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TiHo Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover

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<strong>Tierärztliche</strong> <strong>Hochschule</strong> <strong>Hannover</strong><br />

Konzentrationen der Immunglobuline IgG1, IgG2 und IgM im peripartalen<br />

Zeitraum bei Hochleistungsmilchkühen unter Berücksichtigung der<br />

Energiebilanz sowie der Fütterung mit konjugierten Linolsäuren<br />

INAUGURAL-DISSERTATION<br />

zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin<br />

- Doctor medicinae veterinariae -<br />

(Dr. med. vet.)<br />

vorgelegt von<br />

Jana Horn<br />

Bückeburg<br />

<strong>Hannover</strong> 2013


Wissenschaftliche Betreuung:<br />

Prof. Dr. Gerhard Breves<br />

Physiologisches Institut<br />

1. Gutachter: Prof. Dr. Gerhard Breves<br />

2. Gutachter: Prof. Dr. Jürgen Rehage<br />

Tag der mündlichen Prüfung: 15.11.2013<br />

Mit freundlicher Unterstützung der H. Wilhelm Schaumann Stiftung sowie der Jutta<br />

und Georg Bruns-Stiftung


Für Mama und Papa


Inhaltsverzeichnis<br />

INHALTSVERZEICHNIS<br />

Abkürzungsverzeichnis ................................................................................................ I<br />

I. Einleitung ................................................................................................................. 1<br />

1.1 Der Stoffwechsel der Milchkuh im peripartalen Zeitraum .................................. 1<br />

1.2 Supplementierung der Futterration mit konjugierten Linolsäuren ...................... 6<br />

1.3 Das Immunsystem ............................................................................................. 7<br />

1.4 Immunglobuline des Rindes .............................................................................. 9<br />

1.4.1 Immunglobulin G ......................................................................................... 9<br />

1.4.2 Immunglobulin M ....................................................................................... 11<br />

1.5 Verhalten der Immunglobuline im peripartalen Zeitraum ................................. 12<br />

1.6 Immunisierung des neu geborenen Kalbes ..................................................... 15<br />

II. Fragestellung ........................................................................................................ 18<br />

III. Material und Methoden ........................................................................................ 19<br />

3.1 Tiere ................................................................................................................ 19<br />

3.2 Fütterung ......................................................................................................... 20<br />

3.3 Blutprobenentnahme ....................................................................................... 23<br />

3.4 Milchleistung, Milchprobenentnahme und -aufbereitung ................................. 24<br />

3.5 Bestimmung von Immunglobulin-Isotypen mittels ELISA ............................... 25<br />

3.6 ELISA zur Bestimmung des Gehaltes von IgG1, IgG2 sowie IgM im bovinen<br />

Plasma und im Kolostrum ..................................................................................... 26<br />

3.6 Statistische Auswertung .................................................................................. 29<br />

IV. Ergebnisse .......................................................................................................... 31<br />

4.1 Verlauf der Plasma-Immunglobuline im peripartalen Zeitraum ........................ 31<br />

4.1.1 Verlauf von Gesamt-IgG im Plasma .......................................................... 31<br />

4.1.2 Verlauf von IgG1 im Plasma...................................................................... 32<br />

4.1.3 Verlauf von IgG2 im Plasma...................................................................... 33


Inhaltsverzeichnis<br />

4.1.4 Verlauf von IgM im Plasma ....................................................................... 34<br />

4.2 Verlauf der Immunglobuline in Abhängigkeit der Laktationszahl .................. 35<br />

4.3 Verlauf der Immunglobuline in Abhängigkeit der Fütterung ......................... 37<br />

4.4 Energiebilanz (EB) ....................................................................................... 39<br />

4.4.1 Zusammenhang zwischen Energiebilanz und Immunglobulingehalt im<br />

Plasma ............................................................................................................... 40<br />

4.5 Milchleistung ................................................................................................ 42<br />

4.6 Transfer der Plasma-Immunglobuline ins Kolostrum.................................... 43<br />

4.7 Aufnahme kolostraler Immunglobuline durch das Kalb ................................ 47<br />

V. Diskussion ............................................................................................................ 50<br />

5.1 Immunglobulinbestimmung im Plasma ............................................................ 50<br />

5.1.1 IgG-Bestimmung im Plasma...................................................................... 51<br />

5.1.2 IgM-Bestimmung im Plasma ..................................................................... 56<br />

5.2 Abhängigkeit der Ig-Plasmakonzentrationen von der Laktationszahl .............. 60<br />

5.3 Abhängigkeit der Ig-Plasmakonzentrationen von der Fütterung ...................... 60<br />

5.4 Abhängigkeit der Ig-Plasmakonzentrationen von der Energiebilanz ............... 62<br />

5.5 Immunglobulinbestimmung im Kolostrum ........................................................ 63<br />

5.5.1 Abhängigkeit der Immunglobulinkonzentrationen von der Laktationszahl . 64<br />

5.6 Immunglobulinbestimmung im Plasma der Kälber .......................................... 66<br />

VI. Zusammenfassung .............................................................................................. 67<br />

VII. Summary ............................................................................................................ 69<br />

VIII. Literaturverzeichnis ............................................................................................... i<br />

IX. ANHANG ............................................................................................................... a<br />

Verwendete Chemikalien ........................................................................................ a<br />

Originaldaten ......................................................................................................... 71<br />

X. Danksagung ......................................................................................................... 71


Abkürzungsverzeichnis<br />

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS<br />

a.p.<br />

BHB<br />

Ca<br />

CLA<br />

Co<br />

Cu<br />

DMSO<br />

EB<br />

ECM<br />

ELISA<br />

FCM<br />

FFS<br />

FPTA<br />

H 2 SO 4<br />

I<br />

Ig<br />

IFN-<br />

IGF<br />

IL-<br />

IU<br />

ante partum<br />

β-Hydroxybutyrat<br />

Kalzium<br />

konjugierte Linolsäuren<br />

Cobald<br />

Kupfer<br />

Dimethylsulfoxid<br />

Energiebilanz<br />

energy corrected milk<br />

Enzyme linked immunosorband assay<br />

fat corrected milk<br />

freie Fettsäuren<br />

failure of passive transfer<br />

Schwefelsäure<br />

Jod<br />

Immunglobulin<br />

Interferon<br />

Insulin-like Growth Factor<br />

Interleukin<br />

international Units (internationale Einheiten)<br />

I


Abkürzungsverzeichnis<br />

kDa<br />

Lam.<br />

Mg<br />

MHC<br />

Mn<br />

mRNA<br />

Na<br />

NADPH<br />

NEB<br />

NEL<br />

n.s.<br />

OD<br />

P<br />

PBMC<br />

pIgR<br />

PGF<br />

PMN<br />

p.p.<br />

RER<br />

Se<br />

SEM<br />

sRid<br />

TGF<br />

Kilo-Dalton<br />

Lamina<br />

Magnesium<br />

major histocompatibility complex<br />

Mangan<br />

messenger RNA<br />

Natrium<br />

Nikotinamid-Adenindinukleotid-Phosphat<br />

negative Energiebilanz<br />

Netto-Energie Laktation<br />

nicht signifikant<br />

optische Dichte<br />

Phosphat<br />

periphere mononukleäre Zellen<br />

polymerischer Immunglobulinrezeptor<br />

Platelet Growth Factor<br />

polymorphkernige Monozyten<br />

post partum<br />

raues endoplasmatisches Retikulum<br />

Selen<br />

Standardfehler<br />

single radial immunodiffusion<br />

Transforming Growth Factor<br />

II


Abkürzungsverzeichnis<br />

Th-Zellen<br />

TMB<br />

TNF-<br />

T<br />

T-Helferzellen<br />

Tetramethylbenzidin<br />

Tumornekrosefaktor<br />

Trockensubstanz<br />

V. Vena<br />

Zn<br />

Zink<br />

III


Abbildungsverzeichnis<br />

Abbildungsverzeichnis<br />

Abbildung 1: Molekularstruktur von Immunglobulin G............................................... 10<br />

Abbildung 2: Molekularstruktur von Immunglobulin M .............................................. 11<br />

Abbildung 3: Transport der Immunglobuline durch die Epithelzelle .......................... 13<br />

Abbildung 4: Übersicht über die Laktationsanzahl .................................................... 19<br />

Abbildung 5: Übersicht über die Probenentnahmen ................................................. 23<br />

Abbildung 6:ELISA ................................................................................................... 26<br />

Abbildung 7: Verlauf von Plasma-Gesamt-IgG bei Milchkühen der Rasse Holstein-<br />

Friesian im peripartalen Zeitraum ............................................................................. 31<br />

Abbildung 8: Verlauf von Plasma-IgG1 bei Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian<br />

im peripartalen Zeitraum ........................................................................................... 32<br />

Abbildung 9: Verlauf von Plasma-IgG2 bei Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian<br />

im peripartalen Zeitraum ........................................................................................... 33<br />

Abbildung 10: Verlauf von Plasma-IgM bei Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian<br />

im peripartalen Zeitraum ........................................................................................... 34<br />

Abbildung 11: IgG1 im Plasma von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian in<br />

Abhängigkeit der Laktationszahl. .............................................................................. 35<br />

Abbildung 12: IgG2 im Plasma von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian in<br />

Abhängigkeit von der Laktationszahl. ....................................................................... 36<br />

Abbildung 13: IgM im Plasma von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian in<br />

Abhängigkeit von der Laktationszahl. ....................................................................... 36<br />

Abbildung 14: IgG1 im Plasma von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian in<br />

Abhängigkeit der Fütterung unter Berücksichtigung der Laktation. .......................... 37<br />

Abbildung 15: IgG2 im Plasma von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian in<br />

Abhängigkeit der Fütterung unter Berücksichtigung der Laktation. .......................... 38<br />

Abbildung 16: IgM im Plasma von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian in<br />

Abhängigkeit der Fütterung. .................................................................................... 39<br />

Abbildung 17: Verlauf der EB von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian über den<br />

gesamten Versuchszeitraum .................................................................................... 39<br />

Abbildung 18: Verlauf der EB von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian in<br />

Abhängigkeit der Laktationsnummer. ....................................................................... 40<br />

IV


Abbildungsverzeichnis<br />

Abbildung 19: Übersicht über die Korrelationen zwischen EB und<br />

Immunglobulinspiegel im Plasma von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian an<br />

Tag -7 und Tag 7 für alle untersuchten Isotypen (IgG1, IgG2 und IgM). .................. 41<br />

Abbildung 20: Verlauf der Milchleistung von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian<br />

über den Versuchszeitraum. ..................................................................................... 42<br />

Abbildung 21: Verlauf der Milchleistung von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian<br />

in Abhängigkeit der Laktationszahl. .......................................................................... 43<br />

Abbildung 22: Konzentrationen von IgG1, IgG2 und IgM im Kolostrum von<br />

Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian. ................................................................. 44<br />

Abbildung 23: Gehalt von Gesamt IgG im Kolostrum von Milchkühen der Rasse<br />

Holstein-Friesian in Abhängigkeit der Laktationszahl.. ............................................. 45<br />

Abbildung 24: Gehalt von IgG1 im Kolostrum von Milchkühen der Rasse Holstein-<br />

Friesian in Abhängigkeit von der Laktationszahl. ...................................................... 45<br />

Abbildung 25: Gehalt von IgG2 im Kolostrum von Milchkühen der Rasse Holstein-<br />

Friesian in Abhängigkeit von der Laktationszahl. ...................................................... 46<br />

Abbildung 26: Gehalt von IgM im Kolostrum von Milchkühen der Rasse Holstein-<br />

Friesian in Abhängigkeit von der Laktationszahl. ...................................................... 46<br />

Abbildung 27: IgG1-Plasmakonzentrationen von Kälbern der Rasse Holstein-Friesian<br />

................................................................................................................................. 47<br />

Abbildung 28: IgG2-Plasmakonzentrationen von Kälbern der Rasse Holstein-Friesian<br />

................................................................................................................................. 48<br />

Abbildung 29: IgM-Plasmkonzentrationen von Kälbern der Rasse Holstein-<br />

Friesian………………………………………………………………………………………49<br />

V


Tabellenverzeichnis<br />

Tabellenverzeichnis<br />

Tabelle 1: Normales und krankhaftes Lipomobilisationsgeschehen bei der Milchkuh 4<br />

Tabelle 2: Verteilung der an Mastitis erkrankten Versuchstiere innerhalb der<br />

unterschiedlichen Fütterungsgruppen....................................................................... 20<br />

Tabelle 3: Zusammensetzung der Futtermittel (%). ................................................. 21<br />

Tabelle 4: Fütterungsdesign. .................................................................................... 22<br />

Tabelle 5: Übersicht der aufgetragenen Verdünnungen ........................................... 28<br />

Tabelle 6: Vergleich zwischen Literaturdaten und eigenen Messungen der<br />

Immunglobulinspiegel im Plasma a.p. ...................................................................... 59<br />

Tabelle 7: Vergleich zwischen Literaturdaten und eigenen Messungen der<br />

Immunglobulinspiegel im Kolostrum ......................................................................... 65<br />

Tabelle 8: Durchführung ELISA .................................................................................. b<br />

Tabelle 9: Verwendete Antikörper ............................................................................... c<br />

Tabelle 10: Übersicht über verwendete Lösungen ..................................................... d<br />

Tabelle 11: Zusammensetzung der verwendeten Puffer ............................................ e<br />

Tabelle 12: Originaldaten IgG1 (Plasma).................................................................. 71<br />

Tabelle 13: Originaldaten IgG2 (Plasma).................................................................. 72<br />

Tabelle 14: Originaldaten IgM (Plasma) ................................................................... 73<br />

Tabelle 15: Originaldaten IgG1 (Plasma) und EB (Tier 1 bis 36) .............................. 74<br />

Tabelle 16: Originaldaten IgG1 (Plasma) und EB (Tier 37 bis 66) ............................ 75<br />

Tabelle 17: Originaldaten IgG2 (Plasma) und EB (Tier 1 bis 39) .............................. 76<br />

Tabelle 18: Originaldaten IgG2 (Plasma) und EB (Tier 40 bis 66) ............................ 77<br />

Tabelle 19: Originaldaten IgM (Plasma) und EB ....................................................... 78<br />

Tabelle 20: Originaldaten Kolostrum (Tier 1 bis 59) ................................................. 79<br />

Tabelle 21: Originaldaten Kolostrum (Tier 60 bis 66) ............................................... 80<br />

Tabelle 22: Originaldaten Kälber IgG1 (Plasma) ...................................................... 80<br />

Tabelle 23: Originaldaten Kälber IgG2 (Plasma) ...................................................... 81<br />

Tabelle 24: Originaldaten Plasma Kälber IgM (Plasma) ........................................... 81<br />

IV


I. Einleitung<br />

I. EINLEITUNG<br />

1.1 Der Stoffwechsel der Milchkuh im peripartalen Zeitraum<br />

Durch gezielte züchterische Ansätze sowie durch stetige Verbesserung von Haltung<br />

und Fütterung haben sich die Laktationsleistungen in der modernen Milchviehhaltung<br />

in den vergangenen fünf Jahrzehnten mehr als verdoppelt. JANINHOFF (2012) gibt<br />

in seiner Wirtschaftlichkeitsanalyse von 2009 – 2012 an, dass für eine rentable<br />

Milchwirtschaft Jahresleistungen von 8.000 bis 9.000 kg/Jahr erforderlich sind.<br />

Die Milchleistung weist während des Laktationszyklus einen charakteristischen<br />

Verlauf auf. Zu Beginn der Laktation steigt sie stark an, wobei maximale<br />

Tagesleistungen in der 7.-14. Laktationswoche erreicht werden. In dieser Zeit ist mit<br />

etwa 25 kg/Tag die maximale Trockenmasseaufnahmekapazität ausgeschöpft<br />

(BREVES u. RODEHUTSCORD 2007). Bei sehr hoher Milchleistung müsste das Tier<br />

zur Bedarfsdeckung aufgrund der begrenzten Aufnahmekapazität eine<br />

Energiekonzentration von mehr als 8 MJ Nettoenergie Laktation (NEL) aufnehmen.<br />

Diese hohen NEL-Konzentrationen können jedoch nicht erreicht werden, da über<br />

einen ausreichend hohen Anteil von Grundfutter auch die Strukturwirksamkeit und<br />

damit die Wiederkäuergerechtigkeit der Ration sichergestellt werden muss<br />

(INGVARTSEN u. ANDERSEN 2000; PETERSON et al. 2005; BREVES u.<br />

RODEHUTSCORD 2007).<br />

Neben den Grenzen der Energiedichte zeigt auch der freiwillige Verzehr im<br />

peripartalen Zeitraum charakteristische Veränderungen. PETERSON et al. (2005)<br />

konnten zeigen, dass sich in den letzten vier Wochen a.p. die<br />

Trockenmasseaufnahme um bis zu 50% reduzierte und erst zum Ende der vierten<br />

Laktationswoche eine Trockenmasseaufnahme von 22-24 kg/Tag erreicht wurde. Der<br />

Übergang von der Spätträchtigkeit zur Frühlaktation ist der Zeitpunkt der niedrigsten<br />

Trockenmasseaufnahme. In dieser Periode ist somit die Aufnahme der benötigten<br />

Energiemengen mit dem Futter nicht möglich.<br />

Folglich kommt es peripartal zur Ausprägung einer negativen Energiebilanz (NEB)<br />

mit starker Mobilisation von Körperfett.<br />

Die Auswahl der Grundfuttermittel kann bei hoher Leistung zwar noch einen Einfluss<br />

auf die NEL-Konzentration, die Energieaufnahme und damit auf das Ausmaß der<br />

1


I. Einleitung<br />

Fettmobilisierung haben, dennoch ist die Entwicklung einer negativen Energiebilanz<br />

unvermeidlich. Diese kann unter Umständen bis zu 12 Wochen andauern (BULANG<br />

et al. 2006).<br />

Der Abbau von Körpersubstanz geht unter anderem mit der Bereitstellung von<br />

Metaboliten für die Milchfettsynthese einher. Allerdings kann eine hohe Milchleistung<br />

auch bei moderater Mobilisierung von Körperreserven erzielt werden (LEE u. KIM<br />

2006; DUSKE et al. 2009; HAMMON et al. 2009; VAN DORLAND et al. 2009). Die<br />

Mechanismen, die dieser unterschiedlichen Anpassungsfähigkeit zugrunde liegen,<br />

sind zum jetzigen Zeitpunkt noch unbekannt.<br />

Der bei NEB vorliegende katabole Zustand führt zu charakteristischen<br />

Veränderungen hormoneller und chemischer Parameter. So kommt es zu einer<br />

Abnahme der Plasmakonzentrationen von Insulin, IGF-1, Leptin und Glukose und zu<br />

einer Zunahme der Plasmakonzentrationen von nicht-veresterten Fettsäuren (FFS)<br />

und β-Hydroxybutyrat (BHB) (BUTLER 2003).<br />

Gerade besonders hoch leistende Tiere befinden sich nun in einer labilen<br />

metabolischen Stoffwechsellage, die bei zusätzlichen peripartalen Belastungen wie<br />

Futterwechsel, Bewegungsmangel, Klimaschwankungen, Schwergeburten oder<br />

Vorerkrankungen (Labmagenverlagerung oder Mastitis) schnell entgleisen kann.<br />

(DIRKSEN et al. 2006). Die genannten Faktoren führen zu verminderter<br />

Futteraufnahme. Um den Energiebedarf für Erhaltung und Laktation decken zu<br />

können, muss der Organismus auf eigene Reserven zurückgreifen.<br />

Zur Energiegewinnung wird dem Intermediärstoffwechsel vermehrt Glukose<br />

entzogen. Die entstandene Hypoglykämie soll über eine vermehrte Glukoneogenese<br />

ausgeglichen werden. Dieses entzieht dem Citratzyklus jedoch Oxalactetat, das nun<br />

in der Leber als Reaktionspartner für die aus dem Fettstoffwechsel anfallenden C2-<br />

Bruchstücke fehlt. Bei einer starken Anflutung freier Fettsäuren in der Leber und<br />

damit vermehrt stattfindender β-Oxidation entstehen aus dem biologisch aktivierten<br />

C2-Bruchstück Acetyl-Coenzym A nun sehr schnell Ketonkörper. Dieses geschieht<br />

gerade in der frühen Laktation in großem Umfang. Daher besteht die Gefahr der<br />

Entwicklung einer Ketose. Der Begriff Ketose beschreibt die Akkumulation von<br />

Ketonkörpern (β-Hydroxy-Butyrat, Acetoazetat und Aceton) in den<br />

Körperflüssigkeiten. Überschreitet das Ausmaß der Bildung der Ketonkörper<br />

dasjenige von Verbrauch und Ausscheidung, kann es zu Symptomen wie<br />

Gewichtsabnahme, Milchrückgang und zu einer Beeinträchtigung der Fruchtbarkeit<br />

2


I. Einleitung<br />

kommen. Die Grenzwerte für eine subklinische Ketose liegen dabei bei 0,7 mmol*l -1<br />

BHB für trockenstehende Kühe bzw. 1,4 mmol*l -1 BHB für frisch abgekalbte Kühe<br />

(DIRKSEN et al. 2006).<br />

Der Überschuss an nicht benötigten Fettsäuren wird v.a. bei überkonditionierten<br />

Tieren in der Leber gespeichert (MCNAMARA 2000). Die Hyperlipomobilisation kann<br />

zu einer die Funktion der Leber erheblich einschränkenden Hepatosteatose führen.<br />

Sind mehr als 30 % des Lebergewebes betroffen, kommt es zu einer Verschiebung<br />

des Gleichgewichts zwischen lipostabilisierenden und damit antiautoperoxidativen<br />

Substanzen und eingelagertem Fett (DIRKSEN et al. 2006). Die Gefahr der<br />

Membranschädigungen nimmt damit zu. Da überbelastetes Lebergewebe nicht mehr<br />

ausreichend Eiweiß produziert, kommt es zu einem Mangel an Apolipoprotein,<br />

welches für die Ausschleusung resynthetisierter Triglyzeride aus der Leber benötigt<br />

wird. Dies wiederum führt zu einer zunehmenden Hepatosteatose (DIRKSEN et al.<br />

2006), die mit reduziertem Gesundheitsstatus, reduzierter Produktivität und<br />

verminderter Fruchtbarkeit in Verbindung gebracht werden kann (WENSING et al.<br />

1997).<br />

Die Inzidenz einer Hepatosteatose ist eng assoziiert mit der Inzidenz anderer<br />

metabolischer Erkrankungen, v.a. Ketose und Labmagenverlagerung. Die<br />

Akkumulation von Lipiden in der Leber führt ebenfalls zu einer stärkeren Ausprägung<br />

und Schwere infektiöser Erkrankungen wie Mastitis (HILL et al. 1985) und Metritis<br />

(HARASZTI et al. 1982). Auch fieberhafte Allgemeininfektionen können gehäuft<br />

vorkommen (DIRKSEN et al. 2006). Durch lokale Durchblutungsstörungen kommt es<br />

zur Entstehung von Klauenerkrankungen, v.a. zu Klauenrehe (ONYIRO et al. 2008;<br />

KUJALA et al. 2010). Eine herabgesetzte Kontraktionsfähigkeit der Muskulatur kann<br />

zu Wehenschwäche sowie Puerperal- und Peristaltikstörungen (STENGÄRDE et al.<br />

2012) führen.<br />

Des Weiteren werden bei Kühen, die eine ausgeprägte Fettleber besitzen,<br />

schlechtere Fruchtbarkeitsergebnisse erzielt (LÓPEZ-GATIUS et al. 2005; KAFI u.<br />

MIRZAEI 2010). Die herabgesetzte Immunität und Kontraktilität begünstigen eine<br />

gestörte Involution und Entzündungen der Gebärmutter. Außerdem führt der<br />

Energiemangel zu einem verzögerten Anlaufen der Ovaraktivität. Niedrige<br />

Konzentrationen an IGF-1, Insulin und Glukose hemmen Follikelwachstum und -<br />

reifung (MARKUSFELD 1987; STEVENSON u. CALL 1988; REIST et al. 2003;<br />

BOSSAERT et al. 2008).<br />

3


I. Einleitung<br />

Da die Leber das primäre Metabolisierungsorgan für Steroidhormone darstellt,<br />

resultiert aus der Steigerung der Leberperfusion eine erhöhte Abbaurate der<br />

Sexualsteroide, die bei unveränderter Syntheserate zu einer Abnahme der<br />

Konzentrationen an Sexualsteroiden im peripheren Plasma führt. Dies wiederum wird<br />

als Ursache einer verminderten Konzeptionsrate, einer verkürzten Oestrusdauer, des<br />

gehäuften Auftretens multipler Ovulationen und einer verminderten Eizellqualität<br />

diskutiert (WILTBANK et al. 2006).<br />

Eine Übersicht über die physiologischen und pathologischen Vorgänge innerhalb des<br />

Lipomobilisationsgeschehens gibt Tabelle 1.<br />

Tabelle 1: Normales und krankhaftes Lipomobilisationsgeschehen bei der Milchkuh (DIRKSEN et al. 2006)<br />

Normales<br />

Lipomobilisationsgeschehen<br />

überwachte, „verhaltene“ Fütterung und<br />

mäßige körperliche Bewegung während<br />

der Trockenstehzeit (< 55 Tage)<br />

Ansammlung mäßiger<br />

Körperfettreserven a.p.<br />

gesundes, ungestörtes Puerperium<br />

gute Milchleistung<br />

gute, allmählich zunehmende Fresslust<br />

Glukoneogenese ↑<br />

normale Lipomobilisationsrate<br />

leichte bis mäßige Leberverfettung<br />

(< 20 %) ohne Funktionsstörung<br />

keine/ subklinische Ketose<br />

normaler abkalbe-/laktationsbedingter<br />

Gewichtsrückgang<br />

normales Einsetzen der Brunst<br />

normale Fruchtbarkeit<br />

Zwischenkalbezeit < 370 Tage<br />

Entgleisung des Energiestoffwechsels<br />

(Lipomobilisationssyndrom)<br />

unkontrollierte, zu energiereiche<br />

Fütterung während der u.U. verlängerten<br />

Trockenstehzeit (> 60 Tage), fehlende<br />

Bewegung<br />

Entwicklung übermäßiger<br />

Körperfettreserven a.p.<br />

peripartale Belastung/ Erkrankung<br />

extrem hohe Milchleistung<br />

Appetitrückgang<br />

Glukoneogenese ↓<br />

überschießende Lipomobilisation<br />

hochgradige Verfettung der Leber<br />

(> 25 %) mit Funktionsstörung<br />

klinisch manifeste Ketose<br />

übermäßiger, auf Lipomobilisation und<br />

Eiweißfreisetzung beruhender, länger<br />

anhaltender Gewichtsrückgang<br />

verzögertes/ schwaches Einsetzen der<br />

Brunst<br />

herabgesetzte Fruchtbarkeit<br />

Zwischenkalbezeit > 380 Tage<br />

Im Gegensatz zu den leistungsbedingten Reproduktionsstörungen gibt es<br />

gegenwärtig keine fundierte Wissensgrundlage, um die Bedeutung der Milchleistung<br />

für das vermehrte Auftreten von infektiös bedingten Erkrankungen zu erklären.<br />

4


I. Einleitung<br />

Allerdings kommt es in der peripartalen Periode zu Veränderungen verschiedener<br />

immunologischer Parameter, die sowohl das angeborene wie auch das adaptive<br />

Immunsystem betreffen.<br />

MEHRZAD et al. (2002) konnten zeigen, dass bei Kühen im peripartalen Zeitraum die<br />

Anzahl an neutrophilen Granulozyten im Blut signifikant reduziert ist. Weiterhin sind<br />

die Adhäsionsfähigkeit und die Migration der Zellen in die Milchdrüse beeinträchtigt.<br />

Interessanterweise weisen diese Zellen eine erhöhte phagozytotische Aktivität auf,<br />

was auf eine verbesserte funktionelle Aktivität schließen lässt. Allerdings zeigen<br />

diese Zellen eine verminderte „respiratory burst“-Fähigkeit, was in einer verminderten<br />

Eliminierungsrate für Bakterien resultiert.<br />

Die Eigenschaften von bovinen Lymphozyten in der peripartalen Periode wurden<br />

bereits von mehreren Arbeitsgruppen untersucht. KEHRLI und GOFF (1989) konnten<br />

beim Rind eine signifikante Reduktion des Vorkommens von T-Lymphozyten im Blut<br />

beschreiben. Funktionelle Studien zeigten weiterhin einen Wechsel von einer T-<br />

Helfer(Th)-1- zu einer Th2-Antwort (KEHRLI u. GOFF 1989). Die bei der Th2-Antwort<br />

produzierten immunregulatorischen Zytokine (v.a. IL-10 und TGF-β) haben nach<br />

einer Infektion die Aufgabe, die immunologische Homöostase wieder herzustellen,<br />

um Schäden am Tier einzugrenzen.<br />

Nachfolgende Arbeiten konnten zeigen, dass einige dieser immunsuppressiven<br />

Effekte einer NEB durch zusätzliche Fütterung hoch energetischer Substrate wie<br />

leicht fermentierbarer Kohlenhydrate umgekehrt werden konnten (STABEL et al.<br />

2003; OHTSUKA et al. 2006).<br />

In einem Tierversuch, in dem jeweils 25 Milchkühe mit einerseits hohen FFS-<br />

Konzentrationen a.p. und starker Fettmobilisation p.p. und andererseits mit niedriger<br />

FFS-Konzentration a.p. und geringer Fettmobilisation p.p. gehalten wurden, konnte<br />

MÖSCH (2011) keinen Einfluss der FFS-Konzentration a.p. bzw. der Fettmobilisation<br />

nach der Geburt auf den Verlauf der Immunglobulin(Ig)G-Konzentration zwischen<br />

dem 8. Tag a.p. und dem 56. Tag p.p. zeigen. Allerdings ist ein starker Anstieg der<br />

FFS-Konzentration zwischen Tag 8 a.p. und Tag 3 p.p. mit einer erniedrigten IgG-<br />

Konzentration an Tag 3 p.p. verbunden (MÖSCH 2011). Die Autorin schloss daraus,<br />

dass eine stark erhöhte FFS-Konzentration zu Beginn der Laktation mit einer<br />

Abnahme der IgG-Konzentration korreliert. Allerdings hatten die Parameter BHB,<br />

Leptin, Rückenfettdicke und IGF-1 keinen signifikanten Einfluss auf die IgG-<br />

Konzentration (MÖSCH 2011)<br />

5


I. Einleitung<br />

1.2 Supplementierung der Futterration mit konjugierten Linolsäuren<br />

Konjugierte Linolsäuren (CLA) sind Isomere der Linolsäure, die u.a. durch mikrobielle<br />

Fermentationsprozesse im Pansen (KEPLER et al. 1966) synthetisiert werden.<br />

Aufgrund ihrer Milchfett-reduzierenden Effekte (BAUMGARD et al. 2000) werden<br />

CLA häufig in Futterrationen für Milchkühe eingemischt. Milchfett macht etwa 50%<br />

der gesamten Milchenergie aus und entspricht somit dem größten Anteil des<br />

Energieverlustes über die Milch (TYRRELL u. REID 1965). Durch eine<br />

Supplementation mit CLAs soll erreicht werden, dass durch die eingesparte Energie<br />

der Ausbildung einer negativen Energiebilanz entgegengewirkt werden kann.<br />

Grundsätzlich haben Fettsäuren die Fähigkeit, Immunantworten durch Veränderung<br />

der Phospholipidzusammensetzung der Immunzellen zu modulieren und auch<br />

nachgeschaltete Signalwege zu beeinflussen (MILES u. CALDER 1998). Die<br />

Fütterung von pflanzlichen oder tierischen Ölen mit hohem Anteil an ungesättigten<br />

Omega-3-Fettsäuren reduziert inflammatorische Reaktionen und die Produktion von<br />

Interleukin (IL)-1, IL-6 und Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) in verschiedenen Spezies<br />

(CALDER et al. 2002).<br />

Einige Studien haben bereits gezeigt, dass das bovine Immunsystem sensitiv auf<br />

Fettsäuren reagiert. So konnten LACETERA et al. (2001; 2002) sowohl beim Rind als<br />

auch beim Schaf zeigen, dass hohe Konzentrationen an FFS im Blut oder hohe<br />

Konzentrationen der selben Fettsäuren (Palmitat, Palmitoleat, Stearat, Oleat und<br />

Linoleat) im Kulturmedium mit einer Beeinträchtigung der Lymphozytenantwort auf<br />

Mitogene einhergehen. Der Anstieg der FFS im Blut als Konsequenz der<br />

Lipomobilisation könnte somit ein möglicher Grund für die in der Frühlaktation<br />

bestehende unzureichende Effektivität des Immunsystems während einer negativen<br />

Energiebilanz sein (KEHRLI et al. 2006). Weiterhin konnten THANASAK et al. (2005)<br />

in einer in vitro-Studie zeigen, dass bovine periphere Blutmonozyten (PBMC) in der<br />

Anwesenheit von mehrfach ungesättigten Fettsäuren funktionell beeinträchtigt<br />

werden.<br />

Aufgrund dieser Befunde sind die Auswirkungen einer Fettsäure-supplementierten<br />

Fütterung auf die Immunglobulinfraktionen besonders interessant und sollen in der<br />

vorliegenden Studie untersucht werden.<br />

6


I. Einleitung<br />

1.3 Das Immunsystem<br />

Das Immunsystem besteht aus einer Vielzahl von Zellen und Molekülen, die in der<br />

Lage sind, fremde, in den Organismus eindringende Mikroorganismen zu erkennen<br />

und zu eliminieren. In der Literatur unterscheidet man dabei die angeborene<br />

(unspezifische) Immunität von der erworbenen (spezifischen) Immunität. Rein<br />

funktionell ist diese Unterscheidung allerdings nicht möglich, da beide Systeme eng<br />

zusammenarbeiten.<br />

Das angeborene oder unspezifische Immunsystem ist schnell aktivierbar und dient im<br />

frühen Stadium einer Infektion als primäre Immunabwehr. Die unspezifische Abwehr<br />

wird von Phagozyten wie z.B. polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMN)<br />

und Makrophagen gebildet (RAINARD u. RIOLLET 2006).<br />

Makrophagen erkennen, phagozytieren und eliminieren unspezifische<br />

Fremdpathogene. Sie produzieren Zytokine wie IL-1β, IL-6 und TNF-α. Weiterhin<br />

sind sie in der Lage, über den Major Histocompatibility Complex (MHC) Klasse II-<br />

Rezeptor Antigen zu präsentieren und bilden so die Verbindung zwischen<br />

angeborenem und spezifischem Immunsystem (RAINARD u. RIOLLET 2006).<br />

Nach der Einleitung der inflammatorischen Antwort sind die vorherrschenden Zellen<br />

am Infektionsherd v.a. PMN. Die Migration dieser Zellen aus dem Blut zum Ort der<br />

Entzündung wird als Chemotaxis bezeichnet (SURIYASATHAPORN et al. 1999).<br />

Am Entzündungsherd angekommen, phagozytieren sowohl PMN als auch ansässige<br />

Makrophagen eindringende Mikroorganismen und töten sie ab (PAAPE et al. 1991).<br />

Sobald ein Mikroorganismus phagozytiert ist, kommt es in aktivierten Makrophagen<br />

durch die Aktivierung einer NADPH-abhängigen Oxidase zum so genannten<br />

respiratory burst. Die Oxidase katalysiert die Reduktion von Sauerstoff zu einem<br />

hoch reaktiven Sauerstoff-Radikal, das für die aufgenommenen Bakterien hoch<br />

toxisch ist. Nach dem respiratory burst werden die aufgenommenen Bestandteile des<br />

Mikroorganismus über Exozytose ausgeschieden.<br />

Die spezifische Immunität besteht aus Antikörpern, Makrophagen (Antigenpräsentierenden<br />

Zellen) sowie B- und T-Lymphozyten, die spezifische<br />

Mikroorganismen erkennen (SORDILLO et al. 1997). Sie wird bei einer länger<br />

bestehenden oder persistierenden Infektion aktiviert.<br />

T-Zellen können in T-Helferzellen und zytotoxische T-Zellen eingeteilt werden. T-<br />

Helferzellen produzieren Zytokine wie IL-2 und Interferon (IFN)-γ, die für eine<br />

7


I. Einleitung<br />

effektive zellvermittelte Immunantwort entscheidend sind. Zytotoxische T-Zellen<br />

erkennen und eliminieren mit Antigen infizierte Zellen sowie alte oder beschädigte<br />

Immunzellen.<br />

Die B-Lymphozyten differenzieren sich zu Plasmazellen, die Antikörper<br />

(Immunglobuline) wie IgG1, IgG2 oder IgM produzieren oder als Gedächtniszellen<br />

fungieren (SORDILLO et al. 1997).<br />

Sowohl die angeborene als auch die spezifische Immunabwehr haben eine<br />

umfassende Mechanismendiversität. Ihre Interaktion ermöglicht dem Organismus,<br />

zwischen Eigen- und Fremdmolekülen zu unterscheiden.<br />

8


I. Einleitung<br />

1.4 Immunglobuline des Rindes<br />

1.4.1 Immunglobulin G<br />

IgG bildet mit 70-75 % des Gesamtimmunglobulins die im Serum hauptsächlich<br />

vorkommende Immunglobulinklasse und spielt aus diesem Grund eine Hauptrolle in<br />

der Antikörper-vermittelten Immunantwort. Es wird von Plasmazellen in der Niere,<br />

den Lymphknoten und dem Knochenmark produziert und sezerniert.<br />

IgG hat ein Molekulargewicht von 180 kDa und besteht aus zwei identischen leichten<br />

Ketten und zwei identischen schweren γ- Ketten. Durch ihre Anordnung zueinander<br />

entsteht die für Antikörper-Monomere typische Y-Struktur (Abbildung 1) (BUTLER<br />

1983; TIZARD 2004).<br />

Da es das kleinste der Immunglobulinmoleküle ist, kann IgG am leichtesten aus den<br />

Blutgefäßen in das umliegende Gewebe austreten. Dies spielt v.a. im entzündeten<br />

Gewebe bei erhöhter Gefäßpermeabilität eine wichtige Rolle (BUTLER et al. 1972a,<br />

1972b; BUTLER 1983).<br />

IgG bindet z.B. auf Bakterienoberflächen an spezifische Antigene. Die Anwesenheit<br />

der Antikörper auf der Bakterienoberfläche führt zur Agglutination und zur<br />

Opsonierung der Bakterien (CURTAIN et al. 1970).<br />

Man unterscheidet drei Subklassen bovinen IgGs: IgG1, IgG2 und IgG3. Die<br />

konstanten Domänen der Subklassen weisen eine 95%ige Homologie ihrer<br />

Aminosäuresequenzen auf. Die größten Unterschiede kommen dabei in der Hinge-<br />

Region vor. Die Hinge-Region ist der Teil des Moleküls, der die schweren Ketten<br />

über Disulfidbrücken miteinander verbindet und somit die Flexibilität und<br />

Beweglichkeit des gesamten Moleküls bestimmt.<br />

So weist IgG1 im Gegensatz zu IgG2 eine sehr flexible Hinge-Region auf, die aus<br />

216 – 231 Aminosäuren besteht. Die Fab-Fragmente, d.h. die „Arme“ des y-förmigen<br />

Moleküls, können um ihre Symmetrieachse rotieren.<br />

Die Hinge-Region des IgG2-Moleküls besteht aus nur 12 Aminosäuren und vier<br />

Disulfidbrücken und weist somit eine beschränkte Flexibilität auf (TIZARD 2004).<br />

Der unterschiedliche Aufbau der Immunglobulinsubklassen führt zu Unterschieden in<br />

Effektorfunktionen wie Komplementaktivierung und Fc-Rezeptor-Bindung. Die<br />

Subklassen weisen ebenso unterschiedliche biologische Aktivitäten auf.<br />

9


I. Einleitung<br />

IgG1 ist das vorherrschende Immunglobulin in mukösen Sekreten des Rindes<br />

(CURTAIN et al. 1970) und ist sowohl im Kolostrum als auch im Speichel des Rindes<br />

konzentriert. Radioaktive Markerstudien (CURTAIN et al. 1970) haben gezeigt, dass<br />

der größere Anteil dieses Immunglobulins nicht aus dem Plasma stammt, sondern<br />

lokal synthetisiert wird. Immunfluoreszenzstudien weisen darauf hin, dass IgG1 von<br />

lymphoiden Zellen produziert wird, die in der Lam. propria und der Basis der Mikrovilli<br />

in der Schleimhaut des Darm-, des Atem- und Genitaltrakts nachgewiesen werden<br />

konnten. Zusätzlich gibt es einen selektiven Transportmechanismus für IgG1 aus<br />

dem Plasma. Im Gegensatz dazu stammt der größte Anteil des IgG2 in den mukösen<br />

Sekreten aus dem Plasmapool.<br />

Einen weiteren Hinweis auf den selektiven Transport von IgG1 im Vergleich zu IgG2<br />

konnten CURTAIN et al. (1970) in einer Studie mit radioaktiv markierten Antikörpern<br />

liefern. Dort konnte gezeigt werden, dass der Transport und die initiale Eliminierung<br />

von IgG1 in vaginale Sekrete viel schneller verlief als der von IgG2.<br />

Abbildung 1: Molekularstruktur von Immunglobulin G<br />

10


I. Einleitung<br />

1.4.2 Immunglobulin M<br />

IgM wird von Plasmazellen in der Niere, in den Lymphknoten und im Knochenmark<br />

produziert. Es ist mit 5-15% des Gesamtimmunglobulins das am zweithöchsten<br />

konzentrierte Immunglobulin im Blut.<br />

Im Organismus kommt IgM in zwei unterschiedlichen Formen vor: als Monomer, als<br />

Teil des B-Zell-Rezeptors an die Zelloberfläche von B-Lymphozyten gekoppelt, sowie<br />

als im Serum lösliches Pemtamer. Letzteres stellt bei der Konfrontation mit einem<br />

Antigen den vorherrschenden Immunglobulinisotyp der Primärantwort dar. Zwar<br />

spielt IgM auch bei der sekundären Immunantwort eine Rolle, wird aber durch die<br />

dort vorherrschende Dominanz des IgG maskiert (TIZARD 2004).<br />

Das membranale IgM ist ein 180 kDa schweres Immunglobulin-Monomer, welches<br />

auf der B-Zell-Oberfläche als Antigenrezeptor fungiert.<br />

Das sekretorische IgM besteht aus fünf strukturell konventionell aufgebauten 180<br />

kDa-Untereinheiten, die durch Disulfidbrücken in einer zirkulatorischen Form<br />

verbunden sind (Abbildung 2). Das absolute Molekulargewicht der sekretorischen<br />

Form beträgt 900 kDa. Ein kleines Polypeptid, die J-(joining)Kette (15 kDa), verbindet<br />

zwei der Einheiten, um den Kreis zu vervollständigen (BUTLER 1983; TIZARD 2004).<br />

Obwohl nur in geringeren Konzentrationen sezerniert, ist IgM effizienter als IgG, was<br />

Komplementaktivierung, Opsonierung, Virusneutralisation und Agglutination angeht.<br />

Aufgrund ihrer Größe können IgM-Pentamere auch bei akuten Entzündungen i.d.R.<br />

nicht ins Gewebe übertreten (TIZARD 2004).<br />

Abbildung 2: Molekularstruktur von Immunglobulin M<br />

11


I. Einleitung<br />

1.5 Verhalten der Immunglobuline im peripartalen Zeitraum<br />

In den letzten vier bis acht Wochen vor der Abkalbung kommt es beim Rind unter<br />

dem hormonellen Einfluss von Östrogen und Progesteron zu einem starken Abfall<br />

der Serumkonzentrationen von IgG und IgM. Die niedrigsten Serumspiegel werden<br />

dabei um den Geburtszeitpunkt herum erreicht (DETILLEUX et al. 1995; FRANKLIN<br />

et al. 2005). Etwa vier Wochen p.p. sind die Serumkonzentrationen von IgG1 wieder<br />

so hoch wie etwa fünf Wochen a.p., während die IgM-Konzentrationen zunächst<br />

niedrig bleiben. Diese Beobachtung spricht dafür, dass der erhöhte Transfer von<br />

IgG1 ins Euter so lange erhalten bleibt, bis die Serumkonzentrationen wieder im<br />

Normbereich liegen (SASAKI et al. 1976).<br />

Das Ausmaß der IgG-Reduktion scheint laut HERR et al. (2011) von der initialen IgG-<br />

Konzentration beim Trockenstellen abhängig zu sein. Im Gegensatz zu IgM ist das<br />

Ausmaß der IgG-Reduktion mit der IgG-Konzentration im Kolostrum korreliert.<br />

BRANDON et al. (1971) zeigten, dass sich die Konzentrationen von IgG2 nicht<br />

signifikant verändern, während DETILLEUX et al. (1995) beobachten konnten, dass<br />

es um den Abkalbezeitpunkt zu einem Anstieg der IgG2-Konzentration im Serum<br />

kommt.<br />

Die Konzentration von IgG1 im Kolostrum ist zu Beginn der Sekretbildung etwa 11-<br />

fach höher als die von IgG2 und erreicht ihr Maximum etwa zwei Wochen a.p. Nach<br />

der Geburt fällt die Konzentration von IgG1 in der Milch stark ab und ist etwa vier<br />

Wochen p.p. nur noch vier bis fünf Mal höher als die IgG2-Konzentration (BRANDON<br />

et al. 1971). Der schnelle Anstieg der IgG1-Konzentrationen im Serum am Ende der<br />

aktiven Kolostrumbildung spricht für eine sehr hohe Syntheserate von IgG1.<br />

BUTLER et al. (1972a; 1972b) konnten zum Zeitpunkt der Abkalbung einen Abfall<br />

der IgG1-Konzentrationen im Kolostrum und p.p. einen Anstieg dieses Proteins im<br />

Serum nachweisen. Diese Ergebnisse unterstützen die Vermutung, dass es zu einer<br />

Abnahme des selektiven Transports ins Euter kommt. Bei Eintritt der Milchproduktion<br />

kommt es zu einer Verdünnung der Immunglobulinkonzentrationen im Milchserum.<br />

Veränderungen im Verhältnis von IgG1 zu Gesamtprotein in Serum und Milch<br />

suggerieren, dass es zu einer Reduktion der selektiven Transportmechanismen<br />

kommt (BUTLER et al. 1972a; BUTLER et al. 1972b).<br />

Anders als bei IgG1 kommt es sowohl bei IgG2 als auch bei IgM im peripartalen<br />

Zeitraum im Serum und auch im Kolostrum nicht zu signifikanten Veränderungen der<br />

12


I. Einleitung<br />

Konzentrationen. Dennoch ist die Konzentration von IgM im Kolostrum etwa 2-7 Mal<br />

höher als vergleichbare Werte im Serum (BRANDON et al. 1971). Diese höheren<br />

Konzentrationen könnten, wie bereits beim Schaf beschrieben (LEE u. LASCELLES<br />

1970; MCDOWELL u. LASCELLES 1970) mit einer lokalen Synthese durch<br />

Plasmazellen zusammenhängen. Ebenfalls wäre für IgM ein selektiver<br />

Transportmechanismus durch das Drüsenepithel denkbar. Obwohl die<br />

Konzentrationen von IgG1 und IgG2 im Serum von Kühen etwa gleich hoch sind, ist<br />

IgG1 das vorherrschende Immunglobulin im bovinen Kolostrum. Es entstammt dem<br />

zirkulierenden IgG1-Pool des Serums und wird während der Kolostrumbildung zu<br />

einem Großteil über die Alveolarepithelzellen der Milchdrüse ins Kolostrum<br />

transportiert (BUTLER 1983). Bei diesem Mechanismus handelt es sich um einen<br />

aktiven und Rezeptor-vermittelten, selektiven Transport der Immunglobuline mittels<br />

zytoplasmatischer Vesikel (Abbildung 3) (BRANDTZAEG 1981).<br />

basolateral<br />

luminal<br />

Abbildung 3: Transport der Immunglobuline durch die Epithelzelle; • sekretorische Komponente<br />

13


I. Einleitung<br />

BARRINGTON et al. (1997) konnten immunhistochemisch spezifische Anfärbungen<br />

für bovines IgG1 sowohl in Alveolarepithelien von hochtragenden Kühen als auch in<br />

Kolostrum-produzierendem Gewebe nachweisen. Studien von SASAKI et al. (1976)<br />

zeigten, dass die Menge der transportierten Immunglobuline etwa vier bis sechs<br />

Wochen a.p. zunimmt, so dass das Maximum der Transportkapazität kurz vor oder<br />

zum Zeitpunkt der Geburt erreicht wird.<br />

Dieser rapide Anstieg, v.a. von IgG1, ist von einer reduzierten Plasmakonzentration<br />

und einer verkürzten Lebensspanne der Immunglobuline begleitet und bezeichnet<br />

nicht nur eine akut erhöhte Syntheserate, sondern auch einen Transfer dieses<br />

Proteins aus Immunglobulinspeichern wie Milz und Lymphknoten in das periphere<br />

Blut (SASAKI et al. 1976).<br />

Nach der Abkalbung nimmt die Transportrate rapide ab und ist während der Laktation<br />

und in der frühen Trockenstehphase nur minimal (BLAKEMORE u. GARNER 1956;<br />

MACKENZIE u. LASCELLES 1968). Der Transportmechanismus bleibt jedoch in<br />

allen Phasen der Laktation funktionsfähig. Vermutlich besitzen die Alveolarepithelien<br />

zwei unterschiedliche Typen von IgG1-Rezeptoren: Rezeptoren mit niedriger Affinität,<br />

die während der Laktation ausgebildet werden und solche mit höherer Affinität, die<br />

etwa eine Woche a.p. erscheinen (SASAKI et al. 1976).<br />

LARSON et al. (1980) schlossen daraus, dass der erhöhte Immunglobulintransfer<br />

nicht durch den Vorgang des Trockenstellens der Kuh, sondern durch die<br />

herannahende Geburt eingeleitet wird. Dabei weist die Menge an Östrogen, das bei<br />

tragenden Kühen mit dem Urin ausgeschieden wird, einen engen Zusammenhang<br />

zur Transportkapazität der sekretorischen Epithelzellen für IgG1 auf.<br />

SMITH et al. (1971) konnten in einer Studie an nicht laktierenden, nicht tragenden<br />

Rindern zeigen, dass eine Applikation von Östrogen und Progesteron über sieben<br />

Tage zu einer Bildung von Sekret führt, dass in seiner Zusammensetzung dem<br />

physiologischen bovinen Kolostrum entspricht. Die Verschiebung von Serumprotein<br />

in die Milchdrüse scheint, verglichen mit IgG2 oder Serumalbumin, selektiv für IgG1<br />

zu sein. Die Menge an IgG2 blieb unbeeinflusst von der Hormonapplikation und war<br />

im Vergleich zu IgG1 immer niedrig. KACSKOVICS et al. (2000) konnten bei Kühen<br />

ein Protein nachweisen, das als IgG-Fc-Rezeptor fungiert. Dieses Protein scheint für<br />

die Akkumulation von IgG und den selektiven und aktiven Transport aus dem Serum<br />

in das Lumen des Euters verantwortlich zu sein.<br />

14


I. Einleitung<br />

Die bovine Milchdrüse sezerniert in allen Phasen der Laktation selektiv Serum-γ-<br />

Globuline (IgG). Dieses findet jedoch verstärkt in der Phase der Kolostrumbildung<br />

statt, wenn die kolostralen IgG-Werte die des Serums um das bis zu Fünffache<br />

überschreiten (SASAKI et al. 1976). Dagegen gibt es kaum Unterschiede zwischen<br />

IgM in Kolostrum und Serum.<br />

Die Tatsache, dass der selektive Transport von IgG1 einer hormonellen Kontrolle zu<br />

unterliegen scheint, führt zu der Annahme, dass IgG1 nur eine kleine Rolle beim<br />

Schutz der Milchdrüse vor Infektionen spielt. MACKENZIE und LASCELLES (1968)<br />

zeigten, dass beim Schaf eine Infektion oder akute Entzündung den selektiven<br />

Transport von IgG1 in die Milchdrüse hemmt.<br />

1.6 Immunisierung des neu geborenen Kalbes<br />

Im Gegensatz zu anderen Säugetieren, bei denen Immunglobuline bereits<br />

diaplazentar von der Mutter auf den Fetus übertragen werden und somit für einen<br />

passiven Schutz des Neugeborenen zum Zeitpunkt der Geburt sorgen, lässt die<br />

Plazenta epitheliochorialis des Rindes eine diaplazentare Aufnahme maternaler<br />

Antikörper nicht zu (BRAMBELL 1966; BUSH u. STALEY 1980). Kälber werden also<br />

nahezu ohne passiven Immunschutz geboren und sind daher nach der Geburt auf<br />

eine möglichst zeitnahe und ausreichende Aufnahme von Antikörpern aus dem<br />

Kolostrum angewiesen, um einen ersten spezifischen Schutz gegen Infektionserreger<br />

zu erhalten (ERHARD et al. 1999).<br />

Sowohl KLAUS (1969) als auch PIERCE (1955) konnten zeigen, dass Kälber bei der<br />

Geburt nicht vollständig agammaglobulinämisch sind, sondern bereits geringe<br />

Konzentrationen von IgG und IgM im Serum nachgewiesen werden können.<br />

Eventuell werden diese Mengen vom bovinen Fetus selbst synthetisiert, so wie es<br />

bereits beim Menschen (VAN FURTH et al. 1965) und auch bei Ratten und Hühnern<br />

(READE et al. 1965) beschrieben wurde. Es kann davon ausgegangen werden, dass<br />

die Bildung dieser Immunglobuline durch Antigenstimulierung des Fetus während der<br />

Trächtigkeit induziert wird. Es ist bekannt, dass bovine Feten bereits pränatal auf<br />

spezifische Pathogene mit einer Immunantwort reagieren (KOBAYASHI u. TIZARD<br />

1976).<br />

Nach der Kolostrumaufnahme bis zur 12. Stunde p.p. steigen die IgG- und IgM-<br />

Spiegel beträchtlich an. Dabei ist die Korrelation zwischen den IgG- und IgM-<br />

15


I. Einleitung<br />

Konzentrationen im Serum 24 Stunden p.p. und dem IgG- bzw. IgM-Gehalt im<br />

Kolostrum hoch signifikant (BENDER u. BOSTEDT 2009).<br />

Die Absorption kolostraler Immunglobuline aus dem Gastrointestinaltrakt (v.a.<br />

Jejunum und Ileum) neugeborener Kälber ist ein unselektiver Prozess. IgG und IgM<br />

werden i.d.R. gleichwertig gut aufgenommen. PIERCE und FEINSTEIN (1965)<br />

kamen zu dem Schluss, dass der Intestinaltrakt des neugeborenen Kalbes<br />

verschiedene Proteine mehr oder weniger wahllos absorbiert. Das neugeborene Kalb<br />

ist in der Lage, aufgrund der niedrigen proteolytischen Aktivität seines Darminhaltes<br />

und des Vorkommens von Trypsininhibitoren im Kolostrum die aufgenommenen<br />

Immunglobuline unzerstört zu absorbieren.<br />

Die Absorption wird durch einen pinozytischen Mechanismus der Mukosazellen vom<br />

fetalen Typ ermöglicht. Diese Zellen werden nach und nach durch ausgereifte Zellen<br />

ersetzt, die die Fähigkeit der pinozytischen Absorption verloren haben (SMEATON u.<br />

SIMPSON-MORGAN 1985).<br />

BUSH und STALEY (1980) zeigten, dass der Prozess, aufgrund dessen das<br />

Darmepithel seine Permeabilität für die Antikörper verliert („gut closure“; CLOVER u.<br />

ZARKOWER (1980)), etwa 12 Std. p.p. eingeleitet und durchschnittlich 24 Std. p.p.<br />

abgeschlossen ist. Danach ist der passive Transfer von Antikörpern nahezu<br />

unmöglich. Die Abnahme der Absorptionsfähigkeit der intestinalen Mukosa tritt<br />

schrittweise auf und variiert für die unterschiedlichen Isotypen in ihrer<br />

Geschwindigkeit. Nach KIM und SCHMIDT (1983) tritt der Schluss der<br />

Darmschranke für IgM erheblich früher ein als für IgG. Außerdem bleibt IgM aufgrund<br />

seiner Größe länger zwischen den Mikrovilli im intestinalen Lumen hängen und wird<br />

somit erst mit einiger Verspätung resorbiert.<br />

Eine ungenügende Kolostrum- und somit auch Immunglobulinaufnahme führt zu<br />

einer erhöhten Morbiditäts- und Mortalitätsrate, verursacht durch klassische<br />

Kälbererkrankungen wie Septikämie, Diarrhoe, Pneumonie und Omphalophlebitis<br />

(MCGUIRE et al. 1976; REA et al. 1996).<br />

In diesem Zusammenhang hat sich in der englischsprachigen Literatur der Begriff<br />

des „Failures of passive tranfer of antibodies (FPTA)“ durchgesetzt (GAY et al. 1983;<br />

BESSER u. GAY 1994). Gründe für einen unzureichenden Transfer von<br />

Immunglobulinen können in Mängeln bei der Geburtsüberwachung, einem<br />

schlechten Gesundheitszustand der Muttertiere und bei den Neugeborenen selbst<br />

liegen (Unreife, intestinale Malabsorption) (VOGELS et al. 2013). Untersuchungen<br />

16


I. Einleitung<br />

von McGUIRE et al. (1976) konnten zeigen, dass bei 69 % der in der ersten<br />

Lebenswoche verendeten Kälber ein Immundefizit vorliegt. Ebenso weisen nach REA<br />

et al. (1996) IgG-defiziente Kälber ein höheres Sterblichkeitsrisiko auf.<br />

Mit zunehmendem Abbau der maternalen Antikörper muss das Kalb nach<br />

entsprechendem Antigenkontakt mit der Eigensynthese von spezifischen Antikörpern<br />

beginnen. Die aktive eigene Immunität ersetzt somit den schwindenden passiven<br />

maternalen Immunschutz.<br />

Nach Untersuchungen von WITTUM und PERINO (1995) und PERINO (1995) gilt ein<br />

Serum IgG-Gehalt von 16 mg*ml -1 24 Std. nach der Geburt als ausreichend. Unter<br />

der Voraussetzung, dass das neugeborene Kalb innerhalb der ersten 12 – 15<br />

Lebensstunden zwei Kolostrumgaben von jeweils 2 l erhält, gilt ein Kolostrumgehalt<br />

von IgG von mindestens 50 mg*ml -1 als notwendig für die Ausbildung eines<br />

effizienten Immunschutzes (GUY et al. 1994; ARTHINGTON et al. 1997).<br />

17


II. Fragestellung<br />

II. FRAGESTELLUNG<br />

Der peripartale Zeitraum ist für die Hochleitungsmilchkuh ein sehr sensibler<br />

Abschnitt, in dem das Tier hohen Belastungen ausgesetzt ist. Stoffwechselstörungen<br />

und Erkrankungen in diesem Zeitraum können sich auf die gesamte Laktation, die<br />

darauf folgende erneute Konzeption und damit auf die Nutzungsdauer des<br />

Einzeltieres negativ auswirken.<br />

HERR (2009) untersuchte bereits den Verlauf der Immunglobuline G und M im<br />

Plasma von Kühen in einem Zeitraum acht Wochen a.p. bis vier Wochen p.p. unter<br />

Berücksichtigung des Geburtsablaufs. Allerdings enthielt diese Studie keine<br />

Unterscheidung der einzelnen Immunglobulin-Isotypen. Weiterhin wurden keine<br />

Korrelationen zwischen der Ausprägung einer negativen Energiebilanz und dem<br />

Verlauf der Immunglobulintiter berechnet.<br />

Diese Studie soll daher im Hinblick auf die Auswirkungen der negativen<br />

Energiebilanz auf die Antikörperspiegel von IgG1 und IgG2 sowie IgM im Plasma und<br />

im Kolostrum bzw. der Milch des Muttertieres neue Erkenntnisse liefern.<br />

Außerdem soll anhand von Serumproben der Kälber die Übertragung der kolostralen<br />

Antikörper nachvollzogen werden.<br />

Da in dem Versuchsvorhaben täglich Futteraufnahme und Leistung des Einzeltieres<br />

erfasst wurde, konnte die Energiebilanz berechnet werden. Es sollte daher überprüft<br />

werden, ob ein kausaler Zusammenhang zwischen einer ausgeprägten negativen<br />

Energiebilanz und einem erhöhten Abfall der Immunglobulintiter hergestellt werden<br />

kann.<br />

Weiterhin wurde ein Teil der Probanden mit einer Linolsäure-supplementierten Diät<br />

gefüttert. Die Auswirkung einer Fütterung von ungesättigten Fettsäuren auf<br />

Immunzellen wurde bereits von verschiedenen Arbeitsgruppen untersucht<br />

(LACETERA et al. 2002; LACETERA et al. 2004b; LACETERA et al. 2004a;<br />

THANASAK et al. 2005; LACETERA et al. 2007). Die Auswirkung einer Fettsäuresupplementierten<br />

Fütterung auf die einzelnen Immunglobulinfraktionen scheint<br />

gerade in Hinblick auf die Ergebnisse der vorangegangenen Studien auf Zellebene<br />

besonders interessant und soll in der vorliegenden Studie ebenfalls untersucht<br />

werden.<br />

18


Tierzahl<br />

III. Material und Methoden<br />

III. MATERIAL UND METHODEN<br />

3.1 Tiere<br />

Das Tierkollektiv für die vorgelegte Untersuchung umfasste insgesamt 63 Rinder der<br />

Rasse Deutsche Schwarzbunte, die im Institut für Tierernährung des Friedrich-<br />

Löffler-Institutes in Braunschweig gehalten wurden. Das Alter der Tiere betrug<br />

durchschnittlich 3,5 ± 1,5 Jahre (2 bis 9 Jahre). Die durchschnittliche Laktationszahl<br />

der Versuchstiere betrug 2,3 ± 1,2 Laktationen. Die Auswahl, Haltung und Fütterung<br />

der Tiere sowie das Schema zur Probenentnahme ist im Detail bei Petzold et al.<br />

(2013) beschrieben.<br />

Nach der Laktationszahl verteilten sich die untersuchten Tiere wie folgt:<br />

25<br />

20<br />

15<br />

10<br />

5<br />

0<br />

1. 2. 3. 4. 5. 7.<br />

Anzahl der Laktationen<br />

Abbildung 4: Übersicht über die Laktationsanzahl<br />

Die Gruppeneinteilung erfolgte anhand der Parameter Milchleistung in der<br />

vorausgegangenen Laktation, Lebendmasse und Laktationsnummer. Hierbei wurde<br />

auf eine gleichmäßige Verteilung der Versuchstiere nach BCS, Lebensmasse und<br />

Erstlaktation in allen Gruppen geachtet.<br />

Von den Versuchstieren erkrankten sieben Tiere postpartal an Ketose, fünf an<br />

Milchfieber und 28 an Mastitis, davon zwölf mehrfach. Dabei stammten 75% der an<br />

Mastitis erkrankten Tiere aus den CLA-Gruppen. Die Tiere wurden dem jeweiligen<br />

19


III. Material und Methoden<br />

Krankheitsbild entsprechend behandelt. Bei der Darstellung der<br />

Immunglobulingehalte im maternalen Plasma als Funktion der Zeit wurde überprüft,<br />

ob durch Proben der Tiere mit Mastitis diese Zeitverläufe beeinflusst wurden. Da<br />

diese Effekte statistisch nicht nachzuweisen waren, wurde auf die Elimination der<br />

Proben von erkrankten Tieren verzichtet. Eine Tötung aufgrund vorangegangener<br />

Krankheit erfolgte bei fünf Tieren, von denen jeweils eines aufgrund von Milchfieber,<br />

Mastitis und Fremdkörpererkrankung euthanasiert wurde und zwei aufgrund von<br />

Mastitis zur Schlachtung freigegeben wurden.<br />

Tabelle 2: Verteilung der an Mastitis erkrankten Versuchstiere innerhalb der unterschiedlichen<br />

Fütterungsgruppen.<br />

Mastitis<br />

Rezidivierende Mastitiden<br />

CLA-20 7 4<br />

CLA-60 5 4<br />

KON-20 3 2<br />

KON-60 - 2<br />

Die Geburtsverläufe verliefen über den gesamten Versuchszeitraum ohne besondere<br />

Schwierigkeiten. Insgesamt wurden 28 männliche und 34 weibliche Kälber geboren.<br />

Ein Kalb kam als Totgeburt zur Welt. Nach der Abkalbung verblieben die Kälber für<br />

16 bis 24 Stunden bei ihren Muttertieren und hatten während dieser Zeit die<br />

Möglichkeit, Kolostrum ad libitum aufzunehmen. Die genaue Menge an<br />

aufgenommenem Kolostrum konnte nicht dokumentiert werden. Nachdem die Kälber<br />

von ihren Muttertieren getrennt wurden, wurden sie mit handelsüblichem<br />

Milchaustauscher versorgt.<br />

3.2 Fütterung<br />

Die Versorgung der Tiere mit Energie und Nährstoffen wurden entsprechend der<br />

Empfehlungen der GfE (2001) vorgenommen. Alle Tiere erhielten eine Mischration,<br />

die im Versuchsverlauf aus variierenden Anteilen Kraftfutter (Grundmischung) und<br />

20


III. Material und Methoden<br />

Silage (60% Mais- und 40% Grassilage auf Trockenmassebasis) zusammengesetzt<br />

wurde. Diese Mischration wurde ad libitum angeboten.<br />

Tabelle 3: Zusammensetzung der Futtermittel (%). CLA: konjugierte Linolsäuren, TMR trocken: totale Mischration<br />

für trocken stehende Kühe, TMR Lak: totale Mischration für laktierende Kühe<br />

Futtermittel<br />

Kontrolle<br />

(Silafat®)<br />

CLA (Lutrell®<br />

Pure)<br />

TMR<br />

trocken<br />

TMR Lak<br />

Rapsextraktionsschrot 20 20 20 20<br />

Weizen 41 41 41 41<br />

Sojaextraktionsschrot 6,5 6,5 6,5 6,5<br />

Trockenschnitzel 25,5 25,5 30,5 30,3<br />

Mineralfuttermischung<br />

BASU 3800<br />

Mineralfuttermischung<br />

BASU 243401<br />

2 2 2 -<br />

- - - 2<br />

Futterkalk - - - 0,2<br />

CLA-Gemisch<br />

(Luta CLA 20 P)<br />

Fettmischung<br />

(Grasso Sila Fat 2)<br />

- 5,0 - -<br />

5,0 - - -<br />

Die Mineralfuttermischung für trocken stehende Kühe enthielt 60 g Ca, 105 g Na, 80<br />

g P, 50 g Mg, 7000 mg Zn, 4800 mg Mn, 1250 mg Cu, 100 mg I, 40 mg Se, 30 mg<br />

Co, 800.000 IU Vitamin A, 100.000 IU Vitamin D 3 und 1.500 mg Vitamin E pro kg. Mit<br />

Beginn der Laktation bekamen die Tiere ein Mineralfutter mit 140 g Ca, 120 g Na, 70<br />

g P, 40 g Mg, 6.000 mg Zn, 5.400 mg Mn, 1.000 mg Cu, 100 mg I, 40 mg Se, 25 mg<br />

Co, 1.000.000 IU Vitamin A, 100.000 IU Vitamin D 3 und 1.500 mg Vitamin E pro kg.<br />

Zusätzlich erhielten die Tiere eine Zulage von pansenstabilen konjugierten<br />

Linolsäuren, die in 2 kg Kraftfutter eingemischt wurden und den Tieren über eine<br />

Abrufstation zugänglich waren. Die Fettsäuren wurden dabei in das Kraftfutter<br />

eingepresst, um eine Entmischung zu vermeiden. Wasser stand den Kühen ad<br />

libitum zur Verfügung. Die Tiere waren in einem nicht klimatisierten Boxenlaufstall<br />

untergebracht.<br />

Die Kühe wurden in vier Versuchsgruppen eingeteilt und vor der Abkalbung mit<br />

Rationen mit hohem und niedrigem Kraftfutteranteil jeweils mit und ohne Zusatz von<br />

21


III. Material und Methoden<br />

10 g trans-10, cis-12-CLA/Tag und 10 g cis-9, trans-11-CLA/Tag gefüttert (enthalten<br />

in 100 g CLA-Gemisch, Lutrell® Pure, BASF SE, Ludwigshafen) bzw. mit 100 g einer<br />

pansenstabilen Kontrollfettmischung auf Stearinsäurebäsis (Silafat®, BASF SE,<br />

Ludwigshafen). Nach der Abkalbung wurde der Versuch weitergeführt, wobei dann<br />

alle Tiere im gleichen Verhältnis mit Grund- und Kraftfutter versorgt wurden. Ab Tag<br />

31 p.p. wurden die ursprünglichen CLA-Gruppen ein weiteres Mal aufgeteilt. Jeweils<br />

acht Tiere wurden weiterhin mit CLA substituiert, während die anderen acht Tiere<br />

stattdessen mit Kontrollfett gefüttert wurden (Tabelle 4).<br />

Der hohe Kraftfutteranteil in den letzten Wochen der Trächtigkeit sollte eine<br />

präpartale Prädisposition für eine deutlich ketogene Stoffwechsellage post partum<br />

provozieren, um auf dieser Grundlage im Vergleich zu einer angepassten Fütterung<br />

mit niedrigem Kraftfutteranteil die Wirkungen der CLA besser untersuchen zu<br />

können.<br />

Tabelle 4: Fütterungsdesign.<br />

Legende: Kon: Fütterung mit Kontrollfett auf Stearinsäurebasis. CLA: Supplementierung mit 100 g konjugierten<br />

Linolsäuren/Tag.<br />

Versuchsperiode I: -20: 20% Kraftfutter in der Ration (Versuchsperiode I). -60: 60% Kraftfutter in der Ration<br />

Versuchsperiode II: 50% Kraftfutter in der Ration (alle Fütterungsgruppen).<br />

Versuchsperiode III: B: keine Supplementierung mit CLA<br />

Zeitraum<br />

Gruppe<br />

I<br />

Tag 21 bis 1 a.p.<br />

CLA KF<br />

n<br />

(g/d) (%)<br />

II<br />

Tag 1 bis 30 p.p.<br />

CLA<br />

Gruppe n<br />

(g/d)<br />

KF<br />

(%)<br />

III<br />

Tag 31 bis 60 p.p.<br />

CLA<br />

Gruppe n<br />

(g/d)<br />

KF<br />

(%)<br />

Kon-20 16 0 20 Kon-20 16 0 50 Kon-20 16 0 50<br />

Kon-60 15 0 60 Kon-60 15 0 50 Kon-60 15 0 50<br />

CLA-20 16 100 20 CLA-20 16 100 50<br />

CLA-60 16 100 60 CLA-60 16 100 50<br />

CLA-20A 8 100 50<br />

CLA-20B 8 0 50<br />

CLA-60A 8 100 50<br />

CLA-60B 8 0 50<br />

22


III. Material und Methoden<br />

Zu Versuchsbeginn wurde die Lebendmasse aller Tiere bestimmt. Über den<br />

gesamten Versuchszeitraum erfolgte eine tierindividuelle Erfassung der Kraft- und<br />

Grundfutteraufnahme. Während der Laktation wurden zusätzlich die Parameter<br />

Milchleistung, Lebendmasse sowie wöchentlich die Bestimmung der<br />

Milchzusammensetzung (Fett, Eiweiß, somatische Zellzahl) erfasst. Zusätzlich<br />

wurden Milchproben für weitere Untersuchungen gesammelt.<br />

Die Berechnung der Energiebilanz erfolgte an den Tagen -7, 7, 14, 21, 42 und 56<br />

relativ der Abkalbung nach folgender Formel:<br />

EB [mJ] = T-Aufnahme [kg/Tag]*NEL [mJ/kg] T des jeweiligen Futtermittels – 0,293<br />

MJ NEL/kg KG 0,75 – 3,17 MJ NEL/kg FCM.<br />

Dabei entspricht NEL der Nettoenergie Laktation und KG 0,75 dem metabolischen<br />

Körpergewicht. Für 1 kg FCM wurden 3,17 MJ NEL gerechnet.<br />

Lebendmasse, tägliche Futteraufnahme und Milchleistung wurden vor der Analyse<br />

der Daten zu wöchentlichen Mittelwerten zusammengefasst.<br />

3.3 Blutprobenentnahme<br />

Die Blutprobenentnahme aus der V. jugularis erfolgte ab dem errechneten 259.<br />

Trächtigkeitstag an den in Abbildung 2 dargestellten Tagen. Die Plasma-Monovetten<br />

wurden bei 2000 g und 15°C für 15 min zentrifugiert (Varifuge 3.OR, Heraeus). Nach<br />

der Aliquotierung des Plasmas wurde es bei -18°C eingefroren. Von den Kälbern<br />

wurde ebenfalls Blut aus der V. jugularis gewonnen. Die Probennahme erfolgte hier<br />

unmittelbar nach der Geburt, noch vor Kolostrumaufnahme, dann unmittelbar nach<br />

Kolostrumaufnahme und am 42. Lebenstag (Abbildung 5).<br />

vor Kolostrumaufnahme<br />

nach Kolostrumaufnahme<br />

- 21 - 14 - 7 - 3 1 3 7 14 21 28 42 56<br />

- 40 Geburt 60<br />

Abbildung 5: Übersicht über die Probenentnahmen<br />

23


III. Material und Methoden<br />

3.4 Milchleistung, Milchprobenentnahme und -aufbereitung<br />

Die Milchleistung wurde ab Tag 7 p.p. über den gesamten Versuchszeitraum täglich<br />

erfasst. Vor Auswertung der Daten wurde ein wöchentlicher Mittelwert gebildet. Zur<br />

besseren Vergleichbarkeit ist die Milchleistung im Folgenden als fat corrected milk<br />

(FCM) dargestellt. Der FCM wurde nach folgender Formel berechnet (GAINES<br />

1928): FCM [kg/Tag] = ((Milchfett [%] * 0,15) + 0,4) * Milchleistung [kg/Tag].<br />

Die Milchprobenentnahme erfolgte jeweils morgens in den ersten sieben Tagen nach<br />

der Geburt sowie an Tag 14 und 21 p.p.. Es wurden etwa 250 ml Sekret gewonnen.<br />

Dabei handelt es sich um Sammelmilchproben aus allen Eutervierteln des jeweiligen<br />

Tieres. Die Milchproben wurden zunächst bis zu ihrer weiteren Verwendung bei<br />

-18°C eingefroren.<br />

Als Vorbereitung für den ELISA wurden die Milchproben für 2 x 10 min bei 18.670 g<br />

und 4°C zentrifugiert (RC-5C bzw. RC-5B Sorvall Superspeed Centrifuge, Dupont,<br />

Rotortyp: SS34). Nach der ersten Zentrifugation wurde das Milchfett abgenommen,<br />

dass sich durch das Zentrifugieren an der Oberfläche der Milch abgesetzt hatte.<br />

Anschließend wurde das verbliebene Milchserum noch einmal zentrifugiert und nach<br />

der zweiten Zentrifugation eventuelle Überstände aus Milchfett erneut verworfen. Die<br />

Milchproben wurden anschließend aliquotiert und bis zur weiteren Verwendung bei<br />

-18°C eingefroren. Vor der Herstellung der Verdünnungsreihe für den Immunglobulin-<br />

ELISA wurden die Proben zunächst bei Raumtemperatur aufgetaut und dann bei<br />

6.800 g für 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert (Espresso-Zentrifuge,<br />

Thermo Scientific).<br />

24


III. Material und Methoden<br />

3.5 Bestimmung von Immunglobulin-Isotypen (IgG1 und IgG2 sowie IgM)<br />

mittels ELISA (enzyme-linked immunosorband assay)<br />

Bei dem so genannten „ELISA“ (enzyme-linked immunosorband assay) handelt es<br />

sich um einen Mikrotiterplattentest, der auf dem Nachweis spezifischer Antikörper-<br />

Antigen-Komplexe beruht.<br />

Zunächst wird ein markerspezifischer Antikörper, der so genannte primäre Antikörper<br />

an einen festen Träger gebunden, z.B. in einer Polyvinylchlorid- oder Polystyrolplatte<br />

mit üblicherweise 96 Vertiefungen (so genannte 96-Well-Mikrotiterplatten). Proteine<br />

binden fest an die Polystyrolplatte, so dass nach der Entfernung ungebundener<br />

primärer Antikörper durch Waschen die Vertiefungen auf den Platten mit einer<br />

dünnen Schicht Antikörper bedeckt („gecoatet“) sind.<br />

Im Folgenden wird die Probe in verschiedenen Verdünnungsstufen auf das<br />

gebundene Material gegeben.<br />

Im nächsten Schritt wird ein sekundärer Antikörper dazugegeben, der spezifisch an<br />

die zu untersuchende Probe bindet. Der sekundäre Antikörper ist mit einem Enzym<br />

(z.B. alkalische Phosphatase (AP), Peroxidase oder Urease) gekoppelt, das die<br />

Umwandlung eines farbloses Substrats in ein farbiges Produkt katalysiert.<br />

Ungebundene sekundäre Antikörper werden durch Waschen wieder entfernt, danach<br />

wird das Substrat dazugegeben.<br />

Ist die antigene Zielsubstanz in der Probe vorhanden, bindet sie an den primären<br />

Antikörper und der sekundäre Antikörper bindet dann an ein anderes Epitop an der<br />

Probe. Das gekoppelte Enzym katalysiert eine Farbreaktion (siehe Abbildung 5). Die<br />

großen Vorteile dieses Testverfahrens sind die leichte Durchführung, die Möglichkeit<br />

der Automatisierung und die Messung der Farbtiefe in kurzer Zeit mit Hilfe eines<br />

Photometers.<br />

25


III. Material und Methoden<br />

Abbildung 6:ELISA: (1): Coaten der Mikrotiter-Platte; (2): Beschichten der Platte mit den zu untersuchenden<br />

Proben (=Antigen); (3): Zugabe des Detektions-Antikörper + Substrat; (4): Zugabe der Stopplösung und<br />

Farbumschlag<br />

In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe für Immunologie der <strong>Tierärztliche</strong>n<br />

<strong>Hochschule</strong> <strong>Hannover</strong> wurde ein Sandwich-ELISA zur Bestimmung von bovinem<br />

Immunglobulin G1 und G2 sowie IgM verwendet (HUSSEN 2012).<br />

3.6 ELISA zur Bestimmung des Gehaltes von IgG1, IgG2 sowie IgM im bovinen<br />

Plasma und im Kolostrum<br />

Zunächst wurden die Mikrotiterplatten (NUNC-Immuno Plate F96 Maxisorp) mit<br />

jeweils 75 µl Primärantikörper und Coating-Puffer pro Well beschichtet. Nach einer<br />

Inkubationszeit von 30 Minuten auf einem Schüttler (Heidolph Titramax 1000) wurden<br />

die gecoateten Platten über Nacht bei 4° C im Kühlschrank inkubiert.<br />

Im nächsten Schritt wurden die Platten gewaschen. Anschließend wurde der<br />

verbliebene Puffer abgeschüttet und die Platten auf mehreren Lagen Zellstoff trocken<br />

geklopft.<br />

26


III. Material und Methoden<br />

Nun folgte die Belegung der Platten mit den zu messenden Proben. Vor der<br />

Herstellung der Verdünnungsreihe für den Immunglobulin-ELISA wurden die Proben<br />

bei Raumtemperatur aufgetaut. Die Herstellung einer Verdünnungsreihe ist<br />

notwendig, da der ELISA einer Sättigungskinetik folgt. Auch das Lambert-Beer‘sche-<br />

Gesetz gilt nur für Extinktionen in einem bestimmten Bereich (≤ 0,01 mol*l -1 ) (OTTO<br />

2011). Somit ist die Aussagekraft des ELISAs bei hohen Antigenkonzentrationen<br />

eingeschränkt. Mittels einer Verdünnungsreihe kann ein Bereich gefunden werden, in<br />

dem belastbare Messungen durchführbar sind.<br />

Anschließend wurden die Proben durchmischt und mit einer Pipettenspitze die oft<br />

schon mit bloßem Auge sichtbaren Fibrinkoagula entfernt. Im Folgenden wurden die<br />

Proben bei 2383 g für 6 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert (Labofuge 400,<br />

Heraeus, Rotortyp: 8172).<br />

Nach Titrationsversuchen zur Ermittlung der optimalen optischen Dichten (ODs) bei<br />

niedrigen Hintergrundwerten wurde eine Konzentration von 1 μg/ml sowohl für den<br />

Primärantikörper als auch für den Detektionsantikörper gewählt. Die idealen<br />

Verdünnungen, bei denen eine optimale Abstufung der ODs zu erkennen war, lagen<br />

zwischen 1x10 5 und 3x10 7 (Tabelle 5).<br />

Jede Probe wurde mit jeweils 75 µl/Well mit jeweils vier Verdünnungen/Probe im<br />

Doppelansatz aufgetragen (Tabelle 5). Auf jede Platte wurde außerdem das<br />

Referenzserum (Tabelle 9) im Doppelansatz aufgetragen. Die Platten wurden nun für<br />

eine Stunde auf einem Schüttler inkubiert und im Anschluss erneut gewaschen. Nach<br />

dem Trockenklopfen der Platten wurden sie mit 75 µl Detektionsantikörper/Well<br />

(Tabelle 9) beschichtet.<br />

Es folgte wiederum eine 45-minütige Inkubation auf dem Schüttler. Nach dem darauf<br />

folgenden Waschschritt wurden 75 µl einer Tetramethylbenzindin(TMB)-haltigen<br />

Substratlösung (6,24 mM/*l -1 in DMSO) auf die Platten gegeben.<br />

Nach einer Inkubationszeit von 15 – 20 Minuten bei Raumtemperatur unter<br />

Ausschluss von Tageslicht kam es aufgrund der Bildung von Enzym-Substrat-<br />

Komplexen zwischen der Meerrettich-Peroxidase und dem TMB zu einem blauen<br />

Farbumschlag.<br />

Zum Stoppen der Reaktion wurden 50 µl 1 N H 2 SO 4 auf die Platte pipettiert, was zu<br />

einem gelben Farbumschlag führte. Die Farbintensität wurde in einem<br />

Plattenphotometer (ELISA-Reader Dynatech MR600 mit 2/86-PC und Seikosh-<br />

Nadeldrucker) bei einer Wellenlänge von 450 nm (Testfilter) und 630 nm<br />

27


III. Material und Methoden<br />

(Referenzfilter) gemessen und als OD erfasst. Diese Dualmessung ermöglicht die<br />

Elimination von Messfehlern durch Schmutz, Kratzer oder Feuchtigkeit auf der<br />

Mikrotiterplatte. Die anschließende Auswertung erfolgt mit Hilfe eines<br />

Computerprogramms (MR5000 ELISA-Messung für MS DOS). Die logarithmierten<br />

Serumverdünnungen (X-Achse) wurden anschließend gegen die logarithmierten ODs<br />

(Y-Achse) aufgetragen. Die ELISA-Units unbekannter Proben wurden durch den<br />

Vergleich mit den Werten des Referenzserums (100 Units) im linearen Bereich als<br />

relative Werte angegeben und danach bezüglich der bekannten<br />

Immunglobulinkonzentrationen des Referenzserums in mg*ml -1 berechnet.<br />

Tabelle 5: Übersicht der aufgetragenen Verdünnungen<br />

Nachweis für: Verdünnungen Probe Verdünnungen Referenz<br />

IgG1 (Plasma)<br />

10 5<br />

10 5<br />

3x10 5<br />

3x10 5<br />

10 6<br />

10 6<br />

3x10 6 3x10 6<br />

IgG2 (Plasma)<br />

10 6<br />

10 5<br />

3x10 6<br />

3x10 5<br />

10 7<br />

10 6<br />

3x10 7 3x10 6<br />

IgG1 / IgG2 (Kolostrum)<br />

3x10 5<br />

3x10 5<br />

10 6<br />

10 6<br />

3x10 6<br />

3x10 6<br />

10 7 10 7<br />

IgM (Plasma)<br />

3x10 5<br />

3x10 5<br />

10 6<br />

10 6<br />

3x10 6<br />

3x10 6<br />

10 7 10 7<br />

28


III. Material und Methoden<br />

3.6 Statistische Auswertung<br />

Die statistische Auswertung und Darstellung der Daten erfolgte mit den<br />

Computerprogrammen GraphPad Prism 5 (Graph Pad Software) und IBM SPSS<br />

Statistics 20 (IBM).<br />

Der Verlauf der Immunglobulinspiegel im Plasma wurde bis Tag 28 mittels<br />

multifaktorieller Varianzanalyse für wiederholte Beobachtungen (Repeated<br />

measurements (RM) ANOVA) zunächst mit den Faktoren „Zeit“ und<br />

„Laktationsnummer“ für die einzelnen Immunglobulin-Isotypen ausgewertet.<br />

Zusätzlich wurde der Fisher LSD-Test für den Vergleich der einzelnen<br />

Entnahmezeitpunkte miteinander angewendet.<br />

Zusätzlich wurden die Immunglobulinwerte der einzelnen Isotypen an den<br />

verschiedenen Zeitpunkten untereinander mittels einfaktorieller Varianzanalyse (One-<br />

Way ANOVA) verglichen. Da ab Tag 30 des Versuchsablaufes die Fütterung<br />

nochmals umgestellt wurde, wurden die letzten beiden Zeitpunkte (Tag 42 und Tag<br />

56) ausschließlich mittels One-Way ANOVA verglichen.<br />

Um den Einfluss der Fütterung auf den Verlauf der Immunglobulin-Isotypen zu<br />

untersuchen, wurde ebenfalls bis Tag 28 eine multifaktorielle Varianzanalyse für die<br />

Faktoren „Zeit“, „Kraftfuttermenge a.p.“ und „Gruppe“ durchgeführt. Die<br />

Untersuchung der letzten beiden Entnahmezeitpunkte erfolgte wieder mittels One-<br />

Way ANOVA.<br />

Bei fehlenden Werten wurde bei der Berechnung der Zeitverläufe via RM ANOVA<br />

das betroffene Tier nicht mit berücksichtigt. Im Vergleich der Zeitpunkte miteinander<br />

wurden allerdings lediglich die fehlenden Werte ausgelassen.<br />

Die Auswertung der Immunglobulinspiegel im Kolostrum erfolgte ebenfalls mittels<br />

One-Way ANOVA. Um einen Unterschied zwischen den einzelnen Isotypen zu<br />

ermitteln, wurde eine One-Way ANOVA für wiederholte Beobachtungen<br />

durchgeführt.<br />

Die Plasmaproben der Kälber wurden ebenfalls mit einer One-Way ANOVA<br />

analysiert.<br />

Um zu überprüfen, ob ein Zusammenhang zwischen der Ausprägung der negativen<br />

Energiebilanz und der Höhe der Immunglobulinspiegel besteht, wurden an den<br />

jeweiligen Entnahmezeitpunkten lineare Korrelationen berechnet.<br />

29


III. Material und Methoden<br />

In den folgenden Kapiteln werden in den Darstellungen jeweils arithmetische<br />

Mittelwerte (x‾) und entsprechende Standardfehler (SEM) angegeben. Für die<br />

Signifikanzangaben gilt Folgendes:<br />

n.s.<br />

p < 0,05<br />

p < 0,01<br />

p < 0,001<br />

nicht signifikant<br />

* schwach signifikant<br />

** signifikant<br />

*** hoch signifikant<br />

30


Gesamt IgG [mg*ml -1 ]<br />

IV. Ergebnisse<br />

IV. ERGEBNISSE<br />

4.1 Verlauf der Plasma-Immunglobuline im peripartalen Zeitraum<br />

4.1.1 Verlauf von Gesamt-IgG im Plasma<br />

Zwischen dem Ende des 8. Monats der Trächtigkeit und der Zeit unmittelbar a.p. kam<br />

es zu einem Abfall der intravasalen IgG-Konzentration (19,85 ± 1,45 mg*ml -1 auf<br />

14,91 ± 1,68 mg*ml -1 ). Unmittelbar nach der Geburt stiegen die IgG-Werte wieder an<br />

und erreichten an Tag 21 mit 18,07 ± 1,51 mg*ml -1 die Ausgangskonzentration. Am<br />

Ende des Versuchszeitraums sank der IgG-Spiegel noch einmal leicht bis auf einen<br />

Wert von 14,58 ± 1,30 mg*ml -1 ab.<br />

25<br />

20<br />

15<br />

a<br />

ac<br />

abcd abc<br />

bcd bd<br />

abcd abc<br />

ab<br />

abcd<br />

abcd<br />

10<br />

d<br />

5<br />

0<br />

-20 0 20 40 60<br />

Tage<br />

Abbildung 7: Verlauf von Plasma-Gesamt-IgG bei Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian im peripartalen<br />

Zeitraum (n=63). Angaben als arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM). RM One-Way ANOVA; Tukey<br />

Post Test: Zeiteffekt: ***; Unterschiedliche Buchstaben stehen für signifikant unterschiedliche Mittelwerte<br />

31


IgG1 [mg*ml -1 ]<br />

IV. Ergebnisse<br />

Da sich das intravasale Gesamt-IgG aus den Isotypen IgG1 und IgG2<br />

zusammensetzt, werden im Folgenden die einzelnen Isotypen separat dargestellt.<br />

4.1.2 Verlauf von IgG1 im Plasma<br />

Zwischen dem Messungen zu Beginn des Versuchs und unmittelbar peripartal sank<br />

die IgG1-Konzentration von 8,21 ± 0,77 mg*ml -1 auf 2,90 ± 0,27 mg*ml -1 . Bis zum<br />

Ende des Versuchs wurde mit IgG1-Spiegeln von 8,34 ± 1,26 mg*ml -1 die<br />

Ausgangskonzentration wieder erreicht.<br />

12<br />

10<br />

8<br />

6<br />

4<br />

a<br />

ab<br />

bcd<br />

d<br />

abc<br />

bcd<br />

cd<br />

ab<br />

a<br />

a<br />

a<br />

2<br />

d<br />

0<br />

-20 0 20 40 60<br />

Tage<br />

Abbildung 8: Verlauf von Plasma-IgG1 bei Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian im peripartalen Zeitraum<br />

(n=63). Angaben als arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM). RM One-Way ANOVA; Tukey Post<br />

Test: Zeiteffekt: ***; Unterschiedliche Buchstaben stehen für signifikant unterschiedliche Mittelwerte<br />

32


IgG2 [mg*ml -1 ]<br />

IV. Ergebnisse<br />

4.1.3 Verlauf von IgG2 im Plasma<br />

An Tag -21 lagen die Werte für IgG2 bei 12,7 ± 1,24 mg*ml -1 . Im weiteren Verlauf<br />

waren keine signifikanten Veränderungen zu beobachten. Zum Geburtszeitpunkt<br />

wurden Werte von 13,88 ± 1,66 mg*ml -1 gemessen. Zum Ende der Versuchsperiode<br />

lagen die Werte bei 11,58 ± 1,22 mg*ml -1 .<br />

20<br />

15<br />

10<br />

5<br />

0<br />

-20 0 20 40 60<br />

Tage<br />

Abbildung 9: Verlauf von Plasma-IgG2 bei Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian im peripartalen Zeitraum<br />

(n=63). Angaben als arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM). RM One-Way ANOVA; Tukey Post<br />

Test: n.s.<br />

33


IgM [mg*ml -1 ]<br />

IV. Ergebnisse<br />

4.1.4 Verlauf von IgM im Plasma<br />

Für die Messung von IgM wurden 18 Tiere anhand ihrer Laktationzahl ausgewählt.<br />

Zu Beginn der Messungen lagen die Werte für IgM bei 6,66 ± 0,98 mg*ml -1 . Zum<br />

Geburtszeitpunkt kam es zu einem rapiden Abfall der intravasalen IgM-<br />

Konzentration. An Tag -3 wurden lediglich Werte von 0,59 ± 0,18 mg*ml -1 gemessen.<br />

Bereits an Tag 1 p.p. wurden wieder Plasmaspiegel von 6,69 ± 1,69 erreicht. Diese<br />

blieben bis zum Ende der Versuchsperiode konstant. An Tag 56 lagen die Werte bei<br />

5,30 ± 1,40 mg*ml -1 .<br />

10<br />

8<br />

6<br />

a<br />

a<br />

a<br />

a<br />

a a<br />

ab<br />

ab<br />

a<br />

a<br />

a<br />

4<br />

2<br />

0<br />

b<br />

-20 0 20 40 60<br />

Tage<br />

Abbildung 10: Verlauf von Plasma-IgM bei Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian im peripartalen Zeitraum<br />

(n=18). Angaben als arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM).RM One-Way ANOVA; Tukey Post<br />

Test: Zeiteffekt: ***; Unterschiedliche Buchstaben stehen für signifikant unterschiedliche Mittelwerte<br />

34


IgG1 [m g*m l -1 ]<br />

IV. Ergebnisse<br />

4.2 Verlauf der Immunglobuline in Abhängigkeit der Laktationszahl<br />

In Abhängigkeit der Laktationszahl waren deutliche Unterschiede im Verlauf der<br />

unterschiedlichen Immunglobulin-Isotypen feststellbar. So zeigten Färsen signifikant<br />

niedrigere Ausgangswerte von IgG1 an Tag -21 (4,05 ± 0,79 mg*ml -1 ) und signifikant<br />

niedrigere IgG1-Spiegel zum Zeitpunkt der Geburt (1,95 ± 0,42 mg*ml -1 ) und<br />

erreichten auch post partum nicht so hohe Plasmaspiegel wie Tiere mit mehreren<br />

Laktationen.<br />

Insgesamt zeigten Kühe mit zwei oder mehr Laktationen über die gesamte<br />

Versuchsperiode höhere Plasmaspiegel an IgG1. So lagen die Plasmaspiegel bei<br />

Kühen in der 2. Laktation an Tag -21 bei 7,12 ± 0,78 mg*ml -1 und zum Zeitpunkt der<br />

Geburt 2,76 ± 0,65 mg*ml -1 . Für Tiere mit mehr als zwei Laktationen lagen die<br />

Plasmaspiegel an Tag -21 bei 11,14 ± 1,33 mg*ml -1 und zum Zeitpunkt der Geburt<br />

bei 3,66 ± 0,42 mg*ml -1 .<br />

15<br />

10<br />

a<br />

a<br />

1. Laktation (N=16)<br />

2. Laktation (N=25)<br />

> 2. Laktation (N=22)<br />

a<br />

a<br />

a<br />

5<br />

b<br />

ab<br />

a<br />

a<br />

b<br />

b<br />

b<br />

0<br />

-30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60<br />

Tage um den Geburtszeitpunkt<br />

Abbildung 11: IgG1 im Plasma von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian in Abhängigkeit der Laktationszahl.<br />

Angaben als arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM).Two Way ANOVA: Zeiteffekt: ***, Effekt der<br />

Laktation: **, Interaktion Zeit/Laktation: *; Fisher LSD Test: Unterschiedliche Buchstaben stehen für signifikant<br />

unterschiedliche Mittelwerte.<br />

35


IgM [mg*ml -1 ]<br />

IgG2 [m g*m l -1 ]<br />

IV. Ergebnisse<br />

Im zeitlichen Verlauf von IgG2 und IgM konnten dagegen keine Unterschiede<br />

zwischen den einzelnen Laktationsgruppen festgestellt werden (Abbildung 12 und<br />

13).<br />

20 1. Laktation (N=16)<br />

2. Laktation (N=25)<br />

15<br />

> 2. Laktation (N=22)<br />

10<br />

5<br />

0<br />

-20 0 20 40 60<br />

Tage um den Geburtszeitpunkt<br />

Abbildung 12: IgG2 im Plasma von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian in Abhängigkeit von der<br />

Laktationszahl. Angaben als arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM). Two Way ANOVA: Zeiteffekt: *,<br />

Interaktion Zeit/Laktation: *<br />

20<br />

15<br />

1. Laktation (N=6)<br />

2. Laktation (N=6)<br />

> 2. Laktation (N=6)<br />

10<br />

5<br />

0<br />

-20 0 20 40 60<br />

Tage um den Geburtszeitpunkt<br />

Abbildung 13: IgM im Plasma von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian in Abhängigkeit von der<br />

Laktationszahl. Angaben als arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM). Two Way ANOVA: Zeiteffekt: **<br />

36


IgG1 [mg*ml -1 ]<br />

IV. Ergebnisse<br />

4.3 Verlauf der Immunglobuline in Abhängigkeit der Fütterung<br />

Wie bereits in Kapitel 3.2 beschrieben, wurden die Kühe in vier Versuchsgruppen<br />

eingeteilt und vor der Abkalbung mit Rationen mit hohem und niedrigem<br />

Kraftfutteranteil jeweils mit und ohne Zusatz von 10 g trans-10, cis-12-CLA/Tag und<br />

10 g cis-9, trans-11-CLA/Tag gefüttert.<br />

Nach der Abkalbung wurde der Versuch weitergeführt, wobei dann alle Tiere im<br />

gleichen Verhältnis mit Grund- und Kraftfutter versorgt wurden (siehe Tabelle 4).<br />

Um den Einfluss der Fütterung auf den Verlauf der Immunglobulin-Isotypen zu<br />

untersuchen, wurde bis Tag 28 eine multifaktorielle Varianzanalyse für die Faktoren<br />

„Zeit“, „Kraftfuttermenge a.p.“ und „Gruppe“ durchgeführt. Der Faktor „Laktation“<br />

wurde separat betrachtet.<br />

Dabei konnten für IgG1 und IgG2 keine Unterschiede zwischen den einzelnen<br />

Fütterungsgruppen gezeigt werden (siehe Abbildung 14 und 15).<br />

15<br />

10<br />

5<br />

I II III<br />

Kon-20 (N=16)<br />

Kon-60 (N=15)<br />

CLA-20A (N=16)<br />

CLA-20B (N=16)<br />

CLA-60A (N=16)<br />

CLA-60B (N=16)<br />

0<br />

-30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60<br />

Tage um den Geburtszeitpunkt<br />

Abbildung 14: IgG1 im Plasma von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian in Abhängigkeit der Fütterung unter<br />

Berücksichtigung der Laktation. Angaben als arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM). Two Way<br />

ANOVA (bis Tag 28): Zeiteffekt: ***; One Way ANOVA (Tag 42 und 56): n.s.<br />

37


IgG2 [mg*ml -1 ]<br />

IV. Ergebnisse<br />

25<br />

20<br />

15<br />

10<br />

I II III<br />

Kon-20 (N=16)<br />

Kon-60 (N=15)<br />

CLA-20A (N=16)<br />

CLA-20B (N=16)<br />

CLA-60A (N=16)<br />

CLA-60B (N=16)<br />

5<br />

0<br />

-30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60<br />

Tage um den Geburtszeitpunkt<br />

Abbildung 15: IgG2 im Plasma von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian in Abhängigkeit der Fütterung unter<br />

Berücksichtigung der Laktation. Angaben als arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM). Two Way<br />

ANOVA (bis Tag 28): Zeiteffekt: (*);One Way ANOVA (Tag 42 und 56): n.s.<br />

Da der Einfluss der Fütterung nach Betrachtung von IgG1 und IgG2 eine<br />

untergeordnete Rolle zu spielen schien und der Einfluss der Laktation<br />

vielversprechende Ergebnisse zeigte, wurden die Tiere für die Bestimmung von IgM<br />

ausschließlich nach ihrer Laktationsnummer ausgewählt. Bis auf signifikante<br />

Unterschiede zwischen der CLA-60B-Gruppe und den Kontrollgruppen an Tag 42<br />

konnten hier ebenfalls keine Unterschiede zwischen den einzelnen<br />

Fütterungsgruppen gezeigt werden.<br />

38


Energiebilanz [mJ]<br />

IgM [mg*ml -1 ]<br />

IV. Ergebnisse<br />

25<br />

20<br />

15<br />

I II III<br />

Kon-20 (N=6)<br />

Kon-60 (N=4)<br />

CLA-20B (N=3)<br />

CLA-60B (N=4)<br />

10<br />

5<br />

0<br />

-20 0 20 40 60<br />

Tage um den Geburtszeitpunkt<br />

a<br />

b<br />

b<br />

Abbildung 16: IgM im Plasma von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian in Abhängigkeit der Fütterung.<br />

Angaben als arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM).Two Way ANOVA (bis Tag 28): Zeiteffekt: ***;<br />

One Way ANOVA (Tag 42 und 56): Unterschiedliche Buchstaben stehen für signifikant unterschiedliche<br />

Mittelwerte<br />

4.4 Energiebilanz (EB)<br />

Anhand von Daten, die im Rahmen der Dissertation von PETZOLD et al. (2013) am<br />

Friedrich-Löffler-Institut in Braunschweig erhoben wurden, wurde die Energiebilanz<br />

berechnet, um eine Übersicht über die Stoffwechselsituation der Milchkühe über den<br />

Versuchszeitraum zu erhalten.<br />

Von Tag -7 a.p. zu Tag 7 p.p. kam es zu einem signifikanten Abfall der Energiebilanz<br />

von anfänglich 41,49 ± 4,32 mJ auf -33,52 ± 9,84 mJ. Bis zum Ende der<br />

Versuchsperiode wurden keine positiven Bilanzwerte erreicht.<br />

60<br />

40<br />

a<br />

20<br />

0<br />

-20<br />

-40<br />

-60<br />

Tage<br />

0 20 40 60<br />

d<br />

b c<br />

bcd<br />

e<br />

Abbildung 17: Verlauf der EB von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian über den gesamten<br />

Versuchszeitraum (n=63). Angaben als arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM). One Way-ANOVA,<br />

Tukey Post Test: Unterschiedliche Buchstaben stehen für signifikant unterschiedliche Mittelwerte<br />

39


Energiebilanz [mJ]<br />

IV. Ergebnisse<br />

In Abhängigkeit der Laktationszahl waren ab Tag 14 p.p. deutliche Unterschiede<br />

zwischen der 1. und den nachfolgenden Laktationen feststellbar. Tiere der 1.<br />

Laktation befanden sich an Tag 14 p.p. in einer Energiebilanz von -2,22 ± 4,67 mJ<br />

und lagen damit deutlich über den Werten der Kühe in der 2. Laktation (-36,87 ± 4,85<br />

mJ) bzw. der nachfolgenden Laktationen (-42,85 ± 4,50 mJ). Die statistische<br />

Auswertung dieser Daten ergab, dass die Kühe in der 1. Laktation bis auf den letzten<br />

Messwert (Tag 56) signifikant höhere Energiebilanzwerte aufwiesen.<br />

60<br />

30<br />

1. Laktation (N=16)<br />

2. Laktation (N=25)<br />

> 2. Laktation (N=22)<br />

0<br />

-30<br />

a<br />

a<br />

ab<br />

0 20 40 60<br />

Tage<br />

b<br />

b<br />

b<br />

b<br />

a<br />

b<br />

Abbildung 18: Verlauf der EB von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian in Abhängigkeit der<br />

Laktationsnummer. Angaben als arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM). RM One Way-ANOVA:<br />

Zeiteffekt:**; Fisher LSD Test: Unterschiedliche Buchstaben stehen für signifikant unterschiedliche Mittelwerte<br />

4.4.1 Zusammenhang zwischen Energiebilanz und Immunglobulingehalt im Plasma<br />

Um einen möglichen Zusammenhang zwischen dem Energiehaushalt und der<br />

humoralen Immunität zu charakterisieren, wurden die Immunglobulinspiegel im<br />

Plasma an allen Entnahmezeitpunkten mit der jeweiligen Energiebilanz korreliert.<br />

Dabei konnte kein Zusammenhang festgestellt werden.<br />

Da der Zeitpunkt um die Abkalbung ausschlaggebend für die Fragestellung dieser<br />

Arbeit war, sind in Abbildung 19 beispielhaft die Korrelationen für die Tage -7 und 7<br />

p.p. für alle drei Isotypen dargestellt.<br />

40


IV. Ergebnisse<br />

Korrelation NEB/IgG1 (Plasma) Tag -7 a.p.<br />

Korrelation NEB/IgG1 (Plasma) Tag 7 p.p.<br />

15<br />

10<br />

Tag -7 (N=46)<br />

R 2 : 0,0005<br />

25<br />

20<br />

15<br />

R 2 : 0,1<br />

Tag 7 (N=15)<br />

5<br />

10<br />

5<br />

-50 0 50 100<br />

NEB<br />

-100 -50 0 50 100<br />

NEB<br />

Korrelation NEB/IgG2 (Plasma) Tag -7 a.p.<br />

Korrelation NEB/IgG2 (Plasma) Tag 7 p.p.<br />

40<br />

Tag -7 (N=46)<br />

30<br />

Tag 7 (N=15)<br />

30<br />

R 2 : 0,02<br />

20<br />

R 2 : 0,008<br />

20<br />

10<br />

10<br />

-50 0 50 100<br />

NEB<br />

-100 -50 0 50 100<br />

NEB<br />

20<br />

15<br />

Korrelation NEB/IgM (Plasma) Tag -7 a.p.<br />

R 2 : 0,15<br />

Tag -7 (N=14)<br />

Korrelation NEB/IgM (Plasma) Tag 7 p.p.<br />

25<br />

20<br />

15<br />

R 2 : 0,1<br />

Tag 7 (N=3)<br />

mg*ml -1<br />

10<br />

mg*ml -1<br />

10<br />

5<br />

5<br />

0<br />

0 20 40 60 80 100<br />

NEB<br />

-40 -20 0 20 40<br />

NEB<br />

Abbildung 19: Übersicht über die Korrelationen zwischen EB und Immunglobulinspiegel im Plasma von<br />

Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian an Tag -7 und Tag 7 für alle untersuchten Isotypen (IgG1, IgG2 und<br />

IgM).<br />

41


FCM [kg]<br />

IV. Ergebnisse<br />

4.5 Milchleistung<br />

Die Milchleistung zeigte von Tag 7 p.p. bis Tag 42 p.p. einen leichten Anstieg (von<br />

39,21 ± 1,94 kg an Tag 14 p.p. auf 42,96 ± 1,20 kg an Tag 42 p.p.), der allerdings<br />

statistisch nicht abzusichern war.<br />

50<br />

45<br />

40<br />

35<br />

0 20 40 60<br />

Tage<br />

Abbildung 20: Verlauf der Milchleistung von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian über den Versuchszeitraum<br />

(FCM: fat corrected milk). Angaben als arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM). RM One Way-<br />

ANOVA; Tukey Post Test: n.s.<br />

42


FCM [kg]<br />

IV. Ergebnisse<br />

In Abhängigkeit der Laktationsnummer zeigten sich deutliche Unterschiede in der<br />

Milchleistung zwischen Kühen in der ersten und denen der nachfolgenden<br />

Laktationen. Ab Tag 14 p.p. zeigten die Kühe der 1. Laktation über den gesamten<br />

Versuchszeitraum hinweg signifikant niedrigere Milchleistung im Vergleich mit den<br />

Kühen der zweiten oder späteren Laktationen (siehe Abbildung 21).<br />

50<br />

40<br />

30<br />

a<br />

a<br />

b<br />

a<br />

a<br />

b<br />

a<br />

a<br />

b<br />

a<br />

a<br />

b<br />

1. Laktation (N=16)<br />

2. Laktation (N=25)<br />

> 2. Laktation (N=22)<br />

20<br />

10<br />

0<br />

0 20 40 60<br />

Tage<br />

Abbildung 21: Verlauf der Milchleistung von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian in Abhängigkeit der<br />

Laktationszahl. Angaben als arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM). RM One Way-ANOVA; Fisher<br />

LSD-Test: Unterschiedliche Buchstaben stehen für signifikant unterschiedliche Mittelwerte<br />

4.6 Transfer der Plasma-Immunglobuline ins Kolostrum<br />

Um den Transfer der unterschiedlichen Ig-Isotypen aus dem Plasma ins Kolostrum<br />

nachvollziehen zu können, wurden die Kolostrumproben ebenfalls mittels ELISA<br />

untersucht. Da die Erfassung der Tagesmilchmengen erst ab Tag 7 p.p. erfolgte, war<br />

eine quantitative Bestimmung der über das Kolostrum abgegebenen Mengen an<br />

Immunglobulinen nicht möglich. Sowohl IgG1, IgG2 und IgM sind im Kolostrum<br />

vorhanden, wobei das Verhältnis IgG1:IgG2:IgM etwa 4:2:1 beträgt.<br />

Da die Ergebnisse der Messungen der ersten fünf Tiere darauf hinwiesen, dass nach<br />

Tag 3 p.p. kaum noch nachweisbare Immunglobulingehalte im Kolostrum vorhanden<br />

sind, wurden von den restlichen Tieren nur die Proben der Tage 1 bis 3 p.p.<br />

untersucht.<br />

43


[mg*ml -1 ]<br />

IV. Ergebnisse<br />

Für die Untersuchung von IgM im Kolostrum wurde eine Stichprobe von zehn Tieren<br />

ausgewählt. Dabei wurden die Tiere berücksichtigt, von denen auch die<br />

Plasmaproben ihrer Kälber zur Verfügung standen.<br />

50<br />

***<br />

***<br />

40<br />

30<br />

IgG1 (N=63)<br />

IgG2 (N =63)<br />

IgM (N=10)<br />

20<br />

**<br />

***<br />

***<br />

10<br />

0<br />

***<br />

**<br />

1 2 3 1 2 3 1 2 3<br />

Tage p.p.<br />

Abbildung 22: Konzentrationen von IgG1, IgG2 und IgM im Kolostrum von Milchkühen der Rasse Holstein-<br />

Friesian. Angaben als arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM). Two Way ANOVA mit Tukey Post<br />

Test: Zeiteffekt: ***, Effekt des Isotyps: ***, Interaktion Zeit/Isotyp: ***<br />

In Abhängigkeit der Laktationszahl waren für Gesamt-IgG zunächst keine<br />

signifikanten Unterschiede im Immunglobulingehalt des Kolostrums feststellbar<br />

(Abbildung 23).<br />

44


IgG1 [mg*ml -1 ]<br />

Gesamt IgG [mg*ml -1 ]<br />

IV. Ergebnisse<br />

100<br />

80<br />

60<br />

1. Laktation (N=16)<br />

2. Laktation (N=22)<br />

> 2. Laktation (N=25)<br />

40<br />

20<br />

0<br />

1 2 3<br />

Tage p.p.<br />

Abbildung 23: Gehalt von Gesamt IgG im Kolostrum von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian in<br />

Abhängigkeit der Laktationszahl. Angaben als arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM).Two Way<br />

ANOVA mit Tukey Post Test.<br />

Bei getrennter Betrachtung der einzelnen Isotypen waren jedoch eindeutige<br />

Unterschiede zwischen den einzelnen Laktationszahlen erkennbar. Dabei zeigten<br />

Tiere der 1. Laktation mit 60,83 ± 11,83 mg*ml -1<br />

an Tag 1 p.p. deutlich höhere<br />

Immunglobulinspiegel von IgG1 im Kolostrum als Tiere der 2. Laktation (50,28 ± 5,80<br />

mg*ml -1 ) oder als Tiere in höheren Laktationen (35,64 ± 5,58 mg*ml -1 ).<br />

80<br />

60<br />

40<br />

**<br />

1. Laktation (N=16)<br />

2. Laktation (N=22)<br />

< 2. Laktation (N=25)<br />

20<br />

0<br />

1 2 3<br />

Tage p.p.<br />

Abbildung 24: Gehalt von IgG1 im Kolostrum von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian in Abhängigkeit von<br />

der Laktationszahl. Angaben als arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM). Two Way ANOVA mit<br />

Tukey Post Test: Zeiteffekt: ***<br />

45


IgM [mg*ml -1 ]<br />

IgG2 [mg*ml -1 ]<br />

IV. Ergebnisse<br />

Im Gegensatz dazu wiesen die Tiere der 1. Laktation an Tag 1 deutlich niedrigere<br />

Werte von IgG2 auf (11,22 ± 2,47 mg*ml -1 ) als die Tiere der anderen<br />

Laktationsgruppen (16,55 ± 1,96 mg*ml -1 für Tiere der 2. Laktation respektive 17,80 ±<br />

1,73 mg*ml -1 für Tiere > 2. Laktation).<br />

25<br />

20<br />

15<br />

*<br />

1. Laktation (N=16)<br />

2. Laktation (N=22)<br />

< 2. Laktation (N=25)<br />

10<br />

5<br />

0<br />

1 2 3<br />

Tage p.p.<br />

Abbildung 25: Gehalt von IgG2 im Kolostrum von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian in Abhängigkeit von<br />

der Laktationszahl. Angaben als arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM). Two Way ANOVA mit<br />

Tukey Post Test: Zeiteffekt: ***<br />

Für IgM konnten statistisch keine Unterschiede zwischen den einzelnen<br />

Laktationsgruppen nachgewiesen werden.<br />

8<br />

6<br />

> 2. Laktation (N=4)<br />

2. Laktation (N=3)<br />

1. Laktation (N=3)<br />

4<br />

2<br />

0<br />

1 2 3<br />

Tage p.p.<br />

Abbildung 26: Gehalt von IgM im Kolostrum von Milchkühen der Rasse Holstein-Friesian in Abhängigkeit von<br />

der Laktationszahl. Angaben als arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM). Two Way ANOVA mit<br />

Tukey Post Test: n.s.<br />

46


IgG1 [mg*ml -1 ]<br />

IV. Ergebnisse<br />

4.7 Aufnahme kolostraler Immunglobuline durch das Kalb<br />

Um die Aufnahme der kolostralen Immunglobuline durch das Neugeborene<br />

überprüfen zu können, wurden die Plasmaproben der Kälber ebenfalls mittels ELISA-<br />

Technik auf IgG1, IgG2 und IgM untersucht. Zur Verfügung standen dabei Proben<br />

von 19 Kälbern zu den Zeitpunkten vor und direkt nach der Kolostrumaufnahme<br />

sowie vom 42. Lebenstag.<br />

Die untersuchten Kälber hatten vor der Kolostrumaufnahme einen IgG1-<br />

Plasmaspiegel von 0,76 ± 0,06 mg*ml -1 . Bereits direkt nach der Kolostrumaufnahme<br />

konnte ein signifikanter Anstieg auf 6,45 ± 1,57 mg*ml -1 beobachtet werden. An Tag<br />

42 wiesen die Kälber einen Plasmaspiegel von 11,43 ± 1,47 mg*ml -1 auf und lagen<br />

damit im Bereich adulter Tiere.<br />

*<br />

14 ***<br />

vor Kolostrumaufnahme (N=19)<br />

nach Kolostrumaufnahme (N=19)<br />

12<br />

10<br />

8<br />

6<br />

4<br />

2<br />

0<br />

Tag 42 (N=19)<br />

**<br />

Abbildung 27: IgG1-Plasmakonzentrationen von Kälbern der Rasse Holstein-Friesian (n=19). Angaben als<br />

arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM). RM One Way ANOVA mit Tukey Post Test<br />

47


IgG2 [mg*ml -1 ]<br />

IV. Ergebnisse<br />

Für IgG2 konnte kein signifikanter Unterschied vor und nach der Kolostrumaufnahme<br />

beobachtet werden (3,60 ± 0,27 mg*ml -1 vor der Kolostrumaufnahme respektive 4,07<br />

± 0,39 mg*ml -1 nach der Kolostrumaufnahme). Allerdings waren die Plasmaspiegel<br />

an Tag 42 mit 6,37 ± 0,81 mg*ml -1<br />

vorangegangenen Entnahmezeitpunkten.<br />

signifikant höher als an den beiden<br />

8<br />

*<br />

*<br />

vor Kolostrumaufnahme (N=19)<br />

nach Kolostrumaufnahme (N=19)<br />

6<br />

Tag 42 (N=19)<br />

4<br />

2<br />

0<br />

Abbildung 28: IgG2-Plasmakonzentrationen von Kälbern der Rasse Holstein-Friesian (n=19). Angaben als<br />

arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM). RM One Way ANOVA mit Tukey Post Test<br />

48


IgM [mg*ml -1 ]<br />

IV. Ergebnisse<br />

Auch für IgM wurde ein Anstieg der Plasmakonzentration nach der<br />

Kolostrumaufnahme festgestellt (von 0,92 ± 0,39 mg*ml -1 auf 3,27 ± 1,11 mg*ml -1 ).<br />

Dieser ließ sich statistisch jedoch nicht bestätigen. Es gab jedoch einen statistisch<br />

signifikanten Effekt in der Zunahme der Plasma-IgM-Konzentration von vor der<br />

Kolostrumaufnahme zu Tag 42 (4,29 ± 1,05 mg*ml -1 ).<br />

6<br />

4<br />

*<br />

vor Kolostrumaufnahme (N=19)<br />

nach Kolostrumaufnahme (N=19)<br />

Tag 42 (N=19)<br />

2<br />

0<br />

Abbildung 29: IgM-Plasmakonzentrationen von Kälbern der Rasse Holstein-Friesian (n=13). Angaben als<br />

arithmetischer Mittelwert mit Standardfehler (SEM). RM One Way ANOVA mit Tukey Post Test<br />

49


V. Diskussion<br />

V. DISKUSSION<br />

5.1 Immunglobulinbestimmung im Plasma<br />

Trotz der großen Bedeutung, die dem Immunstatus des Rindes gerade im<br />

peripartalen Zeitraum in Klinik und Wissenschaft beigemessen wird, gibt es<br />

auf diesem Themengebiet bisher nur wenig publizierte Daten.<br />

Mit Hilfe eines in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Immunologie der<br />

<strong>Tierärztliche</strong>n <strong>Hochschule</strong> <strong>Hannover</strong> entwickelten Sandwich-ELISAs<br />

(HUSSEN 2012) konnten in der vorliegenden Studie IgG und IgM und<br />

erstmals auch die unterschiedlichen Isotypen von IgG (IgG1 und IgG2)<br />

quantitativ bestimmt werden. Ab der dritten Woche a.p. konnte ein<br />

signifikanter Abfall der Plasmakonzentration von IgG1 beobachtet werden.<br />

Die Konzentrationen von IgG2 blieben während des gesamten<br />

Untersuchungszeitraumes konstant.<br />

LARSON beschrieb als einer der ersten Autoren (1958) eine Abnahme der<br />

γ 1 -Globulin-Konzentration im Serum von Kühen von der 6. Woche a.p. bis<br />

zur Geburt. Allerdings konnten mit der von ihm gewählten Methode der<br />

Gelelektrophorese lediglich Proteinfraktionen gemessen werden, welche<br />

nicht genauer bestimmt werden konnten. Darauf basierend folgten einige<br />

Studien, die sich mit der Quantifizierung der Immunglobulingehalte im<br />

bovinen Serum beschäftigten. Daraus resultierten sehr unterschiedliche<br />

Immunglobulinkonzentrationen, die für IgG mit Werten von 9,3 bis 36,8 ±<br />

11,6 mg*ml -1 und für IgM von 2,6 bis 8,6 mg*ml -1 angegeben wurden<br />

(KLAUS et al. 1969; CURTAIN et al. 1970; BRANDON et al. 1971;<br />

DUNCAN et al. 1972; J. E. BUTLER 1973; NORMAN u. HOHENBOKEN<br />

1981; GUNNINK 1984; DETILLEUX et al. 1995; FRANKLIN et al. 2005;<br />

HERR et al. 2011). Diese hohe Varianz ist möglicherweise darauf<br />

zurückzuführen, dass die Messungen unabhängig vom Leistungsstadium<br />

innerhalb der Reproduktionsperiode sowie mit unterschiedlichen Methoden<br />

(Radioimmunoassay, single radial immunodiffusion (sRid), ELISA) erfolgten<br />

(Tabelle 6.<br />

50


V. Diskussion<br />

Zwar geben die bereits publizierten Daten zu den Plasma IgG- und IgM-<br />

Konzentrationen eine gute Orientierung, allerdings lassen sie keine<br />

Rückschlüsse darüber zu, inwiefern die unterschiedlichen<br />

Reproduktionsabschnitte Einfluss auf die Antikörpergehalte im Plasma<br />

nehmen. Dabei wird in der Fachliteratur häufig die Meinung vertreten, dass<br />

die überdurchschnittlich hohe Anfälligkeit für Erkrankungen im peripartalen<br />

Zeitraum bei der Milchkuh in engem Zusammenhang mit einer Depression<br />

des Immunsystems stehe (GUNNINK 1984; GOFF u. HORST 1997; LEWIS<br />

1997; MALLARD et al. 1998). BOSTEDT und BERCHTHOLD postulierten<br />

bereits 1968, dass die humoralen Abwehrmechanismen des Milchrindes<br />

während der Geburt einer Depression unterliegen. Während der<br />

Austreibungsphase konnte eine signifikante Reduktion der eosinophilen<br />

Granulozyten gezeigt werden, die erst drei bis fünf Stunden p.p.<br />

abgeschlossen war. Die Dauer der Eosinopenie variierte dabei zwischen 12<br />

und 24 Stunden.<br />

5.1.1 IgG-Bestimmung im Plasma<br />

Die direkte Charakterisierung des Immunstatus der Milchkuh in diesem<br />

kritischen Zeitraum wurde erst in jüngerer Zeit Gegenstand einiger<br />

Untersuchungen (DETILLEUX et al. 1995; FRANKLIN et al. 2005; HERR et<br />

al. 2011). Diese Arbeitsgruppen beschäftigten sich mit der Bestimmung des<br />

tatsächlichen Immunglobulingehaltes im letzten Trimester der Trächtigkeit<br />

und den ersten drei Wochen p.p. In allen Publikationen konnte ein<br />

präpartaler Abfall der IgG- bzw. IgG1-Konzentration nachgewiesen werden.<br />

Allerdings gab es Unterschiede in Bezug auf die absoluten<br />

Immunglobulinkonzentrationen und auf den Beginn des<br />

Konzentrationsabfalls a.p. (Tabelle 6). DETILLEUX et al. (1995) konnten<br />

eine Reduktion des IgG1-Gehaltes von 5,6 mg*ml -1 (fünfte Woche a.p.) bis<br />

auf 2 mg*ml -1 (Geburt) feststellen. Dagegen beschrieben FRANKLIN et al.<br />

(2005) einen kontinuierlichen Abfall der IgG1-Konzentration von der vierten<br />

Woche a.p. bis zur Geburt (von 10,2 ± 0,9 auf 3,3 ± 0,7 mg*ml -1 intra<br />

partum) während HERR et al. (2011) einen Abfall des Gesamt-IgG von 36,8<br />

51


V. Diskussion<br />

± 11,6 mg*ml -1 acht Wochen a.p. auf 18,0 ± 9,1 mg*ml -1 einen Tag vor der<br />

Geburt nachweisen konnten. In der Studie von HERR et al. (2011) wurden<br />

auch unter der Geburt in den unterschiedlichen Geburtsphasen Blutproben<br />

für die Bestimmung für IgG gewonnen. Dabei konnte gezeigt werden, dass<br />

der Abfall der IgG-Konzentration erst bei Expulsion des Fetus mit 15,0 ± 6,4<br />

mg*ml -1 sein Minimum erreichte.<br />

Die Unterschiede in den absoluten Immunglobulinkonzentrationen stehen<br />

sicherlich mit dem versetzten Beginn der Studien in der achten bzw. fünften<br />

und vierten Woche a.p. in Zusammenhang. Außerdem haben HERR et al.<br />

(2011) sich auf die Bestimmung von Gesamt-IgG konzentriert, während in<br />

den anderen Studien IgG1 gemessen wurde. Darüber hinaus wurde die<br />

Studie von FRANKLIN et al. (2005) an 30 Rindern der Rasse Holstein<br />

Friesian und 20 Rindern der Rasse Jersey durchgeführt, wobei die<br />

Versuchs- und Kontrollgruppen unabhängig von der Rassenzugehörigkeit<br />

zusammengesetzt wurden. Weiterhin wurden sowohl die Rinder der<br />

Kontroll- als auch der Versuchsgruppe in der vierten und zweiten Woche<br />

a.p. mit Vakzinen gegen Rota- und Coronaviren sowie E. coli geimpft. Es ist<br />

daher fraglich, ob die angegebenen Immunglobulinkonzentrationen als<br />

Diskussionsgrundlage genutzt werden können, da sie aufgrund der<br />

erfolgten Impfung keine Referenzwerte darstellen können.<br />

DETILLEUX et al. (1995) konnten den Versuch zwar an einer größeren<br />

Tierzahl durchführen (137 Rinder der Rasse Holstein Friesian), Ziel der<br />

Studie war jedoch, eine genetisch determinierte Differenz der<br />

Immunfunktion bei verschiedenen Zuchtlinien milchbetonter Rassen zu<br />

untersuchen. Ebenso wie bei FRANKLIN et al. (2005) wurden die<br />

Konzentrationen von IgG1, IgG2 und IgM mittels radialer Immunodiffusion<br />

(sRid) bestimmt. Diese Methodik der Immunglobulinbestimmung ist<br />

allerdings besonders in dem niedrigen Konzentrationsbereich, in dem sich<br />

die intravasalen Immunglobulinkonzentrationen bewegen, mit nicht zu<br />

vernachlässigenden Ungenauigkeiten belegt (GRANZER 1986).<br />

HERR et al. (2011) verwendeten zur Bestimmung der<br />

Immunglobulinkonzentrationen einen von BENDER (2004) und BENDER<br />

und BOSTEDT (2008) entwickelten kompetitiven ELISA. Allerdings konnte<br />

52


V. Diskussion<br />

mit diesem Verfahren nur die Gesamtkonzentration an IgG bestimmt<br />

werden. Eine Differenzierung zwischen IgG1 und IgG2 war nicht möglich.<br />

Gerade bei der differenzierten Betrachtung der<br />

Immunglobulinkonzentrationen im peripartalen Zeitraum wäre eine<br />

Unterscheidung zwischen den einzelnen Isotypen durchaus interessant.<br />

Zum einen haben die Subtypen unterschiedliche Anteile am Gesamt-IgG<br />

(IgG1 etwa 60%, IgG2 etwa 40% des Gesamt-IgGs) (CURTAIN et al. 1970;<br />

BRANDON u. LASCELLES 1971; BUTLER 1973), zum anderen konnten<br />

SASAKI et al. (1976) in einer ähnlichen Studie ein unterschiedliches<br />

Verhalten der Isotypen im peripartalen Zeitraum zeigen. So kam es vor der<br />

Abkalbung zu einem Abfall von IgG1 im Plasma, während die Konzentration<br />

von IgG2 weitgehend unverändert blieb.<br />

Diese Beobachtung konnte in der vorliegenden Studie bestätigt werden.<br />

Allerdings gab es Unterschiede hinsichtlich der Immunglobulinkonzentration<br />

(Tabelle 6).<br />

HERR et al. (2011) ermittelten in einem ähnlichen Zeitraum (vier Wochen<br />

a.p.) einen Gesamt-IgG-Gehalt von 29,0 ± 11,6 mg*ml -1 . Von der Annahme<br />

ausgehend, dass IgG1 etwa 60% der Gesamt-IgG-Konzentration im Plasma<br />

ausmache (CURTAIN et al. 1970; BRANDON u. LASCELLES 1971; J. E.<br />

BUTLER 1973), errechneten HERR et al. (2011) einen IgG1-Gehalt von<br />

17,4 mg*ml -1 . Dieser Wert liegt deutlich über den Werten aus<br />

vorausgegangenen Studien von DETILLEUX et al. (1995), die fünf Wochen<br />

a.p. einen IgG1-Gehalt von etwa 6,0 mg*ml -1 ermittelten und FRANKLIN et<br />

al. (2005), die in ihrer Studie vier Wochen a.p. eine Konzentration von 10,2<br />

± 0,9 mg*ml -1 für IgG1 nachweisen konnten.<br />

Ähnliche Unterschiede gab es auch in Bezug auf das Ausmaß der<br />

absoluten Konzentrationsabnahme bis zur Geburt. DETILLEUX et al. (1995)<br />

zeigten eine IgG1-Reduktion von 5,6 mg*ml -1 auf 2,0 mg*ml -1 i.p., während<br />

FRANKLIN et al. (2005) einen präpartalen Abfall von 10,2 ± 0,9 mg*ml -1 auf<br />

3,3 ± 0,7 mg*ml -1 i.p. nachweisen konnten. HERR et al. (2011) konnten eine<br />

Abnahme des Gesamt-IgG-Gehaltes von 29,0 ± 11,6 mg*ml -1 auf 15,0 ± 6,4<br />

mg*ml -1 messen und ermittelten daraus rechnerisch eine anteiligen Verlust<br />

von 8,4 mg*ml -1 IgG1.<br />

53


V. Diskussion<br />

In der vorliegenden Studie wurde zum Geburtszeitpunkt ein Gesamt-IgG-<br />

Abfall von 19,85 ± 1,45 auf 14,91 ± 1,68 mg*ml -1 ermittelt. Der zum<br />

Geburtszeitpunkt ermittelte Wert setzte sich aus 2,9 ± 0,27 mg*ml -1 IgG1<br />

und 13,88 ± 1,66 mg*ml -1 IgG2 zusammen. Das bedeutet für IgG1 eine<br />

Gesamtreduktion von etwa 5,3 mg*ml -1 , während die Konzentration von<br />

IgG2 im Vergleich zum Messbeginn sogar um etwa 1,8 mg*ml -1 anstieg.<br />

Dieser Befund entspricht den Ergebnissen von KICKHÖFEN et al. (1968)<br />

und BUTLER (1969), die postulierten, dass nur IgG1 ins Kolostrum<br />

diffundiert, während IgG2 im Plasma verbleibt.<br />

Die Beobachtung, dass es bei der Milchkuh zu einem präpartalen Abfall der<br />

IgG1- und IgM-Konzentrationen kommt, erscheint zunächst widersprüchlich.<br />

Gerade im peripartalen Zeitraum sollte das Muttertier ein stabiles<br />

Immunsystem aufrechterhalten können. Ein bedeutender Faktor für die<br />

intravasale IgG1-Reduktion im letzten Trimester der Trächtigkeit ist die<br />

Diffusion der IgG1-Moleküle ins Kolostrum, wo sie zunächst akkumulieren.<br />

Diese Annahme wird von den Ergebnissen von LARSON (1958) gestützt,<br />

der erstmals präpartal (sechs Wochen a.p. bis zur Geburt) eine Erhöhung<br />

der Immunglobulinfraktion im trockenstehenden Euter bei gleichzeitigem<br />

Abfall der γ- und β-Globuline im Serum nachweisen konnte. Er stellte die<br />

These auf, dass während der Trockenstehphase ein Transfer der<br />

Immunglobuline aus dem Blut in das Euter existieren müsse. Allerdings<br />

konnte LARSON (1958) weder eine qualitative Angabe über den Isotyp<br />

noch eine quantitative Angabe über den absoluten Gehalt der<br />

Immunglobuline treffen. Auch KICKHÖFEN (1968) und BUTLER (1973)<br />

postulierten, die Erniedrigung der intravasalen γ- und β-Globuline in der<br />

Trockenstehperiode beruhe hauptsächlich auf einer Überführung des IgG1<br />

in die Milchdrüse, während IgG2 im Blut verbleibe. DETILLEUX et al. (1995)<br />

und FRANKLIN et al. (2005) beschrieben ebenfalls einen präpartalen Abfall<br />

von IgG1. Durch die vorgelegte Arbeit konnten diese Ergebnisse bestätigt<br />

werden.<br />

PRITCHETT et al. (1991) konnten in einer Studie an 919 Holstein-Friesian-<br />

Kühen zeigen, dass die Abkalbesaison, die Laktationsnummer, die Länge<br />

der Trockenstehperiode, das Zwischenkalbeintervall, die Milch- und<br />

Milchfettproduktion in der gesamten Laktation, das Gewicht des Kolostrums<br />

54


V. Diskussion<br />

und die Dauer von der Abkalbung bis zum ersten Melken einen Einfluss auf<br />

den IgG1-Gehalt im Kolostrum hatten. Somit ist nicht auszuschließen, dass<br />

auch die Immunglobulingehalte im Plasma von diesen Faktoren beeinflusst<br />

werden.<br />

Der Entzug des IgG1 aus dem maternalen Blutkreislauf im letzten Drittel der<br />

Gravidität und dessen Transfer ins Euter ist als physiologischer Vorgang zu<br />

bewerten. BARRINGTON et al. (1997) stellten in diesem Zusammenhang<br />

fest, dass im Eutergewebe trächtiger Milchkühe in der Trockenstehperiode<br />

vor allem IgG1-Rezeptoren exprimiert werden. Dabei konnten in<br />

trockenstehenden Eutern deutlich mehr Rezeptoren nachgewiesen werden<br />

als in laktierenden. So lässt sich die bereits von LARSON (1958),<br />

KICKHÖFEN et al. (1968) und BUTLER (1969) publizierte<br />

Umkompartimentierung der Immunglobuline (vorwiegend IgG1) ins Euter<br />

erklären. Weiterhin wurde der Frage nachgegangen, in welchen Zeitraum es<br />

zum Ausgleich des Verlustes der Immunglobuline im Plasma kommt. In<br />

dieser Studie konnte dabei ab Tag 3 p.p. ein sukzessiver Anstieg der IgG1-<br />

Konzentration im Plasma beobachtet werden. Etwa drei Wochen p.p.<br />

wurden die Ausgangskonzentrationen von IgG1 bereits wieder erreicht. Im<br />

Gegensatz dazu beschrieben HERR et al. (2011) bis zum Tag 7 p.p.<br />

konstant niedrigere Gesamt-IgG-Konzentrationen. Erst danach folgte ein<br />

stetiger Anstieg bis zur vierten Woche p.p. FRANKLIN et al. (2005)<br />

beschrieben zwar auch einen Anstieg der IgG1-Spiegel bis zur dritten<br />

Woche p.p., jedoch eignen sich die Messwerte aufgrund der Vakzinierung<br />

der Studientiere in der zweiten und vierten Woche a.p. nur bedingt zum<br />

Vergleich. Allerdings zeigen die Ergebnisse von DETILLEUX et al. (1995)<br />

einen Anstieg der IgG1-Konzentration. Auf diesem Niveau stagnierten die<br />

Werte bis zum Studienende (fünfte Woche p.p.). Für IgG2 zeigten<br />

DETILLEUX et al. (1995) einen protrahierten Anstieg der<br />

Plasmakonzentration bis zur dritten Woche p.p.<br />

55


V. Diskussion<br />

5.1.2 IgM-Bestimmung im Plasma<br />

Bei der Auswertung der Daten wurde ersichtlich, dass auch im Verlauf der<br />

IgM-Konzentration vom Ende der Laktation bis zur Geburt Unterschiede<br />

bestanden.<br />

In der Studie von FRANKLIN et al. (2005) blieben die IgM-Konzentrationen<br />

von der vierten Woche a.p. bis zur Geburt weitgehend konstant, wobei die<br />

Frage offen bleibt, inwiefern die Impfungen (Vakzinen gegen Rota- und<br />

Coronaviren sowie E. coli in der vierten und zweiten Woche a.p.) Einfluss<br />

auf die IgM-Konzentration genommen haben könnten. DETILLEUX et al.<br />

(1995) zeigten eine Abnahme der IgM-Konzentration von der fünften Woche<br />

a.p. bis zur Geburt, die allerdings statistisch nicht gesichert werden konnte.<br />

Post partum blieben die Werte auf einem konstant niedrigen Niveau. Die<br />

Ausgangskonzentrationen wurden auch zum Studienende nicht wieder<br />

erreicht.<br />

HERR et al. (2011) konnten dagegen ab der vierten Woche a.p. einen hoch<br />

signifikanten Abfall der intravasalen IgM-Konzentration nachweisen, der<br />

sich bis in die subpartale Periode fortsetzte. Nach der Geburt blieben die<br />

IgM-Spiegel über die gesamte Untersuchungsperiode bis zur vierten Woche<br />

p.p. auf einem konstanten Niveau und lagen deutlich unter den<br />

Konzentrationen zu Versuchsbeginn.<br />

Dieser Befund konnte durch die vorliegende Arbeit bestätigt werden.<br />

Allerdings kam es in dieser Studie erst unmittelbar vor der Geburt zu einem<br />

rapiden und sehr starken Abfall der IgM-Konzentration im Plasma. Da ein<br />

ähnliches Verhalten auch für IgG1 im Plasma beschrieben wurde, liegt die<br />

Vermutung nahe, dass auch IgM zum Geburtszeitpunkt ins Kolostrum<br />

umkompartimentiert wird. KICKHÖFEN et al. (1968) und BUTLER (1969)<br />

konnten auch im Kolostrum IgM-Konzentrationen nachweisen, die deutlich<br />

über den Konzentrationen im Plasma lagen. BOURNE und CURTIS (1973)<br />

beschrieben, dass ein großer Anteil des kolostralen IgM aus dem Serum<br />

stammt und mittels eines selektiven Transports aktiv in das Euter<br />

transportiert wird. Weiterhin zeigten BRANDTZAEG (1968) und<br />

56


V. Diskussion<br />

BRANDTZAEG et al. (1970; 1971a), dass menschliche Drüsenepithelien<br />

auch für IgM-Pentamere einen selektiven Transportmechanismus<br />

aufweisen. Hingegen stellten LASCELLES und McDOWELL (1970) die<br />

Vermutung auf, dass das Immunglobulin auf antigene Stimulation hin lokal<br />

im Euter synthetisiert wird.<br />

BARRINGTON et al. (1997) konnten mit Hilfe der Durchflusszytometrie in<br />

kurz vor der Geburt stehenden „trockenen“ Eutergeweben wesentlich<br />

höhere IgM-Konzentrationen nachweisen als in laktierenden Eutergeweben.<br />

Somit ist zumindest denkbar, dass auch eine Umkompartimentierung von<br />

IgM aus dem Plasma ins Euter möglich ist.<br />

UNDERDOWN (1989) konnte zeigen, dass der polymerische<br />

Immunglobulinrezeptor pIgR für den transzellulären Transport von sowohl<br />

dimerem IgA als auch von pentamerem IgM in Mukosa- und Drüsenzellen<br />

zuständig ist. Dieser Rezeptor konnte auch an der basolateralen Membran<br />

der Drüsenepithelzellen im bovinen Euter nachgewiesen werden (MOSTOV<br />

1994; HUNZIKER u. KRAEHENBUHL 1998).<br />

RINCHEVAL-ARNOLD et al. (2002) untersuchten die Ausprägung und die<br />

hormonelle Regulation des pIgR während der Entwicklung der Milchdrüse<br />

im Euter des Schafes. Dabei stellten sie fest, dass es im letzten Trimester<br />

der Trächtigkeit zu einer Akkumulation des Rezeptors im Euter kommt. Eine<br />

Behandlung mit Östradiol-17β und Progesteron führte zu einer leicht<br />

gesteigerten mRNA-Expression des pIgR. Eine zusätzliche Behandlung mit<br />

Glukokortikoiden führte zu einer signifikanten Akkumulation von pIgRmRNA<br />

in der Milchdrüse der behandelten Tiere. Bei Inhibition der Prolaktin-<br />

Sekretion konnte dagegen kein Anstieg in der mRNA-Expression gezeigt<br />

werden. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass eine Kombination<br />

von 17β-Östradiol, Progesteron, Glukokortikoiden und Prolaktin notwendig<br />

ist, um sowohl die Zelldifferenzierung im Euter als auch die Expression des<br />

pIgR zu induzieren. Außerdem kommt es v.a. in stark ausdifferenzierten<br />

Epithelzellen zur maximalen Ausprägung des pIgR.<br />

Zusammenfassend scheint die Expression des pIgR von komplexen<br />

Interaktionen zwischen Steroid- und Peptidhormonen reguliert zu werden.<br />

Dabei spielt der geburtsassoziierte rasche Abfall von Progesteron im<br />

Plasma eine besonders wichtige Rolle. Gleichzeitig kommt es zu einem<br />

57


V. Diskussion<br />

plötzlichen Anstieg von Prolaktin in Zusammenhang mit einem Anstieg der<br />

Glukokortikoid-Konzentration. Zu diesem Zeitpunkt ist Prolaktin<br />

möglicherweise ausschlaggebend für Aufrechterhaltung der pIgR-<br />

Expression auf hohem Niveau (RINCHEVAL-ARNOLD et al. 2002).<br />

In Studien an Ziegen und an Mäusen, bei denen radioaktiv markierte<br />

Disaccharide ins Euter appliziert wurden, konnte gezeigt werden, dass das<br />

Drüsenepithel während der Trächtigkeit auch für größere Moleküle<br />

durchlässig ist. LINZELL und PEAKER (1974) injizierten [ 14 C]-Saccharose in<br />

das Drüsenlumen von Ziegen und konnten den Marker unmittelbar nach der<br />

Injektion im Blut nachweisen. Nur eine geringe Fraktion des Markers war in<br />

der Milch nachweisbar. Im Gegensatz dazu konnte während der Laktation<br />

nach intramammärer Injektion kein Marker im Blut nachgewiesen werden<br />

(NGUYEN u. NEVILLE 1998). Weiterhin konnten LINZELL und PEAKER<br />

(1971, 1974) bei trächtigen Ziegen nachweisen, dass [ 14 C]-Saccharose<br />

auch aus dem Blut in die Milch diffundieren kann. Dass die tight junctions<br />

während der Trächtigkeit für große Moleküle durchlässig sind, wurde im<br />

Drüsenlumen trächtiger Mäuse durch den Transport von<br />

fluoreszenzmarkiertem Albumin und IgG aus dem Lumen ins Interstitium<br />

nachgewiesen (NGUYEN u. NEVILLE 1998). Während der Laktation waren<br />

diese Moleküle im Lumen der Milchdrüse gebunden.<br />

Elektronenmikroskopische Studien von PITELKA et al. (1973) zeigten, dass<br />

das Netzwerk der tight junctions während der Trächtigkeit noch<br />

unorganisiert ist und weniger Zell-Zell-Verbindungen aufweist als das hoch<br />

organisierte tight junctions-Netzwerk während der Laktation.<br />

Ergebnisse mehrerer Studien (LINZELL et al. 1975; ZETTL et al. 1992;<br />

FLINT u. GARDNER 1994; SINGER et al. 1994; THOMPSON 1996;<br />

NGUYEN et al. 2001) weisen darauf hin, dass Progesteron, Prolaktin und<br />

Glukokortikoide eine Rolle in der Regulation der tight junctions im<br />

Drüsenepithel der Milchdrüse spielen. Progesteron verhindert den Schluss<br />

der tight junctions während der Trächtigkeit, möglicherweise mit lokalen<br />

Faktoren wie TGF-β und Prostaglandin. Glukokortikoide werden für die<br />

Differenzierung des Drüsenepithels von trächtigen zum laktierenden Tier<br />

benötigt. Auch Prolaktin wird mit der Regulation der tight junctions im<br />

Drüsenepithel der Milchdrüse in Verbindung gebracht.<br />

58


V. Diskussion<br />

Weiterhin kommt es auf zellulärer Ebene zum Geburtszeitpunkt zu einer<br />

Reduktion der T- und B-Zellen im Blut. Um eine Immunantwort leisten zu<br />

können, ist eine zusätzliche Hilfe von antigenspezifischen T-Helferzellen für<br />

die B-Zellen sehr entscheidend. Die T-Zellhilfe führt zu Aktivierung,<br />

Proliferation und Ausdifferenzierung der B-Zellen in Antikörperproduzierende<br />

Plasmazellen (KUCHEN et al. 2007). Dieses könnte sich<br />

evtl. auch auf die Gesamtkonzentrationen der Immunglobuline im Plasma<br />

auswirken. Dazu kommt, dass IgM – zusammen mit IgA – eine deutlich<br />

geringere Halbwertszeit im Plasma hat (ca. vier Tage), da es durch pIgR<br />

schneller aus der Zirklulation entfernt werden kann (GODDEERIS 1998).<br />

Es kann nur spekuliert werden, ob sich der rapide Abfall der IgM-<br />

Konzentrationen im Plasma mit der Durchlässigkeit des Drüsenepithels a.p.<br />

erklären lässt, oder ob durch den pIgR doch ein aktiver Transport ins<br />

Drüsenlumen geschieht.<br />

Tabelle 6: Vergleich zwischen Literaturdaten und eigenen Messungen der Immunglobulinspiegel im<br />

Plasma a.p.<br />

59


V. Diskussion<br />

5.2 Abhängigkeit der Ig-Plasmakonzentrationen von der Laktationszahl<br />

Weiterhin wurde untersucht, ob eine Beziehung zwischen der<br />

Laktationsanzahl und der peripartalen Abnahme der IgG-Konzentration im<br />

Plasma besteht. HERR et al. (2011) gingen dieser Fragestellung in ihrer<br />

Studie erstmals nach, konnten allerdings über den gesamten<br />

Untersuchungszeitraum hinweg weder signifikante Unterschiede in den<br />

absoluten IgG-Konzentrationen noch einen von der Laktationszahl<br />

abhängigen IgG-Abfall a.p. feststellen.<br />

Im Gegensatz dazu konnten in dieser Studie für IgG1 deutliche<br />

Unterschiede zwischen den einzelnen Laktationsgruppen festgestellt<br />

werden. Insgesamt zeigten Kühe mit zwei oder mehr Laktationen über die<br />

gesamte Versuchsperiode signifikant höhere IgG1-Plasmaspiegel als Tiere<br />

in der ersten Laktation (11,4 ± 1,33 mg*ml -1 respektive 4,05 ± 0,79 mg*ml -1 ).<br />

Zur Geburt hin war bei diesen Tieren ebenfalls ein stärkerer Abfall von IgG1<br />

zu beobachten, ebenso wie ein steilerer Anstieg der Plasma-IgG1-<br />

Konzentration p.p..<br />

Im Verlauf von IgG2 und IgM konnten dagegen keine Unterschiede<br />

zwischen den einzelnen Laktationsgruppen festgestellt werden.<br />

5.3 Abhängigkeit der Ig-Plasmakonzentrationen von der Fütterung<br />

Im weiteren Verlauf wurde der Einfluss einer CLA-supplementierten<br />

Fütterung auf den Verlauf der unterschiedlichen Immunglobulin-Isotypen<br />

untersucht.<br />

Wie bereits erwähnt, wird die Immunfunktion von Milchkühen durch eine<br />

immunsupprimierte Zeitspanne um den Geburtszeitpunkt herum<br />

charakterisiert. Diese Immunsuppression führt u.a. zu einer reduzierten<br />

Monozytenantwort (peripheral blood mononuclear cells, PBMCs) auf<br />

Antigenstimulation (NONNECKE et al. 2003; LOISELLE et al. 2009). Dieses<br />

könnte durch eine p.p. erhöhte FFS-Konzentration im Serum hervorgerufen<br />

werden, die bei der erhöhten Fettmobilisierung in der Frühlaktation<br />

60


V. Diskussion<br />

freigesetzt werden. LACETERA et al. (2004b) konnten bereits zeigen, dass<br />

FFS die Proliferation von bovinem PBMCs in vitro hemmen. STAPLES et al.<br />

(2008) postulierten, dass eine Linolsäure-supplementierte Fütterung die<br />

Freisetzung von Prostaglandin F (PGF)-Metaboliten erhöhen könnte, da<br />

Linolsäure als Vorstufe dieses Metaboliten dient. Dieses kann um den<br />

Geburtszeitpunkt herum durchaus von Vorteil sein, da PGF-2α<br />

proinflammatorisch wirkt und somit zur Migration neutrophiler Granulozyten<br />

an den Ort des entzündlichen Geschehens beiträgt, so dass Entzündungen<br />

effektiver bekämpft werden können. Weiterhin wiesen Kühe, die mit CLA<br />

supplementiert worden waren, u.a. höhere Antikörperkonzentrationen im<br />

Kolostrum auf.<br />

Der Gehalt an FFS und BHB im Plasma der Tiere der vorliegenden<br />

Untersuchung wurde in einer anderen Studie bestimmt (PETZOLD et al.<br />

2013). Dabei konnte kein Einfluss der Fütterung nachgewiesen werden.<br />

Weiterhin konnte in der vorliegenden Studie entgegen den Ergebnissen von<br />

HUSSEN (2011b) ebenfalls kein Einfluss der Fütterung auf den Verlauf von<br />

IgG1, IgG2 und IgM nachgewiesen werden. Allerdings handelte es sich bei<br />

der Studie von HUSSEN (2011a, b) um eine Langzeitstudie, die einen<br />

Zeitraum von Tag -21 bis Tag 252 relativ zur Abkalbung untersuchte. Dabei<br />

traten die immunsuppressiven Effekte in der CLA100-Gruppe erst ab Tag<br />

21 p.p. auf. Von Tag 21 bis Tag 182 p.p. zeigte die CLA100-Gruppe<br />

signifikant niedrigere Anteile an CD4+αβ-T-Zellen als die Kontrollgruppe.<br />

Diese Wirkung zeigte vier Wochen nach dem Absetzen der CLAs (ab Tag<br />

210 p.p.) einen rückläufigen Effekt. Die IgG1- und IgG2-Spiegel waren in<br />

der CLA100-Gruppe ab Tag 7 p.p. signifikant niedriger als in den beiden<br />

anderen Gruppen. CLA100-Kühe zeigten ebenfalls signifikant niedrigere<br />

Milch-IgG1-Spiegel, verglichen mit den beiden anderen Gruppen.<br />

Die signifikant unterschiedlichen Mittelwerte für IgM an Tag 42 der<br />

vorliegenden Studie ergeben sich zwischen den Kontrollgruppen und der<br />

CLA-60B-Gruppe, die zu diesem Versuchszeitpunkt keinen Unterschied in<br />

der Fütterung der Kontrollgruppe aufwies. Somit sind die Unterschiede<br />

wahrscheinlich auf den geringen Stichprobenumfang und starke individuelle<br />

Schwankungen zurückzuführen.<br />

61


V. Diskussion<br />

Allerdings stammten in der vorliegenden Studie 75% der an Mastitis<br />

erkrankten Tiere (21 von insgesamt 28 Erkrankten) aus den mit CLA<br />

supplementierten Fütterungsgruppen. Dieser Befund passt zu den von<br />

HUSSEN et al. (2011a, b) gemachten Beobachtungen, dass die mit CLA<br />

gefütterten Tiere eine Depression der CD4+-T-Zellen zeigten. CD4+αβ-T-<br />

Helferzellen spielen eine zentrale Rolle in der Regulation des adaptiven<br />

Immunsystems (ROMANGNANI 2006). Ihre Bedeutung wird besonders<br />

deutlich bei angeborenen Infekten oder Infektionen, die zum Ausfall dieser<br />

Zellen führen. Ein Beispiel dafür ist das Humane Immundefizinz-Virus (HIV)<br />

(PIRZADA et al. 2006). CD4+αβ-T-Zellen erkennen die von MHC-Klasse-II<br />

präsentierten Peptide und sind, u.a. durch Sekretion von Zytokinen, für die<br />

Aktivierung von Makrophagen verantwortlich. Weiterhin unterstützen sie<br />

zytotoxische T-Zellen bei ihrer Aufgabe, virusinfizierte oder tumorentartete<br />

Zellen abzutöten und helfen B-Zellen bei der humoralen Immunantwort<br />

gegen T-Zell-abhängige Antigene (JANEWAY u. TRAVERS 2005).<br />

5.4 Abhängigkeit der Ig-Plasmakonzentrationen von der Energiebilanz<br />

Um eine Übersicht über die Stoffwechselsituation der Milchkühe im<br />

Versuchszeitraum zu erhalten, wurde die Energiebilanz berechnet und<br />

diese dann mit den Immunglobulinspiegeln im Plasma in Beziehung gesetzt.<br />

Tiere in der ersten Laktation wiesen über den gesamten Versuchszeitraum<br />

eine positivere Energiebilanz als Tiere in höheren Laktationen auf. In<br />

Zusammenhang mit der Milchleistung wird ersichtlich, dass die Färsen über<br />

den gesamten Versuchszeitraum hinweg deutlich weniger Milch<br />

produzierten als Kühe der 2. oder > 2. Laktation. Die<br />

Landwirtschaftskammer Schleswig-Holstein (MAHLKOW-NERGE 2012) gab<br />

für Färsen eine Jahresmilchmenge von 7.500 kg ECM (energy corrected<br />

milk) an, während Kühe der 2. Laktation 9.980 kg ECM und Kühe der 3.<br />

Laktation 10.469 kg ECM erreichten. Folglich liegt die Schlussfolgerung<br />

nahe, dass Färsen aufgrund ihrer geringeren Milchleistung auch einen<br />

geringeren Energieverlust zu Beginn der Laktation auszugleichen haben<br />

62


V. Diskussion<br />

und somit bereits früher als ältere Kühe wieder eine positive Energiebilanz<br />

aufweisen.<br />

Negative Effekte einer Energiemangelsituation auf Komponenten der<br />

zellulären Immunität sind bereits bekannt. Um proliferieren zu können, ist<br />

ausreichend Glukose für Lymphozyten essentiell (FOX et al. 2005).<br />

MEHRZAD et al. (2002) konnten im peripartalen Zeitraum außerdem eine<br />

signifikante Reduktion der Lymphozyten nachweisen. Da ihnen die<br />

Fähigkeit der autonomen Kontrolle für die Aufnahme der notwendigen<br />

metabolischen Substrate fehlt, sind auch T-Zellen von Glukose, Fettsäuren<br />

und Aminosäuren aus ihrer extrazellulären Umgebung angewiesen.<br />

Außerdem wird Energie für die Aktivierung von T-Zellen benötigt. Ruhende<br />

T-Zellen nutzen den Großteil ihrer Energiereserven, um ihren Stoffwechsel<br />

aufrecht zu erhalten. Stehen einer ruhenden T-Zelle nicht genügend<br />

Nährstoffe für die Aufrechterhaltung ihres Stoffwechsels zur Verfügung, wird<br />

die Apoptose der Zelle eingeleitet. Auch die replikative Zellteilung nach<br />

Antigenkontakt ist ein sehr energieaufwändiger Prozess, bei dem es bei<br />

naiven T-Zellen zu einem etwa 20-fachen Anstieg der Glukoseaufnahme<br />

innerhalb einer Stunde kommen kann (FOX et al. 2005). MEHRZAD et al.<br />

(2002) zeigten eine peripartale Reduktion der neutrophilen Granulozyten<br />

beim Rind. Die Zellen wiesen zwar eine erhöhte Phagozytoseleistung auf,<br />

zeigten aber ebenfalls eine reduzierte respiratory burst-Aktivität, was in<br />

einer verminderten bakteriziden Wirkung resultierte. Trotz dieser Einflüsse<br />

einer negativen Energiebilanz auf einige Zellen des angeborenen<br />

Immunsystems gibt es bisher keine Studien über die Auswirkungen eines<br />

Glukosemangels auf B-Zellen. Allerdings konnte in dieser Studie gezeigt<br />

werden, dass eine negative Energiebilanz zu keinem der untersuchten<br />

Zeitpunkte mit den Antikörpergehalten im Plasma korreliert.<br />

5.5 Immunglobulinbestimmung im Kolostrum<br />

Der Gesamt-IgG-Gehalt im Kolostrum spricht mit 61,51 ± 4,71 mg*ml -1 für<br />

ein qualitativ hochwertiges Kolostrum. Nach GUY et al. (1994) und<br />

ARTHINGTON et al. (1997) sollte hochwertiges Kolostrum mindestens 50<br />

mg*ml -1 an IgG enthalten.<br />

63


V. Diskussion<br />

5.5.1 Abhängigkeit der Immunglobulinkonzentrationen von der<br />

Laktationszahl<br />

Die Unterschiede zwischen den einzelnen Laktationsgruppen konnten auch<br />

bei der Bestimmung der Immunglobulinsubtypen im Kolostrum beobachtet<br />

werden. Auch hier gab es deutliche Unterschiede im IgG1-Gehalt in<br />

Abhängigkeit der Laktationszahl. Dabei wiesen Färsen an Tag 1 die<br />

höchsten gemessenen Werte an IgG1 im Kolostrum auf. Im Gegensatz<br />

dazu wiesen diese Tiere deutlich niedrigere Werte von kolostralem IgG2 auf<br />

(8,40 ± 1,41 mg*ml -1 ) als die Tiere der anderen Laktationsgruppen (11,65 ±<br />

2,45 mg*ml -1 für Tiere der 2. Laktation respektive 11,97 ± 3,10 mg*ml -1 für<br />

Tiere der > 2. Laktation).<br />

Diese Beobachtungen stehen im Gegensatz zum aktuellen<br />

wissenschaftlichen Stand. In einer Studie von SHEARER et al. (1992)<br />

wurden für Erstkalbende signifikant niedrigere Immunglobulingehalte<br />

ermittelt. Allerdings unterschieden sie nicht zwischen den unterschiedlichen<br />

Immunglobulin-Isotypen, sondern schätzten den gesamten<br />

Immunglobulingehalt ausschließlich anhand einer speziell entwickelten<br />

Skala am Kolostrometer, die auf dem Zusammenhang zwischen der<br />

spezifischen Schwerkraft des Kolostrums und seines<br />

Immunglobulingehaltes beruht (FLEENOR u. STOTT 1980). Auch andere<br />

Autoren postulierten bereits die These, dass die Konzentration an<br />

kolostralen Immunglobulinen in der ersten Laktation am niedrigsten ist und<br />

mit zunehmender Laktationsnummer steigt (KRUSE 1970 b; FOLEY u.<br />

OTTERBY 1978; DEVERY-POCUS u. LARSON 1983). In Studien von<br />

PRITCHETT et al. (1991) sowie MOORE et al. (2005) und KEHOE et al.<br />

(2011) wurde der Gehalt von Gesamt-IgG bzw. IgG1 im Kolostrum mittels<br />

sRID bestimmt. Auch hier wurde ein höherer Immunglobulingehalt bei<br />

Kühen in der dritten Laktation als bei Kühen der ersten oder zweiten<br />

Laktation nachgewiesen. Ein möglicher Grund für die Abweichung der<br />

Ergebnisse der vorliegenden Studie von ähnlichen Studien könnte in der<br />

gewählten Messtechnik liegen. Wie bereits erwähnt, kann es bei der sRID-<br />

64


V. Diskussion<br />

Methode zu nicht zu vernachlässigenden Messungenauigkeiten kommen.<br />

Des Weiteren wurden auch in dieser Studie bei der Bestimmung des<br />

Gesamt-IgG-Gehaltes im Kolostrum keine Unterschiede zwischen den<br />

einzelnen Laktationszahlen festgestellt. Erst bei der getrennten<br />

Untersuchung der einzelnen Isotypen wurden diese Unterschiede deutlich.<br />

KEHOE et al. (2011) konnten weiterhin in ihrer Studie zeigen, dass die IgG-<br />

Konzentration mit steigendem Volumen des Kolostrums abnimmt. Dieses<br />

widerspricht den in derselben Studie ermittelten Ergebnissen, dass das<br />

Kolostrum von Färsen geringere Immunglobulinkonzentrationen aufweist als<br />

das von multiparen Kühen. PRITCHETT et al. stellten bereits 1991 fest,<br />

dass die Immunglobulinkonzentrationen im Kolostrum mit steigender<br />

Erstgemelkmenge abnimmt. Gerade hoch leistende Milchkühe produzieren<br />

eine weitaus größere Menge an Kolostrum als Färsen. Bei steigender<br />

Milchmenge in höheren Laktationen kann auch ein Verdünnungseffekt nicht<br />

ausgeschlossen werden.<br />

Weiterhin zeigte sich, dass die gemessen kolostralen Werte der<br />

vorliegenden Studie mit den Ergebnissen von STENGEL (1998) und HERR<br />

et al. (2011) übereinstimmen (Tabelle 7).<br />

Tabelle 7: Vergleich zwischen Literaturdaten und eigenen Messungen der Immunglobulinspiegel im<br />

Kolostrum<br />

65


V. Diskussion<br />

5.6 Immunglobulinbestimmung im Plasma der Kälber<br />

Aufgrund der plazentären Verhältnisse ist beim Rind, im Gegensatz zu<br />

Nagetieren, Primaten und dem Menschen eine diaplazentare Übertragung<br />

maternaler Antikörper zur passiven Immunisierung des Fetus nicht möglich.<br />

Bei der Placenta epitheliochorialis cotyledonaria des Rindes kann der fetomaternale<br />

Stoffaustausch ausschließlich durch Endo- und Exozytose<br />

erfolgen (BOSTEDT 2004). Eine erleichterte Diffusion zum Transport<br />

höhermolekularer Substanzen ist nicht möglich (SAMUEL et al. 1976).<br />

Durch die Plazenta des Rindes können nur kleinere Moleküle aus dem<br />

Kreislauf der Mutter in den des Fetus übertreten (BJÖRCKMAN 1954).<br />

Immunglobuline können somit als Makromoleküle die Plazentarschranke<br />

des Rindes nicht penetrieren (SCHNORR 1996). Somit verfügen<br />

neugeborene Kälber zum Zeitpunkt der Geburt nicht über maternale<br />

Antikörper. In neueren Studien von STENGEL (1998), BENDER (2004) und<br />

LACK (2006) konnte jedoch gezeigt werden, dass Kälber bereits vor der<br />

ersten Kolostrumaufnahme geringe Mengen an IgG und IgM im Plasma<br />

aufweisen.<br />

Dieses konnte auch in vorliegender Studie bestätigt werden. Wahrscheinlich<br />

stammen diese Immunglobuline aus eigener Synthese. Dass Kälber bereits<br />

im letzten Trimester der Gravidität ein vollständig entwickeltes<br />

Immunsystem aufweisen und mit einer adaptiven Immunantwort auf<br />

entsprechende Stimuli reagieren können, konnten auch KELLING und<br />

TOPLIFF (2013) in ihrer Studie zeigen.<br />

66


VI. Zusammenfassung<br />

VI. ZUSAMMENFASSUNG<br />

Jana Horn<br />

Konzentrationen der Immunglobuline IgG1, IgG2 und IgM im peripartalen<br />

Zeitraum unter Berücksichtigung der Energiebilanz sowie der Fütterung mit<br />

konjugierten Linolsäuren<br />

Bei hochleistenden Milchkühen kommt es mit Einsetzen der Milchproduktion zu<br />

einem Ungleichgewicht zwischen Energieaufnahme und Energieabgabe, was zur<br />

Ausprägung einer negativen Energiebilanz führt. Gerade in diesem Zeitraum haben<br />

die Tiere eine erhöhte Anfälligkeit für so genannte „Produktionskrankheiten“ wie<br />

Labmagenverlagerung, Nachgeburtsverhaltung, Klauenerkrankungen, Ketose,<br />

Mastitis und andere fieberhafte Erkrankungen. Es ist bereits bekannt, dass die<br />

Supplementierung von konjugierten Linolsäuren (CLAs) positive Effekte auf die<br />

Gesundheit der Milchkühe haben kann. Weiterhin sind bereits negative Effekte eines<br />

Energiemangels auf einige Immunzellen wie neutrophile Granulozyten und T-<br />

Lymphozyten beschrieben worden. Ziel dieser Studie war es, den Verlauf und das<br />

Verhalten der Immunglobulin-Isotypen IgG1, IgG2 und IgM im peripartalen Zeitraum<br />

unter der Berücksichtigung einer CLA-Fütterung sowie der Energiebilanz zu<br />

untersuchen.<br />

21 Tage vor dem errechneten Geburtstermin wurden 63 hochtragende Milchkühe in<br />

vier Fütterungsgruppen eingeteilt (CLA bzw. Kontrollfett, hohe bzw. niedrigere<br />

Kraftfutterkonzentration). Über einen Versuchszeitraum von insgesamt 11 Wochen<br />

wurden den Tieren in regelmäßigen Abständen Blut- und Milchproben entnommen.<br />

Weiterhin wurden den Kälbern vor und nach ihrer ersten Kolostrumaufnahme sowie<br />

an Tag 42 ebenfalls Plasmaproben entnommen. Die Bestimmung der<br />

Immunglobuline IgG1, IgG2 und IgM in Plasma und Kolostrum erfolgte mittels eines<br />

enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) mit spezifischen Antikörpern.<br />

Sowohl IgG1 als auch IgM zeigten um den Geburtszeitpunkt einen signifikanten<br />

Abfall der Plasmakonzentrationen. Dieser war für IgM bereits kurz nach der Geburt<br />

wieder ausgeglichen, während die Plasmaspiegel von IgG1 langsamer ansteigen und<br />

etwa drei Wochen p.p. wieder Konzentrationen wie zu Versuchsbeginn zeigten. Die<br />

Plasmaspiegel von IgG2 blieben über die gesamte Versuchsperiode konstant. Der<br />

67


VI. Zusammenfassung<br />

Verlauf von IgG1 zeigte eine starke Abhängigkeit von der Laktationszahl. Färsen<br />

wiesen deutlich niedrigere Plasmaspiegel auf als ältere Kühe und zeigten um den<br />

Geburtszeitpunkt herum keinen deutlichen Abfall der Plasmakonzentrationen. Die<br />

Fütterung hatte keinen Einfluss auf die Höhe der Immunglobulinspiegel im Plasma.<br />

Auch die Energiebilanz korrelierte zu keinem Zeitpunkt mit den Plasma-<br />

Immunglobulinkonzentrationen. Sowohl IgG1 als auch IgG2 und IgM waren im<br />

Kolostrum nachweisbar, wobei das Verhältnis IgG1:IgG2:IgM etwa 4:2:1 betrug.<br />

Färsen hatten die höchsten IgG1- und die niedrigsten IgG2-Konzentrationen im<br />

Kolostrum. Dieser Befund steht im Gegensatz zu den Ergebnissen der einschlägigen<br />

Literatur. Dieses könnte einerseits an der in den meisten Studien verwendeten<br />

Methodik (sRid) liegen. Andererseits muss bei den älteren Tieren auch ein<br />

Verdünnungseffekt in Betracht gezogen werden, so dass die absoluten<br />

Immunglobulinkonzentrationen relativiert werden.<br />

Bei den Kälbern konnten bereits vor der ersten Kolostrumaufnahme geringe<br />

Plasmaspiegel aller drei untersuchten Immunglobulin-Isotypen nachgewiesen<br />

werden. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass Kälber bereits ante partum in der<br />

Lage sind, geringe Mengen an Immunglobulinen selbst zu synthetisieren.<br />

Ziel weiterer Studien soll es sein, den Einfluss der Energiebilanz auf die zellulären<br />

Komponenten des Immunsystems zu untersuchen.<br />

68


VII. Summary<br />

VII. SUMMARY<br />

Jana Horn<br />

Concentrations of IgG1, IgG2 and IgM in plasma and colostrum of high yielding<br />

dairy cattle during the periparturient period with special reference to energy<br />

balance and conjugated linoleic acids as feed supplements.<br />

In early lactation, high yielding dairy cows are unable to meet their energy<br />

requirements for both maintenance and milk production. This leads to a high energy<br />

deficit. During this period, there is a higher risk for “production diseases” such as left<br />

abomasal displacement, retained placenta, lameness, ketosis, mastitis and other<br />

febrile diseases. It is recently known, that supplementation of conjugated linoleic<br />

acids could have positive effects on the health status of dairy cattle. Furthermore,<br />

high energy deficit leads to negative effects on several cell types of the immune<br />

system, such as neutrophils and T-cells.<br />

The study aimed to characterize the development of IgG1, IgG2 and IgM during the<br />

periparturient period in consideration of energy balance as well as supplementation<br />

with conjugated linoleic acids.<br />

Three weeks prior to calving, 63 pregnant German Holstein cows were assigned to<br />

one of four dietary treatments (CLA supplement respectively control fat, high<br />

respectively low concentrate diet). Plasma and milk samples were taken in regular<br />

intervals over a period of 11 weeks, respectively. Furthermore, plasma samples of<br />

their calves were taken prior and after their first Colostral uptake and on day 42.<br />

Bovine IgG1, IgG2 and IgM in plasma and colostrum were determined by an enzyme<br />

linked immunosorbent assay (ELISA) using isotype-specific coating and detection<br />

antibodies.<br />

In plasma, both IgG1 and IgM show a significant decrease around parturition. For<br />

IgM, the decline was equalized shortly after parturition, whereas IgG1 showed initial<br />

plasma values around 3 weeks p.p. Plasma levels of IgG2 remained unchanged<br />

during the entire experimental period. The developing of IgG1 revealed a strong<br />

dependency on the lactation number. Heifers had significantly lower plasma levels<br />

over the entire period and did not show such a distinct decrease around parturition.<br />

69


VII. Summary<br />

Dietary treatments had no effect on immunoglobulin plasma levels. IgG1, IgG2 and<br />

IgM were detectable in colostrum in which the ratio IgG1:IgG2:IgM was 4:2:1. Heifers<br />

showed the highest amounts of IgG1 and the lowest amounts of IgG2 in colostrum.<br />

These findings do not agree with the common literature, which could be due to the<br />

determination technique used in most of the studies (sRid). In addition, especially in<br />

older animals an effect of dilution cannot be excluded.<br />

In calves, low plasma levels of all examinated immunoglobulins could be detected<br />

even before their first colostral uptake. These results indicate, that calves are able to<br />

synthezise small amounts of immunoglobulins even ante partum.<br />

Further studies should be conducted to examine the influence of negative energy<br />

balance on cellular components of the immune system.<br />

70


VIII. Literaturverzeichnis<br />

IX. LITERATURVERZEICHNIS<br />

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v


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WILTBANK, M., H. LOPEZ, R. SARTORI, S. SANGSRITAVONG u. A. GÜMEN<br />

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Proceedings of the national academy of sciences U.S.A. 89, 9069-9073<br />

vi


IX. Anhang<br />

X. ANHANG<br />

Verwendete Chemikalien<br />

Dimethylsulfoxid (DMSO)<br />

Di-Natriumhydrogenphosphat (Na 2 HPO 4 )<br />

Natriumcarbonat (Na 2 CO 3 )<br />

Natriumchlorid (NaCl)<br />

Natrium-Dihydrogenphosphat (NaH 2 PO 4 )<br />

Natriumhydrogencarbonat (NaHCO 3 )<br />

Schwefelsäure (H 2 SO 4 ), 1N<br />

Tetramethylbenzidin (TMB)<br />

Tween 20<br />

Wasserstoffperoxid (H 2 O 2 ), 30%<br />

Zitronensäure-Monohydrat (Citrat)<br />

Sigma-Aldrich, Steinheim<br />

Sigma-Aldrich, Steinheim<br />

Sigma-Aldrich, Steinheim<br />

Roth, Karlsruhe<br />

Roth, Karlsruhe<br />

Sigma-Aldrich, Steinheim<br />

Merck KG aA, Darmstadt<br />

Sigma-Aldrich, Steinheim<br />

Sigma-Aldrich, Karlsruhe<br />

Merck KG aA, Darmstadt<br />

Roth, Karlsruhe<br />

a


IX. Anhang<br />

Tabelle 8: Durchführung ELISA<br />

Arbeitsschritt Temperatur Menge in µl/Well Zeit<br />

Coaten der<br />

Mikrotiterplatte mit<br />

Sheep Anti-Bovine<br />

IgG1- bzw. IgG2-<br />

Antikörper und<br />

Coating-Puffer<br />

Waschen mit B-Puffer<br />

Inkubation mit<br />

Erstantikörper<br />

Waschen mit B-Puffer<br />

Inkubation mit<br />

Detektionsantikörper<br />

Waschen mit B-Puffer<br />

Inkubation mit<br />

Substratlösung<br />

Stoppen der<br />

Farbreaktion mit<br />

Stopplösung<br />

Messung der<br />

Extinktion bei 450 nm<br />

und 630 nm<br />

Raumtemperatur<br />

(RT) bzw. 4°C<br />

RT<br />

75 µl<br />

5 Waschgänge mit je<br />

300 µl B-Puffer/Well<br />

RT 75 µl<br />

RT<br />

5 Waschgänge mit je<br />

300 µl B-Puffer/Well<br />

RT 75 µl<br />

RT<br />

5 Waschgänge mit je<br />

300 µl B-Puffer/Well<br />

30 min auf dem<br />

Schüttler, dann über<br />

Nacht bei 4°C<br />

4 min<br />

1 h auf dem<br />

Schüttler<br />

4 min<br />

45 min auf dem<br />

Schüttler<br />

4 min<br />

RT 75 µl 15 – 20 min<br />

RT 50 µl<br />

b


IX. Anhang<br />

Tabelle 9: Verwendete Antikörper<br />

Name<br />

Sheep Anti-Bovine IgG1<br />

Sheep Anti-Bovine IgG2<br />

Sheep Anti-Bovine IgM<br />

HRP conjugated Sheep Anti-Bovine IgG1<br />

HRP conjugated Sheep Anti-Bovine IgG2<br />

HRP conjugated Sheep Anti-Bovine IgM<br />

Bovine Immunoglobulin Reference Serum<br />

A10-116A<br />

Bethyl Laboratories Inc., Montgomery,<br />

Texas, USA<br />

A10-117A<br />

Bethyl Laboratories Inc., Montgomery,<br />

Texas, USA<br />

A10-101A<br />

Bethyl Laboratories Inc., Montgomery,<br />

Texas, USA<br />

A10-116P<br />

Bethyl Laboratories Inc., Montgomery,<br />

Texas, USA<br />

A10-117P<br />

Bethyl Laboratories Inc., Montgomery,<br />

Texas, USA<br />

A10-101P<br />

Bethyl Laboratories Inc., Montgomery,<br />

Texas, USA<br />

RS10-103<br />

Bethyl Laboratories Inc., Montgomery,<br />

Texas, USA<br />

c


IX. Anhang<br />

Tabelle 10: Übersicht über verwendete Lösungen<br />

Name<br />

Zusammensetzung<br />

Coating-Puffer („A-Puffer“)<br />

Verdünnungspuffer („B-Puffer”)<br />

Substratpuffer („C-Puffer“)<br />

Substrat<br />

Substratlösung<br />

15 mM Na 2 CO 3<br />

35 mM NaHCO 3<br />

pH = 9,6<br />

2,5 mM NaH 2 PO 4<br />

7,5 mM Na 2 HPO 4<br />

145 mM NaCl<br />

0,1% Tween 20<br />

pH = 7,2<br />

33,3 mM Citrat<br />

66,7 mM Na 2 HPO 4<br />

pH = 5,0<br />

1,5 mg 3,3,‘5,5‘-Tetramethylbenzidine (TMB,<br />

Sigma) gelöst in 1,0 ml DMSO<br />

1 ml TMB<br />

10 ml Substratpuffer („C-Puffer“)<br />

40 µl H 2 O 2<br />

Stopplösung 1 N H 2 SO 4<br />

d


IX. Anhang<br />

Tabelle 11: Zusammensetzung der verwendeten Puffer<br />

Puffer A COATING pH 9,6<br />

Substanz Molar H 2 O MW g/L g/0,5 l<br />

1 a<br />

0x 105,99 1,590 0,795<br />

b<br />

1x 124,00 1,860 0,930<br />

Na 2 CO 3 0,015<br />

c<br />

10x 286, 14 4,292 2,146<br />

2 a NaHCO 3 0,035 0x 84,01 2,940 1,470<br />

Puffer B WASCHEN / VERDÜNNEN pH 7,2<br />

Substanz Molar H 2 O MW g/L g/5,0 l 1<br />

1 a<br />

0x 120,00 0,300 15,00<br />

b<br />

1x 137,99 0,345 17,25<br />

NaH 2 PO 4 0,0025<br />

c<br />

2x 156,01 0,390 19,50<br />

2 a<br />

b<br />

0x<br />

2x<br />

142,00<br />

177,99<br />

1,065<br />

1,335<br />

53,25<br />

66,75<br />

c<br />

0,0075 7x 268,07 2,010 100,53<br />

Na 2 HPO 4<br />

d<br />

12x 358,14 2,686 134,30<br />

3 a NaCl 0,1450 0x 58,44 8,474 423,69<br />

4 a Tween 20<br />

final<br />

vom Tween 20 aus der Flasche<br />

(0,1%)<br />

1 ml 50 ml<br />

Puffer C SUBSTRAT pH 5,0<br />

Substanz Molar H 2 O MW g/L g/5,0 l 2<br />

1 a<br />

0x 192,13 6,398 3,199<br />

Citrat 0,0333<br />

b<br />

1x 210,14 6,998 3,499<br />

2 a<br />

b<br />

0x<br />

2x<br />

142,00<br />

177,99<br />

9,467<br />

11,866<br />

4,733<br />

5,933<br />

c<br />

0,0667 7x 268,07 17,871 8,936<br />

Na 2 HPO 4<br />

d<br />

12x 358,14 23,867 11,938<br />

1 Konzentrat (auf 5,0 l): pH 6,8<br />

e


IX. Anhang<br />

Originaldaten<br />

Tabelle 12: Originaldaten IgG1 (Plasma)<br />

71


IX. Anhang<br />

Tabelle 13: Originaldaten IgG2 (Plasma)<br />

72


IX. Anhang<br />

Tabelle 14: Originaldaten IgM (Plasma)<br />

73


IX. Anhang<br />

Tabelle 15: Originaldaten IgG1 (Plasma) und EB (Tier 1 bis 36)<br />

74


IX. Anhang<br />

Tabelle 16: Originaldaten IgG1 (Plasma) und EB (Tier 37 bis 66)<br />

75


IX. Anhang<br />

Tabelle 17: Originaldaten IgG2 (Plasma) und EB (Tier 1 bis 39)<br />

76


IX. Anhang<br />

Tabelle 18: Originaldaten IgG2 (Plasma) und EB (Tier 40 bis 66)<br />

77


IX. Anhang<br />

Tabelle 19: Originaldaten IgM (Plasma) und EB<br />

78


IX. Anhang<br />

Tabelle 20: Originaldaten Kolostrum (Tier 1 bis 59)<br />

79


IX. Anhang<br />

Tabelle 21: Originaldaten Kolostrum (Tier 60 bis 66)<br />

Tabelle 22: Originaldaten Kälber IgG1 (Plasma)<br />

80


IX. Anhang<br />

Tabelle 23: Originaldaten Kälber IgG2 (Plasma)<br />

Tabelle 24: Originaldaten Plasma Kälber IgM (Plasma)<br />

81


X. Danksagung<br />

VIII. DANKSAGUNG<br />

Bereits Wilhelm Busch wusste Bescheid: Es ist ein lobenswerter Brauch: wer was<br />

Gutes bekommt, der bedankt sich auch. Und weil ich in den letzten 2 ½ Jahren so<br />

viel Gutes bekommen habe, möchte ich mich an dieser Stelle auch mal bedanken.<br />

An erster Stelle danke ich Herrn Prof. Dr. Gerhard Breves für die Überlassung des<br />

interessanten Themas und die freundliche Aufnahme in die Arbeitsgruppe. Ich habe<br />

in der Physiologie eine tolle Zeit verbracht, an die ich mich sicher immer gerne<br />

zurück erinnern werde.<br />

Vielen Dank Marion und Kerstin, für eure Geduld beim Bestellen und der<br />

Beantwortung aller meiner Fragen und - nicht zu vergessen - für eure Hilfe beim<br />

Abzentrifugieren und Umfüllen und vor allem Waschen dieser unendlich vielen<br />

Milchprobengefäße. Danke an Jens, Imke und Inga für das Proben nehmen und<br />

Micha für das Abholen der Proben aus Braunschweig („Es sind auch nur ein paar<br />

Kartons…“).<br />

Weiterhin möchte ich mich bei allen Mitarbeitern und Mitarbeiterinnen der<br />

Arbeitsgruppe Tierernährung des Friedrich-Löffler-Institutes in Braunschweig<br />

bedanken, allen voran bei Herrn Prof. Dr. Dr. Sven Dänicke und Herrn Dr. Ulrich<br />

Meyer für die Bereitstellung der Proben aus dem Tierversuch M48 und ganz<br />

besonders bei Maria Petzold für ihre unendliche Geduld im Fragen beantworten und<br />

für die Zeit, die sie sich für meine Statistik genommen hat.<br />

Vielen Dank allen Mitarbeitern und Mitarbeiterinnen der Arbeitsgemeinschaft<br />

Immunologie, besonders Herrn appl. Prof. Dr. Hans-Joachim Schuberth für die<br />

Bereitstellung des ELISA-Labors, aller Materialien, die ich für meinen ELISA benötigt<br />

habe und natürlich auch für die selbstverständliche Hilfe und das Wissen, auf das ich<br />

jederzeit zugreifen durfte. Außerdem möchte ich mich ganz besonders bei Silke, Udo<br />

und Jamal bedanken, weil sie immer da waren, wenn ich sie brauchte und natürlich<br />

auch, weil sie mir meinen ELISA beigebracht haben und mir bei allen großen und<br />

kleinen Katastrophen immer zur Seite standen. Danke auch an Anna, Mirja, Johanna<br />

und Nino, dafür dass ihr mich wie selbstverständlich aufgenommen habt und mir das<br />

71


X. Danksagung<br />

Gefühl gegeben habt, dazuzugehören – ich habe mich in der Immunologie<br />

euretwegen immer sehr wohl gefühlt und werde die gemeinsamen Frühstücks-<br />

Exzesse sehr vermissen.<br />

Mein ganz besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Dr. h.c. mult. Hartwig Bostedt, für die<br />

selbstverständliche Beantwortung aller meiner Fragen und die Bereitstellung der<br />

Literatur für meine Diskussion.<br />

Vielen vielen Dank an meine tollen Kollegen, die mir die Zeit in der Physio so leicht<br />

gemacht haben: danke Steffi, dass du dir solche Arbeit mit meiner Arbeit gemacht<br />

hast und dass du so bist wie du bist. Ich werde dich schrecklich vermissen. Danke<br />

Mirja, für deine unermüdliche Hilfe mit meiner doofen Statistik – ohne dich wäre das<br />

alles nie was geworden.<br />

Danke Imke und Gigi, dafür, dass ihr mich mit zum Klettern genommen habt und<br />

dafür, dass ihr da ward, wenn ich Hilfe brauchte beim Doktorand-Sein. Ohne euch<br />

hätte ich mich am Anfang bestimmt nicht so gut zurechtgefunden und ich vermisse<br />

euch schon jetzt ungefähr immer. Danke Katrin, für die Runden auf der Bult und für<br />

die Männergespräche (und Lene, weil du meine Tasche getragen hast, als ich zwei<br />

Hände für Mila brauchte und natürlich Finja, weil du Mila verziehen hast, dass sie dir<br />

manchmal Kopfschmerzen bereitet hat). Danke Matthias und Martina, für die<br />

unermüdliche Arbeit an eurem Paper und dass ihr mir damit die Zeit so oft versüßt<br />

habt, danke Matthias für Gespräche, die ich bisher noch mit niemandem geführt habe<br />

und die auf eine besondere Art und Weise sicherlich meinen Horizont erweitert<br />

haben und dafür, dass du uns manchmal aus der Zeitung vorgelesen hast, das<br />

werde ich sehr vermissen, und ich nehme an, auch mein Überblick über das aktuelle<br />

Tagesgeschehen in Deutschland und der Welt wird darunter leiden, dass ich dich<br />

nicht mehr täglich sehe. Und danke dafür, dass du mir ganz zum Schluss – und<br />

wahrscheinlich ohne es zu wissen – den Weg zurück gezeigt hast. Danke Gesine<br />

und Kristin dafür, dass ihr für mich ungefähr perfekt seid: schön, schlau, sportlich und<br />

dann auch noch so nett, dass man noch nicht mal sauer auf euch ist, weil man<br />

beinahe platzt vor Neid. Schade, dass ihr zwei Jahre zu spät angefangen habt mit<br />

der Doktorarbeit, ich hätte so gern mehr von euch gehabt.<br />

Und: danke Johanna. Ohne dich weiß ich gar nicht, wie ich das alles überstanden<br />

hätte. Danke, dass du immer für mich (und für meine Statistik-, Literatur-, Format-<br />

72


X. Danksagung<br />

und Privatprobleme) da warst (ich hab dir prophezeit, dass ich anfange zu heulen,<br />

wenn ich das hier schreibe, schon ist es passiert). Ich bin so froh, dass wir uns<br />

getroffen haben. Ich vermisse dich jetzt schon so schrecklich, das kannst du dir gar<br />

nicht vorstellen. Du bist mein Ernie, ich bin dein Bert – und das wird für immer so<br />

bleiben.<br />

Vielen vielen Dank auch an alle, die schon viel länger für mich da sind: danke Judith<br />

und Fredi und Desi, dafür, dass ihr die besten Freunde seid, die man sich wünschen<br />

kann und extradanke nochmal an Desi, weil ohne dich der ganze Kram noch lange<br />

nicht fertig wäre. Danke Anna, Claudi, Jan und Fabian, dafür, dass ihr mich nie habt<br />

vergessen lassen, dass es auch noch andere Dinge als die Tiermedizin gibt und dass<br />

die auch wichtig und spannend sein können, danke Bine und Christian für das „Zu<br />

Hause-Gefühl“ und danke Katrin und Karl-Ludwig dafür, dass ihr mir immer wieder<br />

gezeigt habt, dass Tiere gesund machen ganz genau das ist, was ich schon immer<br />

machen wollte und was ich für immer machen will und natürlich dafür, dass ihr mich<br />

so aufgenommen habt, wie ihr mich aufgenommen habt und dass ich mich bei euch<br />

genau so wohl fühle wie zu Hause.<br />

Und ganz zum Schluss: danke an die Menschen, die mir am Allerwichtigsten sind:<br />

danke Mama und Papa, dafür, dass ihr immer für mich da seid, dafür, dass ihr immer<br />

hinter mir steht und an mich glaubt und dafür, dass ihr mich zu dem Menschen<br />

gemacht habt, der ich heute bin. Danke Insa, weil du die allerbeste Schwester bist,<br />

die man sich vorstellen kann, ich wüsste nicht, was ich ohne dich machen sollte.<br />

Ich habe euch sehr lieb.<br />

Und: vielen vielen Dank Justus, Peter und Bob. Ohne euch wäre einiges so viel<br />

schwerer zu ertragen.<br />

Mein größter Dank aber dem, der mich mit offenen Armen empfangen hat, als ich zu<br />

ihm zurückgekommen bin, der immer für mich da war und auch immer da sein wird.<br />

Ich bin gespannt auf den Plan, den Du für mich hast und freue mich darauf, meinen<br />

Weg gemeinsam mit Dir zu gehen.<br />

73

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