen. Die Funktionsparameter für die Progesteronkurve

der einzelnen Tiere sowie eine Auflistung der errechneten Kurvenpunkte findet sich

in Anhang B.1.1 Tabelle B.33 sowie B.1.3 Tabellen B.34 und B.35.

Abbildung 4.1: Graphische Darstellung des Progesteronprofils während des Versuchszeitraumes;

+ an den Punktionstagen gemessene Werte, – Näherungsfunktion

Insgesamt gingen die Ergebnisse aus 8 OPU-Durchgängen von 7 Tieren in die Auswertungen

ein. Die durchschnittliche Zykluslänge des ersten Zyklus betrug 23,9 ±1,1 (¯n± SD, n=8)

Tage, der zweite Zyklus während der OPU-Versuchsphase unterschied sich in seiner Länge

(23,5 ±1,7 Tage; ¯n± SD, n=8) nicht vom ersten. Dabei wurde der Tag der Brunst jeweils als

Tag 0 des neuen Zyklus angesehen.

Der Mittelwert des gebildeten Progesterons während der beiden C.l.-Phasen betrug für das natürliche

C.l. 4,6 ±1,9 ng/ml und für das induzierte C.l. 2,8 ±1,0 ng/ml (¯n± SD, n=8, P ≤0,05,

siehe Abbildung 4.2). Die Querschnittsflächen der jeweiligen C.l. unterschieden sich ebenfalls

signifikant (nat. C.l. 246,7 ±56,0 mm 2 , ind. C.l. 140,6 ±55,9 mm 2 ; ¯n± SD, n=8, P ≤0,05, siehe

47


4 Ergebnisse

Abbildung 4.2). Die Länge der Lutealphasen zeigte jedoch keine statistischen Unterschiede (nat.

C.l. 17,0 ±2,3 Tage, ind. C.l. 14,4 ±2,9 Tage, ¯n± SD, n=8, siehe Abbildung 4.2). Der mittlere

Serumprogesterongehalt und die mittlere Querschnittsfläche der beiden C.l. waren nicht korreliert.

Auch die mittlere Querschnittsfläche des natürlichen C.l.s korrelierte nicht mit der des

induzierten C.l.s. Bezüglich des mittleren Serumprogesterongehaltes während der Gelbkörperphasen

bestand insofern ein tendenzieller Zusammenhang zwischen dem natürlichen C.l. und

dem induzierten C.l., als dass eine hohe P4-Produktion während der natürlichen Lutealphase

auch eine höhere P4-Produktion des induzierten C.l.s bedingte.

7

6

a

350

300

a

20

18

16

P4 (ng/ml)

5

4

3

2

4,6

b

2

Fläche in mm

250

200

150

100

246,7

b

Länge der C.l.- Phase (Tage)

14

12

10

8

6

17,0

14,4

2,8

140,6

4

1

50

2

0

nat. C.l.

ind. C.l.

0

nat. C.l.

Abbildung 4.2: Serumprogesterongehalt (links; ¯n±SD, n=8; a:b mit P ≤0,05), Fläche

(Mitte; ¯n±SD, n=8; a:b mit P ≤0,05) und Lutealphasenlänge (rechts;

¯n±SD, n=8) des natürlichen und induzierten C.l.

ind. C.l.

0

nat. C.l.

ind. C.l.

4.1.2 Follikelpunktion, Eizellausbeute und Oozytenqualität

Während der natürlichen C.l.-Phase wurden insgesamt 326 Follikel (32 OPU-Sitzungen), in der

Follikelphase 208 Follikel (21 OPU-Sitzungen) und in der induzierten C.l.-Phase 307 Follikel

(21 OPU-Sitzungen) punktiert. Die Verteilung der Follikelgrößen [Anteile kleiner 3-5 mm, mittelgroßer

5-8 mm, großer ≥ 8 mm Follikel an der Gesamtfollikelzahl (%)] ist der Tabelle 4.2 zu

entnehmen. Die entsprechenden Mittelwerte der punktierten Follikel je OPU-Sitzung und die

Verteilung auf die einzelnen Größenkategorien finden sich in Tabelle 4.3. Bezüglich der Anzahl

der punktierten Follikel und ihrer Größenverteilung in den einzelnen Zyklusphasen konnten

keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden.

48


4.1 OPU

Tabelle 4.2: Punktierte Follikel (n) und Größenverteilung während der Zyklusphasen

Zyklusphase Anteile der Follikelgrößen (%)

(n) 3-5 mm 5-8 mm ≥8 mm

natürliches C.l. 77,6 18,4 4,0

(n=326) (n=253) (n=60) (n=13)

Follikelphase 75,5 16,3 8,2

(n=208) (n=157) (n=34) (n=17)

induziertes C.l. 73,0 21,5 5,5

(n=307) (n=224) (n=66) (n=17)

Tabelle 4.3: Punktierte Follikel pro OPU-Sitzung (¯n±SD) in den einzelnen Zyklusphasen

Zyklusphase

Follikelgröße

Follikel

(OPU-Sitzungen)

3-5 mm 6-8 mm >8 mm

natürliches C.l. 10,2 ±3,4 7,9 ±3,1 1,9 ±1,2 0,4 ±0,6

(32)

Follikelphase 9,9 ±3,6 7,5 ±3,6 1,6 ±1,1 0,8 ±0,8

(21)

induziertes C.l. 9,9 ±2,9 7,2 ±2,7 2,1 ±1,3 0,5 ±0,7

(21)

Die mittlere Wiederfindungsrate (Anzahl KOK/Anzahl punktierte Follikelx100) betrug 38,7 %

(326 punktierte Follikel, 126 KOK) in der natürlichen C.l-Phase, 39,9 % (208 punktierte Follikel,

83 KOK) während der Follikelphase und 30,6 % (307 punktierte Follikel, 94 KOK) in

der induzierten C.l.-Phase. In Bezug auf die Anzahl der gewonnenen KOK und deren Qualität

zeigten sich in den einzelnen Zyklusphasen keine statistisch signifikanten Unterschiede. Die

Anzahl der gewonnenen KOK aus den einzelnen Zyklusphasen und deren Verteilung auf die

Qualitätskategorien sind der Tabelle 4.4 zu entnehmen. Die Mittelwerte der Anzahl der gewonnenen

KOK pro OPU-Sitzung und deren Verteilung auf die Qualitätskategorien sind in Tabelle

4.5 dargestellt.

Tabelle 4.4: Gewonnene KOK (n) und Anteile an den einzelnen Kategorien (%)

Zyklusphase Anteile der Qualitätskategorien (%) IVP-

(n) 1 2 3 4 5 tauglich untauglich

natürliches C.l. 22,2 27,0 32,5 8,7 9,6 81,7 18,3

(n=126) (n=28) (n=34) (n=41) (n=11) (n=12) (n=103) (n=23)

Follikelphase 19,3 22,9 42,2 3,6 12,0 84,4 15,6

(n=83) (n=16) (n=19) (n=35) (n=3) (n=10) (n=70) (n=13)

induziertes C.l. 24,5 33,0 27,6 2,1 12,8 85,1 14,9

(n=94) (n=23) (n=31) (n=26) (n=2) (n=12) (n=80) (n=14)

49


4 Ergebnisse

Tabelle 4.5: Gewonnene KOK der einzelnen Kategorien pro OPU-Sitzung in den Zyklusphasen

(¯n±SD)

Zyklusphase

Kategorie

KOK

(OPU-Sitzungen)

1 2 3 4 5

natürliches C.l. 3,9 ±2,7 0,9 ±1,1 1,1 ±1,0 1,3 ±1,1 0,3 ±0,8 0,4 ±0,7

(32)

Follikelphase 4,0 ±2,9 0,8 ±0,9 0,9 ±0,9 1,7 ±2,4 0,1 ±0,4 0,5 ±0,8

(21)

induziertes C.l. 3,0 ±2,0 0,8 ±0,9 1,0 ±1,2 0,8 ±0,9 0,1 ±0,3 0,4 ±0,6

(21)

4.2 Progesteronsupplementation während der In-vitro-Maturation

4.2.1 Progesteronanalyse im Medium

Im IVM-Medium ohne P4-Zusatz wurde kein P4 detektiert (P4 < 0,1 ng/ml). Die Ausgangskonzentrationen

sowie der P4-Gehalt des supplementierten Mediums nach 24stündiger Inkubation

mit/ohne Oozyten sind der Tabelle 4.6 zu entnehmen. Die P4-Konzentration nach 24stündiger

Inkubation mit Oozyten zeigte sich proportional zur Ausgangskonzentration. Dargestellt sind

hier lediglich die P4-Gehalte der Medien der in die weitere Auswertung eingegangenen IVP-

Durchgänge. Die Gesamtdaten zu den Medien sind den Tabellen B.43-B.46 in Anhang B.2.2

zu entnehmen. Die sehr unterschiedlichen Probenanzahlen (n) resultieren aus der Problematik,

stark unterschiedliche P4-Konzentrationen (< 50 ng/ml - 450 ng/ml) zu analysieren, was

mehrere Verdünnungsschritte erforderte. Aufgrund des geringen Probenvolumens konnte in einigen

Fällen die vollständige Analyse nicht durchgeführt werden. Solche Proben wurden von

der Auswertung ausgeschlossen.

50


4.2 Progesteronsupplementation während der In-vitro-Maturation

Tabelle 4.6: Progesterongehalt des Mediums (¯n±SD) der einzelnen Versuchsgruppen

vor der Inkubation (Ansatz), nach 24stündiger Inkubation ohne Oozyten

(Leerkontrolle) sowie nach 24stündiger Inkubation mit Oozyten

Gruppe

P4

Ansatz Leerkontrolle mit Oozyten

≤ 50 ng/ml 26,7 ±18,5 ng/ml 32,9 ±23,0 ng/ml 17,9 ±11,4 ng/ml

(≤ 0,16 µM) 0,09 ±0,06 µM 0,1 ±0,07 µM 0,06 ±0,04 µM

(n=7) (n=12) (n=9)

150 ng/ml 133,6 ±50,2 ng/ml 129,8 ±30,3 ng/ml 33,1 ±12,0 ng/ml

(0,48 µM) 0,42 ±0,0,16 µM 0,41 ±0,10 µM 0,1 ±0,04 µM

(n=11) (n=33) (n=30)

300 ng/ml 297,9 ±39,3 ng/ml 210,7 ±63,4 ng/ml 88,0 ±119,8 ng/ml

(0,95 µM) 0,95 ±0,13 µM 0,67 ±0,20 µM 0,28 ±0,38 µM

(n=9) (n=9) (n=13)

450 ng/ml 406,7 ±57,5 ng/ml 470,8 ±62,3 ng/ml 62,4 ±24,1 ng/ml

(1,43 µM) 1,29 ±0,18 µM 1,5 ±0,20 µM 0,20 ±0,08µM

(n=6) (n=3) (n=11)

4.2.2 In-vitro-Produktion nach Progesteronzusatz im Reifungsmedium

Nach der 24stündigen Reifung waren die mit Progesteronzusatz gereiften KOK mit deutlich

kompakteren Kumuluszellschichten umgeben als die der Kontrollgruppen (siehe Abbildung

4.3).

Abbildung 4.3: a: gereifte Oozyten der Kontrollgruppe; b: mit EtOH gereift; c: mit P4

gereift; Maßstab in allen Bildern gleich

Die Reifungskontrollen zeigten keine statistischen Unterschiede (P >0,05) in den Reifungsraten

zwischen den einzelnen Versuchsgruppen oder in Relation zu den Kontrollgruppen (siehe

Tabelle 4.7, Gesamtdaten siehe Anhang B.2.3 Tabellen B.47 -B.51). Die Teilungs- und Entwicklungsraten

der Embryonen der jeweiligen Versuchsgruppen sowie die der Kontrollgruppen

sind in Tabelle 4.8 dargestellt. Bezüglich der Teilungsraten gab es keine statistisch signifikanten

Unterschiede. Mit < 50 ng/ml P4 gereifte KOK zeigten sowohl an Tag 7 als auch an Tag 8 der

Entwicklung eine signifikant herabgesetzte Entwicklungsrate gegenüber den Kontrollgruppen

(P ≤0,05). Die Daten zu den IVP-Durchgängen der einzelnen Versuchsgruppen befinden sich

51


4 Ergebnisse

in Anhang B.2.1 Tabellen B.36 -B.42. Weiterhin zeigten mit 300 ng/ml gereifte KOK eine gegenüber

der EtOH-Kontrolle signifikant geringere Entwicklungsrate (P ≤0,05). Im Vergleich

mit der zusatzfreien Kontrolle bestand eine Tendenz zur herabgesetzten Entwicklung in dieser

Gruppe (P=0,084).

Tabelle 4.7: Prozentuale Anteile der Meiosestadien M I und M II in den Reifungskontrollen

(¯n±SD; P > 0,05)

Gruppe

Wiederholungen M I M II

Oozyten(n) (%) (%)

Kontrolle 3 17,8 ±3,5 82,2 ±3,5

(n=82) (n=15) (n=67)

EtOH 3 11,9 ±1,8 88,1 ±1,8

(8 µl) (n=84) (n=10) (n=74)

P4=150 ng/ml 3 17,8 ±3,6 82,2 ±3,6

(0,39 µM) (n=85) (n=15) (n=70)

P4=300 ng/ml 3 14,5 ±3,2 85,5 ±3,2

(0,73 µM) (n=86) (n=12) (n=74)

P4=450 ng/ml 3 17,2 ±3,1 82,8±3,1

(1,51 µM) (n=87) (n=15) (n=72)

Tabelle 4.8: Teilungs- (TR) und Entwicklungsraten (ER) der einzelnen Versuchsgruppen

(¯n±SD)

Gruppe

Wiederholungen TR ER d7 ER d8

Oozyten (%) (%) (%)

Kontrolle 26 55,9 ±11,6 20,7 ±6,6 b 25,4 ±8,0 b

(681) (381) (141) (173)

EtOH 29 53,7 ±11,1 21,4 ±10,3 c 27,9 ±9,2 c

(723) (388) (155) (202)

P4 < 50 ng/ml 6 45,2 ±9,9 10,7 ±5,4 a 15,8 ±5,4 a

(< 0,16 µM) (177) (80) (19) (28)

P4=150 ng/ml 11 49,7 ±11,6 18,3 ±8,2 ab 22,4 ±8,5 ab

(0,39 µM) (322) (160) (59) (72)

P4=300 ng/ml 5 48,2 ±15,9 15,5 ±5,0 d 18,0 ±7,2 d

(0,73 µM (278) (134) (43) (50)

P4=450 ng/ml 7 48,3 ±10,2 16,9 ±3,2 ab 22,4 ±10,6 ab

(1,51 µM) (290) (140) (49) (65)

innerhalb einer Spalte: a:b, a:c mit P≤0,05; c:d mit P=0,084

52


4.3 mRNA-Expression verschiedener Gene

4.3 mRNA-Expression verschiedener Gene

4.3.1 mRNA-Expression in OPU-KOK verschiedener Zyklusphasen

Es konnten statistisch signifikante Unterschiede für die Expression der mRNA von GDF9,

HIF2α, BMP15, PGR, PGRMC1, PGRMC2 und PAQR5 in Abhängigkeit von der Zyklusphase

nachgewiesen werden. Bezüglich der Expression des Glukosetransporters SLC2A1 gab es keine

statistisch signifikanten Unterschiede. Im Folgenden soll lediglich die Expression der signifikant

veränderten Gentranskripte dargestellt werden. Eine ausführliche Auflistung aller Daten

findet sich in Anhang B.3.1.

Eizellen aus der Phase des induzierten C.l. zeigten gegenüber Eizellen der natürlichen C.l.-

Phase eine signifikant verringerte Transkriptmenge von GDF9. Weiterhin bestand eine statistische

Tendenz (P=0,075) zur verringerten Expression von GDF9 im Vergleich zur Follikelphase

(siehe Abbildung). Bezüglich HIF2α zeigte sich eine signifikant geringere Expression bei Eizellen

aus der induzierten C.l-Phase gegenüber dem natürlichen C.l. (siehe Abbildung 4.4). Eizellen

der induzierten C.l.-Phase wiesen ausserdem eine signifikant geringere Transkriptmenge

von BMP15 gegenüber Eizellen der anderen Zyklusphasen auf (siehe Abbildung 4.4).

Abbildung 4.4: mRNA-Gehalte der OPU-Oozyten bezüglich GDF9, BMP15 und HIF2α;

a:b mit P < 0,05, * = Tendenz

Bezüglich der Progesteronrezeptoren gab es signifikant weniger Transkripte in den Oozyten

der induzierten C.l.-Phase im Vergleich zu den anderen Zyklusphasen im Hinblick auf

53


4 Ergebnisse

PGRMC1 und PGRMC2. Die Transkriptmenge des nuklearen Rezeptors PGR war in den Oozyten

der induzierten C.l.-Phase signifikant geringer im Vergleich zur Follikelphase, und in

Relation zur natürlichen C.l.-Phase tendenziell verringert (P=0,059). Die Eizellen der induzierten

C.l.-Phase enthielten gegenüber den Oozyten der natürlichen C.l.-Phase eine signifikant

verringerte Menge an PAQR5 (siehe Abbildung 4.5).

Abbildung 4.5: mRNA-Gehalte der OPU-Oozyten bezüglich der Progesteronrezeptoren;

a:b mit P < 0,05, * = Tendenz

4.3.2 mRNA-Expression in gereiften Oozyten nach IVM mit P4-Zusatz

Die relative Transkriptmenge in den Eizellen der Versuchsgruppen verglichen mit unreifen Oozyten

bzw. den Kontrollgruppen war bei GDF9, HIF2α, PGR, PGRMC2 und PAQR5 signifikant

verändert. Bezüglich SLC2A1, BMP15 und PGRMC1 konnten keine statistisch signifikanten

Unterschiede in der mRNA-Expression festgestellt werden. Im Folgenden soll lediglich auf die

statistisch signifikant veränderten Transkripte eingegangen werden. Eine ausführliche Auflistung

aller Daten findet sich in Anhang B.3.2.

54


4.3 mRNA-Expression verschiedener Gene

Im Vergleich zu unreifen Eizellen zeigten Oozyten der Gruppen < 50 ng/ml, 150 ng/ml

und 300 ng/ml eine signifikant verringerte relative Transkriptmenge von GDF9 (siehe Abbildung

4.6). Bezüglich HIF2α war die Transkriptmenge in Oozyten der Gruppen 150 ng/ml und

450 ng/ml gegenüber den unreifen Oozyten signifikant herabgesetzt, bei den Oozyten der Gruppe

300 ng/ml zeigte sich eine Tendenz (P=0,066; siehe Abbildung 4.6).

Abbildung 4.6: mRNA-Gehalte der gereiften Oozyten aus dem IVM-Versuch bezüglich

GDF9 und HIF2α; a:b mit P < 0,05, * = Tendenz

Der nukleare PGR wies signifikant niedrigere Transkriptmengen in den unreifen Oozyten sowie

den Oozyten der Gruppen EtOH, < 50 ng/ml, 150 ng/ml und 450 ng/ml gegenüber der zusatzfreien

Kontrollgruppe N auf (siehe Abbildung 4.7). Die Oozyten der Gruppe 300 ng/ml tendierten

ebenfalls zu niedrigeren Werten (P=0,086). Oozyten der Progesterongruppen < 50 ng/ml,

150 ng/ml und 450 ng/ml zeigten eine signifikant verringerte Expression von PGRMC2 gegenüber

der zusatzfreien Kontrolle N (siehe Abbildung 4.7). Ausserdem enthielten Eizellen der

Gruppe 150 ng/ml tendenziell weniger PGRMC2-Transkripte als Eizellen der Alkoholkontrolle

EtOH (P=0,063). Der Rezeptor PAQR5 war in den Gruppen EtOH, 150 ng/ml und 450 ng/ml gegenüber

unreifen Eiztellen signifikant verringert. Auch die Gruppen < 50 ng/ml und 300 ng/ml

tendierten zu niedrigeren PAQR5-Transkriptgehalten (P=0,071 und P=0,067; siehe Abbildung

4.7).

55


4 Ergebnisse

Abbildung 4.7: mRNA-Gehalte der gereiften Oozyten aus dem IVM-Versuch bezüglich

der Progesteronrezeptoren; a:b mit P < 0,05, * = Tendenz

56


5 Diskussion

5.1 Zyklusverhalten während der OPU-Versuchsphase

Im OPU-Versuchsteil der vorliegenden Arbeit wurden 7 Tiere zweimal wöchentlich über einen

Zeitraum von 5-6 Wochen der OPU-Prozedur zur Gewinnung von Eizellen unterzogen. Während

dieses Zeitraumes zeigten alle Tiere regelmässige Brunsten mit physiologischer Zykluslänge

sowie die Bildung gelbkörper-ähnlicher, progesteronproduzierender Strukturen.

5.1.1 Zwischenbrunsten und Bildung gelbkörperähnlicher Strukturen

Um eine physiologische Brunst hervorzurufen bedarf es einerseits eines dominanten Follikels,

andererseits aber auch der hormonellen Konstellation, die nicht nur zu den äusseren und inneren

Anzeichen der Brunst führt, sondern den dominanten Follikel letztlich ovulieren und einen

Gelbkörper entstehen lässt. Durch Ergebnisse verschiedener Forschungsgruppen (PIETERSE

et al. 1991b, BERGFELT et al. 1994, BONI et al. 1997, PETYIM et al. 2000) ist belegt, dass das

Absaugen aller Follikel durch OPU eine FSH-Ausschüttung bedingt und somit eine neue Follikelwelle

auslöst. Das Auftreten dominanter Follikel bei zweimal wöchentlichen OPU-Sessions

wurde, in Abhängigkeit vom OPU-Intervall, ebenfalls mehrfach beschrieben (BERGFELT et al.

1994, GINTHER et al. 1996, PETYIM et al. 2000, 2001, 2003) und konnte auch im vorliegenden

Versuch zu verschiedenen Zeitpunkten des Zyklus beobachtet werden. Dies kann mit einem

durch OPU beschleunigten Follikelwachstum (BONI et al. 1997) zusammenhängen. Laut

HAYASHI et al. (2008) ist nach der Luteolyse und somit dem Wegfall des hemmenden Einflusses

des Gelbkörpers eine erhöhte Ausschüttung von Wachstumshormonen zusammen mit

einem erhöhten basalen LH-Level für ein schnelleres Follikelwachstum verantwortlich. Dies

deckt sich mit den Erkenntnissen von CARLIN et al. (1999), die ebenfalls ein erhöhtes basales

LH- und FSH-Level bei niedrigen Progesteronwerten durch zweimal wöchentliches OPU

über einen Zeitraum von 16 Wochen verursachen konnten. Im Gegensatz zu den Ergebnissen

der vorliegenden Arbeit haben einige Autoren beobachtet, dass das wiederkehrende Absaugen

aller Follikel den Zyklus ausser Kraft setzt (GIBBONS et al. 1994, BONI et al. 1997). Diese

57


5 Diskussion

Autoren konnten, wie auch später CARLIN et al. (1999), weder dominante Follikel noch Ovulationen

bei zweimal wöchentlich sattfindendem OPU feststellen. Eine unbemerkte Ovulation

nicht punktierter Follikel, wie sie bei BERGFELT et al. (1994) als Ursache für Zwischenbrunsten

beschrieben wurde, konnte in der vorliegenden Arbeit durch eine Ultraschallkontrolle nach

jeder OPU-Session ausgeschlossen werden.

In der vorliegenden Arbeit wurden weder FSH noch LH gemessen, daher ist eine eindeutige

Klärung der Ursachen für die Zwischenbrunsten und die auftretenden dominanten Follikel hier

nicht möglich. Ein beschleunigtes Follikelwachstum durch die oben beschriebenen hormonellen

Veränderungen könnten dies jedoch erklären.

Auf die während des OPU-Versuchszeitraumes beobachtete Brunst folgte bei allen Tieren die

Bildung gelbkörperähnlicher Strukturen. Da am Tage der Brunst eine OPU-Session erfolgte ist

davon auszugehen, dass der jeweilige Brunstfollikel punktiert wurde. Die Bildung gelbkörperähnlicher

Gebilde nach Follikelpunktionen wurde in der Vergangenheit mehrfach beschrieben

(PETYIM et al. 2000, 2001, 2003). Schon 1994 hielten BERGFELT et al. (1994) eine Gelbkörperbildung

nach der Punktion reifer Follikel für möglich. Hiermit übereinstimmend stellten

(PETYIM et al. 2000) die Bildung C.l.-ähnlicher Strukturen nach Punktion dominanter Follikel

bei Tieren, die äussere Brunstanzeichen zeigten, fest. Diese Autoren setzen die östrusnahe Follikelpunktion

mit einer künstlichen Ovulation gleich. Die auf diese Weise induzierten Gelbkörper

waren zwar kleiner, konnten von den Autoren aber als funktionelle Gelbkörper eingestuft werden.

Auch bei der östrusfernen Follikelpunktion bildeten sich in den Studien von PETYIM et al.

(2000) gelbkörperähnliche Strukturen. Dabei handelte es sich entweder um kurzlebige C.l. mit

einem nur vorübergehenden Anstieg von Progesteron oder um C.l. mit normaler Lebensdauer

und insgesamt niedrigen P4-Werten. Im Gegensatz dazu konnte in früheren Studien von PIE-

TERSE et al. (1988, 1991a,b) keine Luteinisierung punktierter Follikel festgestellt werden.

Im vorliegenden Versuch wird davon ausgegangen, dass die jeweiligen Brunstfollikel punktiert

wurden. Das entspricht der durch PETYIM et al. (2000) beschriebenen künstlichen Ovulation

per OPU. Die auch in diesem Versuch beobachtete C.l.-Bildung lässt vermuten, dass keine

Spontanovulation zur Luteinisierung erforderlich ist. Auch BERGFELT et al. (1994) und HAYA-

SHI et al. (2006) halten dies für möglich. BERGFELT et al. (1994) argumentieren, dass weder

die Follikelwand noch die Granulosazellen durch die Punktion derart beschädigt werden, dass

die Luteinisierungsvorgänge gestört ablaufen.

Physiologischerweise gehen der Spontanovulation und der folgenden Luteinisierung des Follikels

der LH-Peak voraus. Mit unzureichenden oder ausbleibenden LH-Peaks werden verspätete

Ovulationen und anovulatorische Zyklen sowie subfunktionale Gelbkörper in Verbindung

gebracht (LEE et al. 1988, RIEGER et al. 1989, BLOCH et al. 2006, HAYASHI et al. 2006). Ist

der LH-Peak jedoch einmal erfolgt, so findet laut HAYASHI et al. (2006) die Luteinisierung

unabhängig von der Ovulation in jedem Fall statt. Folglich wäre für eine erfolgreiche Luteinisierung

weniger eine Ovulation als die hormonelle Konstellation, insbesondere der LH-Peak,

essentiell. Im Gegensatz dazu beobachteten WISE et al. (1994) die Selbstluteinisierung von

Follikeln ohne vorherigen LH-Peak. Es ist bekannt, dass LH die Granulosa- und Thekazellen

stimuliert und sie auf die Luteinisierung vorbereitet (SMITH et al. 1994). Diese Vorgänge finden

bereits während der präovulatorischen Follikelentwicklung statt, die durch das Hormon LH wesentlich

mitgeprägt ist (SMITH et al. 1994, AERTS und BOLS 2010). Dies entspricht auch den

58


5.1 Zyklusverhalten während der OPU-Versuchsphase

Schlussfolgerungen von DIAZ et al. (2002), die das pulsatil ausgeschüttete LH als essentiell für

ein normales luteales Wachstum einstufen. So könnten funktionelle Gelbkörper durchaus auch

ohne einen LH-Peak entstehen.

Ob und wann in der vorliegenden Studie LH-Peaks stattgefunden haben, wurde nicht untersucht.

Dementsprechend lässt sich auch keine Aussage über die Notwendigkeit des LH-Peaks

für die Luteinisierung treffen. Inwiefern die oben erwähnten, durch OPU eventuell erhöhten

basalen FSH- und LH-Level die Luteinisierung begünstigen, bleibt ebenfalls offen.

Dass in einigen Fällen am Tage der Brunst unmittelbar vor der OPU-Session eine Spontanovulation

stattgefunden hat ist höchst unwahrscheinlich. Letztlich ist dies jedoch nicht vollständig

auszuschliessen, da durch die häufigen Punktionen im Abstand von 3-4 Tagen stets mehrere

blutgefüllte Follikel auf den Ovarien zu sehen waren. Ein kürzlich spontan rupturierter Follikel,

der sich anschließend mit Blut aufgefüllt hat, ist davon nicht zu unterscheiden.

5.1.2 Eigenschaften der gelbkörperähnlichen Gebilde

Die Progesteronproduktion der zu Beginn des Versuches bestehenden, natürlichen Gelbkörper

entspricht den Ergebnissen früherer Studien (SCHAMS et al. 1977, DIAZ et al. 1986, KASTELIC

et al. 1990, RIBADU et al. 1994, FIELDS und FIELDS 1996, SIANANGAMA und RAJAMAHEN-

DRAN 1996, TOM et al. 1998, HERZOG et al. 2010). Dagegen zeigten die während der OPU-

Versuchsphase induzierten, gelbkörperähnlichen Strukturen eine signifikant geringere mittlere

Progesteronproduktion (natürliches C.l. 4,6 ±1,9 ng/ml vs. induziertes C.l. 2,8 ±1,0 ng/ml,

P ≤0,05) bei einer Lebensdauer von 14,4 ±2,9 Tagen. Laut FORDE et al. (2011) dauert die

physiologische Lutealphase 14-18 Tage. Die im vorliegenden Versuch entstandenen induzierten

Gelbkörper liegen somit noch im physiologischen Bereich. Auch PETYIM et al. (2000) beschreiben

das Auftreten funktioneller C.l. mit geringerer oder normaler Progesteronproduktion und

normaler Lebensdauer nach Follikelpunktion. Ursache für die geringe Progesteronproduktion

könnte eine inadäquate präovulatorische Follikelentwicklung sein. SIANANGAMA und RAJA-

MAHENDRAN (1996) beobachteten bei induzierten C.l. eine geringere P4-Produktion, die, wie

in der vorliegenden Arbeit, ebenfalls mit einer geringeren C.l.-Größe einherging. Allerdings

wurden diese Gelbkörper durch hCG-Gaben zu unphysiologischen Zeitpunkten im Zyklus hervorgerufen.

Demgegenüber wurde im vorliegenden Versuchsaufbau keine hormonelle Manipulation

vorgenommen. Die OPU-Prozedur war der einzige artifizielle Einfluss. Veränderungen

des hormonellen Milieus sind dennoch nicht auszuschliessen, da Langzeit-OPU zu veränderten

P4-, LH- und FSH-Profilen führen kann (CARLIN et al. 1999). Immer wieder durch OPU ausgelöste

FSH-Schübe (PIETERSE et al. 1991b, BERGFELT et al. 1994, BONI et al. 1997, PETYIM

et al. 2000) führen zu einem beschleunigten Follikelwachstum (PETYIM et al. 2000, HAYASHI

et al. 2008), welches das Vorkommen der C.l. erklären könnte. Der Zeitpunkt der Luteinisierung,

normalerweise durch die Spontanovulation nach dem LH-Peak bestimmt, wird jedoch

durch die artifizielle Ovulation per OPU vorverlegt. Dementsprechend könnte die Luteinisierung

ohne vorherigen LH-Peak erfolgt sein. SMITH et al. (1994) bringen sowohl das präovulatorisch

ausgeschüttete FSH als auch LH mit den morphologischen, endokrinologischen und biochemischen

Vorgängen der Luteinisierung in Verbindung. Weiterhin zeigten DIELEMAN et al.

(1983), dass im Zeitfenster vom LH-Peak bis hin zur Ovulation wesentliche hormonelle und

59


5 Diskussion

strukturelle Veränderungen im präovulatorischen Follikel stattfinden. So konnte in der Phase

6-20h nach dem LH-Peak ein Größenwachstum der Granulosazellen belegt werden (DIELE-

MAN et al. 1983). Aus den Granulosazellen entstehen im weiteren Verlauf der Luteinisierung

die sogenannten large luteal cells [LLCs; MILVAE et al. (1991), NISWENDER et al. (2000)], deren

Progesteronproduktion wesentlich für die über längere Zeit hohen Serumprogesterongehalte

verantwortlich ist (MILVAE et al. 1991, DIAZ et al. 2002). Demnach könnte eine unzureichende

oder fehlende LH-Exposition oder eine verkürzte Zeit zwischen LH-Peak und künstlicher

Ovulation über die Beeinflussung der follikulären Zellen letztlich zu geringerer Progesteronproduktion

der induzierten C.l. führen.

Weiterhin zeigten die induzierten, gelbkörperähnlichen Gebilde eine signifikant geringere

Querschnittsfläche (nat. C.l. 246,7 ±56,0 mm 2 , ind. C.l. 140,6 ±55,9 mm 2 , P ≤0,05) als ihre

natürlichen Pendants. Verschiedene Autoren vermuten Zusammenhänge zwischen der Größe

des ovulatorischen Follikels und dem daraus resultierenden Gelbkörper (OUSSAID et al.

2000, VASCONCELOS et al. 2001, PERRY et al. 2005, ECHTERNKAMP et al. 2009, CERRI et al.

2011b). PERRY et al. (2005) stellten fest, dass eine GnRH-induzierte Ovulation bei Follikeln

≤ 11 mm eine geringere Fertilität in Bezug auf die Etablierung und Unterhaltung einer Trächtigkeit

durch geringe Progesteronwerte zur Folge hatte. Durch die Abstände der OPU-Sitzungen

von 3 bzw. 4 Tagen konnten die Follikel, aus denen die Gelbkörper entstanden, hier höchstens 4

Tage lang wachsen. Dies entspricht der Wachstumszeit der Follikel in einem 3-Welligen Zyklus

(SIROIS und FORTUNE 1988). Im vorliegenden Versuch stammten die induzierten Gelbkörper

vermutlich aus den jeweiligen Brunstfollikeln. Deren Größen variierten je nach Individuum von

9 mm bis 15 mm. In allen Fällen waren die Progesteronwerte und die gemessenen Querschnitte

jedoch geringer als im Vergleich zum vorhergehenden, natürlichen Gelbkörper. Ein Zusammenhang

mit der Größe der Brunstfollikel zum Zeitpunkt der Punktion ist daher nicht zu vermuten.

Die geringere Größe des C.l. könnte jedoch ebenfalls eine Folge der verkürzten finalen Wachstumsphase

des dominanten Follikels vor der induzierten Ovulation sein. Die Größe des C.l.

wird einerseits durch die Größe der LLC´s, andererseits über die Anzahl der Small Luteal Cells

(SLCs) determiniert (FARIN et al. 1986, NISWENDER et al. 2000). Deren Vorläuferzellen, die

Theka- und Granulosazellen, werden, wie oben schon beschrieben, durch LH stimuliert und beginnen

schon vor der Ovulation sich zu verändern. So könnte neben der Progesteronproduktion

auch die Größe des Gelbkörpers durch die intrafollikulären Vorgänge vor der Ovulation beeinflusst

werden. Anders als in den Studien von PIETERSE et al. (1991a), RIBADU et al. (1994),

OUSSAID et al. (2000), PERRY et al. (2005), CERRI et al. (2009), HERZOG et al. (2010), LÜTT-

GENAU et al. (2011), RIZOS et al. (2012) konnte kein statistischer Zusammenhang zwischen

der Größe der Gelbkörper und ihrer Progesteronproduktion hergestellt werden. Andere Studien

weisen allerdings darauf hin, dass nicht die Größe, sondern vielmehr Reife und Alter des

ovulatorischen Follikels die Steroidsynthesekapazitäten des resultierenden C.l. determinieren

(CERRI et al. 2011b).

Die Progesteronproduktion bzw. die Lebensdauer eines Gelbkörpers haben eine Schlüsselrolle

in der Regulation der Zykluslänge (NISWENDER et al. 2000). Sowohl die Zykluslänge als

auch die Länge der Lutealphasen beider beobachteter Zyklen zeigten keine statistisch signifikanten

Unterschiede. Verschiedene Autoren konnten zeigen, dass die luteale Funktionsdauer

sowie die Produktion von Progesteron weitgehend autoreguliert sind (ROTCHILD 1981, PATE

1988, 1996, SKARZYNSKI und OKUDA 1999, SKARZYNSKI et al. 2000, SCHAMS und BE-

60


5.2 Follikeleigenschaften, Eizellausbeute und Oozytenqualität

RISHA 2002, AROSH et al. 2004, KOTWICA et al. 2004, LISZEWSKA et al. 2005). Weiterhin

reguliert Progesteron die Lebensdauer des Gelbkörpers (SCHAMS und BERISHA 2002). Im vorliegenden

Fall war die Menge des produzierten Progesterons der induzierten, gelbkörperähnlichen

Strukturen im Mittel zwar geringer als die der natürlichen Gelbkörper, konnte jedoch

trotzdem die Aufrechterhaltung der Gelbkörperaktivität über eine physiologische Zeitspanne

hin gewährleisten.

Als subfunktional gelten C.l. mit normaler Lebensdauer und P4-Konzentrationen ≤1,5 ng/ml

an Zyklustag 10 (SCHRICK et al. 1992, BURNS et al. 1997, PETYIM et al. 2000) oder C.l.

mit normaler P4-Sekretion und kurzen Zykluslängen (PETYIM et al. 2000). Dies trifft auf die

hier induzierten, gelbkörperähnlichen Strukturen nicht zu. Daher ist davon auszugehen, dass

sich trotz zweimal wöchentlichem OPU Gelbkörper mit physiologischen Eigenschaften gebildet

haben, welche sich jedoch von ihren natürlichen Pendants entsprechend unterscheiden.

5.2 Follikeleigenschaften, Eizellausbeute und Oozytenqualität

Die mittlere Anzahl der punktierten Follikel pro OPU-Sitzung betrug 10,2 ±3,4 in der natürlichen

C.l.-Phase, 9,9 ±3,6 in der Follikelphase und 9,9 ±2,9 in der induzierten C.l.-Phase. Es

gab keinen statistischen Unterschied zwischen den einzelnen Zyklusphasen. Bezüglich der Anzahl

punktierter Follikel konnten andere Forschungsgruppen bei zweimal wöchentlichen OPU-

Sitzungen teilweise weniger (PETYIM et al. 2003, CHAUBAL et al. 2006, DE ROOVER et al.

2008, HANSTEDT 2009) und teilweise mehr Follikel (BONI et al. 1997, GARCIA und SA-

LAHEDDINE 1998, RAMOS et al. 2010) pro OPU-Session punktieren. Diese Variation in den

Punktionsergebnissen lässt sich auf den Einfluss des Individuums auf die Follikelanzahl zurückführen

(LANSBERGEN et al. 1995). Im Gegensatz zu den Ergebnissen von PETYIM et al.

(2000) konnte kein Einfluss der Zyklusphase auf die Follikelanzahl festgestellt werden. Dies

entspricht den Beobachtungen von DOMINGUEZ (1995) und BOEDIONO et al. (1995).

In Bezug auf die Anzahl der KOK pro OPU-Session konnten in dieser Arbeit ähnliche Ergebnisse

erzielt werden wie in den Arbeiten anderer Autoren (HANENBERG und VAN WAGTEN-

DONK-DE LEEUW 1997, PETYIM et al. 2000, 2003, CHAUBAL et al. 2006, LOPES et al. 2006,

DE ROOVER et al. 2008). RAMOS et al. (2010) und GALLI et al. (2001) erhielten mehr KOK pro

OPU-Session. Hier sei auf den nachgewiesenen Einfluss des Punkteurs auf die Eizellausbeute

hingewiesen (LANSBERGEN et al. 1995, MERTON et al. 2003). Weiterhin kann bei mehreren

wöchentlichen OPU-Sitzungen durch die erneute Punktion blutgefüllter, alter Follikel oder

durch das Durchstechen C.l.-ähnlicher Strukturen Blut in das Schlauchsystem gelangen, was

die Wiederauffindung von Eizellen im Punktat durch die Bildung von Blutkoagula erschwert

(PETYIM et al. 2000). Dies erklärt auch die in dieser Arbeit relativ geringen Wiederfindungsraten

[vergleiche auch PIETERSE et al. (1991b), PETYIM et al. (2003), CHAUBAL et al. (2006),

DE ROOVER et al. (2008)]. Ein Einfluss der Zyklusphase auf die Anzahl der KOK wurde, entsprechend

den Beobachtungen von BOEDIONO et al. (1995), nicht festgestellt.

Die Anzahl der IVP-tauglichen KOK entsprach den Ergebnissen anderer Autoren (LOPES

et al. 2006, HANSTEDT 2009). Im Hinblick auf die morphologische Qualität der gewonnenen

KOK zeigten sich ebenfalls keine Unterschiede zwischen den einzelnen Zyklusphasen. Auch

DE WIT et al. (2000), VASSENA et al. (2003) und PETYIM et al. (2003) konnten keine Unter-

61


5 Diskussion

schiede in der Eizellqualität bezogen auf den Zyklusstand des Donortieres feststellen. Ebenso

hatten die in jeder Zyklusphase auftretenden dominanten Follikel offenbar keinen Einfluss auf

die morphologische Qualität der KOK. Um, analog zu BOEDIONO et al. (1995), LANSBERGEN

et al. (1995), STUBBINGS und WALTON (1995) bzw. HENDRIKSEN et al. (2004) und CHAU-

BAL et al. (2006), einen Einfluss den Zyklusstandes oder eines dominanten Follikels auf die

Teilungs- und Entwicklungsraten sowie die Qualität der resultierenden Embryonen zu verifizieren,

wären weiterführende Untersuchungen mit einer vollständigen IVP notwendig.

5.3 MessengerRNA-Häufigkeiten in den OPU-Oozyten

Da verschiedene äussere Faktoren sich nicht immer auf das morphologische Erscheinungsbild

der Eizelle auswirken (HAGEMANN 1999, JEWGENOW et al. 1999, MERMILLOD et al. 1999,

COTICCHIO et al. 2004, FENG et al. 2007), wurde in den vergangenen Jahren der Fokus auf die

Veränderungen auf molekularer Ebene gerichtet. Dabei konnten verschiedene Gentranskripte

als Marker für Qualität und Entwicklungskompetenz identifiziert werden (WRENZYCKI et al.

2007). Bei der Interpretation von Daten aus der RT-PCR-Analyse ist jedoch zu beachten, dass

sich nicht alle Veränderungen in der mRNA-Expression auch auf funktionaler Ebene bzw. in

der Expression der Proteine wiederfinden.

Um einen möglichen Einfluss der Zyklusphase auf die Qualität bzw. die Entwicklungskompetenz

der Oozyten zu detektieren, wurden die mRNA-Häufigkeiten von vier qualitätsanzeigenden

Genen (GDF9, BMP15, SCL2A1, HIF2α) in den Eizellen der verschiedenen Zyklusphasen gemessen.

Oozyten der induzierten C.l.-Phase zeigten verringerte Transkriptmengen von GDF9,

HIF2α und BMP15. Der Glukosetransporter SCL2A1 war nicht verändert.

Ein verringerter GDF9-Gehalt wurde von verschiedenen Autoren mit einer verminderten Eizellqualität

in Verbindung gebracht (TAN und LU 1990, PAVLOK et al. 1992, BORDIGNON

et al. 1997, HUMBLOT et al. 2005). Die Untersuchungen von DONNISON und PFEFFER (2004)

ergaben eine verringerte Transkriptmenge in Eizellen aus Follikeln ≤ 2 mm gegenüber Follikeln

mit ≥ 5 mm. Auch in vitro gereifte Oozyten enthalten weniger GDF9 als in vivo gereifte

(LONERGAN et al. 2003a). Bei Mäusen konnten ausserdem Störungen der Kumuluszellfunktionen

bei veränderter GDF9-Expression nachgewiesen werden (YAN et al. 2001). Somit scheint

die GDF9-Expression ein Indikator für die Entwicklungskompetenz zu sein. In Bezug auf die

vorliegende Studie würde das bedeuten, dass Eizellen, die während der induzierten Gelbkörperphase

gewonnen wurden, eine geringere Entwicklungskompetenz aufweisen.

Bezüglich der BMP15-Expression in unreifen, in vivo gewonnenen Oozyten gibt es keine

vergleichbaren Studien. In Versuchen von EL-SAYED et al. (2006) enthielten Embryonen, die

sich nicht zu einem Kalb entwickelten, weniger BMP15 als solche, deren Entwicklung bis zum

gesunden Kalb vonstatten ging. Dies könnte einen Einfluss von BMP15 auf die Entwicklungskompetenz

des Embryos implizieren. Inwiefern schon der Gehalt der Oozyte an BMP15 für die

spätere embryonale Entwicklung relevant ist, bleibt jedoch offen.

Genprodukte des HIF2α-Gens sind an der Stressprotektion beteiligt. Eine Herunterregulation

der Genexpression, wie es hier der Fall ist, könnte sich dementsprechend negativ auf die

Anpassungsfähigkeit an das Reifungsmilieu und damit auf die In-vitro-Kompetenz auswirken.

62


5.3 MessengerRNA-Häufigkeiten in den OPU-Oozyten

Weiterhin wurde die Regulation anderer Gene durch HIF2α belegt (SEMENZA 1998, HARVEY

et al. 2007). Eine veränderte HIF2α-Expression könnte demnach weitreichende Konsequenzen

für das Entwicklungspotential haben.

Weiterhin wurden im Hinblick auf einen möglichen Einfluss von Progesteron auf die Eizellreifung

die Transkriptmengen der Progesteronrezeptoren PGR, PAQR5, PGRMC1 sowie

PGRMC2 ermittelt. Sämtliche Progesteronrezeptoren waren in den Oozyten der induzierten

Gelbkörperphase herunterreguliert.

Bezüglich des PGR ist bekannt, dass seine Expression durch umgebendes Progesteron in vitro

verändert wird (APARICIO et al. 2011). Ein Einfluss des Mikromilieus als Ursache für diese

Veränderung ist also zu vermuten. Reife Oozyten enthalten laut LUCIANO et al. (2010) und

SALHAB et al. (2011) mehr PGR als unreife, was auf eine aktive Transkription während der

Reifung hindeutet. Im vorliegenden Versuch wurden nur unreife Eizellen der Kategorien I-III

für die mRNA-Analyse genutzt. Ob eine geringere Ausgangsmenge an PGR, wie hier in den

Eizellen der induzierten Gelbkörperphase, durch eine höhere Transkription während der Reifung

kompensiert werden kann, ist fraglich. Falls nicht, könnte es nachhaltige Folgen für die

embryonale Entwicklung haben und somit auf eine geringere Entwicklungskompetenz hindeuten.

Der Rezeptor PAQR5 zeichnet sich durch eine hohe Bindungsaffinität zu P4 mit begrenzter

Kapazität aus (ZHU et al. 2003b). Ausserdem unterliegt er einer hormonellen Regulation (ZHU

et al. 2003b, CAI und STOCCO 2005). Die verringerte Expression könnte hier ein Ausdruck der

Regulation sein. Für ein tieferes Verständnis der zugrunde liegenden Regelkreise und eventuell

weitere beteiligte Hormone sind jedoch weitere Versuche notwendig. So bleibt in diesem Fall

unklar, ob der Rezeptor als eine Reaktion auf ein Überangebot an P4 vermindert exprimiert

wurde oder ob eine zur P4-Konzentration proportionale Expression zu einem früheren Zeitpunkt

vorliegt.

Auch die membranständigen Rezeptoren PGRMC1 und PGRMC2 sind in ihrer Expression

variabel (KOWALIK und KOTWICA 2008). Verschiedene Autoren (LUCIANO et al. 2010, SAL-

HAB et al. 2011) sprechen dem PGRMC1 eine Rolle bei der Reifung, genauer bei der Trennung

der Chromosomen, zu. Eine wie hier vorliegende verminderte Expression könnte den Ablauf

der Reifung stören und die Teilungs- und Entwicklungsraten verringern. Analog dazu wird dem

PGRMC2 eine Rolle bei der Blastulation zugeschrieben (LUCIANO et al. 2010). Veränderungen

in der Transkriptmenge könnten die embryonale Entwicklung empfindlich stören und zu

verminderten Blastozystenraten führen.

Allgemein ist noch zu wenig über die Progesteronrezeptoren, ihre Aufgaben und ihre Regulation

bekannt. Der Nachweis der P4-Rezeptoren in unreifen und reifen Eizellen lässt jedoch

eine Rolle von P4 bei den Reifungsvorgängen vermuten (APARICIO et al. 2011). Die Tatsache,

dass im vorliegenden Versuch sämtliche Veränderungen in den mRNA-Expressionsmustern bei

Oozyten der induzierten Gelbkörperphase vorlagen, wirft die Frage nach der Ursache auf. Ob

die verringerte P4-Produktion des induzierten Gelbkörpers und somit die geringerte periphere

P4-Konzentration diese Veränderungen bewirkt hat, kann nur vermutet werden. Nach wie vor

ist unklar, ob und wie peripher zirkulierendes P4 die Komposition der Follikelflüssigkeit beeinflusst.

Eine Analyse der endokrinologischen Situation im Follikel über die Follikelflüssigkeit

63


5 Diskussion

in Abhängigkeit von der Zyklusphase bzw. dem peripheren P4 könnte diesen Zusammenhang

klären.

Insgesamt werden deutliche Unterschiede in den Genexpressionsmustern der Eizellen aus den

verschiedenen Zyklusphasen deutlich. Diese lassen auf eine verminderte Qualität der Eizellen

der induzierten Gelbkörperphase schließen. Inwiefern die zyklusabhängigen Veränderungen des

peripheren P4 oder die endokrinologischen Veränderungen durch die OPU-Prozedur die veränderte

Genexpression bewirken und welche Folgen dies für die Entwicklungskompetenz hat,

bedarf weiterer Untersuchungen.

5.4 Progesteronsupplementation während der Eizellreifung

Bezüglich der Reifungsraten wurden keine statistischen Unterschiede zwischen den Oozyten

der einzelnen Gruppen festgestellt. Die Erlangung des Meiosestadiums II wird demnach durch

den Zusatz von Progesteron weder gestört noch gefördert. Dies entspricht den Ergebnissen von

FUKUI et al. (1982). SIROTKIN (1992) hingegen stellten einen positiven Einfluss von P4 auf die

Eizellmaturation fest. Diese unterschiedlichen Ergebnisse könnten eine Folge der Verwendung

unterschiedlicher Medien sein. So enthielt das IVM-Medium im Versuch von SIROTKIN (1992)

FCS.

Im vorliegenden Versuch waren die Teilungsraten in allen Gruppen konstant. Lediglich die

Entwicklungsraten der Gruppe < 50 ng/ml waren an Tag 7 und 8 signifikant verringert. Dies

widerspricht den Ergebnissen von SIROTKIN (1992), die bei P4-Supplementation (0,16 µmol/l,

0,8 µmol/l, 3,2 µmol/l, 16 µmol/l) einen positiven Effekt bezüglich der Oozytenreifung feststellen

konnten. Auch KARLACH (1987) stellten einen positiven Effekt auf die Teilungs- und Entwicklungsraten

fest. Die Studie von SILVA und KNIGHT (2000) hingegen ergab ebenfalls keine

Beeinflussung der Teilungsraten durch P4. Eine Konzentration von 0,3 µmol/l zeigte jedoch

einen negativen Einfluss auf die Entwicklungsrate. Die in der vorliegenden Studie verwendeten,

wesentlich höheren P4-Konzentrationen (0,93 µmol/l, 1,42 µmol/l) scheinen jedoch keinen

Einfluss auf die Teilungs- und Entwicklungsraten zu haben. Auch hier sei auf den Einfluss des

verwendeten Kulturmediums hingewiesen. FUKUI et al. (1982) beobachteten verschiedene Effekte

von Progesteron in Abhängigkeit vom eingesetzten Medium. Dementsprechend sollte beachtet

werden, dass das in den Versuchen von SILVA und KNIGHT (2000) verwendete Medium

Estrous Cow Serum (ECS) enthielt, während bei SIROTKIN (1992) FCS und im vorliegenden

Versuch BSA mit eCG und hCG benutzt wurden. In welchem Maße die eingesetzten Medien

die Progesteronwirkung beeinflussen, bleibt unklar.

Der P4-Gehalt des Mediums wurde in der vorliegenden Arbeit vor und nach der Reifung

gemessen und eine zur Ausgangskonzentration proportionale Reduktion der eingesetzten Konzentrationen

beobachtet. Dies deutet auf einen aktiven Progesteronstoffwechsel und eine Regulation

des Steroidmilieus durch die KOK hin. Es ist weithin akzeptiert, dass die Kumuluszellen

wichtige Aufgaben bei der Regulation des Mikromilieus während der Reifung übernehmen.

Sowohl die Synthese (MINGOTI et al. 2002, SCHOENFELDER et al. 2003, WANG

et al. 2006, NUTTINCK et al. 2008, APARICIO et al. 2011, SALHAB et al. 2011) als auch

die Fähigkeit zum Abbau (NUTTINCK et al. 2008) von P4 durch KOK sind belegt. Da in P4-

64


5.4 Progesteronsupplementation während der Eizellreifung

supplementierten Medienportionen, die ohne Oozyten für 24 h inkubiert wurden, keine Reduktion

der P4-Konzentration gemessen wurde, ist ein chemischer Zerfall auszuschließen.

5.4.1 Einfluss der Progesteronsupplementation auf die Genexpression

Von den hier untersuchten, qualitätsanzeigenden Gentranskripten SCL2A1, GDF9, BMP15 und

HIF2α waren lediglich GDF9 und HIF2α bei den mit P4 gereiften Oozyten signifikant verändert.

Die Expression des Glukosetransporters SCL2A1 zeigte im vorliegenden Versuch keine

statistischen Unterschiede zwischen den Oozyten der Versuchsgruppen bzw. im Vergleich zu

den unreifen Eizellen. Dies entspricht der Beobachtung anderer Autoren, die einen Anstieg des

Glukosestoffwechsels erst im 8- bis 16-Zellstadium beobachteten (JAVED und WRIGHT 1991,

RIEGER et al. 1992, KHURANA und NIEMANN 2000a). Eine Abnahme des Transkriptes, wie

sie durch LEQUARRE et al. (1997) beschrieben wurde, konnte hier nicht bestätigt werden. Allerdings

scheint das SCL2A1-Gen in seiner Expression durch die Reifungsumgebung beeinflusst

zu sein (GARDNER und KAYE 1995, SAGIRKAYA et al. 2007, VAN HOECK et al. 2011).

Bezüglich GDF9 konnte eine signifikant verringerte Menge des Transkriptes in den Progesteronruppen

gegenüber den unreifen Eizellen festgestellt werden. Der Vergleich der ohne Zusatz

gereiften Kontrollgruppe mit unreifen Oozyten ergab keinen Unterschied. Dies widerspricht den

Beobachtungen anderer Autoren, nach denen sich der Gehalt an GDF9 in den Oozyten während

der Maturation verringert (SOMFAI et al. 2011, CHU et al. 2012).

Die Expression von BMP15 war in Oozyten aller untersuchten Gruppen gleich. Ob dies einem

nicht vorhandenen Einfluss der Reifungsumgebung, einer fehlenden Transkription oder einem

fehlenden Verbrauch während der Reifung geschuldet ist, bleibt unklar. Zwar gibt es Hinweise

auf einen Einfluss der BMP15-Expression auf die Entwicklungskompetenz der Oozyte (HOSOE

et al. 2011), dieser könnte allerdings auch erst in den frühen Embryonalstadien relevant werden,

die hier nicht untersucht wurden.

Transkripte des HIF2α Gens wurden sowohl in den unreifen als auch den gereiften Oozyten

nachgewiesen, wobei die Oozyten der Gruppen 150 ng/ml, 300 ng/ml und 450 ng/ml im Vergleich

zu den unreifen Oozyten geringere Mengen des Transkriptes aufwiesen. Dies lässt einen

konzentrationsabhängigen Einfluss von Progesteron auf die Expression vermuten. Ein regulatorischer

Einfluss von HIF2α auf die Expression von SCL2A1 (WRENZYCKI et al. 1998, 2001,

HARVEY et al. 2004) wurde hier nicht offensichtlich.

Für die untersuchten Progesteronrezeptoren ergaben sich veränderte Transkripthäufigkeiten

im Hinblick auf den nukleären Progesteronrezeptor PGR, den membranständigen Progesteronrezeptor

PGRMC2 und PAQR5.

In Bezug auf PGR fällt zunächst die signifikant niedrigere Transkriptmenge in unreifen Oozyten

gegenüber den ohne Zusatz gereiften Oozyten auf. Dies spricht für eine aktive Transkription

während der Reifung. Auch SALHAB et al. (2011) beobachteten eine steigende mRNA-

Expression von PGR in Oozyten während der Maturation und berichten sogar von einer Überexpression

nach 10 h Reifung. In der Studie von CLEMENTE et al. (2009) zeigten hingegen

unreife Oozyten die höchste Expression von PGR. Unter Progesteroneinfluss gereifte Eizellen

enthielten signifikant weniger Transkripte des PGR-Gens. Offenbar ist die Expression des Re-

65


5 Diskussion

zeptors je nach Progesterongehalt der Reifungsumgebung variabel und wird dem Steroidmilieu

angepasst, in diesem Fall durch Herunterregulation. Dies entspricht den Ergebnissen von APA-

RICIO et al. (2011), die auf Proteinebene eine geringere Menge von PGR bei Progesteronzusatz

(100 ng/ml, 500 ng/ml) verzeichneten. Im Hinblick auf eine potenzielle Rolle bei der Blastozystenformation

(LUCIANO et al. 2010) könnte sich dies kritisch auf die Entwicklungsraten und

die weitere Embryonalentwicklung auswirken.

Von den membranständigen Progesteronrezeptoren unterlag der PGRMC1 in diesem Versuch

keiner Veränderung. Es konnte weder ein Unterschied zwischen unreifen und gereiften KOK

noch ein Einfluss der Medienzusätze festgestellt werden. Dies widerspricht den Ergebnissen

von CLEMENTE et al. (2009), die die höchste Transkriptmenge für PGRMC1 und PGRMC2

in unreifen Oozyten ermittelten und einen sinkenden Gehalt während Reifung und Fertilisation

beobachteten. LUCIANO et al. (2010) schreiben dem PGRMC1 eine bedeutende Rolle während

der Reifung, speziell bei der Trennung der Chromosomen, zu. Basierend auf dieser Annahme ist

zu folgern, dass Progesteron auf diesen Mechanismus wohl keinen erkennbaren Einfluss hat, da

das Meiose II-Stadium und damit die nukleäre Reifung in diesem Versuch bei allen Versuchsgruppen

unabhängig vom Progesteroneinfluss in gleichem Maße vollendet wurden. Etwaige

Veränderungen bezüglich der zytoplasmatischen Reifung wurden hier jedoch nicht untersucht.

Auch PGRMC2 soll laut (CLEMENTE et al. 2009) in der unreifen Oozyte zu seiner höchsten

Expression kommen und während der Reifung bis hin zur Aktivierung des embryonalen

Genoms weniger werden. Dies hat sich in der vorliegenden Studie nicht bestätigt. Es konnte

kein Unterschied zwischen unreifen und ohne Zusatz gereiften Oozyten festgestellt werden. Bei

P4-Supplementation zeigte sich jedoch bei allen eingesetzten Konzentrationen eine Herunterregulation

des Rezeptors. Da dem Rezeptor eine Rolle in der frühen embryonalen Entwicklung

zugeschrieben wird (LUCIANO et al. 2010), könnte dies wesentlichen Einfluss auf die Entwicklungsraten

und die Embryonenqualität haben.

Bezüglich PAQR5 konnten keine Unterschiede zwischen reifen und unreifen Oozyten festgestellt

werden. Dies spricht gegen eine Beteiligung an der Oozytenreifung, wie in anderen

Spezies belegt wurde (THOMAS et al. 2002, ZHU et al. 2003b, QIU et al. 2008). In allen Versuchsgruppen

mit P4 sowie der EtOH-Kontrolle war, verglichen mit unreifen Oozyten, eine

geringere Menge an PAQR5 vorhanden. Dies könnte einen Effekt des Alkohols auf die PAQR5-

Expression anzeigen.

Insgesamt scheinen die Prozesse der Eizellreifung während der IVM weitgehend vom Progesteron

unbeeinflusst abzulaufen. Auf molekularer Ebene führt Progesteron jedoch zu einschneidenden

Veränderungen in der Genexpression von GDF9, HIF2α sowie den Progesteronrezeptoren

PGR, PGRMC2 und PAQR5. Besonders letztere könnten durch ihre verringerte Expression

zu massiven Störungen in der frühen embryonalen Entwicklung führen und sich somit auf die

Embryonenqualität auswirken. Um die genauen Mechanismen sowie die Auswirkungen auf die

Embryonen und deren molekulare Struktur näher zu beschreiben, sind jedoch weitere Untersuchungen

notwendig.

66


5.5 Einfluss des Progesterons auf die Eizellqualität in vivo und in vitro

5.5 Einfluss des Progesterons auf die Eizellqualität in vivo und in

vitro

Trotz der unterschiedlichen Herkunft der Oozyten in den beiden Versuchsteilen lassen sich auf

Genexpressionsebene Parallelen erkennen. Sowohl GDF9 und HIF2α als auch die Progesteronrezeptoren

zeigen sich in beiden Fällen massiv beeinflusst. Progesteronzusatz während der

In-vitro-Maturation führt offensichtlich ebenso zu einer Herunterregulation dieser Transkripte

wie die induzierte Gelbkörperphase. Obwohl diesbezüglich noch weitere Untersuchungen notwendig

sind, deuten die Ergebnisse dieser Arbeit auf einen negativen Einfluss von P4 auf die

Entwicklungskompetenz der Eizelle hin.

5.6 Schlussfolgerungen

Aus den Ergebnissen dieser Arbeit lassen sich folgende Erkenntnisse festhalten:

Zweimal wöchentliches OPU

• stört den natürlichen Zyklus und das endokrinologische Profil

• kann zu C.l.-ähnlichen Strukturen führen

Der Zyklusstand des Tieres

• hat keinen Einfluss auf die Anzahl und Größenverteilung der Follikel

• hat keinen Einfluss auf Anzahl oder Morphologie der Oozyten

• beeinflusst die mRNA-Expression entwicklungsrelevanter Gene und somit die Entwicklungskompetenz

der Oozyten

Eine Progesteronsupplementation während der IVM

• hat keinen Einfluss auf die Eizellreifung

• führt zu veränderten Genexpressionsmustern in den reifen Oozyten

• verringert die Entwicklungsraten in der IVP

5.7 Kritische Würdigung der Arbeit

Die Eignung des Versuchsaufbaues für die Fragestellung der Arbeit soll hier kritisch betrachtet

werden. Das OPU-Verfahren gilt allgemein als einfaches, wiederholbares und minimal invasives

Verfahren zur Gewinnung von Eizellen, welches die Gesundheit des Tieres weitestgehend

unbeeinflusst lässt (siehe auch Kap. 2.1.1 und 2.2). Da ohne hormonelle Stimulation gearbeitet

werden kann, lässt sich die Eizelle aus ihrer physiologischen Umgebung heraus gewinnen

und betrachten. Die regelmässige Anwendung der OPU-Prozedur bewirkt jedoch offensichtlich

einschneidende Veränderungen im endokriologischen Profil (siehe Kap. 5.1.1), sodass in der

Folge keine physiologische Situation mehr vorliegt. Die Veränderungen in der Genexpression

der OPU-Oozyten könnten dementsprechend auch eine Folge des Eingriffes in die physiologischen

Vorgänge durch das OPU sein. Die Ergebnisse beim OPU sind in hohem Maße von

67


5 Diskussion

der durchführenden Person abhängig (MERTON et al. 2003). Um die Variation gering zu halten

wurden die OPU-Sessions immer von derselben Person durchgeführt. Um die hier vorgestellten

Ergebnisse zu untermauern oder zu ergänzen, könnte eine Gewinnung und Analyse von Follikelflüssigkeit

aufschlussreich sein. Leider ist es mit dem OPU-Equipment verfahrenstechnisch

noch nicht möglich, aus einem Follikel sowohl die Eizelle als auch die Follikelflüssigkeit zu

gewinnen, da zur Lösung der Eizelle von der Follikelwand ein Unterdruck nötig ist, der zur Vaporisierung

der sehr geringen Mengen an Follikelflüssikeit führt [vgl. auch HANSTEDT (2009)].

Einen der wichtigsten Einfluss nehmenden Faktoren stellt in der IVP die Komposition der

Medien in den einzelnen IVP-Schritten dar. Im vorliegenden Versuch wurde dem auf TCM199

basierenden Medium unter anderem die semi-definierte Komponente BSA zugesetzt. Um zu

prüfen, ob die beobachteten Effekte sich tatsächlich auf das zugegebene P4 bezogen, wurden

zu allen Zeitpunkten (vor der IVM, nach der IVM mit/ohne Eizellen) Kontrollen der Medien

bezüglich unerwünschter Progesterongehalte untersucht. Die Reifungskontrollen und Entwicklungsraten

der Kontrollgruppen lassen auf eine ausreichende Versorgung der Eizellen bzw. Embryonen

schließen. Es bleibt jedoch offen, inwiefern die zytoplasmatische Reifung durch P4

beeinflusst wird.

Die real-time RT-PCR ist die bevorzugte Methode für die Ermittlung quantitativer mRNA-

Expression in kleinen Probenmengen wie Oozyten und präimplantatorische Embryonen (GÁL

et al. 2006), da sie die Ermittlung der exakten Menge der Transkripte erlaubt. Die RT-PCR

hingegen ermöglicht lediglich den Vergleich der relativen Menge einer mRNA zwischen verschiedenen

Proben, da die Effizienz der Amplifikation für die Primer in den einzelnen Zyklen

nicht bekannt ist (TEMELES et al. 1994). Um etwaige Schwankungen durch die durchführende

Person zu vermeiden, wurden die PCR-Analysen von einer erfahrenen Mitarbeiterin durchgeführt.

Die ausgewählten qualitätsanzeigenden Gene haben sich in ihrer Expression bereits von

unterschiedlichen Faktoren beeinflusst gezeigt (WRENZYCKI et al. 2007). Bei der Interpretation

von Daten aus der PCR-Analyse ist jedoch zu beachten, dass eine Relevanz auf funktioneller

Ebene (Proteinebene) nur angenommen werden kann [vgl. auch DRALLMEYER (2008)].

Die hier analysierten OPU-Oozyten stellen weiterhin eine relativ kleine Stichprobenmenge

dar. Zum Zeitpunkt des höchsten, des niedrigsten und wiederum des höchsten Progesteronwertes

gewonnen, sind diese Eizellen auch als eine Momentaufnahme zu betrachten. Die jeweilige

Zyklusphase umfasst jedoch längere Zeiträume mit ansteigenden und wieder abfallenden P4-

Werten. Um ein vollständiges Bild zu erhalten und zu beurteilen, ob und zu welchem Zeitpunkt

das periphere P4 sich auf die Eizelle auswirkt, wäre eine umfassendere Analyse einer größeren

Anzahl von Oozyten aus dem gesamten Zyklus notwendig. Hier wäre eventuell auch die jeweilige

Größe des Follikels, aus dem die Eizelle stammt, interessant, da in Abhängigkeit der Größe

ein unterschiedliches follikuläres Mikromilieu (KRUIP und DIELEMAN 1985) die jeweilige Oozyte

beeinflusst. Je nach follikulärem Entwicklungsstadium unterscheiden sich die Eizellen in

ihrer Qualität (TAN und LU 1990, PAVLOK et al. 1992, LONERGAN et al. 1994, RIZOS et al.

2002). Es wäre also möglich, dass Progesteron zu verschiedenen Zeitpunkten der follikulären

Entwicklung unterschiedlich auf die Eizelle und ihre Qualität einwirkt.

68


6 Zusammenfassung

Nicole Schlüter

Einfluss unterschiedlicher Progesteronkonzentrationen auf die Oozytenmaturation in vivo und

in vitro

In dieser Arbeit sollte der Einfluss verschiedener Progesteronkonzentrationen auf die Eizellreifung

untersucht werden. Dazu wurden im ersten Versuchsteil Oozyten mittels der OPU-

Methode in unterschiedlichen Zyklusstadien gewonnen. Als Beginn des Versuches wurde Tag

7 (Brunst=Tag 0) des Zyklus gewählt. Einer morphologischen Beurteilung der erhaltenen KOK

folgte eine Analyse der mRNA-Expression hinsichtlich GDF9, BMP15, SCL2A1, HIF2α, PGR,

PGRMC1, PGRMC2 und PAQR5. Weiterhin fand eine Analyse des Serumprogesterongehaltes

an bei jeder OPU-Session entnommenen Blutproben statt.

Alle Versuchstiere zeigten trotz zweimal wöchentlichem Absaugen aller Follikel > 2mm

einen physiologischen Zyklus mit Bildung von C.l. (ind. C.l.) während des Versuchszeitraumes.

Diese Gelbkörper zeichneten sich durch eine geringere Größe (ind. C.l. 140,6 ±155,9 mm 2 , nat.

C.l. 246,7 ±56,0 mm 2 ; P ≤0,05) sowie eine geringere P4-Produktion (ind. C.l. 2,8 ±1,0 ng/ml,

nat. C.l. 4,6 ±1,9 ng/ml; P ≤0,05) gegenüber den natürlich entstandenen, zu Beginn des OPU-

Versuches bestehenden C.l. (nat.C.l.), aus. Der Zyklusstand beeinflusste weder die Follikelanzahl

und -größe noch die Eizellausbeute und -qualität. Hinsichtlich der mRNA-Expression bestand

eine verringerte Transkriptmenge von GDF9, BMP15, HIF2α, PGR, PGRMC1, PGRMC2

und PAQR5 bei Eizellen aus der induzierten Gelbkörperphase.

Im zweiten Versuchsteil wurden aus Schlachthofovarien gewonnene KOK unter Zugabe verschiedener

P4-Konzentrationen (< 50 ng/ml, 150 ng/ml, 300 ng/ml, 450 ng/ml) in vitro gereift

und einer vollständigen IVP unterzogen. Gereifte Oozyten der Versuchsgruppen wurden hinsichtlich

der Erlangung des Meiose II-Stadiums beurteilt und ebenfalls mittels RT-qPCR auf

die Expression der oben genannten Gene untersucht.

Die unterschiedlichen Progesteronzusätze zeigten keinen Einfluss auf die Reifung und die

Teilungsraten. Die Entwicklungsraten der Gruppe < 50 ng/ml waren an Tag 7 (10,7 ±5,4 %) und

8 (15,8 ±5,4 %) gegenüber der zusatzfreien Kontrollgruppe (d7: 20,7 ±6,6 %, d8: 25,4 ±8,0 %)

signifikant verringert. Unter Progesteroneinfluss gereifte Oozyten zeigten im Vergleich zu unreifen

Oozyten eine signifikant verringerte Expression von GDF9, HIF2α, PGR, PGRMC2 und

PAQR5.

Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit festgestellt werden, dass zweimal wöchentliche

OPU-Sessions den natürlichen Zyklus beeinflussen und die Bildung von C.l. mit veränderten

Eigenschaften verursachen kann. Die Ergebnisse des OPU sowie die morphologischen Eigenschaften

der KOK sind vom Zyklusstand unbeeinflusst, es gibt jedoch Veränderungen auf molekularer

Ebene, die sich negativ auf die Entwicklungskompetenz auswirken können.

69


6 Zusammenfassung

Die hier untersuchten Parameter zur In-vitro-Reifung von Oozyten zeigten sich durch die Anwesenheit

von Progesteron nicht beeinflusst. Allerdings führt die Progesteronexposition während

der Reifung zu einer veränderten Genexpression, die sich negativ auf die embryonale Entwicklung

auswirken kann.

70


7 Summary

Nicole Schlüter

Influence of different progesterone concentrations on bovine oocyte maturation in vivo and in

vitro

The influence of different progesterone concentrations on oocyte maturation was investigated.

In the first part of the experiments oocytes were retrieved by twice-weekly OPU. The first

OPU-session was performed on day 7 of the natural cycle (oestrus = day 0). Cumulus-oocytecomplexes

(COC) were classified by morphological criteria and mRNA expression of GDF9,

BMP15, SCL2A1, HIF2α, PGR, PGRMC1, PGRMC2 und PAQR5 was measured via RT-qPCR.

Bloodsamples were taken at every OPU-session and serum progesterone levels measured by

radioimmunoassey (RIA).

Despite twice weekly removal of all follicles > 2mm from the ovaries all animals showed

a natural cycle and formation of C.l. (induced C.l.) during the OPU period. Induced C.l. were

smaller (ind. C.l. 140,6 ±55,9 mm 2 , nat. C.l. 246,7 ±56,0 mm 2 ; P ≤0,05) and produced less

progesterone (ind. C.l. 2,8 ±1,0 ng/ml, nat. C.l. 4,6 ±1,9 ng/ml; P ≤0,05) than their natural

counterparts at the beginning of the experiment. There was neither an influence of the cycle on

number or size of follicles nor on number and quality of retreived oocytes. Messenger RNA

expression levels showed a reduced abundance of GDF9, BMP15, HIF2α, PGR, PGRMC1,

PGRMC2 und PAQR5 transcripts in oocytes of the induced c.l.-phase.

In the second part of the experiments oocytes from slaughterhouse ovaries were matured in

vitro with different progesterone concentrations (< 50 ng/ml, 150 ng/ml, 300 ng/ml, 450 ng/ml)

followed by in vitro production of embryos. Matured oocytes were rated for meiosis II stages

and the expression of GDF9, BMP15, SCL2A1, HIF2α, PGR, PGRMC1, PGRMC2 und PAQR5

was measured.

There was no influence of progesterone on maturation and cleavage rates. Oocytes of the

< 50 ng/ml group showed a significant reduction of developmental rates on day 7 and 8 when

compared to those of the control group (d7: 10,7 ±5,4 % vs. 20,7 ±6,6 %; d8: 15,8 ±5,4 %

vs. 25,4 ±8,0 %). Oocytes from all progesterone treatment groups contained less transcripts of

GDF9, HIF2α, PGR, PGRMC2 und PAQR5 compared to immature oocytes.

In conclusion, twice-weekly OPU has an influence on the natural cycle in cattle and may

induce C.l.s with different characteristics. The cycle has no influence on OPU results and morphological

quality of COC. There are alterations in the molecular structure of the oocyte that

may influence their developmental competence.

Supplementation of progesterone did not show an influence on oocyte maturation and cleavage

rates. Gene expression in oocytes matured in progesterone supplemented medium was

altered and may have negative effects on early embryonic development.

71


A Medien und Chemikalien

A.1 Medien für das OPU

Tabelle A.1: Zusammensetzung der PBS-Lösung

Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr.

Dulbecco´s phosphate buffered saline g/l 9,7 Sigma-Aldrich D 5773

Penicillin IE/ml 50,0 Sigma-Aldrich PENK

Streptomycinsulfat µg/ml 50,0 Sigma-Aldrich S 6501

Natrium-Pyruvat µg/ml 36,0 Sigma-Aldrich P 3662

D-Glukose mg/ml 1,0 Riedel-deHaen 16301

CaCl 2 xH 2 O µg/ml 133,0 Sigma-Aldrich C4901

Tabelle A.2: Zusätze für die PBS-Gebrauchslösung (PBS Complete)

Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr.

Heparin IE/ml 2,2 Serva 24900

BSA (Fraktion V) mg/ml 1,0 Sigma-Aldrich A 9647

A.2 Medien für die IVP

PBS-Lösung: siehe oben

Tabelle A.3: Zusammensetzung des TCM air

Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr.

TCM199 g/100 ml 1,5 Sigma-Aldrich M 2520

Gentamycinsulfat mg/100 ml 5,0 Sigma-Aldrich G 3632

Na-Pyruvat mg/100 ml 2,2 Sigma-Aldrich P 3662

NaHCO 3 mg/100 ml 35,0 Riedel-deHaen 31437

ad. X ml H 2 O ml 100,0 Fresenius Ampuwa

BSA (FAF) mg/100 ml 100,0 Sigma-Aldrich A 7030

Tabelle A.4: Zusammensetzung der NaCl-Lösung

Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr.

NaCl g 9,0 Sigma-Aldrich S 5886

Aqua bidest. l 1

73


A Medien und Chemikalien

Tabelle A.5: Zusammensetzung der NaCl-Complete-Lösung

Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr.

NaCl g 9,0 Sigma-Aldrich S 5886

Aqua bidest. l 1

Penicillin g 0,06 Sigma-Aldrich P 3414

Tabelle A.6: Zusammensetzung des Reifungsmediums

Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr.

TCM199 g/100 ml 1,51 Sigma-Aldrich M 2520

Gentamycinsulfat mg/100 ml 5,0 Sigma-Aldrich G 3632

Natrium-Pyruvat mg/100 ml 2,2 Sigma-Aldrich P 3662

NaHCO 3 mg/100 ml 35,0 Riedel-deHaen 31437

ad. X ml H 2 O ml 100,0 Fresenius Ampuwa

BSA (FAF) mg/100 ml 100,0 Sigma-Aldrich A 7030

PMSG IE/ml 10,0 Intervet Suigonan

HCG IE/ml 5,0 Intervet Suigonan

Tabelle A.7: Zusammensetzung der FertTALP-Stocklösung

Substrat Einheit Menge Konzentration Firma Produkt-

(mM)

Nr.

NaCl mg/100 ml 665,8 114,0 Sigma-Aldrich S 5886

KCl mg/100 ml 23,9 3,2 Sigma-Aldrich P 5405

NaHCO 3 mg/100 ml 210,0 25,0 Riedel-deHaen 31437

NaH 2 Po 4 x H 2 O mg/100 ml 4,1 0,3 Merck 1.065.800.500

CaCl 2 x 2 H 2 O mg/100 ml 29,4 2,0 Sigma-Aldrich C 4901

MgCl 2 mg/100 ml 4,8 0,5 Sigma-Aldrich M 8266

Phenolrot mg/100 ml 1,0 0,01 µl/ml Sigma-Aldrich P 5530

Penicillamin mg/100 ml 0,3 20,0 Sigma-Aldrich P 4875

Na-Laktat 60 % mg/100 ml 186,0 10,0 Sigma-Aldrich L 4263

ad. X ml H 2 O ml 100,0 Fresenius Ampuwa

Tabelle A.8: Zusammensetzung der FertTALP-Gebrauchslösung

Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr.

FertTALP-Stocklösung ml 10,14

Gentamycinsulfat µg 50 Sigma-Aldrich G 3632

BSA (Fraktion V) mg 60,0 Sigma-Aldrich A 9647

Na-Pyruvat µg 280,0 Sigma-Aldrich P 3662

74


A.2 Medien für die IVP

Tabelle A.9: Zusammensetzung der Epinephrin-Lösung

Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr.

Epinephrin mg 1,83 Sigma-Aldrich E 4250

Na-Metabisulfit mg 40,00 Fluka 71928

Na-Laktat (60 %) mg 132,0 Sigma-Aldrich L 4263

H 2 O ml 40,0 Fresenius Ampuwa

Tabelle A.10: Zusammensetzung der Hypotaurin-Lösung

Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr.

Hypotaurin mg 1,09 Sigma-Aldrich H 1384

H 2 O ml 10,0 Fresenius Ampuwa

Tabelle A.11: Zusammensetzung der Heparin-Lösung

Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr.

Heparin mg 2,82 Serva 24900

H 2 O ml 10,0 Fresenius Ampuwa

Tabelle A.12: Zusammensetzung der HHE-Stocklösung

Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr.

Hypotaurin-Lsg. ml 10,0

Epinephrin-Lsg. ml 4,0

H 2 O ml 26,0 Fresenius Ampuwa

Tabelle A.13: Zusammensetzung der HHE-Gebrauchslösung

Substrat Einheit Menge

HHE-Stocklsg. µl 80,0

Heparin-Lsg. µl 40,0

Tabelle A.14: Zusammensetzung des Fertilisationsmediums

Substrat Einheit Menge

HHE-Gebrauchslsg. µl 120,0

FertTALP-Gebrauchslsg. ml 2,0

75


A Medien und Chemikalien

Tabelle A.15: Zusammensetzung der Spermfilter-Gebrauchslösung

Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr.

Spermfilter µl 900,0 Gynemed 3SF0010

FertTalp-Gebrauchslsg. µl 100

Tabelle A.16: Zusammensetzung der SOF-Stocklösung A

Substrat Einheit Menge Konzentration Firma Produkt-

(mM)

Nr.

NaCl g/100 ml 6,3 108,0 Sigma-Aldrich S 5886

KCl g/100 ml 0,5 7,2 Sigma-Aldrich P 5405

KH 2 PO 4 g/100 ml 0,2 1,2 Sigma-Aldrich P 5655

MgSO 4 g/100 ml 0,2 1,5 Sigma-Aldrich M 2643

H 2 O ml 98,4 Sigma-Aldrich W 1503

Na-Laktat ml 0,6 4,2 Sigma-Aldrich l 4263

Tabelle A.17: Zusammensetzung der SOF-Stocklösung B

Substrat Einheit Menge Konzentration Firma Produkt-

(mM)

Nr.

NaHCO 3 g/100 ml 2,10 25,0 Sigma-Aldrich S 4019

Phenolrot g/100 ml 0,01 10 mg/100 ml Sigma-Aldrich P 5530

H 2 O ml 100,00 Sigma-Aldrich W 1503

Tabelle A.18: Zusammensetzung der SOF-Stocklösung C

Substrat Einheit Menge Konzentration Firma Produkt-

(mM)

Nr.

Na-Pyruvat mg 80,0 0,73 Sigma-Aldrich P 3662

H 2 O ml 10,00 Sigma-Aldrich W 1503

Tabelle A.19: Zusammensetzung der SOF-Stocklösung D

Substrat Einheit Menge Konzentration Firma Produkt-

(mM)

Nr.

CaCl 2 x 2 H 2 O mg 262,0 1,78 Sigma-Aldrich C 7902

H 2 O ml 10,00 Sigma-Aldrich W 1503

76


A.3 Medien für die Reifungskontrolle

Tabelle A.20: Zusammensetzung der Glutamin-Stocklösung

Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr.

Glutamin mg 292,0 Sigma-Aldrich G 6392

H 2 O ml 10,00 Sigma-Aldrich W 1503

Tabelle A.21: Zusammensetzung des Kulturmediums (SOFaa-Medium)

Substrat Einheit Menge Konzentration Firma Produkt-

(mM)

Nr.

myo-Inositol mg 50,0 2,77 Sigma-Aldrich I 7508

tri-Na-Zitrat mg 10,0 0,34 Sigma-Aldrich S 4641

Gentamycin mg 5,0 50 µg/ml Sigma-Aldrich G 3632

H 2 O ml 78,0 Sigma-Aldrich W 1503

SOF-Stocklsg. A ml 10,0

SOF-Stocklsg. B ml 10,0

SOF-Stocklsg. C ml 1,0

SOF-Stocklsg. D ml 1,0

Glutamin-Stocklsg. µl 100,0 4,2

BME 50x ml 3,0 10 µg/ml Sigma-Aldrich B 6766

MEM 100x ml 1,0 30 µg/ml Sigma-Aldrich M7145

A.3 Medien für die Reifungskontrolle

Tabelle A.22: Zusammensetzung der Fixierlösung

Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr.

Essigsäure 100 % ml 20 Carl Roth GmbH 3738.1

Ethanol ≥99,8 % ml 60 Carl Roth GmbH 9065.1

Tabelle A.23: Zusammensetzung der Lacmoid-Stocklösung

Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr.

Lacmoid g 1 Sigma-Aldrich 274720-10G

Essigsäure 100 % ml 45 Carl Roth GmbH 3738.1

Tabelle A.24: Zusammensetzung der Lacmoid-Arbeitslösung

Substrat Einheit Menge

Lacmoid-Stocklösung ml 5

H 2 O bidest. ml 5,5

77


A Medien und Chemikalien

Tabelle A.25: Zusammensetzung des PVA 0,1 %

Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr.

Polyvinylalkohol mg 10 Sigma-Aldrich P8136-250G

PBS-Stocklösung ml 100

A.4 Medien für den Radioimmunoassay

Tabelle A.26: NaCl-Lösung

Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr.

NaCl g 0,9 Sigma-Aldrich S 5886

H 2 O bidest. ml 100

Tabelle A.27: Boratpuffer

Substrat Einheit Menge Firma Produkt-Nr.

NaCl-Lösung 0,9%ig 1 l

Borax wasserfrei g 4,02 Fluka 71996-250G

A.5 Medien für die RT-qPCR

Tabelle A.28: Herkunft der bei der RT-PCR eingesetzten Medien

Substanz Firma Produkt-Bez.

MgCl 2 Invitrogen 18067-017

PCR-Puffer Invitrogen 1867-017

dNTPs Eurogentec NU-0010-50

Primer Applied Biosystems

RNAse-Inhibitor Applied Biosystems N8080119

MuLV RT Applied Biosystems N8080018

mRNA Globin Sigma-Aldrich R1253-20UG

Master-Mix RT-qPCR Eurogentec

H 2 O Fresenius Ampuwa

Tabelle A.29: Tris-HCl

Substanz Konzentration pH

Tris-HCL 10 mM 7,5

78


A.5 Medien für die RT-qPCR

Tabelle A.30: Lysis/Bindingpuffer

Substanz Konzentration pH

Tris-HCL 100 mM 7,5

LiCl

500 mM

EDTA 10 mM 8,0

LiDS

1 %ig

DTT(Dithiothreitol) 5 mM

Tabelle A.31: Waschpuffer A

Substanz Konzentration pH

Tris-HCL 10 mM 7,5

LiCl 0,15 mM

EDTA 1 mM 8,0

LiDS 1 %ig

Tabelle A.32: Waschpuffer B

Substanz Konzentration pH

Tris-HCL 10 mM 7,5

LiCl 0,15 mM

EDTA 1 mM 8,0

Tabelle A.33: Zusammensetzung des Mastermixes für die Reverse Transkription

Komponente Volumen Endkonzentration

10 x PCR Puffer 2 µl 1 x

MgCl 2 (50 mM) 2 µl 5 mM

dNTPS (10mM) 2 µl 1 mM

Hexamer Primer (50 µM) 1 µl 2,5 µM

RNase Inhibitor (20IE/µl) 1 µl 20 U

Reverse Transkriptase (50IE/µl) 1 µl 50 U

Tabelle A.34: Zusammensetzung des Reaktionsgemisches für die RT-qPCR

Komponente Konzentration einfacher Ansatz

Master-Mix RT-qPCR 10 µl

Primer Forward 0,2 µM 0,4 µl

Primer Reverse 0,2 µM 0,4 µl

cDNA 2-0,25 µl

H 2 0 ad 20 µl

79


B Verzeichnis der Gesamtdaten

B.1 Daten aus dem OPU-Versuch

Tabelle B.1: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Betty1“; Versuchsstart

unklar, nicht gewertet

Datum Zyklustag

Blutprobe

C.l.

Nr. P4 ng/ml Ovar Größe (cmxcm) Homogenität Hohlraum (cm)

28.01.2010 8 3 7 links 2 x 2,5 ja nein

01.02.2010 12 5 4,1 links 2 x 1,5 ja nein

04.02.2010 15 8 0,7 links 2 x 1,5 ja nein

08.02.2010 19/1 11 0,2 links 2 x 1,0 ggr. Inhomogen nein

11.02.2010 22/4 14 0,5 links 1,5 x 1,5 ggr. Inhomogen nein

15.02.2010 26/8 18 2,8 links 1,5 x 1,5 inhomogen 0,5

18.02.2010 29/11 22 3,4

22.02.2010 33/15 26 6,3 (rechts?) (1,5 x 1) (inhom.) nein

25.02.2010 36/18 31 3,7

Tabelle B.2: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Crazy1“

Datum Zyklustag

Blutprobe

C.l.

Nr. P4 ng/ml Ovar Größe (cmxcm) Homogenität Hohlraum (cm)

25.01.2010 8 1 3,1 links 2 x 1,5 ja nein

28.01.2010 11 2 4,6 links 2 x 1,5 ja nein

01.02.2010 15 4 4,1 links 2 x 2,5 ja nein

04.02.2010 18 7 4,4 links 2 x 1,5 ggr. Inhomogen nein

08.02.2010 22/1 10 0,1 links 1 x 1,5 ja nein

11.02.2010 25/4 13 0,1 0

15.02.2010 29/8 17 0,7 0

18.02.2010 32/11 21 1,0 0

22.02.2010 36/15 25 2,5 0

25.02.2010 39/18 30 1,4 0

Tabelle B.3: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von "Frieda1a“; nicht gewertet,

C.l. aus Zyste

Datum Zyklustag

Blutprobe

C.l.

Nr. P4 ng/ml Ovar Größe (cmxcm) Homogenität Hohlraum (cm)

18.02.2010 6 24 1,9 rechts 2x1,5 ja 0,7 cm

22.02.2010 10 28 0,9 rechts 1,5 x 1,5 inhomogen 0,2 cm

25.02.2010 13/1 33 0,1 rechts 1 x 1 inhomogen 0

01.03.2010 17/5 36 1 links??? 1,5 x 1,5 ja 0,5

04.03.2010 20/8 39 2,7 links 2 x 1 ggr. Inhomogen nein

08.03.2010 24/12 42 3,3 links 2 x 2 ja 0,1

11.03.2010 27/15 44 4,8 links 2 x 1,7 ja nein

15.03.2010 31/19 45 1,7 links 1,5 x 1,5 ja 0,1

81


B Verzeichnis der Gesamtdaten

Tabelle B.4: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Frieda1b“

Datum Zyklustag

Blutprobe

C.l.

Nr. P4 ng/ml Ovar Größe (cmxcm) Homogenität Hohlraum (cm)

25.03.2010 7 54 1,4 links 1,5 x 1,5 ja 0,2

29.03.2010 11 57 2,2 links 1 x 1; 1,5 x 1,5 ja;ja nein; nein

01.04.2010 14 60 2,1 links 1,5 x 1,5; 1x1,5 ja;ja nein; nein

05.04.2010 18 63 1,2 links 1,5 x 1,5 inhomogen nein

08.04.2010 21 66 0,1 links 1 x 1; 1x1 inhomogen nein

12.04.2010 25/1 69 0,2 0

15.04.2010 28/4 72 0,6 rechts 0,8 x 0,8 ja 0,2

19.04.2010 32/8 75 1 rechts 1 x 1 ja 0,2

22.04.2010 35/11 78 1,3 rechts 1 x 1 ja 0,2

26.04.2010 39/15 79 1,8 rechts 0,8 inhomogen nein

29.04.2010 42/18 80 0,1 rechts 0,5 x 0,5 Rest-CL

Tabelle B.5: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Hera1a“, Durchgang

wegen C.l.-Bildung abgebrochen

Datum Zyklustag

Blutprobe

C.l.

Nr. P4 ng/ml Ovar Größe (cmxcm) Homogenität Hohlraum (cm)

01.02.2010 7 6 2,9 links 1 x1,5 ja nein

04.02.2010 10 9 4,7 links 1 x 1,5 ja 0,4

08.02.2010 14 12 6,3 links/links 1 x1 ,5 / 1 x 1 ja nein

11.02.2010 17 15 4,9 links/links 1,5x1,5/1x1 ja nein

15.02.2010 21/0 19 0,5 0

Tabelle B.6: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Hera1b“

Datum Zyklustag

Blutprobe

C.l.

Nr. P4 ng/ml Ovar Größe (cmxcm) Homogenität Hohlraum (cm)

15.03.2010 7 47 3 links 1,5 x 2 inhomogen nein

18.03.2010 10 49 3,8 links 2 x 2 ja 0,2

22.03.2010 14 51 4,7 links 2 x 2 central heller 0.2

25.03.2010 17 53 7,5 links 2 x 1,5 ja 0,2

29.03.2010 21/1 56 0,8 0

01.04.2010 24/4 59 0,2 0

05.04.2010 28/8 62 1 0

08.04.2010 31/11 65 2,8 rechts? 1 x 1 inhomogen nein

12.04.2010 35/15 68 3,3 rechts 1,2 x 1,2 ja nein

15.04.2010 38/18 71 3,3 rechts 1, 4 x 1,4 ja nein

19.04.2010 42/22 74 4 rechts 2 x 2 ja nein

22.04.2010 45/25 77 0,9 rechts 1 x 1 inhomogen nein

82


B.1 Daten aus dem OPU-Versuch

Tabelle B.7: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Queen1a“, Durchgang

wegen C.l.-Bildung abgebrochen

Datum Zyklustag

Blutprobe

C.l.

Nr. P4 ng/ml Ovar Größe (cmxcm) Homogenität Hohlraum (cm)

22.02.2010 5 29 3,2 rechts 1,5 x 1,5 ja 0.8

25.02.2010 8 34 2,5 rechts 1,5 x 1,5 ja 0,7

01.03.2010 12 37 5,1 rechts 1,5 x 1,5 ja 0,8

04.03.2010 15 40 2,1 rechts 2 x 1,5 ggr. Inhomogen 0,1

08.03.2010 19/0 keine 0

Tabelle B.8: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Queen1b“

Datum Zyklustag

Blutprobe

C.l.

Nr. P4 ng/ml Ovar Größe (cmxcm) Homogenität Hohlraum (cm)

15.03.2010 7 46 3,0 links 1 x 1,5 +1 x 2 ja; ja nein; nein

18.03.2010 10 48 3,5 links 1,5 x 1,5+1,5 x 1,5 ja; ja nein; nein

22.03.2010 14 50 7,9 links 1 x 1,5 + 1 x 1,5 ja;ja nein; nein

25.03.2010 17 52 2,9 links 1x1; 1x1 ja;ja nein; nein

29.03.2010 21/1 55 0,4 0

01.04.2010 24/4 58 0,4 0

05.04.2010 28/8 61 2,9 links? 1,5 x 1,5

08.04.2010 31/11 64 3,7 links 1 x 1,5 + 1 x 1,5 inhomogen nein

12.04.2010 35/14 67 4,8 links 1,5 x 1,5 ja nein

15.04.2010 38/17 70 3,7 links 1,2 x 1,2 ja nein

19.04.2010 42/21 73 0,3 links 1,2 x 1,2 ggr. Inhomogen nein

22.04.2010 45/23 76 0,2 links 0,8 x 0,8 ggr. inhomogen nein

Tabelle B.9: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Rosa1“

Datum Zyklustag

Blutprobe

C.l.

Nr. P4 ng/ml Ovar Größe (cmxcm) Homogenität Hohlraum (cm)

11.02.2010 5 16 2,6 links 2 x 1,5 ja 0,4

15.02.2010 9 20 5 links 2 x 2,5 ja 0,5

18.02.2010 12 23 4,4 links 1,5 x 1,5 ja 0,5 x 0,7

22.02.2010 16 27 4,3 links 1,8 x 1,5 ja 0,3

25.02.2010 19 32 0,6 links 2 x 1 inhomogen nein

01.03.2010 23/1 35 0,1 links Rest-CL 1x1 inhomogen nein

04.03.2010 26/4 38 0,3 0 nein

08.03.2010 30/8 41 2,8 rechts 1 x 1,5 inhomogen 0,2

11.03.2010 33/11 43 3,3 rechts 1 x 1,5 inhomogen nein

83


B Verzeichnis der Gesamtdaten

Tabelle B.10: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Hera2“, unklarer Versuchsstart, nicht gewertet

Blutprobe C.l.

Datum Zyklustag

Nr. P4 ng/ml Ovar Größe (cmxcm) Homogenität Hohlraum (cm)

31.05.2010 7? 101 8,9 rechts 2 x 2 ja nein

03.06.2010 10? 103 12 rechts 1,5 x 1,8/0,8x0,8 ja/inhomogen nein/nein

07.06.2010 ?/1 106 0,5 rechts 1 x 1 inhomogen nein

10.06.2010 ?/4 112 0,2 0 0

14.06.2010 8 116 1,3 rechts 1,5 x1,5 inhomogen 0,5

17.06.2010 11 122 3,9 rechts 2x2 inhomogen 1; 0,5;0,5

21.06.2010 15 126 4,5 rechts 1,8x1,8 inhomogen 1

24.06.2010 18 132 5,2 rechts 1,8 x 1,5 ja 0,4

28.06.2010 22 139 4,3 rechts 1,8x1,8 ggr. Inhom. 0,4

01.07.2010 25 142 0,8 Rechts Rest-C.l. inhomogen nein

05.07.2010 29/1 146 0,7 0

08.07.2010 32/4 152 1,3 links 1x1 ja nein

12.07.2010 36/8 156 2,2 links 1 x 1 ja nein

15.07.2010 39/11 158 3,0

Tabelle B.11: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Queen2“

Blutprobe C.l.

Datum Zyklustag

Nr. P4 ng/ml Ovar Größe (cmxcm) Homogenität Hohlraum (cm)

07.06.2010 7 107 4,2 links 2 x 2 ja nein

10.06.2010 10 113 6,8 links 1,8 x 1,5 ja 0,2

14.06.2010 14 117 8,1 links 2x2 ja nein

17.06.2010 17 123 9,0 links 1,5 x 1,8 ja nein

21.06.2010 21 127 9,3 links 1,2x 1,2 ja nein

24.06.2010 24/1 133 0,3 links 1,8 x 1,5 ja nein

28.06.2010 28/5 138 1,6 0

01.07.2010 31/8 143 1,4 links Hämatom

05.07.2010 35/11 147 7,2 rechts/links 1,2x1,2/2x1,8 ja/nein 0,2/nein

08.07.2010 38/14 153 6,6 rechts/links/links 1x1/0,8x0,8/1x1 inhom/ja/ja nein/nein/0,4

12.07.2010 42/18 157 5,1 rechts 1 x 1 ggr. Inhom. nein

15.07.2010 45/21 159 0,5

84


B.1 Daten aus dem OPU-Versuch

Tabelle B.12: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Rosa2“; dreimal wöchentliche Punktion, nicht gewertet

Datum Zyklustag

Blutprobe C.l.

Nr. P4 ng/ml Ovar Größe (cmxcm) Homogenität Hohlraum (cm)

02.06.2010 7 102 4,2 links/rechts 1x1/0,8x0,8 ja/ja nein/nein

04.06.2010 9 104 7,3 links/rechts 1,5x1,8/1,4x1 ja/inhomogen 0,4/0,1

07.06.2010 12 108 7,3 rechts/links 1,5x1,5/1,5x2 ggr.inhom./ja nein/0,5

09.06.2010 14 110 9,1 rechts/links 1,4x1,4/1,4x1,4 inhomogen/ja nein/0,4

11.06.2010 16 114 9,6 rechts/links 1,4x1,4/1,8x1,6 inhomogen/ja nein/0,4

14.06.2010 19 118 5,6 rechts/links 1x1/1x1,5 inhom/ja nein

16.06.2010 21 120 7,1 links 1,5x1,8 ggr.inhom. nein

18.06.2010 23 124 7,0 links 1,5 x 1,5 ggr. Inhom. nein

21.06.2010 26/1 128 0,2 0

23.06.2010 28/3 130 0,1 0

25.06.2010 30/5 134 0,3 0

28.06.2010 33/8 136 1,1 0

30.06.2010 35/10 140 1,5 0

02.07.2010 37/12 144 1,8 0

05.07.2010 40/15 148 1,9 0

07.07.2010 42/17 150 2,6 0

09.07.2010 44/19 154 2,0 0

85


B Verzeichnis der Gesamtdaten

Tabelle B.13: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Crazy2“; dreimal wöchentliche Punktion, persistierendes

C.l.; nicht gewertet

Blutprobe C.l.

Datum Zyklustag

Nr. P4 ng/ml Ovar Größe (cmxcm) Homogenität Hohlraum (cm)

04.06.2010 5 105 2,8 rechts 1,4X1,4 ja nein

07.06.2010 8 109 4,9 rechts 1,8x1,8 ja nein

09.06.2010 10 111 5,9 rechts 1,5x2 ja nein

11.06.2010 12 115 7,5 rechts 2x2 ja nein

14.06.2010 15 119 7,0 rechts 1,5x1,5 ja nein

18.06.2010 19 125 7,8 rechts 1,5x1,8 ja nein

21.06.2010 22 129 7,2 rechts 1,5x1,5 ggr. inhom. nein

23.06.2010 24 131 5,2 rechts 1,5 x 1,8 ja nein

25.06.2010 26/1 135 5,1 rechts 1,5 x 1,8 ja nein

28.06.2010 29/4 137 3,1 rechts 1,5x1,8 ggr. inhom. nein

30.06.2010 31/6 141 5,0 rechts 2x2 ja nein

02.07.2010 33/8 145 3,9 rechts 1,5x1,5 ggr. inhom. nein

05.07.2010 36/11 149 4,7 rechts 2x1,5 inhom. nein

07.07.2010 38/13 151 4,2 rechts 2x1,8 ja nein

09.07.2010 40/15 155 3,6 rechts 1,8x1,8 inhom. nein

86


B.1 Daten aus dem OPU-Versuch

Tabelle B.14: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Stella3“

Datum Zyklustag

Blutprobe

C.l.

Nr. P4 ng/ml Ovar Größe Homogenität Hohlraum

28.10.2010 7 205 1,5 rechts 1,3x1,7 ja 0,3x0,5

01.11.2010 11 208 4,2 rechts 2,2x2,7 ja 0,5x0,3

04.11.2010 14 211 5,7 rechts 2,6x1,8 ja 0,5x0,2

08.11.2010 18 214 5,8 rechts 2,6x2 ja nein

11.11.2010 21 216 0,2 rechts 1,8x1,3 inhomogen nein

15.11.2010 25 220 0,1 0 0 0 0

18.11.2010 28/1 221 0,0 0 0 0 0

22.11.2010 32/5 226 0,1 0 0 0 0

25.11.2010 35/8 229 0,2 0 0 0 0

29.11.2010 39/12 232 2,5 0 0 0 0

02.12.2010 42/15 234 3,4 links? 0 0 0

06.12.2010 46/19 236 2,0 links? 2x1,3 ja nein

09.12.10 49/22 238 0,2 0 0 0 0

Tabelle B.15: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „UFO3“; kein induziertes

C.l., nicht gewertet

Datum Zyklustag

Blutprobe

C.l.

Nr. P4 ng/ml Ovar Größe Homogenität Hohlraum

25.10.2010 7 201 2,4 rechts 1,7 x 1,2 ja nein

28.10.2010 10 203 6,8 rechts 2x2,6 ja nein

01.11.2010 14 206 6,4 rechts 2,3x1,7 ja nein

04.11.2010 17 209 6,7 rechts 2,3x1,7 ja nein

08.11.2010 21 212 7,2 rechts 2,3x1,7 inhomogen nein

11.11.2010 24 217 0,2 rechts 1,8x1,2 inhomogen nein

15.11.2010 28 218 0,1 0 0 0 0

18.11.2010 31 223 0,1 0 0 0 0

22.11.2010 35/1 224 0,3 0 0 0 0

25.11.2010 38/4 227 0,2 0 0 0 0

29.11.2010 42/8 230 0,9 0 0 0 0

02.12.2010 45/11 233 0,8 0 0 0 0

06.12.2010 49/15 235 1,5 0 0 0 0

09.12.10 52/18 237 0,6 0 0 0 0

87


B Verzeichnis der Gesamtdaten

Tabelle B.16: C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Tiffy3“

Datum Zyklustag

Blutprobe

C.l.

Nr. P4 ng/ml Ovar Größe Homogenität Hohlraum

25.10.2010 7 202 3,0 rechts 2,2 x 1,5 ja nein

28.10.2010 10 204 6,4 rechts 2,5x1,4 ja nein

01.11.2010 14 207 8,0 rechts 3x1,8 ja nein

04.11.2010 17 210 10,4 rechts 2,2x1,6 ggr. Inhom. nein

08.11.2010 21 213 7,0 rechts 2,3x1,5 hgr. Inhom. nein

11.11.2010 24 215 0,4 rechts 1,7x1,6 inhomogen nein

15.11.2010 28/1 219 0,6 0 0 0 0

18.11.2010 31/4 222 1,1 0 0 0 0

22.11.2010 35/8 225 3,8 rechts 1,4x1 ja nein

25.11.2010 38/11 228 3,8 rechts 1,4x1 ja nein

29.11.2010 42/15 231 2,3 rechts 1,4x1 inhomogen nein

88


B.1 Daten aus dem OPU-Versuch

Datum

Tabelle B.17: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Betty1“; Versuchsstart unklar, nicht gewertet

punktierte Follikel Eizellen (n) der Kategorie

3 mm 4 mm 5 mm 6 mm 7 mm 8 mm 9 mm 10 mm > 10 mm Anzahl (n) 1 2 3 4 5

Box Nr.

28.01.2010 3 1 1 2 0 1 0 0 0 2 0 1 1 0 0 2, 798-799

01.02.2010 1 2 2 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 2, 808

04.02.2010 2 2 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 2, 828

08.02.2010 3 0 0 0 1 0 0 2 0 1 1 0 0 0 0 2, 837

11.02.2010 0 1 2 2 0 1 1 0 0 5 0 3 2 0 0 2, 844-847

15.02.2010 2 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

18.02.2010 1 1 2 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 2, 875

22.02.2010 2 4 3 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 2, 895

25.02.2010 2 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0

Datum

Tabelle B.18: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Crazy1“

punktierte Follikel Eizellen (n) der Kategorie

3 mm 4 mm 5 mm 6 mm 7 mm 8 mm 9 mm 10 mm > 10 mm Anzahl (n) 1 2 3 4 5

Box Nr.

25.01.2010 4 2 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 0 2, 796

28.01.2010 1 2 5 1 0 0 0 0 0 3 0 2 1 0 0 2, 800-802

01.02.2010 2 2 2 1 0 0 0 1 0 2 0 1 1 0 0 2, 806-807

04.02.2010 2 3 2 4 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

08.02.2010 1 2 2 1 1 1 0 2 0 2 0 1 1 0 0 2, 835+836

11.02.2010 2 2 2 0 0 0 0 0 0 2 1 0 1 0 0 2, 842+843

15.02.2010 1 3 1 1 0 1 0 0 1 3 1 1 0 1 0 2, 864-866

18.02.2010 1 2 4 3 0 2 0 1 0 3 0 2 1 0 0 2, 874

22.02.2010 2 3 3 3 0 1 0 0 0 3 0 2 0 1 0 2, 899+900

25.02.2010 1 1 2 1 2 1 0 0 0 3 1 1 1 0 0 2, 904-906

89


B Verzeichnis der Gesamtdaten

Datum

Tabelle B.19: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Frieda1a“; nicht gewertet, C.l. aus Zyste

punktierte Follikel Eizellen (n) der Kategorie

3 mm 4 mm 5 mm 6 mm 7 mm 8 mm 9 mm 10 mm > 10 mm Anzahl (n) 1 2 3 4 5

Box Nr.

18.02.2010 3 1 2 1 0 0 0 0 1 2 1 0 1 0 0 2, 878+879

22.02.2010 0 1 1 4 0 1 0 0 0 3 2 1 0 0 0 2, 901-903

25.02.2010 2 1 1 0 0 0 0 0 1 3 1 1 0 0 1 2, 907-909

01.03.2010 1 2 3 2 1 0 0 1 0 3 2 1 0 0 0

04.03.2010 3 3 4 1 0 0 0 0 0 3 1 0 2 0 0 2, 927-929

08.03.2010 1 1 3 1 1 2 0 0 0 4 0 2 1 1 0 2, 952+953

11.03.2010 2 2 1 2 1 0 0 0 0 3 0 1 2 0 0

15.03.2010 2 1 0 2 2 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Datum

Tabelle B.20: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Frieda1b“

punktierte Follikel Eizellen (n) der Kategorie

3 mm 4 mm 5 mm 6 mm 7 mm 8 mm 9 mm 10 mm > 10 mm Anzahl (n) 1 2 3 4 5

Box Nr.

25.03.2010 1 2 2 2 0 0 0 1 0 2 1 1 0 0 0 2a, 1013+1014

29.03.2010 1 2 1 0 0 1 0 0 2 2 1 0 1 0 0 2a, 1033+1034

01.04.2010 3 3 1 1 0 0 0 0 0 3 0 2 1 0 0 2a, 1043-1045

05.04.2010 2 1 2 5 1 0 0 0 0 4 0 2 1 1 0 2a, 1050-1053

08.04.2010 1 3 1 1 0 1 0 1 0 3 1 1 1 0 0 2a, 1067-1069

12.04.2010 4 1 0 1 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 2a, 1070

15.04.2010 3 3 2 0 1 0 0 1 1 4 2 0 1 0 1 2b, 1088-1090

19.04.2010 2 0 0 1 0 1 0 1 2 1 1 0 0 0 0 2b, 1098

22.04.2010 1 3 3 2 0 0 0 0 0 2 1 0 1 0 1 2b,1112+1113

26.04.2010 1 2 2 1 0 1 0 0 0 3 0 2 0 0 1 2b, 1147-1149

29.04.2010 3 3 0 0 0 0 0 2 0 3 0 0 1 1 1 2b, 1154-1156

90


B.1 Daten aus dem OPU-Versuch

Tabelle B.21: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Hera1a“; Durchgang wegen C.l.-Bildung abgebrochen

Datum

punktierte Follikel Eizellen (n) der Kategorie

3 mm 4 mm 5 mm 6 mm 7 mm 8 mm 9 mm 10 mm > 10 mm Anzahl (n) 1 2 3 4 5

Box Nr.

01.02.2010 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 2, 809

04.02.2010 3 1 3 1 0 1 0 0 0 2 0 1 1 0 0 2, 826+827

08.02.2010 1 1 1 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 2, 838

11.02.2010 2 1 1 0 0 0 0 1 0 4 1 2 0 1 0 2, 848-850

15.02.2010 1 2 0 0 0 0 0 1 0 3 0 1 2 0 0 2, 867+868

Datum

Tabelle B.22: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Hera1b“

punktierte Follikel Eizellen (n) der Kategorie

3 mm 4 mm 5 mm 6 mm 7 mm 8 mm 9 mm 10 mm > 10 mm Anzahl (n) 1 2 3 4 5

Box Nr.

15.03.2010 1 2 2 1 0 0 0 1 0 4 2 2 0 0 0 2, 976-978

18.03.2010 1 2 3 0 1 0 0 0 0 6 0 1 4 0 1 2a, 998-1000

22.03.2010 1 2 2 2 0 0 0 0 0 5 0 2 1 0 2 2a, 1003-1007

25.03.2010 2 2 3 0 0 1 0 0 0 3 1 0 2 0 0 2a, 1010+1011

29.03.2010 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 2a, 1035

01.04.2010 5 4 1 1 1 0 0 1 0 5 1 3 1 0 0 2a, 1038-1042

05.04.2010 2 2 3 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 2a, 1049

08.04.2010 2 4 1 0 1 0 0 0 0 2 0 0 2 0 0 2a, 1065+1066

12.04.2010 3 3 0 0 0 2 0 0 0 7 1 4 1 0 1 2b, 1073-1078

15.04.2010 3 7 3 2 0 0 0 0 0 7 2 2 2 0 1 2b, 1084-1087

19.04.2010 2 2 1 1 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0 0 2b, 1099

22.04.2010 3 3 2 1 0 0 0 0 0 6 2 2 2 0 0 2b,1116-1121

91


B Verzeichnis der Gesamtdaten

Tabelle B.23: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Queen1a“; Durchgang wegen C.l.-Bildung abgebrochen

punktierte Follikel Eizellen (n) der Kategorie

Datum

Box Nr.

3 mm 4 mm 5 mm 6 mm 7 mm 8 mm 9 mm 10 mm > 10 mm Anzahl (n) 1 2 3 4 5

22.02.2010 1 1 1 0 0 1 0 0 0 2 2 0 0 0 0 2, 896

25.02.2010 1 2 3 2 0 0 0 0 0 3 1 2 0 0 0 2, 910-912

01.03.2010 3 4 0 0 0 1 0 1 0 1 1 0 0 0 0 2, 922

04.03.2010 2 2 1 1 0 1 0 0 0 5 2 2 1 0 0 2, 934-937

08.03.2010 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Datum

Tabelle B.24: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Queen1b“

punktierte Follikel Eizellen (n) der Kategorie

3 mm 4 mm 5 mm 6 mm 7 mm 8 mm 9 mm 10 mm > 10 mm Anzahl (n) 1 2 3 4 5

Box Nr.

18.03.2010 2 2 2 1 1 0 0 0 0 3 1 1 1 0 0 2a, 995-997

22.03.2010 2 1 3 1 1 1 0 0 0 3 1 1 1 0 0 2a, 1001+1002

25.03.2010 4 2 3 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 2a, 1012

29.03.2010 3 1 2 1 1 0 0 0 1 2 2 0 0 0 0 2a, 1031+1032

01.04.2010 0 2 1 2 0 1 0 0 0 3 1 1 0 1 0 2a, 1036+1037

05.04.2010 1 2 2 1 0 1 0 0 1 3 2 0 1 0 0 2a, 1046-1048

08.04.2010 2 2 3 1 0 0 0 0 0 5 2 3 0 0 0 2a, 1060-1064

12.04.2010 2 1 1 1 0 1 0 1 0 2 0 1 0 0 1 2b, 1071+1072

15.04.2010 2 1 4 0 0 0 0 1 0 3 1 1 0 1 0 2b, 1081-1083

19.04.2010 2 2 2 1 0 1 0 0 0 7 1 4 0 0 2 2b, 1094-1097

22.04.2010 3 1 3 2 0 1 0 0 0 2 0 1 0 0 1 2b, 1114+1115

92


B.1 Daten aus dem OPU-Versuch

Datum

Tabelle B.25: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Rosa1“

punktierte Follikel Eizellen (n) der Kategorie

3 mm 4 mm 5 mm 6 mm 7 mm 8 mm 9 mm 10 mm > 10 mm Anzahl (n) 1 2 3 4 5

Box Nr.

11.02.2010 3 3 3 0 0 1 0 0 0 2 0 1 0 1 0 2, 851+852

15.02.2010 1 4 2 2 0 0 0 0 0 4 1 1 0 2 0 2, 869+870

18.02.2010 2 1 0 0 1 0 0 0 0 2 0 1 1 0 0 2, 876+877

22.02.2010 1 3 2 1 1 0 0 0 0 2 0 0 2 0 0 2, 897+898

25.02.2010 3 4 0 1 1 0 0 1 0 5 2 2 0 0 1 2, 913-916

01.03.2010 7 3 2 1 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 2, 921

04.03.2010 5 0 4 0 0 0 0 0 0 5 2 2 0 0 1 2, 930-933

08.03.2010 1 2 2 2 1 0 0 0 0 3 0 3 0 0 0 2, 954-956

11.03.2010 3 1 2 1 1 0 0 0 0 4 1 1 2 0 0 2, 965-968

Tabelle B.26: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Crazy2“; dreimal wöchentliche Punktion, persistierendes C.l.,

nicht gewertet

punktierte Follikel Eizellen (n) der Kategorie

Datum

Box Nr.

3 mm 4 mm 5 mm 6 mm 7 mm 8 mm 9 mm 10 mm > 10 mm Anzahl (n) 1 2 3 4 5

04.06.2010 6 2 1 0 0 0 0 0 1 6 1 4 0 0 1 2b, 1266-1271

07.06.2010 1 3 3 2 0 0 0 0 0 4 1 3 0 0 0 2b, 1273-1276

09.06.2010 4 5 4 2 0 0 0 0 0 2 1 0 1 0 0 2b; 1292-1293

11.06.2010 6 3 1 4 0 0 0 0 0 6 0 3 1 0 2 2c, 1324-1327

14.06.2010 4 3 2 3 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 2c, 1333

18.06.2010 6 3 4 1 0 1 0 0 0 6 1 1 4 0 0 2c, 1377-1382

21.06.2010 8 10 0 2 0 1 0 0 0 11 4 3 3 0 1 2c; 1390-1396

23.06.2010 3 6 4 1 0 0 0 0 0 3 1 1 1 0 0 2c; 1402-1404

25.06.2010 5 4 4 0 0 0 0 0 0 3 1 0 2 0 0 2c; 1436-1437

28.06.2010 2 4 1 2 0 2 0 0 0 5 1 1 3 0 0 2c; 1441-1445

30.06.2010 5 3 2 0 1 0 0 0 0 2 0 1 1 0 0 2c; 1457-1458

02.07.2010 3 5 3 1 1 0 0 0 0 6 1 2 1 1 1 2d; 1493-1496

05.07.2010 5 5 4 4 0 1 0 0 0 4 2 0 0 0 2 2d; 1501

07.07.2010 1 5 1 5 0 1 0 0 0 4 2 2 0 0 0 2d; 1508-1511

09.07.2010 3 3 3 2 0 2 0 0 0 1 0 1 0 0 0 2d; 1548

93


B Verzeichnis der Gesamtdaten

Datum

Tabelle B.27: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Queen2“

punktierte Follikel Eizellen (n) der Kategorie

3 mm 4 mm 5 mm 6 mm 7 mm 8 mm 9 mm 10 mm > 10 mm Anzahl (n) 1 2 3 4 5

Box Nr.

07.06.2010 6 5 1 1 0 0 0 1 0 6 2 2 1 0 1 2b, 1283-1287

10.06.2010 7 5 3 1 0 0 0 0 0 8 2 3 3 0 0 2b, 1302-1307

14.06.2010 6 4 1 1 0 1 0 1 0 3 1 0 2 0 0 2c, 1334-1336

17.06.2010 3 5 5 0 2 0 0 0 0 13 3 4 4 0 2 2c, 1367-1376

21.06.2010 7 2 1 2 0 1 0 0 0 2 2 0 0 0 0 2c; 1385+1386

24.06.2010 2 7 0 1 0 2 0 0 1 3 0 2 1 0 0 2c; 1433-1435

28.06.2010 4 5 0 1 0 4 0 0 0 5 2 1 1 0 1 2c; 1446-1450

01.07.2010 3 3 2 1 1 1 0 0 0 4 2 1 1 0 0 2d; 1484-1487

05.07.2010 4 5 1 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0

Tabelle B.28: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Rosa2“; dreimal wöchentliche Punktion, nicht gewertet

punktierte Follikel Eizellen (n) der Kategorie

Datum

Box Nr.

3 mm 4 mm 5 mm 6 mm 7 mm 8 mm 9 mm 10 mm > 10 mm Anzahl (n) 1 2 3 4 5

02.06.2010 2 3 2 1 0 0 0 0 0 5 0 1 3 1 0 2b, 1255-1259

04.06.2010 4 2 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 2b, 1272

07.06.2010 1 0 1 0 0 0 0 0 0 2 1 0 1 0 0 2b, 1281-1282

09.06.2010 3 3 2 0 1 0 0 0 0 2 0 2 0 0 0 2b, 1290

11.06.2010 8 3 3 0 0 0 0 0 0 5 1 1 3 0 0 2c, 1328-1331

14.06.2010 2 5 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 2c, 1332

16.06.2010 4 3 1 0 0 0 0 0 0 3 1 2 0 0 0 2c, 1351-1353

18.06.2010 5 2 3 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

21.06.2010 8 3 0 0 0 2 0 0 1 3 0 3 0 0 0 2c; 1387-1389

23.06.2010 6 7 1 1 0 0 0 0 0 7 3 1 1 0 2 2c; 1397-1401

25.06.2010 6 4 4 2 1 1 0 1 0 4 1 0 1 1 1 2c; 1438-1439

28.06.2010 3 3 3 1 0 1 0 2 0 1 0 1 0 0 0 2c; 1440

30.06.2010 3 6 0 0 1 1 0 0 0 4 2 2 0 0 0 2c; 1459-1462

02.07.2010 3 4 3 1 0 0 0 0 0 6 1 2 1 0 1 2d; 1488-1492

05.07.2010 1 5 3 1 2 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 2d; 1497

07.07.2010 3 6 1 2 0 0 0 0 0 7 2 3 1 0 1 2d; 1502-1507

09.07.2010 5 4 1 1 0 0 0 0 0 7 1 2 4 0 0 2d; 1549-1553

94


B.1 Daten aus dem OPU-Versuch

Datum

Tabelle B.29: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Hera2“; Versuchsstart unklar, nicht gewertet

punktierte Follikel Eizellen (n) der Kategorie

3 mm 4 mm 5 mm 6 mm 7 mm 8 mm 9 mm 10 mm > 10 mm Anzahl (n) 1 2 3 4 5

Box Nr.

31.05.2010 2 3 1 1 0 0 0 2 0 1 0 0 0 1 0 2b, 1254

03.06.2010 4 3 1 2 0 1 0 0 0 6 2 1 2 1 0 2b, 1260-1265

07.06.2010 3 5 1 1 0 0 0 0 1 4 0 2 1 0 1 2b; 1277-1280

10.06.2010 15 7 5 1 0 0 0 0 0 18 5 6 5 0 1+1* 2b, 1302-1307

14.06.2010 4 5 4 0 0 1 0 1 1 4 2 1 0 0 1 2c, 1337-1340

17.06.2010 10 7 7 1 0 0 0 1 0 3 0 3 0 0 0 2c, 1364-1366

21.06.2010 2 4 2 2 0 1 0 0 0 2 2 0 0 0 0 2c; 1383-1384

24.06.2010 6 8 4 0 0 0 0 0 0 8 3 2 2 0 1 2c; 1428-1432

28.06.2010 3 7 4 2 0 1 0 0 0 7 2 2 2 0 1 2c; 1451-1456

Datum

Tabelle B.30: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Stella3“

punktierte Follikel Eizellen (n) der Kategorie

3 mm 4 mm 5 mm 6 mm 7 mm 8 mm 9 mm 10 mm > 10 mm Anzahl (n) 1 2 3 4 5

Box Nr.

28.10.2010 4 5 3 1 0 2 0 0 0 7 2 0 1 4 0 2d; 1783-1789

01.11.2010 4 6 2 1 1 1 0 0 0 3 0 0 1 1 1 2d; 1798

04.11.2010 3 4 1 1 0 0 0 0 0 2 0 0 1 1 0 2d; 1806

08.11.2010 9 3 0 1 0 0 1 0 0 6 1 0 3 2 0 2e; 1822-1827

11.11.2010 10 3 1 1 0 0 0 0 0 13 1 0 10 0 2 2e; 1839-1849

15.11.2010 6 4 5 0 1 0 0 0 0 5 1 2 0 0 2 2e; 1852-1856

18.11.2010 3 1 3 0 0 1 0 0 0 3 0 1 2 0 0 2e; 1867-1869

22.11.2010 3 7 3 2 0 0 0 0 0 5 3 1 1 0 0 2e; 1878-1881

25.11.2010 2 4 2 2 1 1 0 0 0 8 0 0 5 1 2 2e; 1889-1894

29.11.2010 0 4 2 2 0 2 0 0 1 2 0 1 1 0 0 2e; 1906+1907

02.12.2010 3 5 4 1 0 0 0 0 0 4 0 2 2 0 0 2e; 1929-1932

06.12.2010 3 6 5 2 0 1 0 1 0 8 3 4 1 0 0 2e; 1939-1946

09.12.10 5 5 0 2 1 0 0 0 0 5 0 1 4 0 0 2e; 1951-1955

95


B Verzeichnis der Gesamtdaten

Datum

Tabelle B.31: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Tiffy3“

punktierte Follikel Eizellen (n) der Kategorie

3 mm 4 mm 5 mm 6 mm 7 mm 8 mm 9 mm 10 mm > 10 mm Anzahl (n) 1 2 3 4 5

Box Nr.

25.10.2010 2 4 2 1 0 1 0 1 0 10 5 2 1 1 1 2d, 1764-1771

28.10.2010 2 3 1 1 1 0 0 0 0 7 0 2 3 1 1 2d; 1778-1782

01.11.2010 3 2 2 1 0 1 0 1 0 2 0 2 0 0 0 2d; 1796+1797

04.11.2010 5 6 1 2 1 1 0 0 0 6 2 2 2 0 0 2d; 1800-1805

08.11.2010 1 6 4 1 0 1 0 1 0 3 0 0 3 0 0 2e; 1819-1821

11.11.2010 6 1 3 0 0 0 0 0 0 8 0 0 5 1 2 2e; 1828-1835

15.11.2010 6 6 2 0 0 1 1 0 1 5 1 2 2 0 0 2e; 1850+1851

18.11.2010 3 2 3 0 0 0 0 0 0 6 0 0 3 1 2 2e; 1859-1861

22.11.2010 3 3 4 0 0 1 0 0 0 3 0 0 2 0 1 2e; 1875-1877

25.11.2010 6 3 1 2 0 1 0 1 0 5 2 1 1 0 1 2e; 1885-1888

29.11.2010 2 3 2 4 0 0 0 1 0 5 1 1 3 0 0 2e; 1901-1905

Tabelle B.32: Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „UFO3“; kein induziertes C.l., nicht gewertet

punktierte Follikel Eizellen (n) der Kategorie

Datum

Box Nr.

3 mm 4 mm 5 mm 6 mm 7 mm 8 mm 9 mm 10 mm > 10 mm Anzahl (n) 1 2 3 4 5

25.10.2010 8 2 1 2 0 0 0 0 0 9 6 0 2 1 0 2d, 1756-1763

28.10.2010 2 5 3 3 0 0 0 0 0 5 1 0 3 1 0 2d; 1773-1777

01.11.2010 2 0 1 3 1 1 0 0 0 6 2 1 1 2 0 2d; 1790-1795

04.11.2010 4 3 0 2 0 1 0 0 0 2 0 0 1 0 1 2d; 1799

08.11.2010 1 2 2 2 0 0 0 1 0 5 1 3 1 0 0 2e; 1814-1818

11.11.2010 6 1 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 2 0 1 2e; 1836-1838

15.11.2010 3 4 1 1 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0

18.11.2010 4 0 2 1 0 0 1 0 0 4 0 1 3 0 0 2e; 1863-1866

22.11.2010 4 3 3 1 1 0 0 2 0 6 1 2 1 0 2 2e; 1870-1874

25.11.2010 0 3 4 2 0 0 0 0 1 4 1 0 2 0 1 2e; 1882-1884

29.11.2010 3 4 1 0 0 2 0 1 1 6 1 2 3 0 0 2e; 1895-1900

02.12.2010 2 5 4 2 0 0 0 0 1 6 2 2 1 1 0 2e; 1923-1928

06.12.2010 1 3 2 1 1 0 0 0 1 2 0 1 1 0 0 2e; 1937-1938

09.12.10 2 3 3 3 0 1 0 0 0 4 1 1 2 0 0 2e; 1947-1950

96


B.1 Daten aus dem OPU-Versuch

B.1.1 Näherungsfunktionen und Berechnungen für den Verlauf des Serumprogesteronwertes

Die Tabelle B.33 bezieht sich auf die mit Hilfe von Gnuplot ermittelte Näherungsfunktion für

den Verlauf des Serumprogesterongehaltes der Einzeltiere während des Versuchszeitraumes mit

der allgemeinen Funktionsgleichung

f(x) = a · (sin((x + b) · c) + 1) · e (−d·x) .

Tabelle B.33: Die Funktionsparameter mit ihren Standardfehlern (Asymptotic Standard

Error) für die einzelnen Tiere

Tier

Parameter

a b c d

Betty 4.12882 -0.237424 0.255471 0.015388

± 1.008 (24.41%) ± 2.08 (876.1%) ± 0.02276 (8.91%) ± 0.009855 (64.05%)

Crazy 4.37484 -8.36155 0.27077 0.0395779

± 1.017 (23.25%) ± 0.8619 (10.31%) ± 0.02112 (7.8%) ± 0.01188 (30.02%)

Frieda 1.39476 -6.5418 0.268788 0.01741

± 0.2418 (17.34%) ± 0.9339 (14.28%) ± 0.01365 (5.077%) ± 0.007619 (43.76%)

Hera 3.66531 -8.3315 0.266554 0.0146267

± 0.9774 (26.67%) ± 1.155 (13.87%) ± 0.01671 (6.269%) ± 0.0106 (72.49%)

Queen 1 3.42064 -7.88606 0.303657 0.00843052

± 0.7365 (21.53%) ± 0.8206 (10.41%) ± 0.01387 (4.569%) ± 0.008891 (105.5%)

Queen 2 6.71004 -9.70609 0.274973 0.0168831

± 1.795 (26.75%) ± 1.011 (10.42%) ± 0.01613 (5.867%) ± 0.01055 (62.48%)

Rosa 3.0473 -5.46793 0.265753 0.0143687

± 0.6587 (21.62%) ± 1.019 (18.64%) ± 0.02276 (8.563%) ± 0.013 (90.48%)

Stella 3.92724 -8.74304 0.23994 0.0270885

± 1.073 (27.33%) ± 1.265 (14.47%) ± 0.01829 (7.622%) ± 0.01163 (42.93%)

Tiffy 9.32713 -10.1215 0.266051 0.0394403

± 2.183 (23.4%) ± 0.6969 (6.885%) ± 0.01708 (6.421%) ± 0.01118 (28.35%)

UFO 10.4009 -9.80193 0.21255 0.0641817

± 4.307 (41.41%) ± 1.113 (11.36%) ± 0.0223 (10.49%) ± 0.02217 (34.54%)

B.1.2 Progesteronverläufe der Einzeltiere

Für die abgebrochenen, nicht beendeten Versuchsdurchläufe Hera 1a, Frieda 1a und Queen 1a

wurden aufgrund der unvollständigen Daten keine Graphiken erstellt.

97


B Verzeichnis der Gesamtdaten

Abbildung B.1: Graphische Darstellung des Progesteronprofils der Einzeltiere während

des Versuchszeitraumes; Zyklustag = Tag nach natürlicher Brunst; +

gemessene Werte, – Näherungsfunktion

98


B.2 Daten aus dem IVM-Versuch

B.1.3 Berechnungen aus den Funktionen

Tabelle B.34: Berechnungen aus den Funktionen

Zyklus 1 nat. C.l. Zyklus 2 ind. C.l.

Tier (Tage) life span P4 MW Fläche qmm (Tage) life span P4 MW Fläche qmm ∆Max

Crazy 1 23 17 4,1 274,9 23 11 1,7 117,8 3,1

Frieda 1 b 23 12 1,7 225,0 23 9 1,4 62,8 0,8

Hera 1b 24 18 4,7 133,3 24 16 2,9 147,7 1,8

Queen 1b 23 16 4,4 255,3 21 15 3,8 175,5 1,0

Queen 2 25 18 7,5 232,5 23 18 4,4 218,0 3,3

Rosa 3 23 17 4,1 237,6 24 15 3,1 116,2 1,5

Stella 3 26 19 3,5 313,7 27 15 2,7 204,2 2,7

Tiffy 3 24 19 7,0 301,1 23 16 2,7 82,5 6,1

Mittelwert 23,9 17,0 4,6 246,7 23,5 14,4 2,8 140,6 2,5

±SD ±1,1 ±2,3 ±1,9 ±56,0 ±1,7 ±2,9 ±1,0 ±55,9 ±1,7

Tabelle B.35: Vergleich der berechneten und gemessenen Werte

P4-Max 1 gemessenes P4-Max 1 P4-Max 2 gemessenes P4-Max 2 Zyklus 1 beobachteter Zyklus Zyklus 2

Tier Tag ng/ml Tag ng/ml Tag ng/ml Tag ng/ml (Tage) (Tage) (Tage)

Crazy 1 13 5,1 11 4,6 36 2,0 36 2,5 23 21 23

Frieda 1b 12 2,3 11 2,2 35 1,5 39 1,8 23 24 23

Hera 1b 14 6,0 17 7,5 37 4,2 42 4,0 24 20 24

Queen 1b 13 6,1 14 7,9 34 5,1 35 4,8 23 20 21

Qeen 2 15 10,4 21 9,3 38 7,1 35 7,2 25 23 23

Rosa 3 11 5,2 9 5 35 3,7 30 2,8 23 22 24

Stella 3 14 5,3 18 5,8 41 2,6 42 3,4 26 27 27

Tiffy 3 15 10,1 17 10,4 39 4,0 38 3,8 24 27 23

Mittelwert 13,4 6,3 14,8 6,6 36,9 3,8 37,1 3,8 23,9 23,0 23,5

±SD ±1,4 ±2,7 ±4,2 ±2,7 ±2,4 ±1,8 ±4,0 ±1,7 ±1,1 ±2,8 ±1,7

99


B Verzeichnis der Gesamtdaten

B.2 Daten aus dem IVM-Versuch

B.2.1 IVP-Durchgänge der Versuchsgruppen

Datum

Tabelle B.36: IVP-Durchgänge der Gruppe P4


B.2 Daten aus dem IVM-Versuch

Datum

Tabelle B.38: IVP-Durchgänge der Gruppe P4=300 ng/ml

P4 Medium (ng/ml) Teilung Entwicklung

Anzahl (n)

Ansatz leer mit Oozyten

geteilte (n) % d7 (n) % d7 d8 (n) % d8

17.08.2010 267,4 180,2 23,2 56 18 32,1 6 10,7 7 12,5

01.02.2011 346,7 328,2 62 39 62,9 14 22,6 17 27,4

11.04.2011 358,5 55,3 58 33 56,9 10 17,2 13 22,4

03.05.2011 330,5 327,3 40,0 27 7 25,9 3 11,1 3 11,1

15.06.2010 35,8 75 37 49,3 10 13,3 10 13,3

Datum

Tabelle B.39: IVP-Durchgänge der Gruppe P4=450 ng/ml

P4 Medium (ng/ml) Teilung Entwicklung

Anzahl (n)

Ansatz leer mit Oozyten

geteilte (n) % d7 (n) % d7 d8 (n) % d8

01.03.2011 407,1 77,9 60 28 46,7 11 18,3 13 21,7

15.03.2011 464,2 525,3 122,4 25 8 32,0 3 12,0 6 24,0

01.06.2011 330,5 484,3 54,5 29 17 58,6 5 17,2 8 27,6

02.06.2010 301,7 65,8 31 12 38,7 5 16,1 5 16,1

27.07.2010 64,2 59 26 44,1 8 13,6 8 13,6

21.09.2010 65,4 33 18 54,5 7 21,2 15 45,5

07.06.2011 48,9 53 31 58,5 10 18,9 10 18,9

101


B Verzeichnis der Gesamtdaten

Datum

Tabelle B.40: Nicht gewertete IVP-Durchgänge der P4-Gruppen

P4 Medium (ng/ml) Teilung Entwicklung

Anzahl (n)

Ansatz leer mit Oozyten

geteilte (n) % d7 (n) % d7 d8 (n) % d8

02.02.2010 119,7 >40 36,2 55 21 38,2 2 3,6 2 3,6

03.03.2010 >40 27,8 46 14 30,4 2 4,3 4 8,6

17.03.2010 101,7 30,8 12 4 33 1 8 1 8

14.04.2010 87,0 26,3 41 13 53,7 3 7,3 3 7,3

04.05.2010 174,3 162,2 19,0 31 13 41,9 2 6,5 3 9,7

04.08.2010 25,3 53 23 43,4 4 7,5 2 7,5

10.08.2010 281,9 194,0 29,8 27 13 48,1 0 0 2 7,4

07.09.2010 40,9 44 17 38,6 6 13,6 7 15,9

05.10.2010 48,8 45 27 60 7 15,6 9 20

12.10.2010 >40 42,5 22 11 50 6 27,3 9 40,9

26.10.2010 37,8 13 6 46,2 1 7,7 2 15,4

23.11.2010 >40 >40 56 26 46,4 13 23,2 13 23,2

30.11.2010 297,6 209,1 32,9 PILZ

07.12.2010 281,5 206,8 64,1 PILZ

05.01.2011 198,7 190,6 >40 16 5 31,3 1 6,25 1 6,25

18.01.2011 277,3 172,2 17,1 PILZ

18.04.2011 629,9 417,0 0 0 0 0 0 0 0

24.05.2011 504 40,8 51 20 39,2 8 15,7 12 23,5

21.06.2011 410,3 402,8 69,0 30 0 0 0 0 0 0

25.08.2010 252 15,3 26,6 PILZ

102


B.2 Daten aus dem IVM-Versuch

Tabelle B.41: IVP-Durchgänge der zusatzfreien Kontrollgruppe; Durchgänge mit Entwicklungsraten

< 10 % an Tag 7 wurden nicht gewertet

Datum Anzahl (n)

Teilungsrate Entwicklung

% (n) % (n) d7 % (n) d8

12.01.2010 27 33,3 (9) 18,5 (5) 18,5 (5)

19.01.2010 28 71,4 (20) 17,9 (5) 17,8 (5)

26.01.2010 17 58,8 (10) 17,6 (3) 23,5 (4)

02.02.2010 29 37,9 (11) 13,8 (4) 24,1 (7)

09.02.2010 28 67,9 (19) 21,4 (6) 21,4 (6)

23.02.2010 27 37,0 (10) 3,7 (1) 7,4 (2)

02.03.2010 27 59,3 (16) 11,1 (4) 14,8 (4)

09.03.2010 21 61,9 (13) 14,3 (3) 19 (4)

16.03.2010 20 45,0 (9) 0,0 (0) 0,0 (0)

06.04.2010 21 61,9 (13) 14,3 (3) 33,3 (7)

13.04.2010 28 57,7 (16) 25,0 (7) 28,6 (8)

20.04.2010 24 45,8 (11) 4,1 (1) 4,1 (1)

27.04.2010 25 68,0 (17) 36,0 (9) 36,0 (9)

04.05.2010 17 58,8 (10) 5,9 (1) 5,9 (1)

11.05.2010 30 46,6 (14) 16,6 (5) 30,0 (9)

01.06.2010 21 57,1 (12) 23,8 (5) 23,8 (5)

15.06.2010 33 39,4 (13) 12,1 (4) 15,2 (5)

22.06.2010 28 57,1 (16) 3,6 (1) 7,1 (2)

29.06.2010 24 25,0 (6) 4,2 (1) 8,3 (2)

06.07.2010 22 31,8 (7) 9,1 (2) 9,1 (2)

13.07.2010 24 41,7 (10) 25 (6) 29,2 (7)

20.07.2010 21 57,1 (12) 19 (4) 23,8 (5)

27.07.2010 14 7,1 (1) 0,0 (0) 0,0 (0)

03.08.2010 26 61,5 (16) 19,2 (5) 19,2 (5)

10.08.2010 26 46,2 (12) 3,8 (1) 11,5 (3)

17.08.2010 31 58,1 (18) 3,2 (1) 9,7 (3)

19.10.2010 20 35,0 (7) 20,0 (4) 25,0 (5)

23.11.2010 27 59,3 (16) 37,0 (10) 48,1 (13)

01.02.2011 23 69,6 (16) 4,3 (1) 21,7 (5)

01.03.2011 27 51,9 (14) 18,5 (5) 18,5 (5)

15.03.2011 32 3,1 (1) 0,0 (0) 0,0 (0)

29.03.2011 29 58,6 (17) 20,7 (6) 27,6 (8)

11.04.2011 30 73,3 (22) 26,7 (8) 33,3 (10)

18.04.2011 26 50,0 (13) 19,2 (5) 26,9 (7)

02.05.2011 26 50,0 (13) 15,4 (5) 23,1 (6)

24.05.2011 22 72,7 (16) 31,8 (7) 40,9 (9)

30.05.2011 30 70,0 (21) 26,7 (8) 26,7 (8)

01.06.2011 25 56,0 (14) 16,0 (4) 24,0 (6)

07.06.2011 30 56,7 (17) 16,7 (5) 16,7 (5)

103


B Verzeichnis der Gesamtdaten

Tabelle B.42: IVP-Durchgänge der Alkohol(EtOH-)kontrollgruppen; Durchgänge mit

Entwicklungsraten < 10 % an Tag 7 wurden nicht gewertet

Datum EtOH µl Anzahl (n)

Teilungsrate Entwicklung

% (n) % (n) d7 % (n) d8

12.01.2010 2 25 40,0 (10) 16,0 (4) 16,0 (4)

19.01.2010 2 24 58,3 (14) 8,3 (2) 8,3 (2)

26.01.2010 2 24 50,0 (12) 29,2 (7) 25,0 (6)

02.02.2010 2 30 40,0 (12) 6,7 (2) 16,7 (5)

09.02.2010 2 24 62,5 (15) 16,7 (5) 16,7 (5)

16.02.2010 2 12 50,0 (6) 8,3 (1) 16,7 (2)

23.02.2010 2 24 45,8 (11) 0,0 (0) 20,8 (5)

02.03.2010 2 30 43,3 (13) 13,3 (4) 16,6 (5)

09.03.2010 2 24 58,3 (14) 4,2 (1) 4,2 (1)

16.03.2010 2 25 32,0 (8) 8,0 (2) 16,0 (4)

13.04.2010 2 25 52,0 (13) 8,0 (2) 20,0 (5)

27.04.2010 2 20 75,0 (15) 55,0 (11) 55,0 (11)

04.05.2010 2 24 66,6 (16) 25,0 (6) 37,5 (9)

25.05.2010 2 31 32,3 (10) 3,2 (1) 3,2 (1)

07.06.2010 2 23 65,2 (15) 17,4 (4) 30,4 (7)

15.06.2010 2 35 25,7 (9) 5,7 (2) 5,7 (2)

22.06.2010 2 24 54,2 (13) 16,6 (4) 25,0 (5)

29.06.2010 2 29 51,7 (15) 6,9 (2) 10,3 (3)

06.07.2010 2 20 60,0 (12) 15,0 (3) 20,0 (4)

13.07.2010 2 28 28,6 (8) 3,6 (1) 10,7 (3)

20.07.2010 2 20 65,0 (13) 30,0 (6) 30,0 (6)

27.07.2010 4 28 75,0 (21) 46,4 (13) 46,4 (13)

03.08.2010 4 29 55,2 (16) 0,0 (0) 0,0 (0)

10.08.2010 4 30 46,7 (14) 16,6 (5) 16,6 (5)

17.08.2010 4 34 38,2 (13) 11,8 (4) 26,5 (9)

07.09.2010 4 25 48,0 (12) 28,0 (7) 28,0 (7)

14.09.2010 4 31 54,8 (17) 16,1 (5) 22,6 (7)

05.10.2010 4 26 53,8 (14) 15,4 (4) 34,6 (9)

26.10.2010 4 21 61,9 (13) 9,5 (2) 28,6 (6)

23.11.2010 4 31 41,9 (13) 25,8 (8) 32,3 (10)

05.01.2011 4 14 50,0 (7) 7,1 (1) 7,1 (1)

01.02.2011 4 20 70,0 (14) 30,0 (6) 30,0 (6)

01.03.2011 8 23 52,2 (12) 26,1 (6) 30,4 (7)

15.03.2011 8 18 55,6 (10) 27,8 (5) 27,8 (5)

29.03.2011 8 28 39,3 (11) 14,3 (4) 35,7 (10)

11.04.2011 8 30 63,3 (19) 20,0 (6) 40,0 (12)

18.04.2011 8 18 44,4 (8) 22,2 (4) 33,3 (6)

02.05.2011 8 30 43,3 (13) 13,3 (4) 20,0 (6)

24.05.2011 8 18 44,4 (8) 16,7 (3) 22,2 (4)

30.05.2011 8 29 44,8 (13) 20,7 (6) 27,6 (8)

07.06.2011 8 33 69,7 (23) 24,2 (8) 27,3 (9)

104


B.2 Daten aus dem IVM-Versuch

B.2.2 P4 im IVM-Medium

Tabelle B.43: P4-Gehalt des Mediums der Gruppe < 50 ng/ml vor der Inkubation (Ansatz),

nach 24stündiger Inkubation ohne Oozyten (Leerkontrolle) sowie

nach 24stündiger Inkubation mit Oozyten

Datum

P4 (ng/ml)

Ansatz Leerkontrolle mit Oozyten

20.01.10 10,5

27.01.10 15,7 20,6 7,5

09.02.10 52,6

16.02.10 53,9 37,9 12,5

24.02.10 33,4 8,6

17.02.11 15,8 24,7 20,2

17,3 14,8

25,6

31.03.10 23,8 59,3 7,5

48,8 86,5 4,9

25.08.10 14,1 15,3 26,6

13.10.10 30,9 11,2

42,5

Tabelle B.44: P4-Gehalt des Mediums der Gruppe 300 ng/ml vor der Inkubation (Ansatz),

nach 24stündiger Inkubation ohne Oozyten (Leerkontrolle) sowie

nach 24stündiger Inkubation mit Oozyten

Datum

P4 (ng/ml)

Ansatz Leerkontrolle mit Oozyten

15.06.10 133,2 35,8

17.08.10 267,4 180,2 23,2

01.09.10 240,1 171,6 35,7

01.02.11 346,7 328,2

381,5

11.08.10 281,9 194,0 29,8

01.12.10 297,6 209,1 32,9

08.12.10 281,5 206,8 64,1

19.01.11 277,3 172,2 17,1

11.04.11 358,5 55,3

03.05.11 330,5 327,3 41,0

02.06.10 301,7 65,8

33,7

105


B Verzeichnis der Gesamtdaten

Tabelle B.45: P4-Gehalt des Mediums der Gruppe 150 ng/ml vor der Inkubation (Ansatz),

nach 24stündiger Inkubation ohne Oozyten (Leerkontrolle) sowie

nach 24stündiger Inkubation mit Oozyten

P4 (ng/ml)

Datum Ansatz Leerkontrolle mit Oozyten

106

02.02.10 197,5 105,0 36,2

34,1 151,0 35,2

69,5 105,5 23,8

119,7 21,7

03.03.10 104,4 27,8

176,3 23,6

09.03.10 140,6 18,6

17.03.10 101,7 30,8

87,0

117,2

20.04.10 135,3 128,3 52,4

22.06.10 31,3

30.06.10 115,3 116,2 45,4

06.07.10 21,6

13.07.10 32,2

20.07.10 29,9

16.02.11 143,1 139,7 23,5

14.09.10 27,8

28.04.10 130,6 32,1

117,4

30.04.10 125,9

155,7

05.05.10 174,3 162,2 19,0

05.01.11 198,7 190,6 41,0

15.12.10 31,3

34,4

12.05.10 161,1

186,0

19.05.10 172,3

161,1 36,2

26.05.10 155,9

128,9

08.06.10 140,9

137,0

07.04.10 146,6 117,3

92,8

91,0

14.04.10 87,0 22,3

136,9 26,3

24.11.10 104,1 64,3

31.05.11 116,8 65,3

06.10.10 29,5

48,8

27.10.10 75,1 23,4

37,8


B.2 Daten aus dem IVM-Versuch

Tabelle B.46: P4-Gehalt des Mediums der Gruppe 450 ng/ml vor der Inkubation (Ansatz),

nach 24stündiger Inkubation ohne Oozyten (Leerkontrolle) sowie

nach 24stündiger Inkubation mit Oozyten

Datum

P4 (ng/ml)

Ansatz Leerkontrolle mit Oozyten

01.03.11 407,1 77,9

15.03.11 464,2 525,3 122,4

01.06.11 330,5 484,3 54,5

02.06.10 65,8

27.07.10 64,2

21.09.10 65,4

08.06.11 48,9

49,2

39,0

22.06.11 410,3 402,8 69,0

451,5 64,3

406,3

B.2.3 Reifungskontrollen

Durchgänge, bei denen mehr als 10 % der Eizellen nicht auszuwerten waren wurden nicht gewertet.

Tabelle B.47: Gereifte Eizellen der Kontrollgruppe

Datum Anzahl (n)

Meiosestadium

I n (%) II n (%)

nicht auswertbar (n)

25.08.2011 25 12 (85,7%) 3 (14,3%) 10 (41,7%)

26.08.2011 23 18 (85,7%) 3 (14,3%) 2 (8,7%)

08.09.2011 32 18 (85,7%) 3 (14,3%) 11 (34,3%)

22.09.2011 31 23 (82,1%) 5 (17,9%) 3 (9,7%)

23.09.2011 36 26 (78,8%) 7 (21,2%) 3 (8,3%)

29.09.2011 26 15 (78,9%) 4 (21,1%) 7 (26,9%)

Tabelle B.48: Gereifte Eizellen der Alkoholkontrolle

Datum Anzahl (n)

Meiosestadium

I n (%) II n (%)

nicht auswertbar (n)

01.09.2011 38 27 (84,4%) 5 (15,6%) 6 (15,8%)

02.09.2011 31 25 (86,2%) 4 (13,8%) 2 (6,5%)

15.09.2011 34 15 (83,3%) 3 (16,7%) 16 (47,1%)

29.09.2011 28 23 (88,5 %) 3 (11,5%) 2 (7,1%)

14.10.2011 30 26 (89,7%) 3 (10,3%) 1 (3,3%)

107


B Verzeichnis der Gesamtdaten

Tabelle B.49: Gereifte Eizellen der Gruppe P4 150 ng/ml

Datum Anzahl (n)

Meiosestadium

I n (%) II n (%)

nicht auswertbar (n)

15.09.2011 29 14 (82,3%) 3 (17,7%) 12 (41,4%)

22.09.2011 31 25 (86,2%) 4 (13,8%) 2 (6,5%)

23.09.2011 26 19 (79,2%) 5 (20,8%) 2 (7,7%)

13.10.2011 35 26 (81,3%) 6 (18,7%) 3 (8,6%)

Tabelle B.50: Gereifte Eizellen der Gruppe P4 300 ng/ml

Datum Anzahl (n)

Meiosestadium

I n (%) II n (%)

nicht auswertbar (n)

08.09.2011 30 17 (85,0%) 3 (15,0%) 10 (33,3%)

30.09.2011 20 15 (83,3%) 3 (16,7%) 2 (10%)

06.10.2011 40 33 (89,2%) 4 (10,8%) 3 (7,3%)

14.10.2011 34 26 (83,9%) 5 (16,1%) 3 (8,8%)

Tabelle B.51: Gereifte Eizellen der Gruppe P4 450 ng/ml

Datum Anzahl (n)

Meiosestadium

I n (%) II n (%)

nicht auswertbar (n)

02.09.2011 33 26 (83,9%) 5 (16,1%) 2 (6,1%)

16.09.2011 30 23 (85,2%) 4 (14,8%) 3 (10,0%)

07.10.2011 32 23 (79,3%) 6 (20,7%) 3 (9,4%)

108


B.3 Daten aus der RT-qPCR

B.3 Daten aus der RT-qPCR

B.3.1 OPU-Oozyten

Tabelle B.52: Transkripthäufigkeiten in den OPU-Eizellen der natürlichen C.l.-Phase

Analysedatum Eizelle No. GLUT1 PGR GDF9 HIF2a PAQR5 PGRMC1 PGRMC2 BMP15

13.03.2012 798 Betty1 6,12 0,11 542,64 34,15 6,08 28,72 5,15 273,21

14.03.2012 1001 Queen1b 1,61 0,12 256,69 22,22 2,78 21,76 3,82 105,70

15.03.2012 1033 Frieda1b 7,69 0,07 597,94 106,44 10,08 69,74 15,39 394,49

19.03.2012 1800 Tiffy3 9,59 0,67 937,05 68,21 7,68 72,10 11,98 505,65

Mitelwert 6,25 0,24 583,58 57,76 6,66 48,08 9,09 319,76

±SEM ±1,70 ±0,14 ±139,55 ±18,93 ±1,53 ±13,27 ±2,76 ±85,70

Tabelle B.53: Transkripthäufigkeiten in den OPU-Eizellen der Follikelphase

Analysedatum Eizelle No. GLUT1 PGR GDF9 HIF2a PAQR5 PGRMC1 PGRMC2 BMP15

13.03.2012 837 Betty1 3,17 N/A 71,20 20,59 3,30 17,19 3,37 79,55

14.03.2012 1031 Queen 1b 1,26 0,22 256,69 12,41 1,78 11,66 2,29 144,39

15.03.2012 1067 Frieda1b 9,15 0,71 822,49 73,20 6,52 84,67 15,18 485,68

19.03.2012 1828 Tiffy3 4,94 0,42 586,08 45,10 6,61 43,56 9,22 322,90

Mittelwert 4,63 0,45 434,12 37,83 4,55 39,27 7,52 258,13

±SEM ±1,68 ±0,14 ±167,61 ±13,68 ±1,20 ±16,66 ±2,97 ±91,65

Tabelle B.54: Transkripthäufigkeiten in den OPU-Eizellen der induzierten C.l.-Phase

Analysedatum Eizelle No. GLUT1 PGR GDF9 HIF2a PAQR5 PGRMC1 PGRMC2 BMP15

13.03.2012 895 Betty1 4,39 N/A 292,82 21,92 3,67 19,34 4,70 145,40

14.03.2012 1071 Queen1b 1,19 N/A 139,47 14,36 1,85 14,76 2,74 80,66

15.03.2012 1147 Frieda1b 3,30 N/A 149,48 20,73 1,47 16,61 3,13 92,66

19.03.2012 1885 Tiffy3 1,72 0,27 306,74 12,91 1,08 15,57 2,97 137,27

20.03.2012 1072 Queen1b 7,38 N/A 1100,43 75,26 12,85 87,06 15,82 542,64

20.03.2012 1148 Frieda1b 0,48 N/A 13,12 0,40 0,36 6,47 3,69 36,86

20.03.2012 1886 Tiffy3 2,47 0,04 133,51 19,08 1,83 17,68 3,56 105,70

Mittelwert 2,99 0,16 305,08 23,52 3,30 25,36 5,23 163,03

±SEM ±0,88 ±0,12 ±137,93 ±9,05 ±1,64 ±10,40 ±1,78 ±64,74

109


B Verzeichnis der Gesamtdaten

B.3.2 IVM-Versuch

Tabelle B.55: Transkripthäufigkeiten in unreifen Eizellen aus Schlachthofovarien

Analysedatum Eizelle No. GLUT1 PGR GDF9 HIF2a PAQR5 PGRMC1 PGRMC2 BMP15

19.10.2011 622 5,219 N/A 1229,500 36,857 3,467 42,632 13,213 462,675

25.10.2011 528 19,505 0,793 432,261 17,701 2,650 25,559 7,391 197,507

27.10.2011 620 2,049 0,265 249,841 7,647 1,390 14,171 3,084 94,018

14.12.2011 504 8,190 0,699 736,150 43,528 4,671 46,976 11,826 303,143

14.12.2011 530 100,696 18,049 2011,221 74,742 13,966 104,972 42,045 711,074

20.12.2011 566 3,451 0,132 253,735 9,278 1,314 9,944 2,574 111,729

20.12.2011 676 3,516 0,372 324,901 14,359 2,304 30,355 6,207 164,718

20.12.2011 696 8,839 0,803 794,474 38,689 3,716 40,053 15,604 425,748

Mittelwert 18,93 3,02 754,01 30,35 4,18 39,33 12,74 308,83

±SEM ±11,84 ±2,51 ±215,50 ±8,05 ±1,46 ±10,48 ±4,50 ±75,28

Tabelle B.56: Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Kontrollgruppe

Analysedatum Eizelle No. GLUT1 PGR GDF9 HIF2a PAQR5 PGRMC1 PGRMC2 BMP15

18.10.2011 2029 1,122 0,139 353,473 14,475 1,288 13,227 5,961 99,419

20.10.2011 1999 3,326 3,147 691,630 63,288 5,872 68,777 16,494 645,313

26.10.2011 2027 4,671 5,751 2140,684 42,632 7,381 91,383 25,525 1308,643

Mittelwert 3,04 3,01 1061,93 40,13 4,85 57,80 15,99 684,46

±SEM ±1,03 ±1,62 ±548,14 ±14,15 ±1,83 ±23,22 ±5,65 ±349,62

Tabelle B.57: Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Alkoholkontrolle 2 ng/ml

Analysedatum Eizelle No. GLUT1 PGR GDF9 HIF2a PAQR5 PGRMC1 PGRMC2 BMP15

18.10.2011 2047 1,311 0,763 222,949 14,831 1,215 26,919 7,731 172,514

20.10.2011 2025 5,913 0,338 577,572 40,053 2,628 53,961 12,243 282,843

26.10.2011 2044 4,359 0,699 394,493 42,928 3,147 51,051 19,078 431,691

Mittelwert 3,86 0,60 398,34 32,60 2,33 43,98 13,02 295,68

±SEM ±1,35 ±0,13 ±102,39 ±8,93 ±0,58 ±8,57 ±3,30 ±75,09

110


B.3 Daten aus der RT-qPCR

Tabelle B.58: Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Alkoholkontrolle 4 ng/ml

Analysedatum Eizelle No. GLUT1 PGR GDF9 HIF2a PAQR5 PGRMC1 PGRMC2 BMP15

19.10.2011 1991 1,640 1,314 154,756 27,548 3,349 23,165 7,484 141,421

25.10.2011 1973 3,074 0,358 171,252 24,933 2,809 33,128 11,081 170,069

27.10.2011 1988 5,723 1,281 543,739 61,682 5,763 86,628 20,775 620,277

Mittelwert 3,48 0,98 289,92 38,05 3,97 47,64 13,11 310,59

±SEM ±1,20 ±0,31 ±127,00 ±11,84 ±0,91 ±19,70 ±3,97 ±155,06

Tabelle B.59: Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Alkoholkontrolle 8 ng/ml

Analysedatum Eizelle No. GLUT1 PGR GDF9 HIF2a PAQR5 PGRMC1 PGRMC2 BMP15

19.10.2011 2187 3,373 2,758 205,623 34,389 7,081 42,928 16,958 215,846

25.10.2011 2100 4,146 4,632 681,110 26,755 2,871 51,688 16,700 347,711

27.10.2011 2143 9,612 9,480 906,956 79,611 9,480 158,121 37,920 1086,061

Mittelwert 5,71 5,62 597,90 46,92 6,48 84,25 23,86 549,87

±SEM ±1,96 ±2,00 ±206,69 ±16,49 ±1,93 ±37,02 ±7,03 ±270,78

Tabelle B.60: Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Gruppe >50 ng/ml

Analysedatum Eizelle No. GLUT1 PGR GDF9 HIF2a PAQR5 PGRMC1 PGRMC2 BMP15

08.03.2012 2031 0,66 0,08 107,18 20,03 2,72 39,50 7,18 161,33

12.03.2012 2032 5,83 1,78 489,06 69,74 6,89 66,43 9,74 353,08

18.10.2011 2039 3,15 N/A 143,74 17,84 1,91 17,24 7,55 143,74

20.10.2011 2033 4,90 1,99 114,87 18,56 1,61 30,99 5,91 180,25

26.10.2011 2036 9,88 0,69 446,91 48,63 6,04 50,35 22,38 389,06

Mittelwert 4,88 1,14 260,35 34,96 3,83 40,90 10,55 245,49

±SEM ±1,53 ±0,45 ±85,25 ±10,44 ±1,10 ±8,37 ±3,02 ±51,90

111


B Verzeichnis der Gesamtdaten

Tabelle B.61: Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Gruppe 150 ng/ml

Analysedatum Eizelle No. GLUT1 PGR GDF9 HIF2a PAQR5 PGRMC1 PGRMC2 BMP15

08.03.2012 2015 4,77 1,33 172,91 37,89 5,15 33,68 5,67 197,25

08.03.2012 2016 2,32 1,00 209,94 16,84 1,81 18,30 4,15 174,11

08.03.2012 2017 1,49 2,15 193,19 35,60 2,72 35,11 9,15 194,53

21.03.2012 2019 2,16 1,10 263,90 22,85 2,15 31,21 6,04 175,32

Mittelwert 2,69 1,40 209,99 28,30 2,96 29,58 6,25 185,30

±SEM ±0,72 ±0,26 ±19,50 ±5,05 ±0,75 ±3,84 ±1,05 ±6,14

Tabelle B.62: Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Gruppe 300 ng/ml

Analysedatum Eizelle No. GLUT1 PGR GDF9 HIF2a PAQR5 PGRMC1 PGRMC2 BMP15

12.03.2012 1982 1,86 2,03 132,87 30,99 5,48 42,04 9,47 153,69

21.03.2012 1984 2,09 0,80 98,62 26,06 2,92 25,17 5,63 111,73

18.10.2011 1986 2,33 1,06 292,50 27,33 2,89 44,09 10,95 201,17

26.10.2011 1981 9,67 6,70 1108,09 104,25 10,01 151,57 29,12 839,77

Mittelwert 3,99 2,65 408,02 47,16 5,33 65,72 13,79 326,59

±SEM ±1,90 ±1,38 ±237,15 ±19,06 ±1,68 ±28,93 ±5,23 ±172,03

Tabelle B.63: Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Gruppe 450 ng/ml

Analysedatum Eizelle No. GLUT1 PGR GDF9 HIF2a PAQR5 PGRMC1 PGRMC2 BMP15

12.03.2012 2049 4,77 0,08 736,15 46,98 5,95 57,83 9,61 428,71

12.03.2012 2091 1,81 1,81 57,04 16,49 2,15 13,30 2,26 68,78

21.03.2012 2050 3,44 2,18 565,69 30,99 4,33 39,50 6,38 269,45

25.10.2011 2092 2,69 0,16 111,91 14,28 1,55 30,40 8,61 153,93

Mittelwert 3,18 1,06 367,70 27,19 3,50 35,26 6,72 230,22

±SEM ±0,63 ±0,55 ±167,55 ±7,57 ±1,01 ±9,28 ±1,63 ±77,90

112


Abbildungen

2.1 Schematische Darstellung der IVP beim Rind; modifiziert nach NIEMANN und

MEINECKE (1993) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

3.1 Schematische Darstellung des Arbeitsablaufs der OPU-Versuche . . . . . . . . 30

3.2 OPU-Equipment: (1) Vakuumpumpe, (2) Ultraschallgerät, (3) Sondenträger;

Wasserbad, Schlauchsystem und Auffanggefäß nicht abgebildet; Abbildung nach

HANSTEDT (2009) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

3.3 OPU-Sondenträger mit Nadelführung sowie Vergrößerung des vorderen Teiles;

Abbildung nach HANSTEDT (2009) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

3.4 Schematische Darstellung der Follikelpunktion;

Abbildung nach HANSTEDT (2009) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

3.5 Apparatur zur Separation von KOK aus Follikelpunktaten;

Abbildung nach HANSTEDT (2009) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

3.6 IVP-taugliche bovine Kumulus-Oozyten-Komplexe, 50fache Vergrößerung . . 33

3.7 Schematische Darstellung des IVP-Versuchsteils . . . . . . . . . . . . . . . . 36

3.8 a: 8-Zell-Embryo, b: Morula, c: expandierte Blastozysten, d: geschlüpfte Blastozysten

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

4.1 Graphische Darstellung des Progesteronprofils während des Versuchszeitraumes;

+ an den Punktionstagen gemessene Werte, – Näherungsfunktion . . . . . 47

4.2 Serumprogesterongehalt (links; ¯n±SD, n=8; a:b mit P ≤0,05), Fläche (Mitte;

¯n±SD, n=8; a:b mit P ≤0,05) und Lutealphasenlänge (rechts; ¯n±SD, n=8) des

natürlichen und induzierten C.l. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

4.3 a: gereifte Oozyten der Kontrollgruppe; b: mit EtOH gereift; c: mit P4 gereift;

Maßstab in allen Bildern gleich . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

4.4 mRNA-Gehalte der OPU-Oozyten bezüglich GDF9, BMP15 und HIF2α; a:b

mit P < 0,05, * = Tendenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

4.5 mRNA-Gehalte der OPU-Oozyten bezüglich der Progesteronrezeptoren; a:b

mit P < 0,05, * = Tendenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

4.6 mRNA-Gehalte der gereiften Oozyten aus dem IVM-Versuch bezüglich GDF9

und HIF2α; a:b mit P < 0,05, * = Tendenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

4.7 mRNA-Gehalte der gereiften Oozyten aus dem IVM-Versuch bezüglich der

Progesteronrezeptoren; a:b mit P < 0,05, * = Tendenz . . . . . . . . . . . . . . 56

B.1 Graphische Darstellung des Progesteronprofils der Einzeltiere während des Versuchszeitraumes;

Zyklustag = Tag nach natürlicher Brunst; + gemessene Werte,

– Näherungsfunktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98

113


Abbildungen

114


Tabellen

2.1 Untersuchungen zu verschiedenen Parametern und deren Einfluss auf die Entwicklungskompetenz

boviner Oozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

2.2 Effekte verschiedener Zusätze zum IVM-Medium auf die Entwicklungsraten in

der IVP boviner Embryonen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

2.3 Effekte verschiedener Steroidsupplementationen im IVM-Medium für Rinder-

KOK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

3.1 Klassifizierungsschema für bovine KOK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

3.2 Kreuzreaktivität des im RIA genutzten Antikörpers . . . . . . . . . . . . . . . 35

3.3 Eingesetzte Oozyten- bzw. Embryonenäquivalente (EÄ; 1 EÄ ˆ= 20 µl des Reaktionsansatzes)

für die jeweiligen Gentranskripte . . . . . . . . . . . . . . . . 41

3.4 Verwendete Primer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

4.1 Tiernutzung und Auswertung im OPU-Versuchsteil . . . . . . . . . . . . . . . 46

4.2 Punktierte Follikel (n) und Größenverteilung während der Zyklusphasen . . . . 49

4.3 Punktierte Follikel pro OPU-Sitzung (¯n±SD) in den einzelnen Zyklusphasen . 49

4.4 Gewonnene KOK (n) und Anteile an den einzelnen Kategorien (%) . . . . . . . 49

4.5 Gewonnene KOK der einzelnen Kategorien pro OPU-Sitzung in den Zyklusphasen

(¯n±SD) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

4.6 Progesterongehalt des Mediums (¯n±SD) der einzelnen Versuchsgruppen vor

der Inkubation (Ansatz), nach 24stündiger Inkubation ohne Oozyten (Leerkontrolle)

sowie nach 24stündiger Inkubation mit Oozyten . . . . . . . . . . . . . 51

4.7 Prozentuale Anteile der Meiosestadien M I und M II in den Reifungskontrollen

(¯n±SD; P > 0,05) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

4.8 Teilungs- (TR) und Entwicklungsraten (ER) der einzelnen Versuchsgruppen

(¯n±SD) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

A.1 Zusammensetzung der PBS-Lösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

A.2 Zusätze für die PBS-Gebrauchslösung (PBS Complete) . . . . . . . . . . . . . 73

A.3 Zusammensetzung des TCM air . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

A.4 Zusammensetzung der NaCl-Lösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

A.5 Zusammensetzung der NaCl-Complete-Lösung . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

A.6 Zusammensetzung des Reifungsmediums . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

A.7 Zusammensetzung der FertTALP-Stocklösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

A.8 Zusammensetzung der FertTALP-Gebrauchslösung . . . . . . . . . . . . . . . 74

A.9 Zusammensetzung der Epinephrin-Lösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

A.10 Zusammensetzung der Hypotaurin-Lösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

A.11 Zusammensetzung der Heparin-Lösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

A.12 Zusammensetzung der HHE-Stocklösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

115


Tabellen

A.13 Zusammensetzung der HHE-Gebrauchslösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

A.14 Zusammensetzung des Fertilisationsmediums . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

A.15 Zusammensetzung der Spermfilter-Gebrauchslösung . . . . . . . . . . . . . . 76

A.16 Zusammensetzung der SOF-Stocklösung A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

A.17 Zusammensetzung der SOF-Stocklösung B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

A.18 Zusammensetzung der SOF-Stocklösung C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

A.19 Zusammensetzung der SOF-Stocklösung D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

A.20 Zusammensetzung der Glutamin-Stocklösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77

A.21 Zusammensetzung des Kulturmediums (SOFaa-Medium) . . . . . . . . . . . . 77

A.22 Zusammensetzung der Fixierlösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77

A.23 Zusammensetzung der Lacmoid-Stocklösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77

A.24 Zusammensetzung der Lacmoid-Arbeitslösung . . . . . . . . . . . . . . . . . 77

A.25 Zusammensetzung des PVA 0,1 % . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

A.26 NaCl-Lösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

A.27 Boratpuffer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

A.28 Herkunft der bei der RT-PCR eingesetzten Medien . . . . . . . . . . . . . . . 78

A.29 Tris-HCl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

A.30 Lysis/Bindingpuffer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79

A.31 Waschpuffer A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79

A.32 Waschpuffer B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79

A.33 Zusammensetzung des Mastermixes für die Reverse Transkription . . . . . . . 79

A.34 Zusammensetzung des Reaktionsgemisches für die RT-qPCR . . . . . . . . . . 79

B.1 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Betty1“; Versuchsstart unklar,

nicht gewertet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81

B.2 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Crazy1“ . . . . . . . . . 81

B.3 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von "Frieda1a“; nicht gewertet,

C.l. aus Zyste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81

B.4 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Frieda1b“ . . . . . . . . . 82

B.5 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Hera1a“, Durchgang wegen

C.l.-Bildung abgebrochen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82

B.6 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Hera1b“ . . . . . . . . . 82

B.7 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Queen1a“, Durchgang wegen

C.l.-Bildung abgebrochen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83

B.8 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Queen1b“ . . . . . . . . 83

B.9 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Rosa1“ . . . . . . . . . . 83

B.10 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Hera2“, unklarer Versuchsstart,

nicht gewertet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84

B.11 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Queen2“ . . . . . . . . . 84

B.12 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Rosa2“; dreimal wöchentliche

Punktion, nicht gewertet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

116


B.13 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Crazy2“; dreimal wöchentliche

Punktion, persistierendes C.l.; nicht gewertet . . . . . . . . . . . . . . . . 86

B.14 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Stella3“ . . . . . . . . . . 87

B.15 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „UFO3“; kein induziertes

C.l., nicht gewertet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87

B.16 C.l.-Eigenschaften und Serumprogesteronwerte von „Tiffy3“ . . . . . . . . . . 88

B.17 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Betty1“; Versuchsstart unklar,

nicht gewertet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

B.18 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Crazy1“ . . . . . . . . . . . 89

B.19 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Frieda1a“; nicht gewertet, C.l.

aus Zyste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90

B.20 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Frieda1b“ . . . . . . . . . . . 90

B.21 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Hera1a“; Durchgang wegen

C.l.-Bildung abgebrochen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91

B.22 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Hera1b“ . . . . . . . . . . . 91

B.23 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Queen1a“; Durchgang wegen

C.l.-Bildung abgebrochen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92

B.24 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Queen1b“ . . . . . . . . . . 92

B.25 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Rosa1“ . . . . . . . . . . . . 93

B.26 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Crazy2“; dreimal wöchentliche

Punktion, persistierendes C.l., nicht gewertet . . . . . . . . . . . . . . . . 93

B.27 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Queen2“ . . . . . . . . . . . 94

B.28 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Rosa2“; dreimal wöchentliche

Punktion, nicht gewertet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94

B.29 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Hera2“; Versuchsstart unklar,

nicht gewertet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95

B.30 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Stella3“ . . . . . . . . . . . . 95

B.31 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „Tiffy3“ . . . . . . . . . . . . 96

B.32 Punktierte Follikel und gewonnene Eizellen von „UFO3“; kein induziertes C.l.,

nicht gewertet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96

B.33 Die Funktionsparameter mit ihren Standardfehlern (Asymptotic Standard Error)

für die einzelnen Tiere . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97

B.34 Berechnungen aus den Funktionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99

B.35 Vergleich der berechneten und gemessenen Werte . . . . . . . . . . . . . . . . 99

B.36 IVP-Durchgänge der Gruppe P4


Tabellen

B.42 IVP-Durchgänge der Alkohol(EtOH-)kontrollgruppen; Durchgänge mit Entwicklungsraten

< 10 % an Tag 7 wurden nicht gewertet . . . . . . . . . . . . . . . . 104

B.43 P4-Gehalt des Mediums der Gruppe < 50 ng/ml vor der Inkubation (Ansatz),

nach 24stündiger Inkubation ohne Oozyten (Leerkontrolle) sowie nach 24stündiger

Inkubation mit Oozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105

B.44 P4-Gehalt des Mediums der Gruppe 300 ng/ml vor der Inkubation (Ansatz),

nach 24stündiger Inkubation ohne Oozyten (Leerkontrolle) sowie nach 24stündiger

Inkubation mit Oozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105

B.45 P4-Gehalt des Mediums der Gruppe 150 ng/ml vor der Inkubation (Ansatz),

nach 24stündiger Inkubation ohne Oozyten (Leerkontrolle) sowie nach 24stündiger

Inkubation mit Oozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106

B.46 P4-Gehalt des Mediums der Gruppe 450 ng/ml vor der Inkubation (Ansatz),

nach 24stündiger Inkubation ohne Oozyten (Leerkontrolle) sowie nach 24stündiger

Inkubation mit Oozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107

B.47 Gereifte Eizellen der Kontrollgruppe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107

B.48 Gereifte Eizellen der Alkoholkontrolle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107

B.49 Gereifte Eizellen der Gruppe P4 150 ng/ml . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108

B.50 Gereifte Eizellen der Gruppe P4 300 ng/ml . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108

B.51 Gereifte Eizellen der Gruppe P4 450 ng/ml . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108

B.52 Transkripthäufigkeiten in den OPU-Eizellen der natürlichen C.l.-Phase . . . . . 109

B.53 Transkripthäufigkeiten in den OPU-Eizellen der Follikelphase . . . . . . . . . 109

B.54 Transkripthäufigkeiten in den OPU-Eizellen der induzierten C.l.-Phase . . . . . 109

B.55 Transkripthäufigkeiten in unreifen Eizellen aus Schlachthofovarien . . . . . . . 110

B.56 Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Kontrollgruppe . . 110

B.57 Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Alkoholkontrolle

2 ng/ml . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110

B.58 Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Alkoholkontrolle

4 ng/ml . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111

B.59 Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Alkoholkontrolle

8 ng/ml . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111

B.60 Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Gruppe >50 ng/ml 111

B.61 Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Gruppe 150 ng/ml . 112

B.62 Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Gruppe 300 ng/ml . 112

B.63 Transkripthäufigkeiten in den in vitro gereiften Eizellen der Gruppe 450 ng/ml . 112

118


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Abkürzungsverzeichnis

α . . . . . . . . . . . . . .

¯n . . . . . . . . . . . . . . .

β . . . . . . . . . . . . . . .

Alpha

Mittelwert, arithmetisches Mittel

Beta

µl . . . . . . . . . . . . . . Mikroliter

µM . . . . . . . . . . . . . Mikromolar

µmol . . . . . . . . . . .

ANOVA . . . . . . . .

BDNF . . . . . . . . . .

Mikromol

Analysis of Variance, Varianzanalyse

Brain Derived Neurotrophic Factor

BMP15 . . . . . . . . . Bone Morphogenetic Protein 15

BSA . . . . . . . . . . .

bzw. . . . . . . . . . . . .

C.l. . . . . . . . . . . . . .

ca. . . . . . . . . . . . . .

CO 2 . . . . . . . . . . . .

cpm . . . . . . . . . . . .

DF . . . . . . . . . . . . .

DNA . . . . . . . . . . .

DTT . . . . . . . . . . .

E 2 . . . . . . . . . . . . . .

eCG . . . . . . . . . . . .

ECS . . . . . . . . . . . .

EDTA . . . . . . . . . .

EGF . . . . . . . . . . . .

ER . . . . . . . . . . . . .

et al. . . . . . . . . . . .

Bovines serum Albumin

beziehungsweise

Corpus luteum

circa

Kohlenstoffdioxid

Counts pro Minute

Dominanter Follikel

Desoxyribonukleinsäure

Dithiothreitol

17-β-Estradiol

Equines Choriogonadotropin

Estrus Cow Serum

Ethylendiamintetraessigsäure

Epidermal Growth Factor

Entwicklungsrate

et alii, und andere

159


Abkürzungsverzeichnis

EtOH . . . . . . . . . . .

EÄ . . . . . . . . . . . . .

Fa. . . . . . . . . . . . . .

FAF . . . . . . . . . . . .

FCS . . . . . . . . . . . .

FF . . . . . . . . . . . . .

FS . . . . . . . . . . . . .

FSH . . . . . . . . . . . .

G . . . . . . . . . . . . . .

g . . . . . . . . . . . . . . .

Ethanol

Embryonenäquivalent

Firma

Fatty Acid Free, Fettsäurefrei

Fetal Calf Serum, fetales Kälberserum

Follikelflüssigkeit

Fettsäuren

Follikel stimulierendes Hormon

Gauge

Erdschwerebeschleunigung

GDF9 . . . . . . . . . . Growth and Differentiation factor 9

GnRH . . . . . . . . . .

h . . . . . . . . . . . . . . .

H 2 O . . . . . . . . . . . .

HCl . . . . . . . . . . . .

HECM . . . . . . . . .

HHE . . . . . . . . . . .

HIF2α . . . . . . . . . .

ICM . . . . . . . . . . . .

IE . . . . . . . . . . . . . .

IVC . . . . . . . . . . . .

IVF . . . . . . . . . . . .

IVM . . . . . . . . . . .

IVP . . . . . . . . . . . .

KOK . . . . . . . . . . .

l . . . . . . . . . . . . . . .

Gonadotropin-Releasing-Hormon

Stunde

Wasser

Salzsäure

Hamster Embryo Culture Medium

Heparin-Hypotaurin-Epinephrin

Hypoxia Inducible Factor 2α

Inner Cell Mass, innere Zellmasse

Internationale Einheiten

In-vitro-Kultur

In-vitro-Fertilisation

In-vitro-Maturation

In-vitro-Produktion

Kumulus-Oozyten-Komplex

Liter

160


LH . . . . . . . . . . . . .

LOS . . . . . . . . . . . .

LSF . . . . . . . . . . . .

Max . . . . . . . . . . . .

MgCl 2 . . . . . . . . . .

MI . . . . . . . . . . . . .

MII . . . . . . . . . . . .

Min . . . . . . . . . . . .

ml . . . . . . . . . . . . . .

MM . . . . . . . . . . . .

mm . . . . . . . . . . . .

mmHG . . . . . . . . .

MOET . . . . . . . . .

MPC . . . . . . . . . . .

mPGR . . . . . . . . . .

mRNA . . . . . . . . .

Luteinisierendes Hormon

Large Offspring Syndrome

Least Sqaure Fit

Maximum

Magnesiumchlorid

Meiosestadium I

Meiosestadium II

Minimum

Milliliter

Master Mix

Millimeter

Millimeter Quecksilber, Druckeinheit

Multiple Ovulation and Embryo Transfer

Magnetic Particle Concentrator

membranständiger Progesteronrezeptor

Messenger Ribonukleinsäure

N 2 . . . . . . . . . . . . . Stickstoff

Na . . . . . . . . . . . . .

NaCl . . . . . . . . . . .

ng . . . . . . . . . . . . . .

nPGR . . . . . . . . . .

Natrium

Natriumchlorid

Nanogramm

nuklearer Progesteronrezeptor

O 2 . . . . . . . . . . . . . Sauerstoff

OPU . . . . . . . . . . .

PAQR . . . . . . . . . .

PBS . . . . . . . . . . . .

PCR . . . . . . . . . . . .

Ovum-Pick-Up

Progestin und AdipoQ Rezeptor

Phosphate Buffered Saline, Phosohat-gepufferte Salzlösung

Polymerase Chain Reaction, Polymerase-Kettenreaktion

161


Abkürzungsverzeichnis

pg . . . . . . . . . . . . . .

PGR . . . . . . . . . . .

Pikogramm

Progesteronrezeptor

PGRMC1 . . . . . . . membranständiger Progesteronrezeptor 1

PGRMC2 . . . . . . . membranständiger Progesteronrezeptor 2

PVA . . . . . . . . . . . .

PVC . . . . . . . . . . .

PVP . . . . . . . . . . . .

qPCR . . . . . . . . . .

RIA . . . . . . . . . . . .

RNA . . . . . . . . . . .

SD . . . . . . . . . . . . .

SEM . . . . . . . . . . .

Polyvinylalkohol

Polyvinylchlorid

Polyvinylpyrrolidon

quantitative Polymerase-Kettenreaktion

Radioimmunoassay

Ribonukleinsäure

Standardabweichung

Standardfehler

SLC2A1 . . . . . . . . Glukose Transporter 1

SOF . . . . . . . . . . . .

SSS . . . . . . . . . . . .

T . . . . . . . . . . . . . . .

TALP . . . . . . . . . .

Synthetic Oviduct Fluid

Synthetic Serum Substitute, synthetischer Serumersatz

Testosteron

Tyrode´s Albumin Laktat Pyrovat

TCM199 . . . . . . . . Tissue Culture Medium 199

TE . . . . . . . . . . . . .

TGF . . . . . . . . . . . .

TR . . . . . . . . . . . . .

vs. . . . . . . . . . . . . .

◦ C . . . . . . . . . . . . .

Trophektoderm

Transforming Growth Factor

Teilungsrate

versus, gegenüber

Grad Celsius

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Veröffentlichungen

Auszüge dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht:

N. Schlüter, A. Hanstedt, C. Wrenzycki: „Einfluss der Progesteronkonzentration während

wiederholter OPU-Sitzungen auf die Eizellqualität“ (Vortrag, 38. Jahrestagung der AET-d 2011)

N. Schlüter, A. Hanstedt, K. Knauer, H. Stinshoff, C. Wrenzycki: „Influence of peripheral

progesterone concentration on oocyte quality in repeated OPU sessions“ (Poster, 37th Annual

Conference of the IETS 2012)

N. Schlüter, A. Hanstedt, K. Knauer, H. Stinshoff, C. Wrenzycki: „Influence of peripheral

progesterone concentration on morphological oocyte quality in repeated OPU sessions“ (Poster,

45. Jahrestagung Physiologie und Pathologie der Fortpflanzung 2012)

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Danksagung

Bei einem Projekt wie diesem gibt es immer eine Reihe von Personen und Einrichtungen, ohne

die die Durchführung nicht möglich gewesen wäre. An dieser Stelle sei all jenen ein herzlicher

Dank ausgesprochen.

Erwähnen möchte ich hier besonders

• Prof. Dr. Christine Wrenzycki, die dieses Projekt ins Leben gerufen und in seiner Gesamtheit

geleitet und begleitet hat

• die AG Biotechnologie der Klinik für Rinder Hannover

• die Firma Masterrind, die die Versuchstiere zur Verfügung gestellt hat

• Vion Bad Bramstedt, aus deren Schlachthof die Ovarien für die IVP stammten

• den Förderverein Biotechnologie Forschung e.V. für die finanzielle Unterstützung

• Sandra Wilkening für die PCR

• Dr. Marion Piechotta und ihrem Team für die Hilfe bei den P4-Analysen

• die Tierpfleger der Rinderklinik

• Doris für die Medien und die Unterstützung im IVF-Labor

• meine Kollegen aus der Tierarztpraxis Schomacker, die für meine Dissertation den einen

und anderen Dienst für mich übernommen haben

• Alexander Meyer für die Auswertungen mittels Gnuplot

• Björn Guth für die Berechnungen aus den P4-Kurven

• Dr. Ana Hanstedt für Korrekturen, produktive Diskussionen, unendliche Geduld bei den

Reifungskontrollen und ihr offenes Ohr

• Katharina Knauer, zweite Hälfte des Chaos-Kommandos, für die tatkräftige Unterstützung

beim OPU und unvergessliche Tage in OPU-Stall und Labor

• Johanna Bennemann, Leidensgenossin, für gemeinsames Jammern und Dampf ablassen,

gegenseitiges Mut machen und Daumen drücken... und für´s Durchhalten -wir haben´s

geschafft!

• Philipp Gringel für die Hilfe bei L A TEX und 4 Jahre langes Mitzittern, Freuen, Trösten,

Motivieren und für seine Ruhe bis zum Schluss!

• meine Eltern, ohne deren finanzielle und mentale Unterstützung diese Doktorarbeit nicht

realisierbar gewesen wäre

Danke!

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