Elektrophorese - Institut für Analytische Chemie

Elektrophorese

Literatur:
• Reiner Westermeier: “Elektrophorese-Praktikum”, Verlag Chemie 1996
verständlich geschrieben, sehr Labor-orientiert, einige Techniken nicht mehr ganz
aktuell
• Current Protocols in Protein Science, Wiley
regelmäßiges update, sehr verlässlich, ausführlich beschrieben, optimale
Begleitung für jeden der eine neue Technik im Labor etablieren möchte
• Methods in Enzymology, Academic Press
bislang über 400 Bände, sehr ausführlich und mit vielen Spezialanwendungen

Grundlagen
Klassische Elektrophorese: “Zonenelektrophorese”
(aus: Westermeier

Anfänge (1937): Wandernde-Grenzschichten-
Elektrophorese
Moleküle wandern je nach Ladungszahl
und Ladungsart in unterschiedliche
Richtungen, mit Hilfe von Lichtbrechung
kann man verschiedene Frontenbildungen
verfolgen (Schlieren-Optik)
(aus: Westermeier)

Isotachophorese
• Moleküle wandern zwischen
schnellem Leitelektrolyt (L) und
langsamen Folge-elektrolyt (T von
terminierend)
• Dadurch ergibt sich eine
Feldinhomogenität, welche einen
Stacking-Effekt der Proteine
verursacht (siehe Abbildung)
(aus: Westermeier)

Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE)
Gelmatrix für Proteingele
Acrylamid (giftig! – Nervengift)
Quervernetzer: Bisacrylamid
oder Piperazindiacrylamid (PDA)
Polymerisationsinitiator:
Ammonium-peroxodisulfat
Polymerisationskatalysator:
Tetramethylethylendiamin
(TEMED)

Diskontinuierliche Elektrophorese
Zwei Gelsysteme:
1. Trenn-Gel: 8-15% aa,
Tris/HCl pH 8.8
2. Sammel-Gel: 4% aa,
Tris/HCl pH 6.8
Zuerst Isotachophorese: Stapel
an Proteinen in Reihenfolge
ihrer Mobilität – nur von
Ladung, nicht von Größe
abhängig (“Stacking”)
Dann: Proteine treffen auf
dichtes Gel,
Reibungswiderstand – Stau
und Zonenschärfung.
Glycin überholt Proteine –
jetzt: Zonenelektrophorese
Mobilität jetzt von Ladung und
Molekülgröße abhängig
(aus: Westermeier)

SDS-Elektrophorese
• Natriumdodecylsulfat (SDS): anionisches Detergenz, effektive Beladung der Proteine mit ca
1,4g SDS pro g Protein. Effiziente Denaturierung und Streckung der Proteine, durch Zugabe
von Reduktionsmittel 2-Mercaptoethanol oder Dithiothreitol Reduktion von Disulfidbrücken
und somit vollständige Denaturierung
• Vorteile:
– beinahe alle Proteine gehen in Lösung
– Hohe elektrophoretische Mobilität
– Alle Proteine wandern in eine Richtung, getrennt wird nur nach einem Parameter, dem Molekulargewicht
– Durch praktisch vollständige Denaturierung hohes Auflösungsvermögen
• Merke: ein klassisches SDS-Gel ist eine SDS-Disk-Elektrophorese

Isoelektrische Fokussierung (IEF)
Prinzip: Protein wandert nur, wenn es
geladen ist. Der Ladungszustand hängt
vom pH ab.
Im Gel liegt ein pH-Gradient vor. Jedes
Protein wandert bis zur Zone, in dem
der pH dem pI des Proteins entspricht,
dann bleibt es stehen.
Kommt es aus seiner Zone, wird es
wieder geladen und wandert zurück
(Fokussierung)!
(aus: Westermeier)

1.) Freie Trägerampholyte
Wie kommt pH-Gradient zustande?
pH-Gradient entsteht im elektrischen
Feld und wird durch Probe beeinflusst.
2.) Immobilisierte pH-Gradienten (IPG):
pH-Gradient ist in das Gel
einpolymerisiert und wird durch Probe
nicht beeinflusst – bessere
Reproduzierbarkeit!
(aus: Westermeier)

Theoretischer Hintergrund

Elektroosmose I
Bei Kontakt mit Elektrolytlösung kann sich
aufgrund von Oberflächenladungen eine
elektrochemische Doppelschicht bilden.
Im Falle von fused silica dissoziiert H+ von SiOH
und die Wand wird negativ geladen.
Bei Anlegen einer Spannung bewirken die
positiven Gegenladungen durch
Impulsübertragung auf das Lösungsmittel einen
Fluss des Lösungsmittels Richtung Kathode –
den elektroosmotischen Fluss. Dieser wird zB in
der Kapillarelektrophorese gezielt eingesetzt.

Elektroosmose II

Vertikale Elektrophorese-Systeme

Horizontale Elektrophorese-Systeme

Herstellung von Gradientengelen

Präparative Darstellung eines Proteins in Lösung durch Elektroelution

Präparative Zonen-Elektrophorese

2D-Gelelektrophorese

Agarosegelelektrophorese von DNA
Gelmatrix besteht aus Agarose, einem
großporigen Polysaccharid
DNA wird typischerweise mit
Ethidiumbromid, einem interkalierenden
Fluoreszenzfarbstoff detektiert

Standardfärbungen PAGE
• Coomassie Brilliant Blue: Anlagerung von Farbstoff, relativ einfach und billig,
quantitativ, aber wenig empfindlich (Detektionsgrenze ca 100ng)
• Silberfärbung: Anlagerung von metallischem Silber, relativ einfach und billig, nicht
quantitativ, aber sehr empfindlich zwei Unterarten: 1) mit ammoniakalischem
Silberkomplex und Protein-Quervernetzung mit Glutaraldehyd – nicht MS-tauglich
(Detektionsgrenze ca 0.1ng) und 2) ohne Quervernetzung mit Silbernitratlösung
und basischer Entwicklung mit Formaldehyd (Detektionsgrenze ca 1ng)
• Fluoreszenzfärbungen: Anlagerung von Fluoreszenzfarbstoffen, generell
empfindlich und quantitativ, oft teuer. Allerdings nicht sichtbar mit freiem Auge,
Laser-Scanning erforderlich.
Cypro Ruby: einfach, rasch, empfindlich aber teuer
RuBPS (Ruthenium (II) tris (bathophenantroline disulfonate)): kann selbst
hergestellt werden, fast vergleichbar mir Ruby

Proteine
• „Eigentliche“ Akteure des zellbiologischen Geschehens
• Expression sowie Modifikation(en), Lokalisation, Bindungspartner oder
auch enzymatische Aktivität abhängig vom aktuellen Zustand der Zelle
• Mit Einschränkungen gut zugänglich für sehr sensitive und quantitative
Analysen (2D-PAGE, LC/MS-MS...)
Analytik erlaubt Suche nach:
• Marker-Proteinen für Erkrankungen etc.
• Aktivierungszustand von Signaltransduktionswegen (Phosphorylierung,
proteolytische Aktivierungen etc.)
• Charakterisierung von Zellreaktionen auf veränderte Umweltbedingungen
oder definierte Wirkstoffe

Zum Verständnis eines Proteom-Experimentes
U937 Zellen, 35 S-Autoradiographie A:Kontrolle, B: 7min 44°C, 4h chase

Reliability: Cell type-specific protein expression
DC
EC
P06702 Calgranulin B (MRP-14) 10 0
P18510 Interleukin-1 receptor antagonist protein (IL-1ra) 2 0
P55008 Allograft inflammatory factor 1 (AIF-1) 2 0
Q16864 Vacuolar ATP synthase subunit F (EC 3,6,3,14) 4 0
DC EC DC EC
00167 Cytochrome b5 - Homo sapiens (Human) 0 3
P47813 Eukaryotic translation initiation factor 1A 0 4
Q03135 Caveolin-1 - Homo sapiens (Human) 0 3
O75368 SH3 domain-binding glutamic acid-rich-like protein 6 5
O75947 ATP synthase D chain, mitochondrial (EC 3,6,3,14) 9 10
95881 Thioredoxin domain-containing protein 1 2 5
P00441 Superoxide dismutase [Cu-Zn] (EC 1,15,1,1) 6 8
P02792 Ferritin light chain (Ferritin L subunit) 8 4
P02794 Ferritin heavy chain (EC 1,16,3,1) (Ferritin H subunit) 9 1
P07741 Adenine phosphoribosyltransferase (EC 2,4,2,7) (APRT) 7 9
P09382 Galectin-1 (Beta-galactoside-binding lectin L-14-I) 7 10
P10599 Thioredoxin (ATL-derived factor) (ADF) 6 6
P15531 Nucleoside diphosphate kinase A (EC 2,7,4,6) (NDK A) 8 10
P16949 Stathmin (Phosphoprotein p19) (pp19) (Oncoprotein 18) 1 8
P20674 Cytochrome c oxidase polypeptide Va (EC 1,9,3,1) 3 4

Differential gel electrophoresis DIGE
Fluoreszenz-markierte N-Hydroxy-Succinimide-Derivate reagieren mit ε-Amino-
Gruppen von Lysinen (kovalentes Labeling, keine Anlagerung!)
(Van den Bergh and Arckens, COBt, 2004)

Verbesserte Analyse-Strategien durch DIGE
Elimination von Gel-Variationen, verbesserte statistische Auswertung durch internen
Standard

Minimal Labeling vs. saturation labelling
Die Fluoreszenz-Tags sind sehr hydrophob. Werden alle Lysine vollständig umgesetzt,
fällt relativ viel Protein aus und kann nicht mehr getrennt werden. Daher wird gerade
soviel Farbstoff eingesetzt, dass pro Proteinmolekül maximal ein Lysine gelabelt wird
(minimal labelling). Die Empfindlichkeit bleibt relativ gut (Detektionsgrenze ca
1ng/spot) und das Verfahren ist MS-kompatibel.
Saturation dyes: Cysteine werden mit
Maleimide Cyanine-Farbstoffen umgesetzt.
Empfindlichkeit wird besser, allerdings
erheblicher Proteinverlust
Shaw-J et al. Proteomics 2003

Analyse von Post-translationalen Modifikationen
35
S-für Translation, 32 P für Phosphorylierung,
3
[H]Mannose für N-glykosylierte Proteine,
3
[H]Galaktose für O-GlcNAc, 3 [H]Myristate und
3
[H]Mevalonate für Lipid-Modifikationen

Detektion von Kinase-Aktivitäten nach Renaturierung
• SDS-PAGE
• Blotten auf PVDF-Membran
• Renaturierung am Blot (Isoton, 2mM DTT, 0.1% NP-40)
• Kinase-Puffer mit γ 32 ATP und ev. Kinase-Target
• Autoradiographie
Zymographie: Detektion von Protease-Aktivitäten nach dem
gleichen Prinzip, der Abbau von Target-Proteinen wird
beobachtet.

Bsp. Affinitätschromatographie-2D-PAGE
Plasma depletions-Säule:
Abundante Proteine (hier: Albumin, Serotransferrin,
Haptoglobin, Antitrypsin, Ig-A, Ig-G) werden durch
Antikörper in der Säule gebunden,
andere fließen ungehindert durch. Gebundene
Proteine werden in zweitem Schritt eluiert.
Dadurch relative Anreicherung der
gering konzentrierten Proteine
Plasma control bound to column flow through