Ästhetik und die bestmögliche Wiederherstellung der ... - FreiDok

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Ästhetik und die bestmögliche Wiederherstellung der ... - FreiDok

Aus der Universitätsklinik für Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde

Klinik für Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie

der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br.

Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. Dr. R. Schmelzeisen

Effekt von Trans-8-tert-butyl-GABA-Pentin-Lactam und

Cis-8-tert-butyl-GABA-Pentin-Lactam

auf das Proliferations- und Differenzierungsverhalten von

humanen mesenchymalen Stammzellen

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Zahnmedizinischen Doktorgrades

der Medizinischen Fakultät

der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br.

vorgelegt 2012

von Helene Betz

geboren in Koktschetaw/ Kasachstan


Dekan

Prof. Dr. med. Dr. h.c. mult. Hubert E. Blum

Ärztlicher Direktor Abteilung Innere Medizin II

Universitätsklinikum Freiburg

Freiburg i. Br.

1. Gutachter PD Dr. med. Dr. med. dent. S. Sauerbier

Abt. Klinik f. Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie

Universitätsklinik f. Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde

Freiburg i. Br.

2. Gutachter PD Dr. med. dent. Olga Polydorou

Abt. f. Zahnerhaltungskunde und Parodontologie

Universitätsklinik f. Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde

Freiburg i. Br.

Jahr der Promotion 2013

2


Gewidmet meinem Sohn Alexander

3


Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung ......................................................................................................................... 6

1.1 Indikationen für Knochentransplantation .................................................................... 7

1.2 Klassifikation von Knochentransplantaten .................................................................. 8

1.2.1 Autogenes Knochentransplantat .......................................................................... 8

1.2.2 Allogene Knochentransplantate ......................................................................... 11

1.2.3 Xenogene Knochentransplantate ....................................................................... 12

1.2.4 Alloplastische Knochentransplantate ................................................................. 13

1.3 Tissue Engineering ................................................................................................... 15

1.3.1 Lebende Zellen bzw. Gewebe............................................................................ 16

1.3.2 Strukturelles Gerüst ........................................................................................... 17

1.3.3 Wachstumsfaktoren ........................................................................................... 18

1.4 Ziele der Untersuchung ............................................................................................ 22

2. Material und Methoden ............................................................................................... 23

2.1 Versuchsablauf ......................................................................................................... 23

2.2 Votum der Ethikkommission ..................................................................................... 24

2.3 Gewinnung und Konzentrierung der Stammzellen ................................................... 24

2.3.1 Vorbereitung ...................................................................................................... 24

2.3.2 Punktion des Beckens ....................................................................................... 25

2.3.3 BMAC (Bone Marrow Aspirate Concentrate) ..................................................... 27

2.4 Zellkultur ................................................................................................................... 29

2.4.1 Primärkultur ....................................................................................................... 29

2.4.2 Zellpassage ....................................................................................................... 29

2.5 Versuch mit GABA-Peptin-Lactam–Derivaten .......................................................... 30

2.6 Proliferationstest EZ4U ............................................................................................ 31

2.7 Multipotenznachweis der MSCs ............................................................................... 32

2.7.1 Differenzierung von MSCs zu Adipozyten .......................................................... 32

2.7.1.1 Adipozytennachweis .............................................................................................. 33

2.7.2 Differenzierung von MSCs zu Chondrozyten ..................................................... 33

2.7.2.1 Chondrozytennachweis ......................................................................................... 34

2.7.3 Differenzierung von MSCs zu Osteoblasten ...................................................... 36

2.7.3.1 Osteoblastennachweis .......................................................................................... 36

2.8 Statistische Auswertung ........................................................................................... 38

3. Ergebnisse .................................................................................................................. 40

3.1 Zellkultur ................................................................................................................... 40

3.2 Multipotenznachweis ................................................................................................ 40

3.2.1 Nachweis der adipogenen Differenzierung mit einer Oil Red O-Färbung .......... 41

3.2.2 Nachweis der chondrogenen Differenzierung mit Aggrecanfärbung .................. 41

3.2.3 Nachweis der osteogenen Differenzierung ........................................................ 42

3.2.3.1 ALP-Test .................................................................................................................. 42

3.2.3.2 Kollagen Typ I-Test ................................................................................................ 42

3.2.3.3 Von-Kossa Färbung ............................................................................................... 43

3.3 Proliferationstest EZ4U ............................................................................................ 43

4. Diskussion .................................................................................................................. 46

5. Zusammenfassung ..................................................................................................... 59

6. Literaturverzeichnis ..................................................................................................... 60

7. Danksagung ............................................................................................................... 76

4


Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Schematischer Versuchsablauf ..................................................................... 23

Abbildung 2: Vorbereitung .................................................................................................. 24

Abbildung 3: Das filzstiftmarkierte Operationsfeld ............................................................. 25

Abbildung 4: Stabilisation der Hohlnadel mit dem Mittelfinger ........................................... 26

Abbildung 5: Die Punktion des Knochenmarks am Patienten ............................................ 26

Abbildung 6: Schematischer Ablauf der BMAC .................................................................. 27

Abbildung 7 :BMAC-Aufbereitungsgefäß nach der Zentrifugation ..................................... 28

Abbildung 8: Chemische Strukturformel der getesteten Mediatoren .................................. 31

Abbildung 9: Lichtmikroskopische Aufnahme der MSCs in Azur-II-Färbung (40-fach) ....... 40

Abbildung 10: Lichtmikroskopische Aufnahme der MSCs-Rasen, rechts in HE-Färbung,

links in Azur-II-Färbung (40-fach) ............................................................................... 40

Abbildung 11: Adipozytennachweis mit Oil-Red-O-Färbung (40-fach) ............................... 41

Abbildung 12: Chondrozytennachweis mit Aggrecanfärbung ............................................. 42

Abbildung 13: ALP-Test...................................................................................................... 42

Abbildung 14: Kollagen Typ 1 ............................................................................................ 43

Abbildung 15: Von-Kossa Färbung .................................................................................... 43

Abbildung 16: Zusammenfassung der Ergebnisse ............................................................ 44

5


1. Einleitung

Ästhetik und die bestmögliche Wiederherstellung der Kaufunktion werden bei der Wahl des

richtigen Zahnersatzes immer wichtiger. Die Ergebnisse der Vierten Deutschen

Mundgesundheitsstudie (DMS IV) zeigen ein steigendes Interesse am

implantatgetragenen Zahnersatz. 1,4 Prozent (1997: 0,0 Prozent) der Erwachsenen und

2,6 Prozent (1997: 0,7 Prozent) der Senioren sind inzwischen mit implantatgetragenem

Zahnersatz versorgt. Laut der Deutschen Gesellschaft für Implantologie (DGI)

implantierten Zahnärzte im vergangenen Jahr in Deutschland rund 600.000 der

künstlichen Zahnwurzel. Das sind 70.000 mehr als im Jahr zuvor.

Neben der prothetischen Indikation zur Wiederherstellung der Kaufunktion erstreckt sich

die Anwendung von Implantaten sowohl auf traumatologische Folgezustände als auch auf

kieferorthopädische- und epithetische Bereiche. Für eine erfolgreiche Implantation ist das

lokale Knochenangebot in Höhe und Breite enorm wichtig. Die Überbrückung großer

Knochendefekte, welche als Folge von degenerativen Prozessen, eines Traumas, einer

Knochenresektion z.B. nach einem Tumor, entstehen, stellen für die Chirurgen nach wie

vor eine große Herausforderung dar.

6


1.1 Indikationen für Knochentransplantation

Im Jahr 1965 wurde in Schweden das erste dentale Implantat inseriert. Dieses wurde von

Prof. Per-ingvar Bränemark an der Universität Göteburg entwickelt. Die Verankerung des

Implantats wurde als Osteointegration definiert; das bedeutet einen direkten strukturellen

und funktionellen Verbund zwischen dem organisierten lebenden Knochen und der

Oberfläche eines belasteten Implantats. Heutzutage wird Osteointegration als ein

lichtmikroskopisch direkter knöcherner Kontakt zwischen dem vitalen knöchernen

Lagergewebe und dem Implantat ohne die zwischengeschaltete Bindegewebsstruktur

verstanden. 1

1982 wurde Implantologie als wissenschaftliche Therapie von Deutsche Gesellschaft für

Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde (DGZMK) anerkannt. Heutzutage werden Schätzungen

zufolge weltweit pro Jahr 1,5 Mio. Zahnimplantate gesetzt. Die Zuwachsrate soll jährlich

bei 15 % bis 20 % liegen.

Trotz allem Fortschritt und nahezu grenzenloser Indikationsausweitung machen die

ungünstigen lokalen Voraussetzungen die Implantation oft sehr schwierig. Um Implantate

fest im Ober- und Unterkiefer zu verankern, ist ein ausreichendes Knochenangebot eine

wesentliche Vorraussetzung. 2 Die fehlende funktionelle Belastung nach dem Zahnverlust

führt zu einer horizontalen und vertikalen Knochenresorption. Im hinteren

Oberkieferbereich wird das Knochenangebot nach dem Zahnverlust durch die

Pneumatisierung der Kieferhöhle extrem reduziert. 3 In diesem Bereich ist es möglich das

Knochenangebot durch eine Sinusbodenaugmentation zu verbessern. Die erste

Sinusbodenaugmentation wurde von Oscar Hilt Tatum, Jr. im Jahre 1974 durchgeführt.

Die Auflagerungsosteoplastik, die Sandwichosteoplastik, die geführte

Knochenregeneration und die Alveolarkammdistraktion werden als chirurgische

Alternativen zur vertikalen Augmentation für eine Implantatinsertion angesehen.

1 Koeck & Wagner 1996

2 Schilli & Krekeler 1984

3 Lamberti 1994

7


1.2 Klassifikation von Knochentransplantaten

Unter immunologischen Gesichtspunkten lassen sich die Augmentatmaterialien in vier

folgende Kategorien einteilen: autogene, allogene, xenogene sowie alloplastische

Materialien. 4

Im Hinblick auf ihre Wirkungsweise werden die Knochentransplantate in drei Klassen

aufgeteilt: Die autogenen Transplantate besitzen eine osteogene, osteoinduktive und

osteokonduktive Potenz. Die allogenen Transplantate wirken osteoinduktiv und

osteokonduktiv. Die alloplastischen Transplantate wirken dagegen nur osteokonduktiv. 5

Die Osteogenese wird als eine von überlebenden Zellen eines Knochentransplantats

(Osteoblasten und Osteoprogenitorzellen) ausgehende Knochenneubildung definiert. Die

Osteokonduktion bezeichnet eine Knochenneubildung, bei welcher das anorganische

Gerüst eines Knochenersatzmaterials als dreidimensionale, passive Leitschiene für die

Einwanderung von Gefäßen und Osteoprogenitorzellen aus dem Transplantatbett dient.

Die Osteoinduktion beschreibt einen Prozess, bei dem die Knochenneubildung durch im

verwendeten Ersatzmaterial enthaltene Differenzierungsfaktoren angestoßen wird, sodass

Stammzellen zu Osteoblasten differenzieren können. Im Folgenden werden die

Eigenschaften der verschieden Knochentransplantate näher erläutert.

1.2.1 Autogenes Knochentransplantat

Bei der autogenen Knochentransplantation wird ein Knochendefekt mit dem eigenem

Knochengewebe ausgefüllt. Diese Methode hat den Vorteil, dass das Transplantat nicht

abgestoßen wird und kein großes Infektionsrisiko besteht. Die Verwendung von

autogenem Knochentransplantat gilt als der „Goldstandard“ unter den Knochen-

Augmentationsverfahren. 6 Auch im Hinblick auf seine osteokonduktiven und -induktiven

Eigenschaften wird der autogene Knochen als Augmentationsmaterial bevorzugt. 7

4 Spiekermann et al. 1994

5 Misch & Dietsh 1993

6 Kahn et al. 2003

7 Springfield et al. 1992

8


Das Knochentransplantat kann als ein freies avaskuläres Transplantat oder als ein

mikrovaskulär anastomosiertes Knochentransplantat eingepflanzt werden. Als freie

avaskuläre Transplantate kommen die Transplantate aus dem Beckenkamm, den Rippen,

der Schädelkalotte, dem Tibiakopf sowie dem Unterkiefer zum Einsatz. Bei ausgedehnten

Knochendefekten sowie funktionell geschädigtem Gewebe, wie beispielsweise nach

Tumorresektionen, finden meist die Verfahren der mikrovaskulär anastomosierten

Knochentransplantate Anwendung.

Transplantate aus dem Beckenkamm, der Fibula, der Skapula sowie der Radius haben

sich als Spenderregionen für den mikrovaskulären Knochenersatz bewährt. Mit einem

freien mikrovaskulär anastomosierten Fibulatransplantat wurden zufriedenstellende

funktionelle und ästhetische Ergebnisse bei einer Unterkiefer-Rekonstruktion erzielt. 8

Ein vaskularisiertes Beckenkammtransplantat eignet sich insbesondere zum Aufbau der

Maxilla, z. B. nach einer Maxillaresektion. 9 Der Beckenkamm selbst eignet sich

hervorragend als eine Entnahmestelle sowohl eines freien avaskulären

Beckenkammblocks als auch eines freien mikrovaskulär anastomosierten

Knochentransplantats.

Ein freies avaskuläres Knochentransplantat kann sowohl aus dem vorderen als auch aus

dem hinteren Beckenkamm entnommen werden. Christa illiaca posterior bietet sich für die

Entnahme größerer spongiosareicherer Blöcke an.

10

Aufgrund der höheren

Komplikationsrate bei der Knochenentnahme aus dem vorderen Beckenkamm, ist der

hintere Beckenkamm für die Transplantatgewinnung zu bevorzugen. Zu bedenken dabei

ist allerdings, die intraoperative Positionsänderung des Patienten.

11

Kleinere

Knochenmengen können aus dem Tuber maxillae, dem Kieferwinkel, der mandibulären

Symphyse, in diesem Fall durch Abtragung von Exostosen, sowie in Form von bei der

Implantation anfallenden Knochenspänen gewonnen werden. 12

8 Cordeiro et al. 1999

9 Brown et al. 2001

10 Leyder et al. 1985

11 Leyder et al. 1985

12 Misch & Dietsh 1993

9


Einheilung des autogenen Knochentransplantats

Im Rahmen der Einheilung eines mikrovaskulär anastomosierten Transplantates durchläuft

das Gewebe die gleichen Phasen wie bei der Frakturheilung. Das gefäßgestielte

Transplantat wird gut durchblutet, dadurch bleiben die Knochenstrukturen und die Zellen

vital. Das Transplantat ist unabhängig von der Wertigkeit des Transplantatlagers. Die

freien mikrovaskulär anastomosierte Transplantate eignen sich besser als freie avaskuläre

Knochentransplantate für größere Rekonstruktionen, wie z. B. bei einer

Unterkieferrekonstruktion nach einer ausgedehnten Resektion. Diese haben den Vorteil

der gleichzeitigen Weichgewebsrekonstruktion. 13 Aufgrund der direkten Durchblutung des

Transplantats findet keine Resorption der Knochensubstanz statt, was die schnellere und

komplikationslosere Einheilung verspricht. 14

Urist hat 1965 die Prinzipien der Osteoinduktion erfasst. Er hat festgestellt, dass das

Transplantat durch Histiozyten und Fremdkörperriesenzellen aufgeschlüsselt wird. In

Folge findet durch die demineralisierte Knochenmatrix die Bildung neuer

Knochensubstanz statt. Die Knochenneubildung findet unter dem Einfluss osteoinduktiv

wirkender Proteine statt. Erst später im Jahre 1971 prägte Urist den Begriff bone

morphogenetic proteine(BMP).

Bei der Einheilung des freien Knochentransplantats bewirken die überlebenden

Transplantatosteoblasten die Osteogenese. Durch die Entzündungsreaktion am Ort findet

durch die Gefäßeinsprossung die Revaskularisierung des Transplantats statt. Im Rahmen

des Transplantatabbaus werden osteoinduktive Proteine und Wachstumsfaktoren

freigesetzt, welche die Differenzierung der knochenbildenden Zellen im Lagergewebe

stimulieren (Osteoinduktion). Der neugebildete Knochen besiedelt die ehemaligen

Markräume. Das Transplantat dient dabei als eine Leitschiene. Dieser Prozess wird als

Osteokonduktion verstanden. Der Prozess des Knochenremodelings wurde von Barth

1893 als „schleichender Ersatz“ bezeichnet. Dabei hat sich gezeigt, dass die Spongiosa

aufgrund ihrer porösen Struktur und des höheren Zellanteils eine bessere osteogene

Potenz aufweist, als Kortikalistransplantate. 15 Der Nachteil dieser Spongiosatransplantate

ist ihre geringe mechanische Stabilität, so dass in mechanisch belasteten Bereichen

13 Ferrari et.al. 1998

14 Walker 1981

15 Gray & Elves 1982

10


kortikospongiöse Transplantate bessere Dienste leisten.

Obwohl autogene Knochentransplantate aufgrund ihrer osteogener, -induktiver,

und -konduktiver Wirkung sowie der fehlenden Immunantwort die besten Resultate im

Augmetationsverfahren liefern, ist ihre Gewinnung mit hoher Morbidität verbunden. Die

häufigste Entnahmestelle zur Gewinnung von autogenem Knochenmaterial ist die

Beckenkammregion. Komplikationen wie z. B. Schmerzen, Infektionen, zusätzlicher

Blutverlust, ausgeprägte Hämatome, Hernien, Nervverletzung, Gefäßverletzung und

Beckenkammfrakturen können die Genesung des Patienten lange hinauszögern und den

stationären Aufenthalt verlängern. 16

1.2.2 Allogene Knochentransplantate

Eine gute Alternative zum autogenen Knochen sind allogene Knochentransplantate. Diese

werden einem anderen Individuum derselben Spezies entnommen. Sie kommen als

gefrorene, gefriergetrocknete oder gefriergetrocknete entmineralisierte

Knochentransplantate vor. 17

Der Vorteil der oben genannten Transplantate besteht darin, dass das Material in großen

Mengen in diversen Knochenbanken verfügbar ist. Somit kann ein Zweiteingriff zur

Entnahme von autogenem Knochen vermieden werden.

Allogene Knochentransplantate sind sowohl osteokonduktiv als auch -induktiv. Das

allogene Spongiosamaterial besitzt sowohl eine osteokonduktive als auch -induktive

Potenz. Nicht gefriergetrocknete Kortikalistransplantate sind osteokonduktiv. Die

entmineralisierte Knochenmatrix ist dagegen hoch osteoinduktiv. 18

Diverse Studien haben hervorragende Ergebnisse einer Sinusaugmentation mit einem

allogenen Material zeigen. 19

Um eine sichere Verwendung der allogenen Knochentransplantate zu gewährleisten,

müssen diese verarbeitet werden. Die Kryokonservierung (Kälte-Konservierung von -70°

16 Arrington et al. 1988

17 Hoexter 2002

18 Goldberg 2000

19 Guerrero et al. 2001

11


is -80°C), die Autoklavierung, chemische Konservierungsmaßnahmen und die

Lyophilisierung (Gefriertrocknung) stellen dabei die meistverwendeten

Behandlungsverfahren dar.

Trotz aller Sicherheitsmassnahmen gibt es Fälle von Übertragungen einiger

Infektionskrankheiten, wie z. B. Clostridium Sordelli 20 oder HIV-Virus-Übertragung bei der

Transplantation des gefriergetrockneten allogenen Knochenmaterials. 21 Dabei wurde

festgestellt, dass diese Infektionsübertragungen in der Zeit stattgefunden haben, als noch

die Antikörpertests zum HIV-Nachweis verwendet wurden. Dadurch bestand eine emorme

diagnostische Lücke. Mit den neuen Antigen-Tests ist es gelungen, die diagnostische

Lücke zu verkleinern, weil sich Antigene vor der Bildung der HIV–Antikörper im Blut

finden. 22

Berichte über solche Fälle haben dazu geführt, dass die Behandlungsverfahren des

allogenen Materials in den letzten Jahren verbessert wurden. Folglich wurden die

Selektionskriterien für die Spenderauswahl verschärft, um das allogene Material sicherer in

der Anwendung zu gestalten. 23 Im April 2001 führte die Bundesärztekammer eine

Novellierung der Richtlinien zum Führen einer Knochenbank durch.

Die Gefahr einer eventuellen Krankheitsübertragung, hohe Kosten einer Knochenbank und

aufwendige Voruntersuchungen münden in der Suche nach weiteren Alternativen.

1.2.3 Xenogene Knochentransplantate

Xenogene Knochenpräparate werden aus der Knochensubstanz anderer Säugetiere

gewonnen. Sie sind osteokonduktiv und die Abbaurate im Körper ist als gering zu

bezeichnen. Es wurde eine Resorptionsresistenz von Bio Oss beobachtet. 24

Xenotransplantate auf boviner Basis haben eine weite Verbreitung in der klinischen

Anwendung gefunden. Sie liefern gute Resultate beim Auffüllen parodontaler Defekte, 25

20 Kainer et al. 2004

21 Mellonig 1995

22 Malhotra et al. 1993

23 Hinsekamp et al. 2012

24 Hallman et al. 2001

25 Camelo et al. 1998

12


kleinerer Knochendefekten 26 sowie bei Sinusaugmentationen. Die Einheilzeit der

xenogenen Knochentransplantate von 12 bis 16 Monaten im Vergleich zu einem

autogenen Präparat mit einer Einheilzeit von vier bis sechs Monaten ziemlich langwierig

ist. 27 Die gewonnenen Knochen werden chemisch und/oder physikalisch aufgearbeitet.

Dabei werden alle Proteinstrukturen eliminiert, so dass eine Abstoßungsreaktion und das

Übertragen von Krankheiten laut Hersteller ausgeschlossen werden kann.

Zu Beginn der neunziger Jahre hat sich in Großbritannien die Bovine Spongiforme

Enzephalopathie-Erkrankung (BSE-Erkrankung) des Rindes epidemieartig ausgebreitet.

Es wurde nachgewiesen, dass Kreuzfeld-Jakob-Krankheit (vCJD) bei Menschen und BSE

bei Tieren durch die gleichen Prionen hervorgerufen wird. Am 27. Dezember 2000 hat die

Kommission der Europäischen Gemeinschaft den Rinderdarm als Risikomaterial

eingeschätzt. Daraufhin hat die Bundesregierung in Berlin die Arzneien aus dem

Rindermaterial verboten. Im Februar 2001 wurde anschließend die Verwendung von

chirurgischem Nahtmaterial auf der Basis von Rinderdarm durch das Ministerium für

Frauen, Jugend und Gesundheit des Landes Nordrhein-Westfalen verboten.

Schwartz hat daraufhin die Xenotransplantate auf boviner Basis genauer untersucht. 28 Es

wurden Proteinstrukturen in bovinen Xenotransplantaten nachgewiesen und ihre Aktivität

gemessen. Diese Untersuchungen haben gezeigt, dass eine Übertragung der vCJD nicht

vollständig ausgeschlossen werden kann. Andere Studien konnten diese Behauptung

widerlegen und Xenotransplantate boviner Herkunft als risikofrei hinsichtlich der

Übertragung von vCJD bezeichnen. 29 Das alloplastische Material als Alternative ermöglicht

den Ausschluss der Erregerübertragung durch Materialien tierischen Ursprungs.

1.2.4 Alloplastische Knochentransplantate

Als alloplastisches Knochenersatzmaterial werden Biomaterialien bezeichnet, die

entweder vollsynthetisch hergestellt oder durch physikalische sowie chemische

Bearbeitung speziesfremder Gewebearten gewonnen werden. Sie besitzen

osteokonduktive Eigenschaften. Im Hinblick auf ihre Wirkungsweise gehören

26 Artzi et al. 2003

27 Smiler et al. 1992

28 Schwartz et. al. 2000

29 Wenz et al. 1999

13


Xenotransplantate zu den alloplastischen Knochenersatzmaterialien. Aufgrund der

vorhandenen Heterogenität der Materialien ist die Klassifikation sehr schwierig.

Vollsynthetische Materialien, wie z.B. Polymethylmethacrylate, Polyethylen, Polyamid,

Polytetrafluorethyl und Silikon besitzen eine reine Platzhalterfunktion im Defektareal.

Weiterhin gibt es Materialien, die zum Teil resorbieren und durch den umgebenden

Knochen umgebaut werden, wie z. B. Kalziumphosphate und Glaskeramiken.

Obwohl diverse Knochenersatzmaterialien für die Kieferknochen-Augmentation getestet

wurden, wird autogenes Knochenmaterial nach wie vor als der „Goldstandard“ in der

augmentativen Chirurgie angesehen. Bei diesem Verfahren kann das Ergebnis bezüglich

der präimplantären Knochenregeneration am ehesten vorhergesagt werden und verspricht

die höhere Erfolgsrate bei der späteren Implantation. 30

Trotz aller Bemühungen der Forschung, bleibt das Problem des richtigen Knochenersatzes

aufgrund der unterschiedlichen Vor- und Nachteile sowie unterschiedlicher Risikofaktoren

der verschiedenen Ersatzmaterialien weiterhin nicht endgültig gelöst. Der große Nachteil

bei autogenen Transplantaten besteht in der Entnahmemorbidität, bei allogenen und

xenogenen Knochentransplantaten wiederum im Restrisiko einer übertragbaren

Virusinfektion. Die künstlich hergestellten Materialien weisen dagegen Probleme bei der

Verankerung und der mechanischen Stabilität auf oder können immunologische

Reaktionen erzeugen. 31

Neue Möglichkeiten der Knochenregeneration können sich durch Methoden des Tissue

Engineerings ergeben. Das Tissue Engineering wird im nächsten Kapitel näher

beschrieben.

30 Kahn et al. 2003

31 Kastenbauer et al. 1993; Berghaus 1992

14


1.3 Tissue Engineering

Der Begriff Tissue Engineering wurde 1987 erstmals bei der „National Science

Foundation“-Konferenz verwendet. Tissue Engineering ist ein inderdisziplinäres Feld,

welches die Prinzipien der Ingenieurs-, Werkstoff-, und Lebenswissenschaften kombiniert,

um die Funktion des gesunden und pathologisch veränderten Gewebes zu erforschen und

biologische Konstrukte zur Gewebefunktionsverbesserung und/oder -wiederherstellung zu

entwickeln. 32

Das Ziel des Tissue Engineerings, ist die Entwicklung lebender Ersatzgewebe, um damit

kranke Gewebe bei einem Patienten zu ersetzen oder zu regenerieren. Hierfür werden

Zellen gewonnen und in vitro vermehrt. Je nach Bedarf können die Zellen im nächsten

Schritt zweidimensional oder mittels Zellgerüsten dreidimensional kultiviert werden, um

anschließend diese dem Patienten zu implantieren.

Die Verwendung autogener Zellen und Methoden des Tissue Engineerings bietet die

Möglichkeit die Probleme des klassischen Gewebeersatzes wie Entnahmemorbidität bei

autogenen Transplantaten, Immunogenität bei allogenen Transplantaten und mangelhafte

mechanische Stabilität von alloplastischen Implantaten zu überwinden und erweitert das

Indikationsspektrum in der rekonstruktiven Chirurgie. 33

Die ersten Erfolge auf dem Gebiet der Gewebezüchtung wurden bereits im Jahre 1975

gefeiert, als Rheinwald und Green durch eine Keratinozytenkultivierung in vitro

Plattenepithel gezüchtet haben. 34 1981 wurde über den erfolgreichen Einsatz von

kultivierten epidermalen Transplantaten bei einer Brandwundversorgung berichtet. 35

Die drei Grundelemente des Tissue Engineerings - lebende Zellen bzw. Gewebe, das

strukturelle Gerüst und die Wachstumsfaktoren – werden im Folgenden näher erläutert.

32 Langer & Vacanti 1993

33 Schaefer et al. 2000

34 Rheinwald & Green 1975

35 O´Connor et al. 1981

15


1.3.1 Lebende Zellen bzw. Gewebe

Eine Zelle ist die kleinste lebende Einheit und der Grundbaustein aller Lebewesen. Der

menschliche Organismus setzt sich aus ca. 220 unterschiedlichen Zell- und Gewebetypen

zusammen. Die meisten Körperzellen sind zu Geweben mit bestimmten Aufgaben und

Funktionen zusammengefasst. Abgesehen von ihren Aufgaben und

Gewebszugehörigkeiten haben die Zellen gemeinsame Fähigkeiten, wie beispielsweise

Reproduktion durch Zellteilung, Stoff– und Energiewechsel, Bewegungsmöglichkeiten,

Reaktionen auf Reize sowie die Fähigkeit zum Wachstum und Entwicklung. Diese werden

in Stammzellen und ausdifferenzierte Zellen unterschieden. Ausdifferenzierte Zellen haben

einen eingeschränkten Funktionsbereich, ihre Wachstumsfähigkeit ist stark begrenzt und

es fehlt ihnen an Selbsterneuerungspotential.

Der Grund für das große wissenschaftliche Interesse an Stammzellen liegt in deren

Fähigkeit, sich entweder im undifferenzierten Stadium endlos zu teilen

(Proliferationspotenzial) bzw. sich theoretisch in jeden Zelltyp der drei Keimblätter

differenzieren zu können (Potenz), begründet. 36

Stammzellen lassen sich in embryonale und adulte Stammzellen einteilen. Embryonale

Stammzellen sind pluripotent, d. h. können sich in Zellen aller drei Keimblätter

differenzieren. Adulte Stammzellen haben dagegen ein eingeschränktes

Differenzierungspotential und werden als multipotent bezeichnet. 37

Die Verwendung embryonaler Stammzellen gestaltet sich schwierig. Zum einem sind

ethische Bedenken vorhanden, weil für die Gewinnung dieser Zellen menschliche

Embryonen zerstört werden müssen. Des Weiteren lösen diese eine immunologische

Reaktion aus und neigen dazu nach der Transplantation Teratome zu bilden. 38

Adulte Stammzellen sind in vielen Organen, wie z.B. Blut, Knochenmark, Gehirn, Haut,

36 Bartsch & Frimberger 2004

37 Prelle et al. 2002

38 Cao et al. 2007; Drukker et al. 2006

16


Fettgewebe sowie Nabelschnur zu finden. Folglich ist ihre Gewinnung einfacher und es

findet keine Immunabstoßung statt so lange autologe Zellen verwendet werden.

1990 hat Caplan eine neuartige Klasse von Stammzellen aus dem Knochenmark

gewonnen. Diese haben die Fähigkeit, sich zum mesenchymalen Gewebe zu

differenzieren. Er hat sie als mesenchymale Stammzellen (MSCs) beszeichnet.

Aufgrund ihrer Fähigkeit zur Selbsterneuerung, Proliferation und Differenzierung zu

Chondrozyten, Adipozyten und Osteoblasten sind mesenchymale Stammzellen für das

Tissue Engineering ganz besonders interessant. 39 Diese Zellen können aus einer Vielzahl

verschiedener Gewebearten gewonnen werden. Dennoch hat sich das Knochenmark am

meisten bewehrt. Ihre immunsuppressiven Eigenschaften bieten viele therapeutische

Vorteile in der Zelltherapie. 40

1.3.2 Strukturelles Gerüst

Das zweite Grundelement des Tissue Engineerings stellt das strukturelle Gerüst (Scaffold)

dar. Die Anforderungen an das künstliche Gerüst sind sehr hoch. Sie sollen die Aufgaben

der natürlichen extrazellulären Matrix übernehmen.

Im Gewebe sind die Zellen in die native extrazelluläre Matrix eingebettet, die ein wichtiger

Bestandteil der zellulären Umgebung ist. Die extrazelluläre Matrix ist ein komplexes,

dynamisches System. Sie beinhaltet Wachstumsfaktoren, Zytokinen, Chemokinen,

Kollagenasen, Proteoglykane und Adhäsionsmoleküle. Dieser fungiert als ein Gerüst für

die Zellen und beeinflusst somit ihre Proliferation und Differenzierung, fördert die

Aufrechterhaltung der Gewebsvitalität und leitet die Reparaturvorgänge ein. 41

39 Maurer 2011

40 Le Blanc & Pittenger 2005

41 Kleinman et al. 2003

17


Über folgende Kriterien soll ein ideales Gerüst gemäß Hutmacher 42 verfügen:

1. dreidimensional und hochporös, mit einer Porenarchitektur, die Zellenwachstum und

Transport von Nährstoffen und Metaboliten gewährleistet

2. biokompatibel und resorbierbar, mit einer Degradationsgeschwindigkeit, die der

Wachstumsgeschwindigkeit des Gewebes in vivo oder in vitro entspricht

3. geeignete Oberfläche für die Zellhaftung, Proliferation und Differenzierung

aufweisen

4. mechanische Eigenschaften besitzen, die deren der Empfängerregion

entsprechen 43

Weiterhin können Scaffolds in natürliche und künstliche Materialien unterteilt werden,

wobei jede Klasse zusätzlich in organische und anorganische Gruppen weiter differenziert

werden kann. Somit werden synthetisch-organische (Polyactide, Polyglykoide),

synthetisch-anorganische (Hydroxylapatit, Kalzium-Phosphat-Composite, Glaskeramiken),

natürlich-organische (Kollagen, Fibrin, Hyaluronsäure) und natürlich-anorganische

Materialien (Korallenhydroxylapatit) unterschieden.

Das optimale Trägergerüst ist derzeit noch nicht existent, aber die Suche danach

beschäftigt Mediziner, Biomaterialforscher und Ingenieure.

1.3.3 Wachstumsfaktoren

Damit das gewünschte Gewebe entstehen kann, wird auf die Zellen

zellteilungsaktivierende und zelldifferenzierende Wirkung durch verschiedene Mediatoren

ausgeübt. Diese Mediatoren werden in Mitogene und osteoinduktive Faktoren

(Morphogene) eingeteilt. Wesentliche Bedeutung im Tissue Engineering haben

beispielsweise Fibroblast Growth Faktor (FGF), Plateletd-derived Growth Factor (PDGF)

und Insulin-like Growth Factor (IGF), Epidermal Growth Factor (EGF), Vascular

Endothelial Growth Factor (VEGF), Hepatocyte Growth Factor (HGF), Transforming

Growth Factor (TGF) und die zu der TGF-ß-Familie gehörende BMP.

42 Hutmacher 2000

43 Hutmacher 2000

18


BMPs haben eine besondere Bedeutung für die Züchtung von Knochengewebe, weil diese

im Vergleich zu Mitogenen die Fähigkeit besitzen, eine Knochenneubildung selbst im

normalerweise nicht ossifizierenden Gewebe zu induzieren.

Bereits 1965 wurde eine hypothetische Existenz der BMP von Marschal postuliert. Er

beobachtete eine Knochenneubildung, nachdem er entmineralisiertes Knochenpulver in

das Muskelgewebe von Kaninchen injizierte. 44 1971 prägte er den Begriff "Bone

Morphogenetic Protein”. 45 Schließlich 1983 gelang es Urist et al. BMP aus humanem

Knochen zu isolieren.

1988 wurde die Gensequenz des humanen BMP entdeckt und mittels rekombinanter

Gentechnologie BMP–1, BMP–2A und BMP–3 produziert. 46 Mehr als 20 Moleküle wurden

zwischenzeitlich identifiziert, 47 aber nur zwei, BMP–2 und BMP–7, sind für die Behandlung

von Patienten zugelassen. Sie werden unter dem Namen rhBMP2 und OP-1(rh BMP-7)

geführt.

Diverse Studien belegen Therapieerfolge mit rhOP-1 48 von Tibiapseudarthrosen sowie von

Fibulafrakturen. 49 Auch ihre klinische Anwendung bei der Wirbelfusion hat in der

Popularität zugenommen. 50

In einer Studie von Boyne 51 wurde der erfolgreiche Einsatz von rhBMP-2 bei Makaken

während der Behandlung von Kieferdefekten gezeigt. Boyne hat eine Mandibularresektion

bei Affen mit rhBMP-2 und einem Kolagenträger versorgt. Nach fünf bis sechs Monaten

Ausheilzeit wurden den Affen die Implantate inseriert, welche acht Monate in Funktion

waren. Anschließend haben mikroskopische Untersuchungen eine höhere Knochendichte

44 Urist 1965

45 Urist 1971

46 Wozney et al. 1988

47 Bragdon et al. 2011

48 Friedlaender et al. 2001

49 Geesink et al. 1999

50 Robinson et al. 2008

51 Boyne 2001

19


des neugebildeten Knochens im Vergleich zu dem Originalknochen der Gegenseite

gezeigt. Bei diesem Versuch waren die Affen in zwei Altersgruppen eingeteilt, eine Gruppe

des mittleren Alters und eine Gruppe des höheren Altes. Bei dem Vergleich beider

Gruppen konnte Boyne aufzeigen, dass Alter keine große Rolle bei der

Knochenregeneration spielt, obwohl die Anzahl der Stammzellen mit zunehmendem Alter

abnimmt.

In einem Parallelversuch hat Boyne die Gaumenspalten bei jungen Affen mit rhBMP-2 und

Kollagenträger versorgt. Auf der kontralaterallen Seite hat er autogenes Knochenmaterial

verwendet. Drei Monate später wurde eine komplette Knochenregeneration auf der

rhBMP-2 Seite beobachten, im Vergleich zu einer unvollständigen Regeneration auf der

Kontrollseite. 52 Obwohl rhBMP in vitro und in vivo ihr Potential bewiesen haben, wird ihre

klinische Verwendung durch die hohen Kosten und anhaltende Sicherheitsbedenken

gebremst. 53

GABA-Pentin Lactam-Derivat

GABA-Pentin ist ein Arzneistoff aus der Gruppe der Antikonvulsiva. Es wird zur

Behandlung der Epilepsie und neuropathischer Schmerzen eingesetzt. Feuerstein et al.

von der neuropharmakologischen Abteilung der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg gelang

es, ein Lactam-Derivat des GABA–Pentins zu isolieren und zu modifizieren. Die

modifizierten Derivate sind Phenyl-GABA-Lactam (Phenyl-GBL), Trans-8-tert-butyl-GABA-

Pentin-Lactam und Cis-8-tert-butyl-GABA-Pentin-Lactam. Die so erhaltenen Derivate

wurden von der Abteilung für Neuropharmakologie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg

patentiert.

Bei GABA-Pentin-Lactam und seinen Derivaten handelt es sich nicht um

Wachstumsfaktoren im klassischen Sinne. GABA-Pentin und sein Derivat GABA-Pentin-

Lactam wurden von Jehle et al. in vivo und in vitro untersucht und seine neuroprotektive

Eigenschaften bewiesen. In einem in vitro–Modell haben beide Substanzen die

Glutamatfreisetzung in den ischämiegeferdeten Gehirnzellen der Raten gesenkt. 54

52 Boyne 2001

53 Shimer et al. 2009

54 Jehle et al. 2000

20


Glutamat ist ein Neurotransmitter, welcher bei der Vermittlung von Sinneswahrnehmungen,

an der Ausführung von Bewegungen und an höheren Gehirnfunktionen unverzichtbar ist.

Die Glutamtrezeptoren stellen zelluläre Kanäle dar, deren Aktivierung zum Einstrom von

Natrium- und Kalzium-Ionen in die Nervenzelle führt. Eine erhöhte Konzentration von

Glutamat außerhalb der Neurone, wie es z. B. bei Ischämien der Fall ist, führen zu einem

überschüssigen Einstrom von Kalzium in die Nervenzellen, der ein Schädigung des

Neurons, einen Funktionsverlust und schließlich das Absterben der Zelle zur Folge hat.

In dem in vivo-Modell zur retinalen Ischämie an Ratten hat das GABA–Pentin keine

Wirkung gezeigt, das GABA-Pentin–Lactam dagegen hat die Anzahl an überlebenden

Ganglienzellen verdoppelt. Die beiden Wirkstoffe haben unterschiedliche

pharmakokinetische Eigenschaften. GABA-Pentin–Lactam ist im Vergleich zu GABA-

Pentin ungeladen, dadurch kann er durch die biologische Membranen

hindurchdiffundieren.

Diese Tatsache erlaubt die Annahme, dass die Hemmung der Glutamatfreisetzung nicht an

den plasmalemmalen ATP–abhängigen Kaliumkanälen stattgefunden ist, sondern an den

intrazellulären, eventuell mitochondrialen K ATP- Kanälen.

55

Außer einer höheren

Überlebensrate der Ganglienzellen hat, wurde zusätzlich eine gesteigerte Proliferation

unter Kulturbedingungen beobachtet.

Feuerstein et al. hat die ähnlichen Studien zur Wirkung auf Osteoblasten durchgeführt.

Dabei hat das GABA-Lactam-Derivat einen proliferationssteigernden Effekt auf die

Osteoblasten gezeigt und es wurde der Anstieg von ROS-Werten (Reaktive Oxygen

Species) beobachtet. 56

ROS agieren als second messenger und werden unter anderem in den Mitochondrien und

der Plasmamembran produziert. Sie leiten Signalkaskaden zum Zellkern und regulieren

somit zelluläre Prozesse wie Proliferation und Differenzierung. Zusammen mit dem

intrazellulären Kalziumhaushalt halten sie das Gleichgewicht zwischen dem Zellwachstum

und dem Zelltod. 57

55 Jehle et al.2000

56 Feuerstein et al. 2008

57 Sauer et al. 2001

21


1.4 Ziele der Untersuchung

In Folge sollte untersucht werden, ob der von Feuerstein nachgewiesene positive,

proliferative Effekt der GABA-Pentin-Lactam Derivate auf Osteoblasten auch für humane

mesenchymale Stammzellen gilt. Es sollten das Trans-8-tert-butyl-GABA-Pentin-Lactam

und das Cis-8-tert-butyl-GABA-Pentin-Lactam in vitro untersucht werden. Des Weiteren

sollte die wirksamste Konzentration geklärt werden. Weitere Fragen waren, ob die GABA-

Pentin-Lactam Derivate Einfluss auf die multipotente Differenzierungsfähigkeit der MSCs

haben und welchen Einfluss auf Zellproliferation und Differenzierungsfähigkeit der Zellen

Dimethylsulfoxid (DMSO) als verwendetes Lösungsmittel hat.

22


2. Material und Methoden

2.1 Versuchsablauf

Abbildung 1: Schematischer Versuchsablauf 58

Die Zellen, die durch die Aspiration aus dem Beckenknochen gewonnen und anschließend

konzentriert wurden, wurden kultiviert. Die Primärkulturen wurden auf drei verschiedene

Medien zu je vier verschiedenen Konzentrationen und zusätzlich auf ein Kontrollmedium

verteilt. Die drei oben genannten Medien waren: das Lösungsmittel DMSO und die

Wachstumsmoleküle Trans-8-tert-butyl-GABA-Pentin-Lactam und Cis-8-tert-butyl-GABA-

Pentin-Lactam. Als Kontrollmedium wurde reines NH-Expansion–Medium verwendet. Die

Wirksamkeit der Testmedien wurde durch den Proliferationstest Easy For You-Test (EZ4U)

photometrisch ermittelt und statistisch ausgewertet. Der Multipotenznachweis, der sowohl

vor als auch nach der Stimulation mit den verschiedenen Testmedien durchgeführt wurde,

lieferte den Beweis für das Vorliegen der Stammzellen des Knochenmarks. Im Rahmen

des Multipotenznachweises wurden die Zellen in verschiedenen Differenzierungsmedien

58 Wolter 2009

23


zum Wachstum von Adipozyten, Chondrozyten und Osteoblasten angeregt und dieses

durch spezifische Färbungen belegt.

2.2 Votum der Ethikkommission

Bei den Stammzellenspendern handelte es sich um Patienten, die sich im Rahmen der

Anwendungsbeobachtung „Sinus floor elevation with autogenous stemcells and the

biomaterial Bio-Oss® for patients with alveolar atrophy“ behandeln ließen. Diese wurde

von der Ethikkommission mit dem Votum 26/05 genehmigt. Die Patienten wurden

ausführlich aufgeklärt. Die Einverständniserklärung beinhaltete auch die weitere Analyse

einer Fraktion der zur Transplantation gewonnenen Zellen

2.3 Gewinnung und Konzentrierung der Stammzellen

2.3.1 Vorbereitung

Alle zur Knochenmarkaspiration und Stammzellseparation benötigten Materialien waren in

Bone Morrow Aspirate Concentrate (BMAC) Procedure Pack (Harvest Technologies

Corporation, Plymouth, MA, USA) enthalten. Ein Karton enthielt das Bone Marrow

Aspiration Kit, d.h. eine Punktionsnadel, einen Trokar und Spritzen, die steril durch das

instrumentierende OP-Personal bereitgelegt wurden. Zusätzlich wurden zwei 60-ml-

Perfusorspritzen mit Verschlusskappen, Edelstahlschüsseln, Skalpell, Nadelhalter,

Pinzette, Hautnaht, Tupfer, Pflaster, Hautdesinfektionsmittel und Lokalanästhesie

vorbereitet.

Abbildung 2: Vorbereitung 59

59 Kuenz 2011

24


Zur Vorbereitung einer Heparinlösung mit 1000 U/ml wurden 18 ml NaCl-Lösung mit 2 ml

Heparin 10000 U/ml (beides B. Braun, Melsungen, Germany) in einer Edelstahlschüssel

vermischt. Die Spritzen, die Punktionsnadeln und der Trokar wurden zur vollständigen

Oberflächenbenetzung mit der Heparinlösung gespült, so dass etwas Heparinlösung im

Lumen verblieb. In eine der 60-ml Spritzen wurden 5 ml Heparinlösung gegeben. Die

Heparinlösung verblieb im Lumen. In eine der 60-ml-Spritzen wurden 5 ml Heparinlösung

gegeben.

2.3.2 Punktion des Beckens

Der Patient wurde in Linksseite gebracht. Das Operationsfeld wurde von der Glutealfalte

bis etwa 10 cm über den Beckenschaufeln desinfiziert und steril abgedeckt. Die

Wirbelsäule, der Beckenkamm und die Spina iliaca posterior superior wurden palpiert.

Diese wurden mit einem sterilen Filzstift markiert. Etwa 2 cm unterhalb der Spina iliaca

posterior wurde die Punktionsstelle markiert.

Abbildung 3: Das filzstiftmarkierte Operationsfeld 60

Mit einer 20-ml Spritze wurde das Lokalanästhetikum aufgezogen. Mit der Nadel der

Lokalanästhesie wurde nach dem Knochen im Punktionsgebiet getastet und infiltriert. Mit

einem Skalpell erfolgte anschließend parallel zu den Hautspannungslinien eine ca. 5 mm

lange Stichinzision. Die Punktionskanüle wurde so gehalten, dass der Mittelfinger die

Nadel stabilisiert und das letzte Fingerglied die Stopperfunktion übernimmt, um eine

Perforation ins Peritoneum zu verhindern.

60 Kuenz 2011

25


Abbildung 4: Stabilisation der Hohlnadel mit dem Mittelfinger

Nach der Perforation des Weichgewebes mit der Hohlnadel, wurde der Knochenkontakt

hergestellt. Mit drehenden Bewegungen wurde die Compacta perforiert bis sämtliche

Perforationen der Kanüle im Markraum lagen. Die Punktion sollte vorsichtig erfolgen. Der

Trokar sollte einen rechten Winkel zum Knochen aufweisen, damit das Abrutschen und die

Verletzung des Peritoneums und der dahinterliegenden Organen verhindert wurden.

Abbildung 5: Die Punktion des Knochenmarks am Patienten 61

Anschließend wurde mit einer 60-ml-Spritze, die mit Heparin gespült und mit 8-ml

Zitratlösung (ACD-A aus BMAC-Procedure-Pack) gefüllt war, das Knochenmark aspiriert.

Während der Aspiration sollte die Kanüle mehrfach gedreht werden, um die Stammzellen

61 Kuenz 2011

26


aus den verschiedenen Regionen anzusaugen. Anschließend wurde die Wunde mit einem

Pflasterverband verschlossen.

2.3.3 BMAC (Bone Marrow Aspirate Concentrate)

Zur Konzentrierung des Knochenmarkaspirats wurden 3 ml der im BMAC-Procedure-Pack

enthaltenen ACD-A-(Zitrat)-Lösung durch den weißen Port in die Plasmakammer des

Zentrifugationsgefäßes gegeben. Durch den roten Port wurde das Knochenmarkaspirat

aus der 60–ml-Spritze in die andere Kammer gefüllt. 5 ml wurden in der Spritze

zurückbehalten, steril verschlossen und in das Zelllabor gebracht.

Anschließend wurde das Zentrifugationsgefäß in der Zentrifuge platziert und das blaue

Gegengewicht eingesetzt. Die Zentrifuge wurde verschlossen und der Start ausgelöst. Der

Zentrifugationsprozess dauerte 14 Minuten an. Währenddessen stoppte die Zentrifuge

einmal, damit der Überstand in die Plasmakammer abfließen konnte. Dabei darf sie nicht

geöffnet werden.

Abbildung 6: Schematischer Ablauf der BMAC

27


Das Zentrifugat wies einen dreischichtigen Aufbau auf. Auf dem Boden der kleinen

Kammer ließen sich eine rote und eine weiße Schicht erkennen, darüber war eine

bernsteinfarbene Flüssigkeit zu erkennen. Die mittlere weiße Schicht war der sogenannte

„Buffy Coat“, der die Stammzellen enthält. Darüber der Plasmaüberstand, darunter die

Erythrozyten-reiche Schicht. Die folgende Abbildung verdeutlicht die Zusammensetzung

der unterschiedlichen Schichten.

Abbildung 7 :BMAC-Aufbereitungsgefäß nach der Zentrifugation 62

Von der Kanüle der Aspirationsspritze wurde der Abstandhalter (weißer Kunststoffring)

entfernt und der Überstand vorsichtig aspiriert. Während der Aspiration sollten alle oben

schwimmende Zelldebris entfernt, die sedimentierten Zellen aber nicht aufgewirbelt

werden. Zusätzlich wurde die Spritze weiterversenkt, bis der Abstandshalter es nicht mehr

zugelassen hat. An dieser Stelle wurde die Aspiration unterbrochen. Mit einer 20-ml Spritze

wurden die verbleibenden Zellschichten resuspendiert und aufgesaugt. Als Ergebnis

erhielt man das fertige Stammzellgemisch (BMAC) mit einem Volumen von 7 ml.

62 Wolter 2009

28


2.4 Zellkultur

2.4.1 Primärkultur

Die Probe mit den 1,5 ml Knochenmarkkonzentrat wurde mit NH-ExpansionMedium

(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach) auf 30 ml aufgefüllt, resuspendiert und jeweils 5 ml in

75 cm² Kulturflaschen (Cellstar, Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany)

gegeben. Dieses Medium erlaubt die Expansion der Zellen, die Zelldifferenzierung wird

dabei nicht induziert. Nach 24 Stunden Inkubationszeit im Brutschrank (Hersteller) bei

95 % Luftfeuchtigkeit, 5 % CO 2 und 37 C wurde das Medium komplett gewechselt.

Dadurch wurden die nicht plastikadhärenten Zellen entfernt. Dieses diente der Selektion

der mesenchymalen Stammzellen, deren Eigenschaft es war, an Plastik zu haften. 63 Der

Wechsel des Zellnährmediums erfolgte alle drei Tage. Dabei wurden die Kulturen

hinsichtlich ihres Wachstums unter dem Lichtmikroskop (Carl Zeiss AG, Göttingen,

Germany) untersucht.

2.4.2 Zellpassage

Mit dem Lichtmikroskop wurde kontrolliert, ob die Zellen am Boden der Kulturflasche eine

Konfluenz von 80-90 % erreicht haben. Zur Subkultivierung wurde das Trypsin EDTA

(0,05 %/ 0,53 mM)(PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich), das PBS (jeweils PAA

Laboratories GmbH, Pasching, Austria) und das NH-Expansions-Medium (Miltenyi Biotec,

Bergisch Gladbach) im Wasserbad auf 37°C vorgewärmt. Abschließend wurde das

NH-Expansions-Medium aus der Kulturflasche abpipettiert und die Zellen mit 2 ml PBS

gewaschen, um das restliche NH–Expansions-Medium zu entfernen. Die mit 1 ml

Trypsin/EDTA bedeckten Zellen wurden nach einer siebenminütiger Inkubationszeit bei

37°C unter dem Mikroskop (Axiovert 135, Zeiss, Kochern) auf ihre Dissoziation kontrolliert.

Bei der vollständigen Lösung der MSCs wurden 5 ml NH-Expansions-Medium zugefügt,

resuspendiert und die Zellen in eine 50 ml Tube (Cellstar, Greiner bio-one GmbH,

Frickenhausen, Germany) überführt. Die 25 cm 2 Kulturflasche (Falcon, NJ, USA) wurde

zusätzlich mit 5 ml NH-Expansions-Medium gespült, um möglichst alle Zellen zu

überführen. Anschließend kamen die Zellen bei Raumtemperatur zehn Minuten in die

Zentrifuge bei 300 g (Biofuge Stratos, Heraeus Instruments, Osterode, Germany). Der

Überstand wurde verworfen und die Zellen in 2 ml NH-Expansions-Medium resuspendiert

63 Pittinger et al. 1999; Dominici et al. 2006

29


und mit 10 ml Expansionsmedium in 75 cm 2 Kulturflaschen überführt.

2.5 Versuch mit GABA-Peptin-Lactam–Derivaten

Nach ca. 14 Tagen wurde die Konfluenz des Zellrasens im Lichtmikroskop kontrolliert. Die

Zellen wurden durch die Trypsinierung aus dem Zellverband gelöst (vgl. die erste

Zellpassage), um anschließend ihre Anzahl und Vitalität zu überprüfen.

Dafür wurden 50 µl Zellsuspension mit dem organischen Farbstoff Trypan Blau (Biochrom

AG, Berlin) im Verhältnis 1:2 verdünnt. Durch das negativ geladene Trypan Blau konnte

der Farbstoff nur in die Zellen gelangen, deren aktiv aufrechterhaltenes inneres

Membranpotential aufgehoben war, was bedeutete, dass diese Zellen irreversibel

geschädigt und avital waren. Vitale Zellen stellten sich unter dem Mikroskop transparent

dar, während abgestorbene Zellen sich dunkelblau färbten.

Von der homogenen Zellsuspension wurden 10 µl in eine Neubauer-Zählkammer (Brand

GmbH, Wertheim, Germany) gegeben. Unter dem Mikroskop wurden die lebenden Zellen

gezählt. Die Zellzahl lässt sich folgendermaßen errechnen:

So konnten nach einer entsprechender Verdünnung äquivalente Zellmengen von 1x10 4

MSCs ermittelt werden, an denen die Wachstumsmoleküle Trans-8-tert-butyl-GBP-L, Cis-

8-tert-butyl-GBP-L und DMSO in jeweils vier Konzentrationen von 1 nM, 10 nM, 100 nM

und 1000 nM getestet wurden.

30


Abbildung 8: Chemische Strukturformel der getesteten Mediatoren

Die Inkubation der Zellen erfolgte in 24-Well-Platten (Greiner-bio-one, Frickenhausen,

Germany). Für jede zu testende Mediatorenkonzentration wurden drei Wells angesetzt

und alle zwei Tage das Nährmedium gewechselt. Nach Erreichen einer Konfluenz der

Zellen von 80 %, die nach durchschnittlich zwei Wochen Inkubation im Brutschrank

erreicht war, wurde der Prolieferationstest EZ4U durchgeführt.

2.6 Proliferationstest EZ4U

Zur Bestimmung der Zellproliferation wurde der EZ4U-Test (Biomedica, Wien, Austria)

durchgeführt. Der Test basierte auf der Fähigkeit lebender Zellen, farbschwache gelbliche

Tetrazoliumsalze in ihren Mitochondrien zu farbintensiven Formazanderivaten zu

reduzieren. Die Reduktionsreaktion fand in den Mitochondrien statt, die wenige Minuten

nach dem Zelltod inaktiv wurden und diese Reaktion unmöglich machten. Diese rötlichen

Formazanderivate wurden von den Zellen in das Kulturmedium abgegeben. So ließ sich

die Zellvitalität photometrisch bestimmen, da die Menge an Formazanderivaten mit der

Aktivität lebender Zellen in der Kultur korreliert. Die weitere Proliferation der Zellen wurde

durch diesen Test nicht beeinflusst.

Testdurchführung

Zu dem lyophilisiertem Substrat wurden 2,5 ml Aktivatorlösung bei Zimmertemperatur

pipettiert. Im Brutschrank wurde die Lösung bei 37 C für 15 Minuten inkubiert. Jedes Well

der 24-Well-Platten wurde mit 500 µl frischem Medium sowie 50 µl der Substrat-

/Aktivatorlösung beschickt. Die Inkubationszeit im Brutschrank bei 37°C und 5 %-igem

CO 2 belief sich auf drei Stunden. Der Überstand wurde abpipettiert und jeweils auf drei

31


weitere Wells à 100 µl auf 96-Well-Platten verteilt. So ergaben sich neun Messwerte von

jeder Mediatorenkonzentration.

Die Messung der Extinktion im ELISA-Reader (Anthos Labtech, Salzburg, Österreich)

wurde bei einer Wellenlänge von 450 nm durchgeführt. Um negative Einflüsse von

Verunreinigungen und Zelldebris auf die Ergebnisse auszuschließen, wurden Messungen

bei einer Wellenlänge von 620 nm durchgeführt und diese von den Messwerten bei 450

nm abgezogen. Auch der Leerwert, welcher bei 540 nm von Medium und Substrat ohne

Zellen ermittelt wurde, wurde von dem Messwert von 450 nm abgezogen.

2.7 Multipotenznachweis der MSCs

Während des Ansatzes der 24-well Platten zur Kultivierung und EZ4U-Auswertung wurde

pro Individuum, Mediatorenkonzentration und Kontrolle jeweils ein 25 cm 3 Fläschchen

(Falcon, NJ, USA) zur späteren Differenzierung angelegt. Nach zweiwöchiger Kultivierung

wurden die Kulturen auf 12-Well-Platten zu einer Konzentration von 5x104 Zellen/ml NH–

Diff-Medium (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach) übertragen. Pro Patient wurden drei

Wells zur Bestimmung des osteogenen Phänotyps und ein Well für den

Adipozytennachweis angelegt.

Der Chondrozytennachweis fand in 1,5ml-Reagenzgefäßen (Eppendorf AG, Hamburg,

Germany) statt. Zur Differenzierung der MSCs in Adipozyten, Osteoblasten und

Chondrozten wurden NH–Diff-Medium verwendet. Die Medien wurden im Wasserbad auf

37°C erwärmt und mit 1 % Penicillin/Streptomycin (Biochrom / Seromed, Berlin,

Deutschland) angereichert. Der Mediumwechsel fand alle zwei Tage statt. Nach

zweiwöchiger Inkubation in Brutschrank bei 37°C, 5 % CO 2 und über 95 % Luftfeuchtigkeit

folgten die spezifischen Färbungen.

2.7.1 Differenzierung von MSCs zu Adipozyten

Um die Differenzierung von MSCs zu Adipozyten zu induzieren, wurde das AdipoDiff

Medium (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach) verwendet. Die MSCs wurden zu einer

Konzentration von 5x10 4 Zellen/ml NH-Adipo-Diff-Medium (Miltenyi Biotec, Bergisch

Gladbach) verdünnt und mit je 1,5 ml Zellsuspension auf 12-Well-Platten (Becton

Dickinson, Los Angeles, CA, USA) verteilt. Nach der zwei Wochen Inkubationszeit zeigten

32


sich erste Fettvakuolen.

2.7.1.1 Adipozytennachweis

Der Nachweis der Adipozyten sollte mittels Oil Red O-Färbung geschehen. Die Adipozyten

produzierten und speicherten neutrale Lipide. Diese in der Zelle gespeicherten

Fetttröpfchen konnten zu Vakuolen verschmelzen, die sich durch Färbereagenz rosa

färben.

Die Färbelösung wurde folgendermaßen zubereitet. Man mischte 0,5 % Oil Red O

Grundstocklösung (Sigma-Aldrich Chemie GmbH P.O., Steinheim) mit Isopropanol (Sigma-

Aldrich Chemie GmbH P.O., Steinheim). Eine Filterung des Reagenz (Millipore Corporation,

Porengröße 0,22 μm, Bedford, MA, U.S.A.) kurz vor dem Anfärben war nötig, da die Oil–

Red-O-Grundlösung nicht komplett in die Lösung geht.

Für die Färbeprozedur wurde zunächst das NH-Adipo-Diff-Medium von den 12-Well-

Platten (Becton Dickinson, Los Angeles, CA, USA) entfernt, anschließend wurden die

Zellen mit je 2 ml PBS (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich) gewaschen. Als

nächstes wurden diese mit dem zuvor auf -20°C abgekühlten Methanol (Merck KGaA,

Darmstadt, Germany) fixiert. Nach einer fünfminutiger Inkubationszeit bei -20°C wurde das

Methanol (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) abpipettiert. Die Zellen wurden mit je 2 ml

destilliertem Wasser gespült. Anschließend wurde die 2 ml Oil-Red-O-Färbereagenz

(Sigma-Aldrich Chemie GmbH P.O., Steinheim) auf die 12-Well-Platten (Becton Dickinson,

Los Angeles, CA, USA) verteilt und auf einem Platten-Shaker (IKA Basic 260 B, IKA-

Werke GmbH & Co KG, Staufen) für 20 Minuten stehen gelassen. Nach der Entfernung

des Oil-Red-O-Färbereagens (Sigma-Aldrich Chemie GmbH P.O., Steinheim) wurden die

Zellen zweimal mit je 2 ml destilliertem Wasser gewaschen. Unmittelbar nach dem

Anfärben wurden die Adipozyten unter dem Mikroskop (Axioskop, Zeiss, Oberkochen,

Germany) ausgewertet.

2.7.2 Differenzierung von MSCs zu Chondrozyten

Um die Differenzierung von MSCs zu Chondrozyten zu unterstützen, wurde das NH-

Chondro-Diff-Medium (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) verwendet.

33


Die Zellen wurden zu einer Konzentration von 3x10 4 Zellen/ml NH-Expansion-Medium

verdünnt und in ein 50 ml Tube gegeben. Hier ist die Plastikadhärenz der Zellen

unerwünscht, deswegen wurden Polypropylen- und keine Polystyren-Gefäße verwendet.

Die Zellsuspension wurde bei 150 g fünf Minuten lang zentrifugiert, danach wurde das

NH–Expansion-Medium verworfen. Die Zellen wurden anschließend mit 1 ml des auf 37°C

erwärmten Chondro-Diff-Medium resuspendiert und in ein 1,5 ml Eppendorfhütchen

(Eppendorf AG, Hamburg, Germany) gefüllt. Nach der nächsten fünfminütigen

Zentrifugation bei 150 g wurden die Zellen im Brutschrank inkubiert. Die Deckel der

Eppendorfhütchen wurden mit kleinen Löchern versehen, damit der Austausch mit der

Atmosphäre des Brutschrankes stattfinden kann. Alle zwei Tage wurde das alte Medium

entfernt und 1 ml frisches NH ChondroDiff Medium hinzupipettiert. Nach zwei bis drei

Wochen folgte der Chondrozytennachweis.

2.7.2.1 Chondrozytennachweis

Der Chondrozytennachweis wurde mittels Aggrecanfärbung durchgeführt. Das Aggrecan

ist ein Proteoglykan, welches für die Elastizität des Knorpels verantwortlich ist.

Zunächst wurden die Zellen mit 3,7 %-igem Formalin (Otto Fischar GmbH & Co.KG,

Saarbrücken, Deutschland) fixiert und durch die aufsteigende Ethanolreihe (VWR

International, Darmstadt, Germany) dehydriert. Dann wurden die Zellknötchen zweimal 30

Minuten in Roti-Histol (Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany) gegeben und

dreimal 30 Minuten im 58 °C warmen, flüssigen Paraffin ( (Roti-Plast, Carl Roth GmbH &

Co. KG, Karlsruhe, Germany) eingebettet. Mit dem Mikrotom (M 2065, Leica Instruments

GmbH, Nußloch, Germany) wurden 5 µm dicke Gewebsschnitte gewonnen und diese in

das 40°C warme Wasserbad gebracht. Die Gewebsschnitte wurden auf einen Objektträger

(Polysine Slide, Gerhard Menzel Glasbearbeitungswerk GmbH & Co. KG, Braunschweig,

Germany) aufgebracht und für 3 Stunden bei 55 °C inkubiert und anschließend auf

Raumtemperatur heruntergekühlt.

Für die Vorbereitung des Färbereagenz wurde ein Liter Waschpuffer hergestellt. Dazu

wurde das PBS (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich) mit 1 % BSA (Biochrom

Seromed, Berlin, Deutschland) vermischt. Um 50 ml Blockpuffer herzustellen wurde

Waschpuffer mit 10 % Eselserum (Jackson Immuno Research, Laboratories, Inc., PA,

USA) verdünnt.

34


Das Mischen von Blockpuffer mit 0,3 % Trition X 100 (Sigma Aldrich GmbH & Co.KG,

Steinheim) ergab 10 ml Permiabilitätspuffer. Maus-anti-Mensch-Aggrecan-Antikörper

(Chemicon International, Hofheim, Deutschland) und rhodaminkonjugierte

Sekundärantikörper (Jackson ImmunoResearch, Laboritories, Inc.) wurden gemäß der

Herstelleranweisung verdünnt. Das DAPI (Sigma Aldrich GmbH & Co.KG, Steinheim)

wurde in destilliertem Wasser bis zu einer Konzentration von 5 mg/ml verdünnt.

Für eine gelungene reproduzierbare spezifische Färbung wurden die Gewebsschnitte

während des gesamten Versuchs feucht gehalten Die Mittels Roti-Histol (Carl Roth GmbH

& Co. KG, Karlsruhe, Germany) und absteigender Ethanolreihe (VWR International,

Darmstadt, Germany) entparaffinerte Gewebsschnitte wurden mit destilliertem Wasser

gespült und für fünf Minuten in PBS (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria) gegeben.

Danach wurden die Gewebsschnitte bei Raumtemperatur mit Permeabilitätspuffer 45

Minuten lang inkubiert. Anschließend wurde der Objektträger trockengetupft und der

Abschnitt mit einem wasserfesten Stift umrandet.

Der erste Antikörper (Maus-Anti-Mensch-Aggrecan) (Millipore GmbH, Schwalbach,

Germany), der mit Blockpuffer auf 10 µm/ml verdünnt war, wurde auf die Präparate

aufgebracht und über Nacht bei 5 C in einer feuchten Kammer inkubiert. Am nächsten

Morgen folgte die dreimalige Reinigung mit Waschpuffer für je fünf Minuten.

Der zweite Antikörper (Esel Anti-Maus IgG Rhodamine, Dianova GmbH, Hamburg,

Germany) markierte mit dem fluoreszierenden Rhodamin, welches lichtempfindlich war.

Deswegen fand der letzte Teil der Färbung in der Dunkelkammer statt. Der zweite

Antikörper wurde mit Waschpuffer in einem Verhältnis 1:50 verdünnt, auf das

filzstiftmarkierte Objekt aufgetragen und 60 Minuten inkubiert. Anschließend wurde das

DAPI (Sigma Aldrich GmbH & Co.KG, Steinheim) mit Waschpuffer im Verhältnis 1:1000

verdünnt und für 15 Minuten im Dunkeln inkubiert. Die Gewebsschnitte wurden zweimal

für fünf Minuten mit Waschpuffer gespült, danach mit destilliertem Wasser abgewaschen

und trockengetupft. Mit einem Fassungsmedium und Deckglas vom Licht geschützt,

konnten die Gewebsschnitte bis zur Analyse unter dem Floureszensmikroskop (Axiovert

135, Zeiss, Kochern) aufbewahrt werden.

35


2.7.3 Differenzierung von MSCs zu Osteoblasten

Zur Differenzierung von MSCs zu Osteoblasten wurde das NH-Osteo-Diff-Medium

(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) verwendet. Die MSCs wurden mit NH–

Osteo-Diff-Medium auf 5×10 4 Zellen pro 2 ml verdünnt und mit 2 ml je Well auf 12-Well-

Platten übertragen.

2.7.3.1 Osteoblastennachweis

Die Differenzierung von MSCs zu Osteoblasten wurde mit drei unterschiedlichen

Färbungen nachgewiesen.

36


2.7.3.1.1 Alkalische Phosphatase-Färbung

Zum Nachweis der alkalischen Phosphatase wurden eine immunhistochemische Färbung

eines fertigen Testkits (Sigma-Aldrich, München, Germany) durchgeführt. Das Prinzip

dieses Tests ist es, ein lösliches Substrat durch die Aktivität des Enzyms „alkalische

Phosphatase“ in einen unlöslichen blauen Farbstoffkomplex zu überführen. Als

Färbeergebnis sollte die alkalische Phosphatase im Cytoplasma als diffuser, blauer

Farbniederschlag erscheinen.

Für die Herstellung der Gebrauchslösung wurden 0,25 ml Fast-Blue-B-Lösung mit 0,25 ml

Natriumnitrit-Lösung vorsichtig vermischt und zwei Minuten stehengelassen. Dazu kamen

11,25 ml destilliertes Wasser und 0,25 ml alkalische Naphthol AS-BI-Lösung. Anschließend

wurde alles noch mal gut vermischt.

Für die Färbung wurden die Proben zunächst luftgetrocknet und in einer Citrat-Aceton-

Formaldehyd-Lösung für 30 Sekunden fixiert. Nach einer Spülung mit destilliertem Wasser

wurde die ALP-Lösung auf die Präparate aufgetragen und für 15 Minuten im Brutschrank

inkubiert. Nach einer zusätzlichen Spülung mit destilliertem Wasser wurden die Proben mit

Neutralrot gegengefärbt. Nach einer erneuten Spülung mit destilliertem Wasser konnten

die Proben unter dem Lichtmikroskop (Axioskop, Zeiss, Oberkochen, Germany) bei 100-

facher Vergrößerung untersucht werden.

2.7.3.1.2 Kollagen Typ I-Nachweis

Um die Proben auf Gehalt des Kollagen Typ 1 zu untersuchen, wurden die Zellen

nachdem das Medium abgezogen wurde, für fünf Minuten mit PBS bedeckt. Danach

wurde 70%-iges Ethanol auf die Zellen gegeben und eine Stunde abgewartet. Nach dieser

Zeit wurde der Alkohol abgegossen und das PBS erneut für fünf Minuten dazugegeben.

Über Nacht trockneten die Platten an der Luft. Zur weiteren Bearbeitung wurden die Zellen

erneut mit PBS für fünf Minuten bedeckt. Anschließend folgten zehn Minuten mit 0,3 %

Wasserstoffperoxid. Um die Zellen zu spülen, folgte nun dreimal ein PBS-Bad für jeweils

fünf Minuten. Die Zugabe von 10 % Rinderalbumin für zehn Minuten sollte unspezifische

Immunreaktionen verhindern. Anschließend folgte der erste Antikörper (Anti-Kollagen Typ

I, Sigma-Aldrich, München, Germany) in einer Verdünnung von 1:100, der über Nacht bei

37


4 °C einwirkte. Am nächsten Tag wurde dieser erneut dreimal mit PBS für je fünf Minuten

gewaschen und für jeweils 45 Minuten der zweite biotinylierte Antikörper (Vectastain Elite

Kit, Vector Laboratories, Burlingame, USA) und der Avidin/Biotin-Peroxidase-Komplex

(Vectastain Elite Kit, Vector Laboratories, Burlingame, USA) auf die Zellen gegeben.

Zwischen jedem Inkubationsschritt erfolgte eine drei- bis fünfmalige Spülung mit PBS. Nun

folgte die Färbung mit der Peroxidasesubstrat-Lösung (4 mg Diaminobenzidin + 10 ml

0,05 M Trispuffer + 17 μl 30 % H 2 O 2 ). Dabei wurde die Immunreaktion für 20 Minuten bei

Raumtemperatur gestartet. Nach drei Spülungen mit PBS für je fünf Minuten folgte die

Gegenfärbung mit Hämalaun (Merck KGaA, Darmstadt, Germany). Anschließend wurden

die Platten für ca. 30 Sekunden mit Leitungswasser gespült und getrocknet. Unter dem

Mikroskop (Axioskop, Zeiss, Oberkochen, Germany) bei 100-facher Vergrößerung konnten

positive Zellen daran erkannt werden, dass das Cytoplasma braun und die Zellkerne blau

waren.

2.7.3.1.3 Kalknachweis nach Kossa

Im oben genannten Test wurde Calcium gegen Silberionen ausgetauscht. Nach

Entfernung des Mediums wurden Zellen mit 5 %-iger Silbernitratlösung 60 Minuten lang im

Dunkeln inkubiert. Nach dem Waschen mit destilliertem Wasser wurde die 1 %-ige

Pyrogallussäure für vier Minuten zu den Zellen dazugegeben. Die Pyrogallussäure

reduzierte die Silberionen zu metallischem Silber. Nach dem erneuten Waschen mit

destilliertem Wasser wurden die Zellen mit 5 %-igem Natriumthiosulfat für drei bis fünf

Minuten fixiert. Nach dem 15-minutigen Spülen mit destilliertem Wasser wurde die

Gegenfärbung mit Kernechtrotlösung für acht Minuten durchgeführt. Die

Kernechtrotlösung wurde wie folgt vorbereitet. 0,1 g Kernechtrot, Aluminiumsulfat 5 % und

100 ml destilliertes Wasser wurden erhitzt und nach der Abkühlung filtriert. Nach der

Gegenfärbung wurden die Zellen erneut mit destilliertem Wasser gespült. Die

anschließende Auswertung mit dem Lichtmikroskop (Axioskop, Zeiss, Oberkochen,

Germany) zeigte kalkhaltige, tiefschwarze Zellen mit rot angefärbten Kernen.

2.8 Statistische Auswertung

Die statistische Analyse wurde von Dr. Martin Wolkewitz vom Institut für Biometrie,

Universität Freiburg, durchgeführt.

38


Die MSCs mit reinem Medium ohne weitere Zusätze wurden als Referenz betrachtet.

Mithilfe der generalized-estimation-equations–Methode (GEE), wurde die Wirkung der

einzelnen Substanzen in jeweils unterschiedlichen Konzentrationen statistisch

ausgewertet. Dabei wurde jeder Patient als Cluster betrachtet. Ausschließlich Messungen

von unterschiedlichen Patienten wurden als statistisch unabhängig angesehen und die

Substanz, Konzentration und Substanz-Konzentration-Interaktion wurden als kategorische

Variable betrachtet. Dadurch konnten stabile Standartabweichungen ermittelt und die

Ergebnisse mit dem 95 %-igem Konfidenzintervall angegeben werden. Bei Ablehnung der

Nullhypothese wurde ein Ergebnis dann als signifikant betrachtet, wenn der p-Wert kleiner

als 0,05 war, die Irrtumswahrscheinlichkeit also weniger als 5 % betrug. Eine graphische

Darstellung des 95 %-igen Konfidenzintervalls folgt weiter unten. Alle Berechnungen

wurden mit der PROC GENMOD und REPEATED Ausführung der Statistiksoftware SAS

system version 9.1. ermittelt.

39


3. Ergebnisse

3.1 Zellkultur

Die MSCs wurden mit einem NH–Expansions-Medium kultiviert. Nach drei Tagen konnte

eine Zellvermehrung beobachten werden, die sich unter dem Lichtmikroskop als ein

lockerer Zellverband mit spindelförmigen Stammzellen darstellte.

Abbildung 9: Lichtmikroskopische Aufnahme der MSCs in Azur-II-Färbung (40-fach)

Bereits nach sieben Tagen fand die erste Passage statt. Die Zellen wiesen eine starke

Plastikadhärenz auf. Lichtmikroskopisch war ein dichter, konfluierender Zellverband zu

erkennen.

Abbildung 10: Lichtmikroskopische Aufnahme der MSCs-Rasen, rechts in HE-Färbung,

links in Azur-II-Färbung (40-fach)

3.2 Multipotenznachweis

Durch die Wachstumsstimulation mit Trans-8-tert-butyl-GABA-Pentin-Lactam und Cis-8-

tert-butyl-GABA-Pentin-Lactam wurde die Multipotenz der mesenchymalen Stammzellen

nicht beeinflusst. Die Zellen konnten sowohl vor der Stimulation mit den

40


Wachstumsmolekülen als auch danach sich in Adipozyten, Chondrozyten oder

Osteoblasten differenzieren. Somit wurde die Tatsache bewiesen, dass es sich um

mesenchymale Stammzellen handelt.

3.2.1 Nachweis der adipogenen Differenzierung mit einer Oil Red O-Färbung

Um die Ausdifferenzierung zu Adipozyten nachzuweisen, wurde die Oil-Red-O-Färbung

durchgeführt. Sobald die Fettvakuolen lichtmikroskopisch zu sehen waren, konnten die

Zellen angefärbt werden. Hierbei stellten sich die Fettvakuolen der Zellen rot dar, die

restlichen Zellstrukturen blieben ungefärbt.

Abbildung 11: Adipozytennachweis mit Oil-Red-O-Färbung (40-fach)

3.2.2 Nachweis der chondrogenen Differenzierung mit Aggrecanfärbung

Nach der Differenzierung des MSCs zu Chondrozyten konnte dies mit Aggrecanfärbung

nachgewiesen werden. Hierzu wurden die Knorpelbereiche mit Aggrecan rot markiert, die

Zellkerne mittels DAPI blau.

41


Abbildung 12: Chondrozytennachweis mit Aggrecanfärbung

3.2.3 Nachweis der osteogenen Differenzierung

Um die Ausdifferenzierung zu Osteoblasten nachzuweisen, wurden drei spezifische

Färbungen durchgeführt.

3.2.3.1 ALP-Test

Der ALP-Test sollte das Enzym Alkalische Phosphatase immunhistochemisch direkt

nachweisen. Das intrazelluläre Plasma enthielt das Enzym, daher wurde diese blau

angefärbt, die Zellkerne wurden rot markiert.

Abbildung 13: ALP-Test

3.2.3.2 Kollagen Typ I-Test

Osteoblasten sezernieren Kollagen Typ 1. In dieser immunhistochemischen Färbung

wurde das Kollagen Typ 1 braun und die Zellkerne blau dargestellt.

42


Abbildung 14: Kollagen Typ 1

3.2.3.3 Von-Kossa Färbung

Die von-Kossa Färbung wies Kalk in Osteoblasten nach. Die kalkhaltigen Zellen

erschienen schwarz, die Zellkerne rot.

Abbildung 15: Von-Kossa Färbung

3.3 Proliferationstest EZ4U

Die MSCs wurden mit den Wirkstoffen Cis-8-TB-GBPL, Trans-8-TB-GBPL und DMSO in

unterschiedlichen Konzentrationen proliferiert. Aufgrund ihrer Hydrophobie wurden die

Wirkstoffe mit DMSO als Lösungsmittel versetzt. Der EZ4U-Test maß dann die Vitalität der

Zellen. Die Extinktionswerte der optischen Dichte bei 450 nm wurden als Mittelwerte

separater Einzelproben bestimmt. Als Referenz dienten die Leerproben. Anhand der

statistischen Ausrechnungen des Testsergebnisses war es möglich eine Aussage über die

Proliferationsbereitschaft der Zellen zu machen. Es konnte bewiesen werden, dass DMSO

43


mit ansteigender Konzentration einen wachstumshemmenden Effekt ausübt. Unerwartet

war die Feststellung, dass bei allen mit DMSO versetzten Proben eine

Proliferationssteigerung im Vergleich zum Referenzmedium beobachtet wurde. Sogar bei

höchster Konzentration war die Proliferationssteigerung von durchschnittlich +8,9 %.

Im Vergleich zum Referenzmedium konnte eine Proliferationssteigerung bei allen Proben

beobachtet werden, wobei bei steigender Konzentration eine Verminderung der

Zellproliferation stattfand. Das Signifikanzniveau wurde in keinem Fall erreicht.

Das Trans-8-TB-GBPL zeigte einen proliferationsfördernden Effekt, welcher bei 1000 nM

durchschnittlich +12 %, bei 1 nM durchschnittlich +14 % betrug. Das beste

Proliferationsverhalten der MSCs von durchschnittlich +19 % konnte mit Cis-8-TB-GBPL

bei einer Konzentration von 1 nM erzielt werden. Dieser Wert war aber immer noch kleiner,

als der Proliferationswert von +24 % bei nur mit DMSO versetzten Proben mit der

Konzentration von 20 µl/l.

Abbildung 16: Zusammenfassung der Ergebnisse

Zur photometrischen Auswertung diente die bei 450 nm gemessene OD der vier

Konzentrationen von DMSO, Cis-8-TB-GBPL und Trans-8-TB-GBPL. Die Werte wurden im

95%-igen Konfidenzintervall dargestellt. Als Referenz diente die Proliferation von MSCs im

reinen Kontrollmedium (rote Horizontale). Die blaue Horizontale stellte den

Proliferationswert bei größter DMSO-Konzentration.

44


Abschließend ließ sich zusammenfassen, dass die Ergebnisse in keinem Fall das

Signifikanzniveau erreicht haben. DMSO wies keine Hemmung der Proliferation im

Vergleich zum Kontrollwert auf. Es wurde eine Proliferationshemmung mit zunehmenden

Konzentrationen der Wachstumsmediatoren beoachtet. Cis-8-TB-GBPL mit der

Konzentration von 1 nM zeigte die größte Wachstumssteigerung und das größte

Konfidenzintervall.

45


4. Diskussion

Die vorliegende Untersuchung zielte darauf ab, die proliferationsfördernde Wirkung von

GABA-Pentin-Lactam-Derivaten zu untersuchen, um eventuell eine geeignetere

Alternative zu den bereits bekannten Wachstumsfaktoren wie Platelet-Rich Plasma (PRP)

oder BMPs zu finden. Zusätzlich sollte die Fähigkeit der MSCs sich in die Adipozyten,

Chondrozyten und Osteoblasten nach der Proliferation mit Cis-8-TB-GBPL und Trans-8-

TB-GBPL zu differenzieren, beobachtet werden.

Mesenchymale Stammzellen

Autogenes Knochenmaterial galt lange als der „Goldstandard“ bei einer

Knochenaugmentation. Das Knochenmark hat die Tendenz, sich zu dem

„Platinstandard“ zu entwickeln. Knochenmark ist leicht zu gewinnen und enthält

Stammzellen sowie Wachstumsfaktoren, die zusammen mit den Scaffolds, zur

Regeneration der Knochendefekte im Mund-Kiefer-Bereich beitragen kann. 64 Als Caplan

gelungen ist, die MSCs aus dem Knochenmark zu gewinnen und ihre Fähigkeit, sich zu

den Zellen des mesenchymalen Gewebes zu differenzieren, beschrieben hat, 65 haben

diese ein großes Interesse der regenerativen Medizin geweckt. Bruder et al. hat gezeigt,

dass mesenchymale Stammzellen ihr Entwicklungspotenzial auch nach umfangreichen

Subkultivierungen in vitro beibehalten. 66 Ihr Prolifertaions- und Differenzierungspotential

wird dazu benutzt, durch Züchtung eigener Zellen neues Ersatzgewebes zu produzieren,

um es anschließend dem Patienten zu implantieren. Dabei werden Nachteile des

allogenen Transplantates, wie fehlende Qualität, Quantität und Immunreaktion des

Empfängers sowie des autogenen Transplantates, wie hohe Patientenmorbidität

umgangen. 67 Aufgrund ihrer ethisch und technisch relativ unproblematischen Gewinnung,

des guten Proliferationsverhaltens, der Fähigkeit zur Selbsterneuerung, des ausgeprägten

Differenzierungspotential sowie ihrer immunologischen Eigenschaften sind MSCs äußerst

interessant für das Hartgewebstissue Engineering. Die Behandlung von Knochendefekten

kritischer Größe, die aus körpereigenem Regenarationspotenzial heraus nicht mehr heilen,

64 Soltan 2005

65 Caplan 1990,1991

66 Bruder et al. 1997

67 Ringe J et al. 2002

46


stellt eine besondere Herausforderung für Orthopäden und Unfallchirurgen dar. Ex vivo

vordifferenzierte MSCs, aufgetragen auf ein Scaffold, wurden erfolgreich bei

verschiedenen Knochendefekten eingesetzt.

In einem Tierversuch am Schaf wurde eine verbesserte Knochenheilung durch die in vitro

vordifferenzierten MSCs mit Calcium-Alginat-Träger bei einem Defekt der Schädelkalotte

gezeigt. 68 Bei Versuchen an den belasteten Knochen haben MSCs-beladene Scaffolds

sehr gute Ergebnisse geliefert. Die Tibiafrakturen der Schafe wurden mit MSCs-beladenen

Hydroxylapatit–Trägern versorgt. Bei der Kontrollgruppe wurden die

Hydroxylapatitkeramit–Scaffolds ohne die Zellen eingesetzt. Nach zwei Monaten

Beobachtungszeit war die Knochenregeneration bei den mit MSCs-beladenen Scaffolds

deutlich intensiver und besser im Vergleich zu der Kontrollgruppe. 69

In einer klinischen Studie an drei Patienten wurden Defekte an Röhrenknochen (TIbia,

Radius und Ulna) mit MSCs auf einem Hydroxylapatit–Träger versorgt. Das Ergebnis war

eine beschleunigte komplikationslose Knochenregeneration. 70

Eine intravenöse Gabe von MSCs bei Patienten mit Myokardinfarkt und eine

endoventriculare MSCs Injektion bei Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz führte zu

einer Reduzierung der kardialen Zwischenfälle. 71

Neben ihrer Proliferations- und Differenzierungsfähigkeit, die sehr lange im Fokus der

Forschung stand, sezernieren mesenchymale Stammzellen bioaktive Moleküle und zeigen

immunmodulatorische Aktivitäten, 72 die bei manchen Autoimmunkrankheiten ihre Wirkung

bereits gezeigt haben.

Es wurden erfolgreiche Effekte bei der Behandlung von Kindern mit Osteogenesis

imperfekta nach intravenöser Applikation von MSCs im Rahmen eines klinischen Tests

68 Shang et al. 2001

69 Kon et al. 2000

70 Quarto et al. 2001

71 Vassalli & Moccetti 2011

72 Caplan 2011

47


gezeigt. 73 In den präklinischen Studien wurde das immunmodulatorische Potenzial und die

Differenzierung in Nerven- und Gliazellen von mesenchymalen Stammzellen

nachgewiesen und dadurch erfolgreiche Reparaturvorgänge des Zentralen Nervensystem

(ZNS) bei Patienten mit multiple Sklerose und anderen neurodegenerativen Erkrankungen

gezeigt.

74

Man erhofft sich positive Ergebnisse bei der Behandlung von

sklerodermieartigen chronischen Graft-versus-host-Krankheiten mit MSCs, vor allem

angesichts bisheriger Erfolge bei der Behandlung der akuten Form dieser Krankheit. 75

Mesenchymale Stammzellen können aus dem Knochenmark und praktisch aus jedem

anderen Organ oder Gewebe gewonnen werden. 76 Mittlerweile werden die MSCs aus der

Zahnpulpa, 77 aus dem Fettgewebe im Rahmen einer Liposuktion, 78 aus dem Fruchtwasser,

der Amnion, dem Nabelschnurblut und der Plazenta 79 isoliert.

Besonders intensiv wurden die aus dem Fettgewebe gewonnenen MSCs untersucht.

Mazzetti hat die im Rahmen einer Liposuktion gewonnen Stammzellen auf Quantität und

Qualität untersucht und kam zum Entschluss, dass es eine sichere Methode für die

Gewinnung der MSCs ist. 80 De Ugarte konnte keine signifikanten Unterschiede zwischen

aus dem Knochenmark und den aus dem Fettgewebe entnommenen Stammzellen bei

demselben Patienten feststellen. 81 Dennoch werden Stammzellen meistens aus dem

Knochenmark gewonnen. Die Aspiration von Knochenmark durch ein geschultes Personal

kann als eine sichere Standartmethode angesehen werden. 82

Bei der Versorgung der Knochendefekte mit autogenem Transplantat ist die erste Zeit bis

zu Revaskularisierung immer die kritischste. In der Zeit gehen viele Osteoblasten

zugrunde, weil diese unter Hypoxie einen Funktionsverlust erleiden, der zur Apoptose

führt.

83

In einer Studie an Ratten wurde gezeigt, dass unter Hypoxie die

Osteoklastenaktivität zu- und die Osteoblastenaktivität abnehmen. Das zerstört die

73 Horwitz et al.2002

74 Slavin 2008

75 Zhou 2010

76 Nardi 2011

77 Kadiyala 1997; Tandon 2010

78 Baer 2012; Locke 2009

79 Longo 2012

80 Mazzetti 2010

81 De Ugarte 2003

82 Lannert 2008

83 Liu 2012

48


Balance zwischen dem Knochenab- und Knochenaufbau. 84 MSCs dagegen können sehr

gut mit dem niedrigen Sauerstoffgehalt der Umgebung umgehen, da diese sich im

Knochenmark in den Nischen mit sehr niedriger Sauerstoffkonzentration befinden. 85 Man

geht sogar davon aus, dass Hypoxie die osteogene Differenzierung der MSCs unterstützt.

Die MSCs von Ratten weisen bei 5 %-tiger Sauerstoffsättigung eine höhere osteogene

Differenzierungspotenz, als bei einer 20 %-tiger. 86 In einem weiteren Tierversuch wurden

MSCs erwachsener Kaninchen unter Hypoxie-Bedingungen untersucht. Man beobachtete

bei 5 %-tiger Sauerstoffsättigung die Proliferationssteigerung der MSCs und

Aktivitätssteigerung der alkalischen Phosphatase. 87

Immer wieder wird die Sicherheit der MSCs–Anwendung im klinischen Alltag angezweifelt.

Manche Autoren ziehen diverse Parallele zwischen der Tumorentstehung und MSCs. Es

existieren widersprüchliche Studien zu diesem Thema. So wurden Vermutungen

ausgesprochen, dass solide Tumoren aus vom Knochenmark gewonnenen Stammzellen

entstehen. Die Fusion von Stamm- und Krebszellen kann die Aggregationfähigkeit der

letzten verbessern, und die Stammzellen können zur Metastasierung beisteuern. 88 Miura

et al hat gezeigt, wie aus dem Knochenmark gewonnene Stammzellen nach zahlreichen

Passagen durch spontane Transformation sich zu einem Fibrosarkom entwickelt haben. 89

Es gibt weitere Beweise dafür, dass viele Krebsarten aus Krebsstammzellen entstehen.

Ando S et al. Hat wiederum in einem Test gezeigt, dass MSCs keine Vorläufer der

Krebsstammzellen sind. 90

Es wurde sogar eine Apoptose der Lungenkrebszellen an einem Mausmodel durch

Transfer Adenoviren mittels MSCs beschrieben. 91 In einer in vivo Studie an Ratten wurde

eine Hemmung des Tumors beschrieben. Bei der gleichen Anzahl von Tumor- und

Stammzellen wurde der Tumor sogar zum Stillstand gebracht. 92

84 Orriss et al. 2009

85 Fink 2004

86 Lennon 2001

87 Huang 2011

88 Wu et al. 2007

89 Miura et al.2006

90 Ando et al. 2009

91 Mohr et al. 2008

92 Ohlsson et al.2003

49


Trotz kontroverser Diskussionen, werden MSCs erfolgreich bei vielen Krankheiten

eingesetzt, neue Therapieansätze werden entwickelt. Aufgrund ihrer ethisch und technisch

relativ unproblematischen Gewinnung, des guten Proliferationsverhaltens, der Fähigkeit

zur Selbsterneuerung, des ausgeprägten Differenzierungspotentials und ihrer

immunologischen Eigenschaften haben mesenchymale Stammzellen enormes

Entwicklungspotenzial in der modernen Medizin.

Proliferationstest EZ4U

Die Messung der Zellproliferation soll den Einfluss der Wachstumsmoleküle auf die MSCs

wiedergeben. Es gibt folgende Möglichkeiten die Anzahl der Zellen zu bestimmen: durch

direktes Auszählen, indirekt durch Messung der eingebauten Radioaktivität oder aus der

Umsatzrate von zellulären Enzymen.

Im Jahr 1956 erschien erstmalig eine Publikation, welche über die Möglichkeit die

Zellvitalität mit Hilfe der Tetrazoliumsalze zu messen, berichtete. Bei diesem Test wird ein

wasserlösliches, gelbliches Tetrazoliumsalz 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

diphenyltetrazoliumbromid (MTT) zu einem blau-violetten, wasserunlöslichen Formazan

reduziert. Diese Farbstoffveränderung kann photospektrometrisch erfasst werden.

In der Vergangenheit ist davon ausgegangen worden, dass MTT durch mitochondriale

Succinat-Dehydrogenase reduziert wird. In den letzten Jahren haben Untersuchungen

gezeigt, dass die Reduktion der Tetrazolium-Salze nicht in den Mitochondrien, sondern

extramitochondrial durch NADH sowie NADPH und zum Teil durch Succinat stattfindet. 93

Die Reduktion von MTT durch NADH und NADPH ist abhängig von Enzymen des

endoplasmatischen Retikulums. Die partielle Reduktion von MTT durch Succinat in den

Mitochondrien dagegen ist abhängig von dem Enzym Succinat-Dehydrogenase.

In unserem Versuch haben wir für die Vitalitätsbestimmung der Zellen EZ4U (Biomedica,

Wien, Österreich), einen modifizierten XTT-Test (2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-

2H-tetrazolium-5carboxanilide) verwendet.

93 Berridge & Tan 1993

50


Die ursprünglich verwendeten Tetrazoliumsalze haben unlösliche Formazanderivate

gebildet, die durch ihre Kristallbildung die Zellen zerstört haben. Diese Behandlung

beendete irreversibel die Zellproliferation und machte eine Verlängerung der Inkubation

zur Erhöhung der Empfindlichkeit oder eine Fortsetzung der Zellkultivierung unmöglich.

Der Test war zeitaufwendig und es kamen toxische Lösungsmitteln zum Gebrauch. Bei

dem neuentwickelten XTT-Test (EZ4U) wird ein nicht-toxisches Tetrazoliumsalz verwendet,

der ein wasserlösliches Formazan bildet. Diese Modifizierung hat viele Pipettierschritte

unnötig gemacht und den Test dadurch vereinfacht. Vergleichsstudien haben bestätigt,

dass MTT- und XTT-Tests gleichwertige Ergebnisse liefern. Dabei ist der XTT-Test

schneller und einfacher auszuführen als der MTT-Test. Dabei entfallen die Pipittierschritte

vor der Messung, um formazanversetzte Testkulturen wieder in Lösung zu bringen. 94

Es gibt aber auch Studien, welche die Unzuverlässigkeit des XTT-Tests zeigen.

Schröterová L. et al haben fünf Zytotoxizität-Tests miteinander verglichen. Es wurde der

antiproliferative Effekt von Selen auf Karzinomzellen getestet. Die metabolische Aktivität

der mit Selen inkubierten Zellen war im WST-1 und XTT-Assay höher, als in der

Kontrollgruppe. Die drei anderen Tests haben umgekehrte Ergebnisse geliefert, die der

Wirkung des Selens entsprechen. 95

Wang S et al, hat festgestellt, dass sowohl der MTT- als auch das XTT-Assay ungenaue

Ergebnisse liefern können, wenn in den kultivierten Zellen die Superoxid-Bildung erhöht

ist. Superoxide können Tetrazoliumsalze reduzieren. Dies führt zu der höheren

Einschätzung der Zellvitalität. 96

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der MTT-Test keine absoluten Werte misst,

sondern relativ vergleichbare Korrelate. Er soll den Anteil lebender Zellen einer Zellprobe

in Relation zu einer anderen Zellprobe bestimmen. Der MTT-Test kann Mittelwerte

bestimmen, ist aber für die genaue Bewertung des Prozentsatzes vitaler Zellen in einer

Zellpopulation nicht geeignet. 97

94 Stevens & Olsen 1993 ; Roehm et al.1991

95 Schröterová et al. 2009

96 Wang et al. 2011

97 Pruett & Loftis 1990

51


Da die Proliferationsergebnisse in unseren Untersuchungen nur mit dem EZ4U–Assay

zustande gekommen sind, sollten diese kritisch betrachtet werden. Ein zweiter Test zur

Messung des Untersuchungsparameters könnte den Vergleich der Ergebnisse

ermöglichen und sie entweder bestätigen oder widerrufen.

DMSO

DMSO ist ein organisches Lösungsmittel und zählt zur Verbindungsklasse der Sulfoxide.

Das DMSO fällt als Nebenprodukt bei der Zellstoffherstellung in der Holzindustrie an. Es

ist extrem hygroskopisch und mit Wasser und vielen organischen Lösemitteln mischbar.

Das DMSO wurde erstmals von dem russischen Wissenschaftler Alexander Saytzeff

synthetisiert. Als ein Therapeutikum wurde der Stoff erst 1961 vom Dr. Stanley Jacob

neuentdeckt. Er war auf der Suche nach einem Konservierungsmittel für zur

Transplantation vorgesehener Organe, als er eine klare nach Knoblauch riechende

Flüssigkeit entdeckt hat, die sehr schnell in die Haut eindrang.

Ab diesem Zeitpunkt war das DMSO in den Fokus der Forschung gerückt und wurde bald

zu einem „Wundermittel“.

Durch seine Fähigkeit leicht durch die Haut und andere Zellmembranen durchzudringen,

wird DMSO als Trägersubstanz in Salben, Gelen und Pflastern zur Einschleusung der

Wirkstoffe verwendet. Durch seine analgetische Wirkung, die durch Kappung der

C-Nervenfasern erklärt wird, 98 und antiphlogistische Eigenschaft, die bei einer

Konzentration von 30% auftritt, 99 wird es als perkutanes Arzneimittel bei Sportverletzungen

oder rheumatischen Beschwerden verwendet.

Eine weitere Eigenschaft de DMSO ist seine Fähigkeit freie Radikale zu fangen. 100

Weitere Fähigkeiten des DMSO wie überschüssige Freisetzung des Glutamats zu

bremsen, den Na+- und Ca+-Einstrom in die Zellen zu steuern, die Verklumpung durch

98 Evans et al. 1993

99 Hanna et al. 1997

100 Carpenter et al. 1994

52


Blutplättchen, den Tissue Factor (TF) (Initiator der Gerinnungskaskade) sowie die

Proliferation und Migration von glatten Muskelzellen, die Atherosklerose verursachen

können, zu hemmen, und den intrakranialen Druck zu senken wurden gezeigt.. Diese

Eigenschaften des DMSO können hilfreich bei der Behandlung der ZNS-, Herz- und

Kreislauferkrankungen sein. 101

Busch et al hat eine hemmende Wirkung des DMSO auf eine Vielzahl von Bakterien und

Pilzen und bei höheren Konzentrationen sogar auf Viren beschrieben. 102 Ein Jahr zuvor

hat Pottz eine hemmende Wirkung des DMSO auf die Bakterienresistenz gegen

Antibiotika gezeigt. 103

Obwohl das DMSO universell eingesetzt wird, gibt es auch Beschreibungen von

zytotoxischen Eigenschaften bei einer Untersuchung der Colon-Krebs-Zellen. Nur in

Konzentrationen von


DMSO ist das meistuntersuchte, aber am wenigsten verstandene Pharmazeutikum

unserer Zeit. 108

Im durchgeführten Versuch wurde die zytotoxische Wirkung des Lösungsmittels DMSO auf

die Zellkulturen in vier Konzentrationen getestet. Da beide Wirkstoffe DMSO als

Lösungsmittel enthalten haben, sollte die Proliferationsminderung des Lösungsmittels von

den Proliferationswerten der GABA-Pertin-Lactam Derivaten subtrahiert werden, um den

tatsächlichen Wachstumseffekt der Wachstumsfaktoren einzuschätzen.

Zu erwarten war ein wachstumshemmender Effekt von DMSO auf die MSCs in

Abhängigkeit von seiner Konzentration. Erstaunlicherweise zeigte das DMSO eine

Steigerung der gemessenen Proliferation gegenüber der Referenz in allen vier getesteten

Konzentrationen, wobei die geringste Proliferation bei der größten DMSO-Konzentration

und die größte Proliferation dementsprechend bei der kleinsten Konzentration gemessen

wurde. Allerdings war keines der Ergebnisse statistisch signifikant. Der Parallelversuch

von Obermeyer und Wolter, indem das DMSO in exakt denselben Konzentrationen wie im

oben dargestellten Versuch auf bovinen MSCs getestet wurde, konnte den zytotoxischen

Effekt des DMSO signifikant zeigen. 109 Dabei konnte die Minderung der Proliferation mit

der steigenden DMSO-Konzentration beobachten werden. Man kann die unterschiedlichen

Ergebnisse beider Studien durch die unterschiedlichen Spezies erklären. Immerhin hat das

DMSO den negativen Einfluss auf die Augenlinse nur bei kleinen Tieren gezeigt, nicht bei

Menschen. 110 Eventuell hat die DMSO-Substanz bei humanen MSCs ihre positiven

Eigenschaften entfaltet, wobei keine Studie eine direkte prolifertaionsfördernde Fähigkeit

des DMSO beschrieben hat. Da Violante G et al. hat umgekehrt die zytotoxische

Eigenschaften des DMSO präsentiert, indem ein signifikanter LDH-Anstieg in den

Darmkrebszellen ab der DMSO-Konzentration von 20 % bis 50 % beobachtet wurde. Bei

niedrigen Konzentrationen wurden keine Veränderungen in der Zellevitalität beobachtet. 111

Obwohl in der durchgeführten Studie das Proliferationsniveau von mit DMSO versetzten

108 Muir 1996

109 Obermeyer 2010; Wolter 2009

110 Rubin & Mattis1966; Brobyn 1975

111 Da Violante et al. 2002

54


Zellen bei allen Konzentrationen im Vergleich zur Kontrollgruppe höher war, ist eine

Abnahme der Extinktionswerten mit zunehmender Konzentration des DMSO deutlich.

Diese Tatsache korreliert mit den Beobachtungen von Wolter und Obermeyer und

entspricht nur teilweise den erwarteten Ergebnissen.

Wenn man das Problem von der anderen Seite betrachtet, dann kann angenommen

werden, dass die Ursache in der Kontrollgruppe zu suchen ist. Diese Annahme wird durch

die Tatsache unterstützt, dass gerade einige der bestproliferierten Kontrollkulturen Opfer

eines Pilzbefalls wurden. Diese Werte konnten nicht mit in den Mittelwert der Kontrolle

einfließen. Dies hat auch dazu geführt, dass das 95%-ige Konfidenzintervall der Kontrolle

vergrößert ist.

Wenn man reinhypothetisch annimmt, dass das DMSO bei niedrigen Konzentrationen

doch die Proliferatin der Zellen ein wenig stimuliert und dadurch das 95%-ige

Konfidenzintervall insgesamt nach oben bewegt habe, auf der anderen Seite das 95%-ige

Konfidenzintervall der Kontrollgruppe durch den Pilzbefall insgesamt nach unten gerutscht

sei, würde das Bild mehr den Ergebnisse der Studie von Wolter und Obermeyer

entsprechen.

Letztendlich sind die oben genannten Überlegungen hypothetischer Natur.

Da der verwendete EZ4U-Assay nur Bezugswerte und keine Absolutwerte ermittelt, sollten

diese Werte kritisch betrachtet werden. Ein zweiter vergleichbarer Test zur

Proliferationsbestimmung der Zellen wäre in diesem Fall sehr hilfreich.

Die vorliegende Studie konnte keine statistisch signifikanten Ergebnisse zeigen. Es kann

festgehalten werden, dass Cis-8-TB-GBPL und Trans-8-TB-GBPL das

Proliferationsverhalten der mesenchymale Satmmzellen beeinflusst hat. Welche

Mechanismen sich dabei auf der zellulären Ebene abspielen, ist noch nicht genau

bekannt. Ebenso wenig kann die entstandene negative Dosis-Wirkungs-Beziehung von

Wachstumsmolekülen erklärt werden. Die proliferationshemmende Wirkung des DMSO

auf die MSCs im Vergleich zur Kontrollgruppe konnte nicht bestätigt werden. Die

55


Vermutungen wurden bereits bei der Diskussion erwähnt. Das Differenzierungspotential

der mesenchymalen Stammzellen wurde durch den Einfluss beider Wirkstoffe nicht

beeinflusst.

In einer Parallelstudie von Arne Kuenz wurden weitere GABA-Pentin-Lactam Derivate, das

GBP-L und das Phenyl-GBL, untersucht. Die Studie lieferte auch hier keine signifikanten

Ergebnisse. Beide Substanzen haben gegenüber dem Kontrollwert eine in allen

Konzentrationen gesteigerte Proliferation gezeigt, mit einer der Konzentration

proportionalen Dynamik der Proliferationsänderung. 112 Das GBPL hat die besten Resultate

erzielt. Seine Wirkung wurde auf die Proliferation boviner und humaner MSCs untersucht.

Aufgrund der heterogenen Ergebnisse konnte keine klare Aussage über die Wirkung der

Substanz auf die MSCs getroffen werden. 113

Die neuroprotektive und proliferationsfördernde Wirkung der GABA-Pentin-Lactam

Derivate in vivo und in vitro auf verschiedenen Tiermodellen wurde bereits beschrieben.

Die Substanz hat Potenzial und sollte weiterhin untersucht werden. Es sollte vielleicht über

anderes Lösungsmittel als DMSO nachgedacht werden. Erstens ist DMSO für die klinische

Anwendung am Patienten ein Risikofaktor, 114 zweitens besitz diese Substanz sehr viele

Wirkmechanismen. In der vorliegenden Studie wurde bei beiden getesteten Substanzen

DMSO als Lösungsmittel verwendet, was das Auseinanderhalten der Substanzwirkung

und DMSO-Wirkung sehr schwierig macht und Wechselwirkungen zulässt. Es wäre auch

sehr hilfreich das Proliferationspotenzial der Zellen vor und nach der Untersuchung zu

testen, um diese zu vergleichen und sicherere Aussagen zu machen.

GABA-Pentin–Lactam Derivate

Wie in der Einleitung bereits erwähnt, wurden die GABA-Pentin–Lactam Derivate von

Feuerstein et al. in der neuropharmakologischen Abteilung der Albert-Ludwigs-Universität

Freiburg isoliert und untersucht. Es entstanden das Phenyl-GABA-Lactam, das Trans-8-

tert-butyl-GABA-Pentin-Lactam und das Cis-8-tert-butyl-GABA-Pentin-Lactam. Die

112 Kuenz 2011

113 Degenhardt 2010

114 Guerre et al. 1999

56


neuroprotektive Wirkung des GABA-Pentin-Lactams wurde von Jehle in vivo und in vitro

gezeigt. Es wird vermutet, dass das GABA-Pentin-Lactam seine Wirkung an den

spannungsunabhängigen mitochondrialen ATP-abhängigen Kaliumkanälen entfaltet. 115 In

den späteren Untersuchungen an den Zellen des ZNS wurde die antiapoptotische Wirkung

der mitochondrialen ATP-abhängigen Kaliumkanälen durch die Aufrechterhaltung des

inneren Membranpotentials unter ischämischen Bedingungen bestätigt. 116 Feuerstein hat

eine proliferationssteigernde Wirkung der Substanz 8-tert-butyl-GABA-Pentin-Lactam an

den bovinen Osteoblasten untersucht. 117 Er beobachtete einen durch 8-tert-butyl-GABA-

Pentin-Lactam induzierten Anstieg des Membranpotentials und die damit verbundene

ROS-Steigerung, die mit Proliferationssteigerung der Osteoblasten korreliert. Dieser Effekt

wurde nur bei Konzentrationen des GBPL-Derivates im nano- bis mikromolaren Bereich

beobachtet. Bei millimolaren Konzentrationen wurden eine Verminderung des

Membranpotentials und der darauf folgende Anstieg des Glutamatimports in die

Mitochondrienmatrix beobachtet. Dabei wurden keine Hinweise für eine Beteiligung des

mitochondrialen KATP-Kanals an der ROS-Produktion gefunden. 118

Im oben dargestellten Versuch zeigen das DMSO und die beide Wirksubstanzen,Trans-8-

tert-butyl-GABA-Pentin-Lactam und Cis-8-tert-butyl-GABA-Pentin-Lactam, die DMSO als

Lösungsmittel enthalten, einen proliferationssteigernden Effekt auf die MSCs, bezogen auf

den ermittelten Kontrollwert. Durch einen Pilzbefall sind einige Kontrollkulturen

ausgefallen. Dadurch wurde das 95%-tige Konfidenzintervall der Kontrolle vergrößert und

der Mittelwert ist weit nach unten verschoben.

Wie erwartet zeigte sich, dass das DMSO mit ansteigender Konzentration einen

zunehmenden Hemm-Effekt auf die Zellproliferation der MSCs hat. Die negative Dosis-

Wirkungs-Beziehung der Wirkstoffe war nicht zu erwarten. In den dargestellten Versuchen

hat die höhere Konzentration des Wirkstoffes die Proliferation der Stammzellen

zunehmend gehemmt. Die Graphik zeigt die Dosis-Wirkungs-Beziehung, welche durch die

Steigung der Geraden ausgedrückt wird. Entgegen der Erwartung haben alle Geraden in

dem oben präsentieren Versuch eine negative Steigung.

115 Jehle et al. 2001; Pielen et al. 2004; Lagrèze et al. 2001

116 Teshima et al. 2003

117 Feuerstein et al. 2008

118 Feuerstein et al. 2008

57


Eine der Erklärungen für die negative Dosis-Wirkungs-Beziehung der getesteten

Wirkstoffe, wäre die Annahme, dass weder das Cis-8-tert-butyl-GABA-Pentin-Lactam noch

das Trans-8-tert-butyl-GABA-Pentin-Lactam eine wachstumsstimulierende Wirkung auf die

MSCs ausgeübt hat. Diese Annahme wird wahrscheinlicher, wenn der Verlauf des Cis-8-

tert-butyl-GABA-Pentin-Lactam-Gerade und der DMSO-Gerade in der Grafik betrachtet

wird. Beide Geraden verlaufen fast parallel zueinander, also haben sie identische

Steigungen. In diesem Fall wäre die Durchführung eines Prolifertationstests der MSCs vor

der Versuchsreihe hilfreich. Dadurch hätte eine Aussagen getroffen werden können, in

wieweit sich die Proliferationsfähigkeit der Zellen verändert hat.

Feuerstein et al. hat die proliferationsfördernde Eigenschaft des 8-tert-butyl-GABA-Pentin-

Lactam bei Konzentrationen im nano- bis mikromolaren Bereich angegeben. Bei den

millimolaren Konzentrationen wurde der Erhöhte Glutamateinstrom in die

Mitochondienmatrix beobachtet. 119 Die Osteoblastenproliferation wurde an den bovinen

Zellen untersucht, im dem oben dargestellten Versuch wurden dagegen humane MSCs

verwendet. Man kann eine Hypothese aufstellen, dass aufgrund von

Speziesunterschieden die ungünstige Wirkung des Wirkstoffes, welche bei den

millimolaren Konzentrationen bei bovinen Osteoblasten auftritt, bei humanen MSCs bereits

im nano molaren Bereich zu beobachten ist.

Alternativ kann ein anderes Extrem betrachtet werden. Mit der steigenden Konzentration

des Wirkstoffes, steigt die Wirkung so stark und so schnell, dass die unphysiologische

ROS-Steigerung einen oxidativen Stress hervorruft. Das DMSO, als Fänger der freien

Radikale, 120 könnte die ROS eliminieren und die Proliferation unterdrücken. In einer

Parallelstudie hat Arne Kuenz das GABA-Pentin-Lactam und seinen Derivat Phenyl-GBL

untersucht. Es wurden keine statistisch signifikanten Ergebnisse erzielt. Aber die

Wirkstoffe zeigten eine zur Konzentration proportionale Dynamik der

Proliferationsänderung, die der erwarteten Richtung entsprach. 121 Es wird empfohlen, das

GABA-Pentin-Lactam mit den vielversprechendsten Ergebnissen, in weiteren Studien zu

untersuchen.

119 Feuerstein et al. 2008

120 Carpenter et al. 1994

121 Kuenz 2011

58


5. Zusammenfassung

In der vorliegenden in vitro Studie sollte der proliferationssteigernde Effekt von

GABA-Pentin-Lactam Derivaten an humanen mesenchymalen Stammzellen getestet

werden. Die getesteten Substanzen waren Trans-8-tert-butyl-GABA-Pentin-Lactam und

Cis-8-tert-butyl-GABA-Pentin-Lactam. Durch Beckenpunktion gewonnenes Aspirat wurde

mittels BMAC-Verfahren konzentriert und in Kultur gebracht. Die MSCs wurden mit je vier

unterschiedlichen Konzentrationen an GABA-Pentin-Lactam Derivaten und DMSO

proliferiert. Anschließend wurde die Effektivität mit dem EZ4U-Test getestet und mit einer

Kontrollkultur mit reinem Expansionsmedium verglichen. Um die Verwendung der MSCs

und ihre Multipotenz nachzuweisen wurden vor und nach den Proliferationstimulationen

Differenzierungstests durchgeführt. Die MSCs wurden zu Adipozyten, Chondrozyten und

Osteoblasten differenziert. Es wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede

zwischen den Substanzen oder Konzentrationen gefunden. Alle getesteten Substanzen

einschließlich DMSO haben einen proliferationsfördernden Effekt im Vergleich zu der

Kontrollgruppe und gleiche Dosis-Wirkungs-Beziehung gezeigt. Das

Differenzierungspotenzial der MSCs wurde durch den Versuch nicht beeinflusst.

Aufgrund des pilzbedingten Ausfalls besonders gut gewachsener Kontrollen lässt sich das

niedrige Niveau des Kontrollschätzers erklären. Dadurch erscheint die Wirkung des DMSO

proliferationsfördernd zu sein, wobei mit steigender Konzentration zytotoxische

Eigenschaften auftreten und dadurch die Proliferationswerte sinken. Es gibt keine klare

Erklärung dafür, warum Proliferationswerte der MSCs mit steigender Konzentration der

Wachstumsmoleküle sinken. Man kann vermuten, dass es gar keine

Proliferationssteigerung stattgefunden hat, deswegen sind die Werte zumindest bei Cis-8-

tert-butyl-GABA-Pentin-Lactam mit den Werten bei DMSO fast identisch. Eine

Wechselwirkung zwischen dem Lösungsmittel DMSO und den Wirkstoffen selbst ist nicht

auszuschließen, weshalb weitere Studien zu diesem Thema notwendig sind.

59


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7. Danksagung

Zuerst möchte ich Herrn PD. Dr. Dr. Sebastian Sauerbier, aus der Abteilung für Mund-,

Kiefer- und Gesichtschirurgie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, für die freundliche

Überlassung des Themas und die hilfreiche Unterstützung und Förderung der

vorliegenden Promotion aufrichtig danken. Seine herzliche Art und Weise war sowohl bei

der Laborarbeit als auch bei der Verfassung eine große Stütze. Vielen Dank!

Frau PD. Dr. med. dent. Olga Polydorou, aus der Abteilung für Zahnerhaltungskunde und

Parodontologie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, danke ich für ihre spontane

Zusage und die Erstellung des Zweitgutachtens.

In ganz besonderem Maße danke ich Frau Heike Jahnke für ihr einzigartiges Engagement

rund um die Uhr, welche über die gesetzlichen Arbeitszeiten hinweggesehen hat.

Herzlichen Dank!

Herrn Dr. Martin Wolkewitz für die fundamental wichtige Auswertung der Statistik.

Frau Annette Lindner und Herrn Dr. Heiner Nagursky danke ich für die wohlige

Arbeitsatmosphäre in ihrem Labor und die zuckerhaltige Verpflegung.

Meinen Co-Doktoranten Arne Kuenz, Julia Obermeyer und Franziska Wolter für die gute

Zusammenarbeit.

Zuletzt danke ich meinem Mann und meinem Sohn sowie meinen Eltern für ihre

grenzenlose Geduld und die großartige Unterstützung bei jeder einzelnen Seite.

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