Sox 9-Expression am Haarfollikel - FreiDok - Albert-Ludwigs ...

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Sox 9-Expression am Haarfollikel - FreiDok - Albert-Ludwigs ...

Aus der Universitäts-Hautklinik

der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br.

Sox 9-Expression am Haarfollikel

Expressionsverhalten bezüglich Haarfarbe, Haarergrauen

und Haarausfall

INAUGURAL-DISSERTATION

zur

Erlangung des Medizinischen Doktorgrades

der Medizinischen Fakultät

der Albert-Ludwigs-Universität

Freiburg i. Br.

Vorgelegt 2013

von Paulina Stoeva

geboren in Sofia


Dekan: Prof. Dr. Dr. h.c. mult. Hubert E. Blum

Erstgutachter: Prof. Dr. med. Markus Braun-Falco

Zweigutachter: Prof. Dr. med. Wilhelm-Bernhard Niebling

Jahr der Promotion: 2013


INHALTSVERZEICHNIS:

SEITE

1. EINLEITUNG - 5 -

1.1 FUNKTION UND EINTEILUNG DER MENSCHLICHEN HAARE - 5 -

1.2 ANATOMIE DES MENSCHLICHEN TERMINALHAARES - 6 -

1.3 HAARWACHSTUMSZYKLUS, STAMMZELLEN UND ALTERN - 8 -

1.4 MELANOZYTEN UND MELANIN - 11 -

1.5 HAARFARBE - 13 -

1.6 HAARERGRAUEN - 14 -

2. FRAGESTELLUNG - 16 -

3. MATERIAL UND METHODEN - 17 -

3.1 PROBANDEN - 17 -

3.1.1 Gewebeschnitte der Probanden ............................................................................ - 17 -

3.1.2 Probandeninformationen ...................................................................................... - 17 -

3.2. ANFERTIGUNG DER SCHNITTPRÄPARATE - 18 -

3.3 ENTPARAFFINIERUNG - 18 -

3.4 ANTIGENRETRIEVAL-METHODEN - 19 -

3.4.1 Hitzeinaktivierung in Citrat-Puffer im Dampfkocher .......................................... - 19 -

3.4.2 Hitzeinaktivierung in Tris-EDTA-Puffer im Dampfkocher ................................. - 20 -

3.4.3 Permeabilitätserhöhung der Zellwände mit Triton X100 ..................................... - 20 -

3.4.4 Proteolytischer Enzymverdau .............................................................................. - 20 -

3.5 IMMUNHISTOCHEMISCHE FÄRBUNG - 21 -

3.5.1 Färben mit dem TechMate Horizon Färbeautomaten .......................................... - 21 -

3.5.2 Ansetzen der Antikörper ...................................................................................... - 22 -

3.5.3 Beladen der Maschine und Färbevorgang ............................................................ - 22 -

3.5.4 Eindecken der gefärbten Präparate ....................................................................... - 23 -

3.6 MIKROSKOPISCHE AUSWERTUNGEN - 23 -

3.7 PROBANDENGRUPPEN - 24 -

3.8 STATISTISCHE ANALYSE UND AUSWERTEVERFAHREN - 24 -

3.9 MATERIALIEN - 25 -

3.9.1 Antikörper ............................................................................................................ - 25 -

3.9.2 Chemikalien ......................................................................................................... - 25 -


3.9.3 Geräte ................................................................................................................... - 26 -

3.9.4 Sonstiges ............................................................................................................... - 26 -

4. ERGEBNISSE - 27 -

4.1 ETABLIERUNG DER IMMUNHISTOCHEMISCHEN FÄRBUNGEN - 27 -

4.1.1 Testreihen ............................................................................................................. - 27 -

4.1.2 Ergebnisse der Etablierungsversuche ................................................................... - 28 -

4.2 PROBANDENCHARAKTERISIERUNG - 29 -

4.2.1 Allgemeine Angaben zu den Probanden .............................................................. - 29 -

4.2.2 Haarfarben der Probanden .................................................................................... - 31 -

4.3 EXPRESSION VON SOX 9 IM PROBANDENKOLLEKTIV - 34 -

4.4 VERGLEICHENDE ANALYSEN DER SOX 9-EXPRESSION - 38 -

4.4.1 Vergleich der Haarfarben ..................................................................................... - 38 -

4.4.2 Altersabhängigkeit von SOX 9 ............................................................................ - 48 -

4.4.3 SOX 9-Expression abhängig von Alter und Geschlecht ...................................... - 49 -

4.4.4 Differenzierung nach Geschlecht ......................................................................... - 51 -

5. DISKUSSION - 53 -

5.1 DER HAARAPPARAT UND STAMMZELLEN - 54 -

5.1.1 SOX 9 ................................................................................................................... - 56 -

5.1.2 SOX 10 ................................................................................................................. - 56 -

5.1.3 PAX 3 ................................................................................................................... - 56 -

5.1.4 CLIM 2 ................................................................................................................. - 57 -

5.2 SOX 9-EXPRESSION IM HAARFOLLIKEL - 58 -

5.2.1 SOX 9-Expression und Haarfarbe ........................................................................ - 58 -

5.2.2 SOX 9-Expression und Haarergrauen .................................................................. - 60 -

5.2.3 SOX 9-Expression und altersbedingte Alopezie .................................................. - 62 -

5.2.4 SOX 9-Expression in Abhängigkeit vom Alter .................................................... - 62 -

5.2.5 Geschlechtsabhängigkeit der SOX 9-Expression ................................................. - 62 -

5.3 METHODISCHE SCHWÄCHEN - 63 -

5.3.1 Einschränkungen bei den Färbeergebnissen......................................................... - 63 -

5.3.2 Einschränkungen bei der Ergebnisinterpretation ................................................. - 64 -

5.4 AUSBLICK - 66 -

6. ZUSAMMENFASSUNG - 67 -

7. LITERATURVERZEICHNIS - 68 -


8. DANKSAGUNG ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.

9. LEBENSLAUF ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.

10. ANHANG - 79 -

ABKÜRZUNGEN - 79 -


1. Einleitung

„Zweimal färbt sich das Haar; zuerst aus dem Blonden ins Braune,

Bis das Braune sodann silbergediegen sich zeigt.“

(„Weissagungen der Bakis“, Johann Wolfgang von Goethe)

Bereits Goethe beschäftigte sich im Jahre 1827 mit Haarfarben und deren Wandelbarkeit mit

zunehmendem Alter als Symbol für Vergänglichkeit. In diesem Gedicht beschreibt er das

Phänomen, dass Neugeborene und Säuglinge zunächst helleres Kopfhaar haben, welches sich

jedoch im Laufe der Zeit dunkler färbt, um dann nach Jahrzehnten als prototypisches Zeichen

menschlichen Alterns grau zu werden.

1.1 Funktion und Einteilung der menschlichen Haare

Unsere Haare erfüllen vielerlei Funktionen. Das Kopfhaar bietet Schutz gegen

Sonnenstrahlen, die Wimpern und Augenbrauen schützen die Augen vor Schweiß und die

Vibrissae am Naseneingang vor Reizungen der Nasenschleimhaut. Desweiteren spielen Haare

eine Rolle beim Wärmehaushalt, dienen der Reibungsminderung, Berührungsempfindung und

erfüllen eine Signalwirkung.

Beim Menschen unterscheidet man drei verschiedene Haararten. Lanugohaare kommen beim

Feten und unreifen Neugeborenen vor. Vellushaar ist das normale Oberflächenhaar, welches

das menschliche Integument nahezu vollständig bedeckt. Ausnahmen stellen die Handflächen

und Fußsohlen, die Schleimhäute, die Glans penis und das Lippenrot dar. Das Vellushaar ist

normalerweise weniger als 2 cm lang, dünn (< 40 µm), marklos und gewöhnlich farblos. Die

dritte Art, und diejenige, um die es in dieser Arbeit geht, ist das Terminalhaar. Zwischen

80.000 und 120.000 Terminalhaare bedecken das Kapillitium (behaarte Kopfhaut). Sie sind

lang, dick (> 40 µm), pigmentiert und besitzen ein Haarmark. Bereits beim Neugeborenen

sind sie am Kapillitium sowie als Augenbrauen und Wimpern vorhanden. Eine besondere

Form der Terminalhaare stellen die Sexualhaare dar, die in der Pubertät unter

Androgeneinfluss an bestimmten Körperstellen aus Vellushaaren entstehen. Zu ihnen zählen

die Genital- und Achselhaare, sowie die männliche Bart- und Körperbehaarung (Braun-Falco

et al., 2005).

- 5 -


1.2 Anatomie des menschlichen Terminalhaares

a

b

Abbildung 1: a) Schema einer Haarwurzel (nach Junqueira and Carneiro, 1991),

b) Haarwurzel im histologischen Schnittpräparat mit Hämatoxylin-Eosin (HE) gefärbt,

Vergrößerung 5 x

Der Haarfollikel lässt sich in Haarschaft (Scapus pili) und Haarwurzel (Radix pili) einteilen.

Er ist aus mehreren konzentrischen Epithelschichten aufgebaut. Die Haarwurzel endet mit

einer Anschwellung, dem Haarbulbus (Abbildung 1, Abbildung 2). Darin befindet sich die

Wachstumszone, die sogenannte Matrix, die die bindegewebige Haarpapille (Papilla pili) mit

den Blutgefäßen enthält. Die Haarmatrixzellen steigen nach der Zellteilung im Bulbus auf und

differenzieren sich zu den Zellen des Haarschafts und der inneren Wurzelscheide. In der

Matrix befinden sich auch die Melanozyten, die ihren Farbstoff Melanin an die Zellen des

wachsenden Haars abgeben.

- 6 -


Abbildung 2: Unterer Teil eines Haarschaftes mit Wulstregion und Bulbus, HE, 5 x

Der Haarschaft liegt im Haarkanal und besteht aus Medulla (Mark), Kortex (Rinde) und

Kutikula (Cuticula pili, Oberhäutchen des Haares) (Abbildung 1). Der innerste Teil, die

Medulla, ist nur bei manchen Terminalhaaren, zum Teil auch nur abschnittsweise,

nachweisbar. Sie enthält schwammartiges Gewebe, das faser- oder kugelartig sein kann,

Cementum und luftgefüllte Hohlräume (Wagner and Joekes, 2007). Die Rinde besteht aus

komplett keratinisierten, axial ausgerichteten Matrixzellen, die die Hauptmasse des Haars

ausmachen. Die äußerste Haarschicht, die Kutikula, wird aus flachen, sich dachziegelartig

überlappenden Zellen gebildet.

Anliegend folgt nun die innere Wurzelscheide (Vagina epithelialis radicularis interna), die

von innen nach außen aus den drei Lagen Kutikula, Huxley-Schicht (Stratum epitheliale

internum [granuliferum]) und Henle-Schicht (Stratum epitheliale externum [pallidum])

aufgebaut ist. Die Kutikula des Haarschafts und die der inneren Wurzelscheide sind

dachziegelartig gegeneinander ausgerichtet, sodass sie lamellenartig ineinander greifen und so

fest verankert sind, dass die innere Wurzelscheide bei Epilation des Haares mit herausgerissen

wird. Die innere Wurzelscheide umgibt die Matrixzellen des Bulbus, schützt und formt den

noch weichen, nach oben steigenden Schaft.

Die äußerste Hülle des Haarfollikels ist die äußere Wurzelscheide (Vagina epithelialis

radicularis externa). Sie geht oberhalb des Infundibulums, der Einmündung der Talgdrüse

(Glandula sebacea), in die Epidermis über. Auf Höhe des Ansatzes des Musculus arrector pili

verdickt sie sich zu einem Wulst (bulge region) (Abbildung 2) und bildet den Sitz der

epithelialen Stammzellen (Abbildung 4 (5)) (Braun-Falco et al., 2005; Tobin D. J., 2011; Wu

et al., 2011).

- 7 -


1.3 Haarwachstumszyklus, Stammzellen und Altern

Im Gegensatz zu allen anderen menschlichen Organen, durchläuft das Haar postnatal

periodisch Zyklen von aktiver Produktion (anagen), Regression (katagen) und Ruhe (telogen).

Dabei stellt der Haarfollikel den Schaftproduktionsort des Haares dar (Abbildung 3).

Abbildung 3: Haarzyklus: Die drei Phasen und ihre jeweilige Dauer (nach Braun-

Falco et al., 2005)

Während der Anagenphase erreicht der Haarfollikel seine maximale Größe und die

Matrixzellen eine sehr hohe mitotische Aktivität.

Die maximale Haarlänge ist von der Dauer des Anagens, die sich meist auf 3-6 Jahre beläuft,

abhängig und variiert individuell sehr stark. Die Wachstumsgeschwindigkeit beträgt ca. 1 cm

pro Monat oder 0,3 mm pro Tag. Ist die Anagenphase beendet, folgt eine ca. 2-wöchige

Umbauphase, das Katagen. Millionen synchronisierter Apoptosen führen dabei zur

Schrumpfung des Haarfollikels und einer beinahe vollständigen Auflösung der Haarpapille.

Nun schließt sich eine etwa 2-4 Monate dauernde Telogenphase an. Während dieser findet

kein Stoffwechsel statt, was das Haar für schädigende Noxen unempfindlich macht. Das

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Telogenfollikelhaar enthält im Gegensatz zum wachsenden Haar keine Matrix,

Wurzelscheiden oder Kutikula. Am Ende des Telogens kommt bereits das folgende

Anagenhaar im selben Haarkanal nach (Braun-Falco et al., 2005; Paus and Cotsarelis, 1999;

Stenn and Paus, 2001).

a

b

Abbildung 4: Kopfhaarfollikel in verschieden Haarzyklusphasen aus Braun-Falco et al.,

2005.

a) mikroskopisch

b) makroskopisch (1, Epidermis; 2, Isthmus; 3, Talgdrüse; 4, M. arrector pili; 5, Wulst

(bulge); 6, innere und äußere Haarwurzelscheide; 7, Haarbulbus; 8, Haarpapille; 9,

Blutgefäß)

- 9 -


Beim Wachstum eines neuen Haars kommt es zur Stammzellenstimulierung. Diese verlassen

ihre Nische, wandern in Richtung Matrix und beginnen dort zu wachsen und zu einem neuen

Haarschaft zu differenzieren (Oshima et al., 2001). Wichtige Induktoren des Wachstums

scheinen u.a. sonic hedgehog und Wnt/ β-catenin zu sein (Vidal et al., 2005).

Nach Verletzungen oder aufgrund physiologischen Bedarfs liefern Stammzellen Nachschub

an Zellen der betroffenen Gewebe, wie Haut, Knochenmark, Gehirn, Intestinum und

Skelettmuskulatur. Somit erfüllen sie eine Schlüsselrolle bei der Erneuerung und

Aufrechterhaltung adulten Gewebes. Diese Fähigkeit lässt mit zunehmendem Alter allmählich

nach. Im Zuge dessen kommt es, beispielsweise bei Stammzellen des Hämatopoesesystems

oder der Skelettmuskulatur, nicht zu einer signifikant sinkenden Anzahl (Rando T. A., 2006),

sondern lediglich zu Einbußen und Anomalitäten der Regenerierungs- oder

Differenzierungsfähigkeit (Van Zant and Liang, 2003). Ganz im Gegensatz zum

menschlichen Haar, bei dem das Alter zusätzlich ein Sinken der Melanozytenstammzellzahlen

mit sich bringt (Commo et al., 2004; Steingrímsson et al., 2005; Nishimura et al., 2005;

Aubin-Houzelstein et al., 2008). Es kommt dabei zu einer gestörten Melanozytenhomöostase.

Die Stammzellen sind nicht mehr in der Lage, für den nötigen Zellnachschub zu sorgen, was

schließlich als potenzielle Ursache des Haarergrauens zu sehen ist (Sarin and Artandi, 2007).

Zu den möglichen Ursachen des Stammzellenuntergangs zählen oxidativer Stress (Johnson

and Jackson, 1992; Arck et al., 2006), eine gestörte Telomerasefunktion (Chang et al., 2004;

Rudolph et al., 1999), ein nicht ausreichender Apoptoseschutz zum Beispiel durch Bcl 2-

Mangel (Nishimura et al., 2005; Steingrímsson et al., 2005; Arck et al., 2006; Veis et al.,

1993), eine intrinsisch determinierte Lebensspanne und vorbestimmte, limitierte Anzahl von

Zellteilungen (Sharpless and De Pinho, 2004) (s. Kapitel 4).

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1.4 Melanozyten und Melanin

Melanozyten sind aus der Neuralleiste abstammende, sekretorisch aktive Zellen, die sich in

der Basalschicht der Epidermis, in der äußeren Wurzelscheide und im Bulbus des

Haarfollikels befinden (Abbildung 1). Ferner sitzen sie in der Uvea des Auges und im

Innenohr.

Beim Übergang des Haarfollikels von telogen zu anagen werden die

Melanozytenstammzellen stimuliert, sodass es während der Anagenphase zu

Melanozytenstammzellproliferation und zur vermehrten Bildung von Melanozytenvorläufern

kommt. Im Laufe der weiteren Entwicklung des Haares wandern die Melanozytenvorläufer

unter Einfluss von c-kit- und Endothelin-Signalen (Barsh G. S., 1996) in den entstehenden

Haarfollikel und teilen sich in zwei Gruppen: differenzierte Melanozyten, die im Haarbulbus

verbleiben und innerhalb ihrer Melanosomen aus Tyrosin das Pigment Melanin synthetisieren,

dieses speichern und an benachbarte Zellen abgeben (Botchkareva et al., 2003), und

Melanozytenstammzellen, die in der Stammzellennische, dem Wulst der äußeren

Wurzelscheide, verbleiben (Abbildung 5) (Nishimura et al., 2005).

Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass im reifen Haarfollikel drei anatomisch und

funktionell unterschiedliche Vertreter der Melanozytenzellreihe gleichzeitig vorhanden sind:

Melanozytenstammzellen, Melanozytenvorläufer (hier stellvertretend die Melanoblasten) und

die ausdifferenzierten und für die Melaninsynthese verantwortlichen Melanozyten im Bulbus

(Botchkareva et al., 2001; Tobin and Bystryn, 1996; Kumano et al., 2008). Als

Unterscheidungsmerkmal zwischen diesen verschiedenen Vertretern der

Melanozytenzellreihe gilt u.a. die Enzymproduktion. Nur die reifen Melanozyten produzieren

alle für die Melanogenese wichtigen Enzyme, also auch die Tyrosinase, die Vorläufer

dagegen lediglich Tyrosinase-related protein (Trp 1) und Dopachrom-Tautomerase (Dct)

(Sarin and Artandi, 2007).

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a

b

Abbildung 5: a) Anagener Haarfollikel mit dem Wulst in der äußeren Wurzelscheide als

Sitz der Melanozytenstammzellen und dem Haarbulbus als Sitz der reifen Melanozyten

(nach Braun-Falco et al., 2005). Stammzellen und Melanozytenvorstufen wandern vom

äußeren Wurzelscheidenwulst in Richtung Bulbus, wo sie dann als ausdifferenzierte

Melanozyten liegen bleiben und sich der Melaninproduktion widmen.

b) grobes Schema der Melanozytendifferenzierung. Ein Teil der Melanozytenstammzellen

(MSZ) differenziert sich zu Melanozytevorstufen, hier stellvertretend Melanoblasten (MB),

und diese schließlich zu Melanin-produzierenden Melanozyten (MZ). Der andere Teil bleibt

als Stammzellenreservoir erhalten.

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1.5 Haarfarbe

Die Haarfarbe des Menschen ist komplex polygen determiniert und hängt im Wesentlichen

davon ab, welcher Melanintyp im Haarfollikel produziert wird. Eumelanin kennzeichnet

braunes oder schwarzes Haar, welches bei über 90 % der Weltbevölkerung vorherrscht,

während Phäomelanin bei Blonden und Rothaarigen vorkommt (Tobin D. J., 2008; Ito and

Wakamatsu, 2010 & 2011). Neben Quantität und Qualität des Pigments spielen das Verhältnis

der beiden Pigmentarten zueinander, sowie die Haardicke eine Rolle. So entstehen die vielen

Farbnuancen durch eine Mischung beider Pigmentarten (Ito and Wakamatsu, 2011). Blonde

Haare sind dünn, pigmentarm und enthalten fast kein Mark. Schwarze Haare haben viel

Eumelanin und die größten Melanosomen, die im Haarschaft über Mark und Rinde verteilt

sind. Zahlreiche genetische Faktoren kodieren für Farbmutationen. Auf diese wird im

Diskussions-Kapitel gesondert eingegangen.

Die Anzahl der Melanozyten in der Haut ist bei Individuen unterschiedlicher Hauttypen

gleich, deren melanogene Aktivität variiert jedoch stark. Darunter versteht man die

produzierte Menge und Art des Melanins und die Anzahl und Größe der Melanosomen. Die

Melanogenese beinhaltet die Melaninproduktion und dessen Transfer zu den Keratinozyten

von Haut und Haaren. Beim Haar ist sie streng an das anagene Stadium des Wachstumszyklus

gekoppelt. Schlüsselenzyme der Melanogenese sind die Tyrosinase und die Dopachrom-

Tautomerase.

UV-B-Strahlen stimulieren die Melanozyten direkt oder aber indirekt über parakrine

Stimulatoren. Ferner bewirkt UV-Licht eine direkte DNA-Schädigung, eine sekundäre

Aktivierung der Tyrosinase und somit eine verstärkte Melanogenese. Faktoren, wie ACTH, α-

MSH, α-Melanotropin, Endothelin, TNF-α, u.a., stimulieren das Melanozytenwachstum, die

Dendritenformation und ebenfalls die Melanogenese.

Im Allgemeinen sind follikuläre Melanozyten gegenüber Umwelteinflüssen empfindlicher als

epidermale, was sich im unübersehbaren Vorgang der Canities zeigt. Ursache dafür ist u.a. die

Tatsache, dass das Haarpigment bei der Ausscheidung von Schwermetallen, Chemikalien und

Giften aus dem Körper mitwirkt, indem es diese an sich bindet (Tobin D. J., 2008).

Erkrankungen mit Beteiligung der Melanozyten sind Hypopigmentierungen, wie z.B. der

genetisch bedingte Albinismus oder die erworbene Vitiligo, und Hyperpigmentierungen. Die

häufigste generalisierte Hyperpigmentierung der Haut ist die „Bräune“ als Folge UVinduzierter

Zellaktivierung. An Veränderungen der Haarfarbe unterscheidet man Albinismus,

Poliose, Vitiligo, Canities sowie Heterochromien. Beim Albinismus handelt es sich um eine

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ezessiv vererbte Störung der Melaninsynthese, die in weiß-gelblicher Haarfarbe resultiert.

Die Poliose ist eine erworbene Erkrankung, bei der es in den entzündlichen

Kopfhautbereichen fleckförmig zu pigmentlosen Haarbüscheln kommt. Bei Heterochromien

bestehen Unterschiede zwischen Kopf-, Bart- und Körperhaaren (Braun-Falco et al., 2005). In

den Kapiteln 1.6 und 4 wird näher auf die Canities (Haarergrauen) eingegangen.

1.6 Haarergrauen

Eines der sichtbarsten Zeichen menschlichen Alterns ist der Prozess des Haarergrauens

(Canities). Mit zunehmendem Lebensalter kommt es beim Menschen physiologischer Weise

zu verringerter Pigmentproduktion im Haarfollikel und somit zu natürlichem Haarergrauen.

Genauer betrachtet werden die Haare nicht grau, sondern weiß. Dieses Weiß resultiert aus der

Eigenfarbe des Haarkeratins und der, durch Fehlen des Melanins bedingten Reflexion des

Lichts. Das gleichzeitige Vorhandensein pigmentierter und nicht pigmentierter Haare führt

zum optischen Effekt der grauen Haare (Braun-Falco et al., 2005).

Der Beginn des Ergrauens ist genetisch festgelegt und findet bei Kaukasiern im Alter von 34

± 9,6 Jahren, bei Afroamerikanern im Alter von 43,9 ± 10,3 Jahren statt (Tobin and Paus,

2001). Im Alter von 50 Jahren sind bei annähernd 50 % der Menschen 50 % weiße Haare

sichtbar. Üblicherweise werden Barthaare noch vor den Haaren des Kapillitium weiß. Am

Kapillitium sind vorwiegend zuerst die Schläfen betroffen (Braun-Falco et al., 2005).

Rauchen scheint mit einem früheren Haarergrauen einherzugehen (Mosley and Gibbs, 1996).

Tritt das Ergrauen bereits ab dem 20. Lebensjahr auf, spricht man von Canities praecox.

Canities symptomatica kann begleitend bei Malignomen, schweren endokrinologischen

Störungen, Malnutrition (Vitamin-A-, Spurenelement- und Eisenmangel), perniziöser

Anämie, akuten fieberhaften Zuständen, durch Einwirkung von Arzneimitteln, Kosmetika,

Metallen oder auch spontan auftreten (Braun-Falco et al., 2005; Ito and Wakamatsu, 2011).

Das physiologische Haarergrauen geht mit einer abnehmenden Melanozytenfunktion einher

(Sato et al., 1973; Lloyd et al., 1987; Tobin and Paus, 2001). Dabei führt insbesondere eine

verminderte Tyrosinaseaktivität zu zunehmendem Pigmentverlust des Haarschafts. Neben der

reduzierten Pigmentproduktion ist ein eingeschränkter Transport des Melanins zum

wachsenden Haarschaft für den Ergrauungsprozess verantwortlich (Kaplan et al., 2011; Tobin

and Paus, 2001).

Doch nicht nur die Funktionalität der Melanozyten, auch eine altersbedingte Beeinträchtigung

ihrer Homöostase, welche von einer kleinen Menge Stammzellen im äußeren

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Wurzelscheidenwulst aufrechterhalten wird, wird für den Ergrauungsprozess verantwortlich

gemacht. Mit anderen Worten, die vorhandenen Melanozytenstammzellen sind zum einen

nicht mehr in der Lage, genügend Melanozyten nachzuliefern (Sarin and Artandi, 2007), zum

anderen sinkt die Anzahl der Melanozytenstammzellen im Haarfollikel mit zunehmendem

senilem Ergrauen der Haare (Nishimura E. K., 2011). Eine Abnahme der Melanozyten sowohl

in der äußeren Wurzelscheide als auch im Haarbulbus wird als verantwortlich für die

Abnahme des Melaningehalts angesehen (Tobin D. J., 2009; Commo et al., 2004). So scheint

folglich neben dem Funktionsverlust auch eine verringerte Melanozyten(stammzellen)anzahl

eine Ursache der Canities darzustellen.

Welche Auslöser führen zu diesen Funktionsverlusten und Zahleneinbußen der Melanozyten

oder deren Vorläufer?

Eine Vielzahl äußerer und innerer Einflüsse, wie UV-Strahlung, Zigarettenrauch,

Entzündungen und psychoemotionaler Stress, generieren oxidativen Stress, dessen

Zusammenhang mit Canities bereits in zahlreichen Publikationen beschrieben worden ist

(Arck et al., 2006; Johnson and Jackson, 1992). Die Melaninsynthese des anagenen

Haarfollikels erzeugt als interner Stressor ebenfalls einen hohen oxidativen Stress und wird

verdächtigt, durch die dabei entstehenden freien Radikale, zu selektivem vorzeitigem Altern

und Apoptose der Haarfollikelmelanozyten und somit zum Altern des Haarbulbus zu führen

(Arck et al., 2006). Johnson und Jackson (1992) zeigten in Versuchen an Mäusen durch

Oxidantien verursachte Defizite innerhalb der Melanozytenzellreihen und bei der

Pigmentation. Spannenderweise kam es bei Albinomäusen nicht zu solch

Melanozytenverlusten, was die These stützt, dass diese durch bei der Melaninsynthese

entstehende toxische oxidative Produkte zustande kommen (Johnson and Jackson, 1992).

Weiterhin weist unpigmentiertes Haar aufgrund der geringeren oxidativen Belastung besseres

Wachstum auf (Arck et al., 2006). Es unterscheidet sich von pigmentiertem Haar durch seine

Beschaffenheit, ist starrer, rauer und anfälliger für äußere Schädigungen, insbesondere durch

UV-Strahlen (Kaplan et al., 2011).

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2. Fragestellung

Der Einfluss von Stammzellen innerhalb des Haarfollikels in Bezug auf die Entstehung

unterschiedlicher Haarfarben, den Vorgang des Haarergrauens und des androgenetischen

Haarausfalles sind derzeit nicht vollständig verstanden und eröffnen ein breites Feld an

Untersuchungsmöglichkeiten.

Bei der Haarfarbe spielen Quantität und Qualität der Melanogenese, neben der Melaninart,

eine entscheidende Rolle. Welche Faktoren hierbei auf den Haarfollikel einwirken, und wie

sie das tun, ist derzeit noch offen.

Auch der Vorgang des Haarergrauens ist, obwohl es sich dabei um einen weit verbreiteten,

alterungsbedingten Vorgang handelt, noch nicht vollständig verstanden. Es gibt in der

Literatur die Meinung, dass sowohl die Anzahl als auch die Aktivität der Melanozyten im

Haarfollikel mit dem Alter abnehmen und somit zu Haarergrauen führen (Tobin D. J., 2009;

Commo et al., 2004; Botchkareva et al., 2001; Steingrímsson et al., 2005). Mit sinkender

Haarpigmentierung wird eine Reduktion der Melanozytenstammzellen im Wulst der äußeren

Wurzelscheide postuliert (Steingrímsson et al., 2005). Von pigmentiert über grau hin zu

unpigmentiert sinkt dort die Zellenanzahl (Arck et al., 2006). Sarin und Artandi (2007) sehen

die Ursache des Ergrauens vielmehr im Absinken der Zahlen innerhalb der

Melanozytenzelllinie als in deren Funktionsstörung.

Haarausfall geht mit einem Untergang im Bereich des Stammzellkompartments einher.

Welche zahlentechnischen Unterschiede finden sich bei den Faktoren zwischen Probanden

mit und ohne Haarausfall?

In der vorliegenden Arbeit sollte der Einfluss unterschiedlicher Stammzellmarker auf

Haarpigmentierung, Haarergrauen und Haarverlust anhand der immunhistochemischen

Expression von SOX 9, SOX 10, PAX 3 und CLIM 2 bei einem Kollektiv von Menschen

unterschiedlichen Alters, Geschlechts und unterschiedlicher Haarfarbe evaluiert werden.

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3. Material und Methoden

3.1 Probanden

3.1.1 Gewebeschnitte der Probanden

Für diese Arbeit wurden Probanden ausgewählt, die zwischen den Jahren 2005 und 2008 in

der Universitäts-Hautklinik Freiburg am Kopf operiert worden sind, oder die sich einer

Probeentnahme am Kopf unterzogen haben. Die entsprechenden Schnittpräparate wurden

herausgesucht und angesehen. Für die engere Auswahl war im Wesentlichen entscheidend,

dass unabhängig von der vorliegenden Diagnose ein ausreichend großes Gewebestück ohne

Einfluss des pathologischen Prozesses Einblick auf möglichst zahlreiche tangential

geschnittene Haarfollikel erlaubte. Zu kleine Präparate wurden aussortiert.

Schließlich wurden die histologischen Gewebeblöcke der selektierten Probanden

herausgesucht und für weitere Schnitte und immunhistochemische Färbungen verwendet.

3.1.2 Probandeninformationen

Von den selektierten Fällen wurden die Probandenakten herausgesucht und daraus Daten wie

deren Alter, Geschlecht, Diagnose und Haarfarbe entnommen.

79 Probanden im Alter von 1 bis 93 Jahren, davon 35 männlichen und 44 weiblichen

Geschlechts, wurden in die Arbeit eingeschlossen. Sämtliche Präparate entstammen dem

Archiv der Hautklinik Freiburg und sind diagnostisch abgeklärt. Vom harmlosen Naevus,

über Ekzeme und bis hin zu Tumorerkrankungen wie dem malignen Melanom sind

unterschiedlichste Diagnosen vertreten.

Waren Fotos der Operationslokalisation vorhanden, konnte aus diesen die Haarfarbe

entnommen werden. Soweit die Fotodokumentation keine Rückschlüsse auf Haarfarbe und

Haarergrauen erlaubte, wurden die Probanden angefragt nach ihrer Haarfarbe, im Speziellen

der Status des Haarergrauens.

- 17 -


3.2 Anfertigung der Schnittpräparate

Zur Anfertigung immunhistochemischer Schnitte wurden die Paraffinblöcke der ausgewählten

Probanden herausgesucht. Diese wurden mindestens 20 Minuten bei -18 °C gekühlt. Von den

gekühlten Blöcken wurde mittels eines Mikrotoms (Abbildung 6) 4 µm dicke Schnitte

angefertigt, in ein ca. 40 °C warmes Wasserbad gelegt und von dort aus auf beschichtete

Objektträger aufgezogen. Nach Trocknung auf einer Wärmeplatte wurden sie senkrecht in

Aufbewahrungskästen sortiert und solange im Trockenen gelagert, bis sie zum

Entparaffinieren und Färben eingesetzt wurden.

3.3 Entparaffinierung

Abbildung 6: Mikrotom

Die Objektträgerpräparate wurden im Brutschrank 30 Minuten lang bei 60 °C inkubiert und

anschließend entparaffiniert. Für diesen Zweck wurden sie senkrecht auf einen Ständer

verteilt und in eine Xylol-gefüllte Glasküvette gestellt. Nach 15 Minuten wurden sie in zwei

weitere Xylol-gefüllte Küvetten und in einer Alkoholverdünnungsreihe, welche aus Behältern

mit absteigenden Alkoholkonzentrationen (100 %, 100 %, 95 %, 95 %, 80 %, 70 %, 50 %)

bestand, durch mehrfaches Tunken gespült. Daraufhin wurde der Ständer in eine mit Aqua

dest. gefüllte Plastikküvette abgestellt.

- 18 -


3.4 Antigenretrieval-Methoden

Durch die Einbettung in Paraffin kommt es zu einer Konservierung von Gewebe und Zellen.

Diese gewebeschützende Funktion kommt Zustande, indem Proteine durch Koagulation

und/oder chemische Quervernetzung denaturieren. Die Erhaltung der Morphologie bringt

jedoch den Nachteil des Verlustes der Immunreaktivität vieler Antigene mit sich.

Um diese „Antigenmaskierung“ wieder rückgängig zu machen, was für die bessere

immunhistochemische Färbbarkeit notwendig ist, ist eine Demaskierung, auch Epitop-

Retrieval genannt, angezeigt. Hierfür stehen verschiedene Methoden zur Auswahl. In den

folgenden Abschnitten werden die in dieser Arbeit verwendeten Vorgehensweisen erläutert.

3.4.1 Hitzeinaktivierung in Citrat-Puffer im Dampfkocher

Als Retrieval-Lösung wurde 10 mM Citrat-Puffer mit pH 6,0 verwendet, der jedes Mal vor

Gebrauch frisch hergestellt wurde. Hierfür wurden je 4,5 ml 0,1 mol Zitronensäure und

20,5 ml 0,1 mol Natriumcitrat in einen Glaszylinder gegeben, dieser mit Aqua dest. auf ein

Volumen von 250 ml aufgefüllt und die Flüssigkeit mit einem Magnetrührer gut durchmischt.

Anschließend wurde der pH-Wert gemessen und auf pH 6 eingestellt.

Nun wurde die Pufferlösung in Küvetten gegeben und im Dampfgarer 10 Minuten lang

vorgekocht und danach die entparaffinierten Präparate mit Plastikständer in die Pufferbehälter

gestellt und 20 Minuten lang darin gekocht. Im Anschluss daran wurden die Küvetten in ein

kaltes Wasserbad gestellt. Nach 10 Minuten fand ein Wasserwechsel statt, d.h. das inzwischen

erwärmte Wasser wurde durch frisches kaltes ersetzt und erneut einige Minuten stehen

gelassen. Am Ende wurden die Plastikständer mit den Präparaten in Aqua dest. gestellt.

Bestandteile Citratpuffer (pH 6):

4,5 ml 0,1 Zitronensäure (21.01g in 1000 ml Aqua dest.)

20,5 ml Natriumcitrat (29,41g in 1000 ml Aqua dest.)

ad 250 ml Aqua dest.

- 19 -


3.4.2 Hitzeinaktivierung in Tris-EDTA-Puffer im Dampfkocher

Nach Herstellen der Pufferlösung wurden hier dieselben Schritte des Kochvorgangs an Stelle

von Citrat-Puffer (pH 6) mit Tris-EDTA-Puffer (pH 9) durchgeführt. Ziel des Einsatzes von

Puffern verschiedener pH-Werte ist es, die optimalen Bedingungen für die Immunreaktivität

zu finden.

Bestandteile Tris-EDTA-Puffer (pH 9):

- 5 ml 0,5 mol Tris Puffer pH 7,6

- 0,5 ml 0,5 mol EDTA

- ad 250 ml Aqua dest.

- NaOH (zur Einstellung pH 9)

3.4.3 Permeabilitätserhöhung der Zellwände mit Triton X100

Pro Milliliter verwendeten Antikörperverdünnungsmediums wurden 0,05 g Rinderserum

(Albumin Fraktion V) aufgelöst. Nun wurde langsam 0,3 % Triton X 100 dazugeben. Erst

wenn sich das zähe Triton aufgelöst hatte, wurde der Antikörper hinzupipettiert und nach

sanftem Schütteln in den Färbeautomaten pipettiert. Das Triton als nicht-ionisches Detergenz

hilft dabei, die Membranproteine aus Membranproteinkomplexen zu lösen.

3.4.4 Proteolytischer Enzymverdau

Durch eine Trypsin-Andauung des Gewebes sollte eine Permeabilisierung, und somit eine

verbesserte Immunreaktivität erreicht werden (Boenisch et al., 2003). Hierfür wurden die

Schnitte mit Trypsinlösung (pH 7,8) der Firma DAKO (DAKO S2012) für 15 min bei

Raumtemperatur vorbehandelt.

- 20 -


3.5 Immunhistochemische Färbung

Angewendet wurde die „Zwei-Schritt indirekte Methode“, eine allgemein bekannte

Sandwich-Färbemethode, bei welcher zunächst ein unmarkierter Primärantikörper spezifisch

an das Zielantigen bindet. Im nächsten Schritt bindet ein zweiter enzymmarkierter

Sekundärantikörper an diesen Primärantikörper. Anschließend folgt die Substrat-

Chromogenreaktion, bei der es zu einer roten Färbung kommt (Abbildung 7) (Boenisch et al.,

2003). Die Methode wurde entsprechend der Anleitung der Firma Dako durchgeführt.

Abbildung 7: Prinzip der immunhistochemischen Färbung mit Primär- und Sekundär-

Antikörper (nach Boenisch et al., 2003)

3.5.1 Färben mit dem TechMate Horizon Färbeautomaten

Es wurde nach einem Standardprotokoll zur Anfertigung immunhistochemischer Färbungen

(MSAPAL) gearbeitet und diesem entsprechend die TechMate Horizon Färbemaschine

(Abbildung 8) mit Puffern (Dako REAL Wash Buffer 1-4), je sechs Tropfen sekundärem

Antikörper (AB 2), sechs Tropfen Dako Streptavidin Alkaline Phosphatase (AP) und je 400 µl

Dako Hämatoxylin pro Vertiefung befüllt.

- 21 -


Abbildung 8: TechMate Horizon Färbeautomat

3.5.2 Ansetzen der Antikörper

In Eppendorfreaktionsgefäße wurden jeweils die gewünschte Menge Dako

Antikörperverdünnungsmedium und Antikörper pipettiert und mit einem Vortexer gemischt.

Dem Protokoll folgend, wurden je 300 µl Antikörperverdünnung in die vorgesehenen

Gerätevertiefungen pipettiert. Dabei wurde beachtet, dass sich keine Blasen bilden.

3.5.3 Beladen der Maschine und Färbevorgang

Als nächstes wurde die Maschine mit den Präparaten beladen. Dabei wurden je zwei

Objektträger in einem Spalt befestigt, sodass die Hautschnitte einander zugewandt waren. Bei

ungerader Anzahl wurde ein ungebrauchter Objektträger dagegen gestellt. Somit wurden

jeweils zwischen zwei Objektträgern über Kapillarwirkung die Lösungen in der Maschine

hochgesogen. Die Objektträgerhalter sollten gleichmäßig mit Objektträgern beladen sein.

Bevor der Färbevorgang startet, wurden die Präparate manuell drei Mal in Puffer BUF 2

gespült und auf den Saugkissen abgetupft. Anschließend wurde der beladene

Objektträgerhalter in die Färbemaschine eingesetzt, der Deckel geschlossen und das

Färbeprogramm gestartet.

Nach 90 Minuten wurde Chromogen frisch angesetzt. In einem Eppendorfreaktionsgefäß

wurden die benötigte Menge Dako AP Substratpuffer und Dako Chromogen Rot 1-3 pipettiert

und das Ganze auf dem Vortex geschüttelt. Vorsichtig wurden je 700 µl der hergestellten

Chromogenlösung pro Vertiefung pipettiert, der Deckel erneut geschlossen und die Maschine

weiter den Färbevorgang durchführen gelassen.

- 22 -


3.5.4 Eindecken der gefärbten Präparate

Sobald die Maschine fertig mit der Färbung war, wurden der Objektträgerhalter entnommen,

die Objektträger auf eine Metallhalterung verteilt und in eine mit 100 % Ethanol gefüllte

Plastikküvette gestellt. Zügig wurde die Metallhalterung je fünf Sekunden in einer Xylol-

Reihe, bestehend aus drei Xylol-enthaltenden Glasküvetten, getaucht. Diese wurden

ursprünglich mit derselben Xylolflüssigkeit befüllt. Da die Objektträger jedoch stets in der

gleichen Reihenfolge in die Küvetten getaucht wurden, wurde in der stets zuerst verwendeten

Xylolflüssigkeit dabei mehr Farbstoff aus der vorangegangenen Färbung gelöst, in der 2.

weniger und in der 3. am wenigsten. Letztere Küvette enthielt somit die klarste Lösung.

Im Anschluss wurden die Objektträger in die Coverslipping-Maschine gestellt, welche die

Deckgläser auf die gefärbten Präparate klebt. Schließlich wurden die Objektträger horizontal

unter einer Abzugshaube gelagert bis die Deckgläser angetrocknet waren.

3.6 Mikroskopische Auswertungen

Es wurden pro Präparat diejenigen drei Haaranschnitte mit den meisten positiv gefärbten

Zellen identifiziert und als horizontal, schräg, travers oder Papille differenziert. Bei 40-facher

Vergrößerung wurden pro Gewebeschnitt die drei Rasterfelder mit der höchsten Anzahl

positiver Zellen ausgezählt. Dieser Vorgang wurde nochmals bei einem zweiten Präparat

desselben Probanden wiederholt. Auf der Evaluation dieser sechs Felder beziehen sich alle

weiteren Berechnungen. Ein Beispiel für die verschiedenen Haaranschnitte und die

Rasterfelder mit positiven Zellen ist in Abbildung 9 gezeigt.

a b c d

Abbildung 9: SOX-9 Expression in unterschiedlichen Bereichen des Haarschaftes.

a) horizontal (20 x), b) schräg (40 x), c) travers (40 x), d) Papille (20 x)

- 23 -


3.7 Probandengruppen

Die Probanden wurden anhand unterschiedlicher Merkmale wie Alter, Geschlecht und

Haarfarbe in Gruppen unterteilt. Die Unterteilung erfolgte nach folgenden Gesichtspunkten:

• nach Haarfarben

Einteilung in drei Farbgruppen: hell, dunkel, grau unter Auszählung aller

Haaranschnittebenen

Einteilung in neun Farbgruppen: rötlich, blond, dunkelblond, braun,

dunkelbraun, schwarz, grau (beginnend), grau, Alopezie;

hier erfolgte auch eine Differenzierung in unterschiedliche anatomische Areale:

o Auszählung aller Haaranschnittebenen

o nach Haarfarbe unter Ausschluss der Papillenschnitte

o nach Haarfarbe unter isolierter Betrachtung der Papillenschnitte

nach Haarfarbe unter Streichung bestimmter Mittelwerte pro Proband

• Haarausfall versus nicht-Haarausfall

• graue Haare versus nicht-graue

• nach Altersgruppen: 0-14, 15-40, 41-60, > 61 Jahre

• nach Geschlecht: Frauen versus Männer

3.8 Statistische Analyse und Auswerteverfahren

Für die Berechnung der Mittelwerte, Mediane, Standardabweichungen und

Korrelationskoeffizienten wurde das Programm EXCEL verwendet. Zusätzlich wurden nach

Gruppenbildung mittels GraphPad Prism 5-Programm student’s t-Tests durchgeführt. Als

signifikant wurde ein Unterschied mit p < 0,05 angesehen. Die Tabellen wurden im Word-

Programm, die Grafiken, wie Kreis- oder Balkendiagramme, wurden mithilfe von EXCEL

erstellt. Die Box-Whisker-Plots entstanden durch Einsatz des „QtiPlot“-Programms.

- 24 -


3.9 Materialien

3.9.1 Antikörper Spezies Klonalität Hersteller

SOX 9 (H-90): sc-20095 Kaninchen polyklonal Santa Cruz Biotechnology, Inc.

Santa Cruz, California, USA

PAX 3/7 (H-208): sc-25409 Kaninchen polyklonal Santa Cruz Biotechnology, Inc.

Santa Cruz, California, USA

SOX 10 (N-20): sc-17342 Ziege polyklonal Santa Cruz Biotechnology, Inc.

Santa Cruz, California, USA

CLIM 2 (N-18): sc-11198 Ziege polyklonal Santa Cruz Biotechnology, Inc.

Santa Cruz, California, USA

3.9.2 Chemikalien Bestellnr.: Hersteller:

Albumin Fraktion V (Rind) 8076.4 Carl Roth, Karlsruhe

Triton X 100 93426 Fluka BioChemika, Buchs

Xylol 9713-2 Roth, Karlsruhe

Ethanol

Aqua destillata

Detektionskit Dako, Alkaline Phosphatase/

RED, Rabbit/Mouse K5005 Dako, Hamburg

Antikörperverdünnungsmedium S2022 Dako, Hamburg

Hämatoxylin S2020 Dako, Hamburg

Trypsin S2012 Dako, Hamburg

Pufferkit für TechMate-Färbeautomaten K5006 Dako, Hamburg

Citronensäure-Monohydrat D1.00244 MERCK, Darmstadt

tri-Natriumcitrat-Dihydrat 6448 MERCK, Darmstadt

Target-Retrieval Solution pH 9 S2367 Dako, Hamburg

- 25 -


3.9.3 Geräte

Kühlschrank 4 °C

Gefrierschrank -18 °C

Mikrotom

Wasserbad

Wärmeplatte

Waage

Brutschrank

Pipetten

Immunostainer TechMate Horizon

Mikroskop

Vortex

Magnetrührer

Dampfgarer

pH-Meter Seven Easy

Coverslipping Machine, Automatic Promounter RCM90

BOSCH, München

Haier, Bad Homburg

MIKROM HM 360, Walldorf

Medax Nagel KG, Kiel

Medax Nagel KG, Kiel

Mettler P160, Giessen

Heraeus, Hanau

Eppendorf, Hamburg

Dako, Hamburg

Carl Zeiss, Oberkochen

Heidolph, Kelheim

IKA Labortechnik, Staufen

Multigourmet, BRAUN

Mettler Toledo, Giessen

Medite, Meisei, CH

3.9.4 Sonstiges

Kapillarspaltobjektträger 100 µm/ 75 µm, S2025/ S2024

Deckgläser

Eindeckmedium Permount, 17986-05

Reagenziengefäße für TechMate Horizon, S2039

Saugkissen für TechMate Horizon, S2043

Pipettenspitzen

Reaktionsgefäße 1,5 ml

Microtome Blades, Stainless Steel S35, 02.075.00.000

AxioVision Fotosoftware

Metallhalterungen für Objektträger

Plastikküvetten

Magnetrührstäbchen

Dako, Hamburg

Langenbrinck, Emmendingen

Electron Microscopy Sciences,

Hatfield, USA

Dako, Hamburg

Dako, Hamburg

Eppendorf, Hamburg

Eppendorf, Hamburg

Feather, Osaka, Japan

Carl Zeiss, Oberkochen

- 26 -


4. Ergebnisse

4.1 Etablierung der immunhistochemischen Färbungen

Nach einer Durchsicht der Fachliteratur zu den Stichworten „Haare“ und

„Stammzellfaktoren“ wurde eine Korrelation zu käuflichen Antikörpern erstellt, aus der sich

folgende Antikörper zum immunhistochemischen Nachweis von Stammzellmarker ergab:

SOX 9 (H-90): sc-20095,

SOX 10 (N-20): sc-17342,

PAX 3/ 7 (H-208): sc-25409,

CLIM 2 (N-18): sc-11198.

Soweit vorhanden, wurden methodische Anwendungsbeschreibungen aus der Literatur in die

Etablierungsversuche eingebracht (Kordes and Hagel, 2006; Moriyama et al., 2006).

Die Antikörper wurden in Referenzschnitten von Kopfhautgewebe ausgetestet. Als

Negativkontrolle dienten konsekutive, parallel methodisch mitgeführte Schnittpräparate unter

Auslassung des Primärantikörpers. Als Positivkontrolle dienten Gewebeschnitte von

Malignen Melanomen.

4.1.1 Testreihen

Zuerst wurde im Standardfärbeverfahren ohne Demaskierung eine Verdünnungsreihe der

Antikörper in Citratpuffer pH 6 durchgeführt. Darüber hinaus wurden Verdünnungsreihen

unter Hitzevorbehandlung als Demaskierungsverfahren ausgetestet. Als Pufferlösung für die

Hitzeinaktivierung kam sowohl Citrat- (pH 6), als auch Tris-EDTA-Puffer (pH 9) in

unterschiedlichen Inkubationszeiten bei 100 °C zum Einsatz. Desweiteren wurde eine

Vorbehandlung mit Triton X 100 verwendet, um die Zellmembranen temporär porös zu

machen und somit die Wahrscheinlichkeit einer intrazellulären Färbung zu erhöhen.

- 27 -


Im Konkreten wurden folgende Variablen an den einzelnen Antikörpern ausgetestet:

• SOX 9:

o Antikörperverdünnungsreihe: 1:50, 1:100, 1:200, 1:300, 1:400

o Kochen in Citratpuffer, pH 6

o Kochen in Tris-EDTA-Puffer, pH 9

o Blocken mit 5 % -igem Rinderserum

o 10 min Inkubation in 0,3 % -igem Triton X 100

• SOX 10:

o Antikörperverdünnungsreihe: 1:50, 1:100, 1:200, 1:300, 1:400

o Kochen in Citratpuffer, pH 6

o Kochen in Tris-EDTA-Puffer, pH 9

o mit 5 % -igem Rinderserum blocken

o 10 min Inkubation in 0,3 % -igem Triton X 100

• PAX 3:

o Antikörperverdünnungsreihe: 1:50, 1:100, 1:150, 1:200

o Kochen in Citratpuffer, 10 min/20 min

o Kochen in Tris-EDTA-Puffer, pH 9, 20 min

o mit 5 % -igem Rinderserum blocken

o 10 min Inkubation in 0,3 % -igem Triton X 100

• CLIM 2:

o Antikörperverdünnungsreihe: 1:50, 1:100, 1:200, 1:300, 1:400

o Kochen in Citratpuffer, pH 6

o Kochen in Tris-EDTA-Puffer, pH 9

4.1.2 Ergebnisse der Etablierungsversuche

PAX 3 und CLIM 2

Die Etablierungsversuche der immunhistochemischen Färbung mit den spezifischen

Antikörpern gegen PAX 3 und CLIM 2 erbrachten keinerlei akzeptable Ergebnisse. Trotz

Austesten unterschiedlicher Konzentrationen sowohl von Primär- als auch von

- 28 -


Sekundärantikörpern, sowie unterschiedlicher Demaskierungsmethoden zeigte sich entweder

eine vollständige Negativität oder eine intensive Hintergrundfärbung der Gewebsschnitte,

sodass keine spezifische Auswertung möglich war.

SOX 10

Bei SOX 10 zeigten sich in den Verdünnungsreihen von 1:50 bis 1:400 schwankende und

insgesamt nur sehr geringe Anfärbungen einzelner Zellen. Eine Verlängerung und

Intensivierung der Hitzeinaktivierung führte zu einem Anstieg der Hintergrundsfärbung,

welche sich auch nach Blocken mit Rinderserum nicht unterdrücken ließ. Gleiches geschah

nach Vorbehandlung mit Triton X 100. Eine Zunahme spezifischer Anfärbungen konnte

hierdurch nicht erlangt werden. Aufgrund dieser inkonstanten Anfärbbarkeit wurden weitere

Versuche mit SOX 10 eingestellt.

SOX 9

Bei SOX 9 kristallisierten sich im Laufe der Etablierungsversuche folgende Parameter als

optimal heraus: Primärantikörperverdünnung: 1:100, Demaskieren in Citratpuffer pH 6 über

20 min bei 100 °C und Antikörperinkubation in Inkubationspuffer unter Zusatz von 0,3 %

Triton X 100 und 5 % Rinderserum. Diese Parameter wurden bei den folgenden Versuchen

konstant gehalten.

4.2 Probandencharakterisierung

4.2.1 Allgemeine Angaben zu den Probanden

Anhand der histologischen Datei der Freiburger Universitäts-Hautklinik wurden ca. 250

Probanden ermittelt, die zwischen 2005 und 2008 am Kopf operiert worden waren.

Schnittpräparate der Gewebestücke wurden auf die Beurteilbarkeit von Haarfollikeln

(tangentiale Schnittführung) überprüft. Es wurden nur Präparate ausgewählt, welche

mindestens zehn Haarfollikelanschnitte aufwiesen, welche zudem präferenziell tangential

angeschnitten waren. Dies führte zu einem Ausschluss von ca. 150 Präparaten, welche zu

klein waren.

- 29 -


Von den übrigen ca. 100, ließ sich bei ca. 30 Probanden die Haarfarbe weder anhand von

Fotos in den elektronischen Akten, noch telefonisch eruieren. So blieben zur weiteren

Analyse 79 Probanden, 35 männliche und 44 weibliche Probanden im Alter von 1-93 Jahren.

Das Durchschnittsalter lag bei 47,2 Jahren.

Die Verteilung der zugrundeliegenden Diagnosen (n=79) verhielt sich in abnehmender

Häufigkeit wie folgt: Naevuszellnaevus (16 Probanden), Basalzellkarzinom (16), Malignes

Melanom (10), Naevus sebaceus (7), spinozelluläres Karzinom (SCC) (6), Lichen ruber (5),

maligner adenoider Mischtumor (2), Naevus bleu (2), seborrhoische Keratose (2),

androgenetische Alopezie (2), unauffällige Kopfhaut (2), Follikulitis (2), Juveniles

Xanthom (1), Psoriasis vulgaris (1), Trichoepitheliom (1), Alopecia areata (1), diffuses

Effluvium (1), Aplasia cutis congenita (1), Akne vulgaris (1).

Abbildung 10: Diagnosenverteilung der Probanden

- 30 -


4.2.2 Haarfarben der Probanden

Die Haarfarben der Probanden wurden aus den Probandenakten übernommen. In Fällen, in

denen keine Informationen zur Haarfarbe vorlagen, wurden die Probanden telefonisch befragt.

Die Haarfarben wurden nach zwei unterschiedlichen Schemata unterteilt.

Schema 1:

Einteilung in die drei Farbgruppen hell (rötlich, blond, dunkelblond), dunkel (braun,

dunkelbraun, schwarz), grau (grau beginnend, grau). Hierbei zeigte sich folgende

Fallzahlverteilung:

hell (n=23)

dunkel (n=26)

grau (n=30)

Schema 2:

Einteilung in neun Haarfarben (rötlich, blond, dunkelblond, braun, dunkelbraun, schwarz,

grau (beginnend), grau, Alopezie). In Tabelle 1 sind die einzelnen Zuordnungen aufgeführt.

Tabelle 1: Probanden (Haarfarben, Alter, Geschlecht, Fotobeispiele)

Haarfarbe Alter m/w Fotobeispiele

Rötlich: n=1

blond-rötlich 46 m

Blond: n=8

aschblond (manchmal Strähnchen)

aschblond, einzelne grau

hellblond

hellblond

blond

blond

hell-mittel-blond (Strähnchen blond)

mittelblond

Dunkelblond: n=13

dunkel-blond, vereinzelt grau

dunkel-blond, vereinzelt grau

dunkel-blond, vereinzelt weiß

dunkelblond

dunkelblond

67

58

7

22

3

22

28

42

66

66

76

35

- 31 -

w

w

m

w

w

w

w

w

w

w

w

m


dunkelblond

dunkelblond

dunkelblond

dunkelblond

dunkelblond

dunkelblond- Kastanie

dunkelblond- hellbraun

dunkelblond- hellbraun

32

24

37

40

16

9

53

24

27

w

w

m

m

m

m

m

m

m

Braun: n=13

hellbraun

hellbraun

mittelbraun

mittelbraun

mittelbraun

braun

braun

braun

braun

braun

braun

braun

braun, etwas grau

25

20

18

14

14

20

1

6

1

38

39

12

75

m

w

w

w

w

w

m

w

m

w

m

w

m

Dunkelbraun: n=9

dunkelbraun, einzelne graue

dunkelbraun, einzelne graue

dunkelbraun

dunkelbraun

dunkelbraun

dunkelbraun

dunkelbraun

braun, getönt schwarz

dunkelbraun

46

50

47

33

28

24

28

38

24

m

m

m

w

m

m

w

w

w

Schwarz: n=3

dunkelbraun-schwarz

schwarz

schwarz

10

37

26

m

m

m

- 32 -


Grau (beginnend): n=8

grau- dunkelbraun 50:50

braun- grau

braun- grau

braun- grau 50:50

grau- braun

grau- braun, braun gefärbt

grau- dunkelblond

kastanienrot, leicht grau,

(gefärbt: kastanienrot)

67

80

80

63

79

55

72

62

w

w

w

w

m

w

m

w

Grau: n=16

grau (und dunkelblond)

grau (- bräunlich), gefärbt: bräunlich

grau, gefärbt: rötlich (früher: dunkelblond)

grau (bis mittelblond)

grau (- aschblond)

grau

grau

grau

grau- meliert/ weiß (früher blond)

grau- weiß

grau

weiß

weiß

weiß (-grau)

grau- weiß

weiß- grau

64

57

65

70

72

66

83

69

93

80

76

86

80

91

84

81

m

w

w

m

w

m

m

m

w

m

m

m

m

m

w

w

Alopezie: n=8

hellbraun + Alopezie

Alopezie (blond)

weiß-grau (+Haarausfall)

weiß-grau (+Haarausfall)

weiß (wenig)

weiß (wenig)

weiß, wenig

diffuse Alopezie

40

37

75

75

73

73

79

34

w

w

w

w

w

w

w

w

- 33 -


4.3 Expression von SOX 9 im Probandenkollektiv

SOX 9-positive Zellen im Bereich der Haarfollikel waren bei Probanden aller Haarfarben zu

erkennen. Diese ließen sich durch ihre rote Kernfärbung klar von anderen Zellen abgrenzen.

Im Folgenden sind Bildbeispiele zur morphologischen Verteilung der SOX 9-Expression von

mehreren Probanden unterschiedlichen Alters, Haarfarbe und Haardichte dargestellt. Die

Auswertungen wurden anhand verschiedener Schnittebenen am Haarfollikel durchgeführt.

a

b

c

d

Abbildung 11: Sox 9-Expression an vier Haaranschnitten einer 73-jährigen Probandin

mit weißen Haaren. Der Mittelwert von SOX 9-positiven Zellen pro 40x HPF lag bei

20,17.

a) Schräger Anschnitt. 40 x Vergrößerung. 20 SOX 9-positive Zellen

b) Schräger Anschnitt, 40 x Vergrößerung, 29 SOX 9-positive Zellen

c) Traverser Anschnitt, 40 x Vergrößerung, 24 SOX 9-positive Zellen

d) Traverser Anschnitt, 20 x Vergrößerung, 28 SOX 9-positive Zellen (Summe der 40x

Felder 20+8)

- 34 -


Zunächst sehen wir exemplarisch vier unterschiedliche Haarfollikel einer Probandin mit

weißen Haaren und einer insgesamt hohen SOX 9-Expression (Abbildung 11). In zwei

schrägen Anschnitten wurden pro ausgezähltes Rasterfeld die Zellanzahl 20 und 29 für

SOX 9-positive Zellen ermittelt (Abbildung 11 a, b). Die beiden traversen Anschnitte liefern

24 und 28 SOX 9-positive Zellen (Abbildung 11 c, d). Abbildung 11 d zeigt, im Gegensatz zu

den drei Haarfollikeln in 40-facher Vergrößerung (Abbildung 11 a, b, c), eine 20-fache

Vergrößerung mit insgesamt 28 positiv angefärbten Zellen. Da für die Auswertung jedoch

deren Anzahl im 40-er Feld gilt, zählen wir hier zwei 40x Felder mit je 20 und

8 SOX 9-positiven Zellen.

Um einen besseren Eindruck über die Verteilung der SOX 9-positiven Zellen am Haarfollikel

zu erhalten, sind vier Probanden mit unterschiedlichen Haarfarben und hoher SOX 9-

Expression beispielhaft dargestellt (Abbildung 12). Unabhängig von der Anschnittart, also ob

travers, horizontal oder schräg, sind die SOX 9-positiven Zellen regelmäßig entlang der

inneren Wurzelscheide verteilt. Zunächst sehen wir in einem schrägen Haarschaftanschnitt

einer hellblonden Probandin 23 SOX 9-positive Zellen (Abbildung 12 a). Im transversen

Anschnitt zeigt das Haar eines 46-jährigen Mannes mit dunkelbrauner Haarfarbe 27

(Abbildung 12 b), ein horizontaler, leicht schräger Anschnitt beim Haar eines 3-jährigen,

blonden Mädchens 38 SOX 9-positive Zellen (Abbildung 12 c). Ein weiterer schräger

Haaranschnitt zeigt 17 SOX 9-positive Zellen bei einem dunkelblonden Probanden

(Abbildung 12 d).

- 35 -


a

b

Abbildung 12: Haaranschnitte von vier Probanden mit verschiedenen Haarfarben

c

d

a) Probandin weiblich, 67 Jahre alt, Haarfarbe hellblond, schräg angeschnitten,

40 x Vergrößerung, 22 SOX 9-positive Zellen; Mittelwert aus mehreren 40 x Feldern

lag bei 23

b) Männlich, 46 Jahre, dunkelbraun, transverser Anschnitt, 40 x Vergrößerung,

27 SOX 9-positive Zellen; Mittelwert 17

c) Weiblich, 3 Jahre, blond, horizontal-schräger Anschnitt, 20 x Vergrößerung,

38 SOX 9-positive Zellen (Summe der 40 x Felder 28+10); Mittelwert 15,3

d) Männlich, 24 Jahre, dunkelblond, schräger Anschnitt, 40 x Vergrößerung, 17 SOX 9-

positive Zellen; Mittelwert 11,33

Einen Einblick in eine niedrige SOX 9-Expression gewinnt man beim Betrachten der

folgenden vier Haaranschnitte (Abbildung 13). Hier sind Gewebeanschnitte von Probanden

gezeigt, deren Mittelwerte sich zwischen 1 und 12 (gerundet) bewegen. Die Haarfarben gehen

dabei von grau über grau-braun bis hin zu braun. Zu sehen sind zwei transverse Anschnitte,

sowie ein Papillen- und ein horizontaler Haaranschnitt, die keine SOX 9-positiven Zellen

aufweisen.

- 36 -


a

b

c

d

Abbildung 13: Haaranschnitte ohne SOX 9-positive Zellen von vier Probanden mit

niedriger SOX 9-Expression und verschiedenen Haarfarben

a) Männlich, 69 Jahre alt, graue Haare, travers angeschnittenes Haar,

40 x Vergrößerung, ohne SOX 9-positive Zellen; Mittelwert des Probanden 1,3

b) Weiblich, 80 Jahre, grau (bis braun-) haarig, transverser Anschnitt,

20 x Vergrößerung, keine SOX 9-positiven Zellen; Mittelwert von 12,3

c) Weiblich, 14 Jahre, mittelbraune Haarfarbe, Papille, 40 x Bildausschnitt,

keine SOX 9-positiven Zellen; Mittelwert 5,3

d) Männlich, 50 Jahre, dunkelbraune (einzelne graue Haare), horizontaler Haaranschnitt,

20 x Vergrößerung, keine SOX 9-positiven Zellen; Mittelwert 9

- 37 -


4.4 Vergleichende Analysen der SOX 9-Expression

4.4.1 Vergleich der Haarfarben

Im Folgenden wurden die unterschiedlichen Gruppen (Schema 1 und 2, Kapitel 4.2.2) in ihrer

SOX 9-Expression miteinander verglichen und statistisch ausgewertet. Der Mittelwert eines

jedes Probanden ergab sich dabei aus den sechs 40x Rasterfeldern mit der höchsten Anzahl

positiver SOX 9-positiver Zellen. Nach Gruppenbildung wurde aus den Mittelwerten der

dazugehörigen Probanden ein Gruppenmittelwert gebildet.

4.4.1.1 Vergleich von hellem, dunklem und grauem Haar (Schema 1)

Stellt man die Daten der drei Haarfarbengruppen einander gegenüber, wird ersichtlich, dass

der Mittelwert der SOX 9-positiven Zellen bei heller Haarfarbe mit 15,43 am höchsten ist

(Tabelle 2). Dunkelhaarige weisen einen Mittelwert von 11,98 auf. Bei grauhaarigen

Probanden liegt der Mittelwert SOX 9-positiver Zellen mit 10,98 am niedrigsten.

Tabelle 2: Rohdaten der Probandengruppen hell, dunkel, grau bezüglich SOX 9-Expression

Haarfarbe Anzahl Mittelwert Median SD Min Max

hell 23 15,43 16,17 4,68 6,17 23

dunkel 26 11,98 13,17 4,72 2,17 22,17

grau 30 10,98 9,0 4,59 0,33 23,67

Zur Beurteilung inwieweit eine Normalverteilung vorliegt, wurde die empirische Verteilung

der Mittelwerte SOX 9-positiver Zellen der obigen Farbgruppen analysiert (Abbildung 14).

Bei allen drei Gruppen ließ sich eine Normalverteilung feststellen, womit die Voraussetzung

für die Gültigkeit des t-Tests erfüllt ist (Schumacher und Schulgen, 2008).

In der direkten Nebeneinanderstellung der Normalverteilungen der drei

Haupthaarfarbengruppen (Schema 1) war zudem zu erkennen, dass der Maximalwert

grauhaariger Probanden bei einem niedrigeren Mittelwert SOX 9-positiver Zellen liegt, als bei

blonden oder braunhaarigen.

- 38 -


Häufigkeit

Verteilung der Mittelwerte SOX9-positiver

Zellen

12

11

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

0

0 5 10 15 20 25 30

Mittelwert

hell

dunkel

grau

Abbildung 14: Verteilung der Mittelwerte SOX 9-positiver Zellen („hell ■“, „dunkel ■“

und „grau ■“ im Vergleich)

Die oben tabellarisch aufgeführten Rohdaten der SOX 9-positiven Zellen wurden als Box-

Whisker-Plot visuell dargestellt (Abbildung 15). Diese Diagrammart erlaubt gleichzeitig die

Visualisierung von Mittelwerten (□), Medianen (──), Perzentilen (95 %- Quantil ┬,

5 %- Quantil ┴), Minima (unteres x) und Maxima (oberes x). Die Grenzen der farbigen

Boxen markieren das 25 %- und 75 %-Quantil der Verteilung, die Boxen unterteilende,

waagerechte Gerade das Median. Die antennenförmigen Schwänze, Whiskers genannt,

reichen vom 5 %- bis zum 95 %-Quantil der empirischen Verteilung.

Im vorliegenden Gruppenvergleich fiel ein Absinken der Zellzahlen von „hell“ nach „dunkel“

zu „grau“ auf (Abbildung 15). So verhielten sich sowohl Mittelwerte, Mediane und Minima,

als auch die 5 %- und 25 %-Quantilwerte absteigend. Bei den Maxima, den 75 %- und 95 %-

Quantilen ließ sich dieser Trend jedoch nicht feststellen. Innerhalb der Probandengruppe

„grau“ ließ sich anhand der langen Whiskers und der weit auseinander liegenden Minimalund

Maximalwerte eine relativ große Schwankungsbreite der SOX 9-positiven Zellzahlen

erkennen.

- 39 -


Abbildung 15: Box-Whisker-Plot zur Darstellung der Mittelwerte SOX 9-pos. Zellen

von „hell ■“, „dunkel ■“ und „grau ■“ im Vergleich

Der Vergleich der SOX 9-Expression bei hellen und dunklen Haarfarben zeigte signifikante

Unterschiede bezüglich der Mittelwerte. Die statistische Berechnung der Daten zeigt

signifikante Unterschiede zwischen „hell“ und „dunkel“ (p=0,02), sowie zwischen „hell“ und

„grau“ (p=0,01). Keine Signifikanz lag vor zwischen den Kohortengruppen „dunkelhaarig“

und „grau“ (p=0,54) (Tabelle 3).

Tabelle 3: t-Test (p-Wert) für den Vergleich der Gruppen "hell", "dunkel" und "grau"

Haarfarbenvergleich (Mittelwerte)

hell (15,43) > dunkel (11,98)

hell (15,43) > grau (10,98)

dunkel (11,98) > grau (10,98)

p-Wert

p=0,02

p=0,01

p=0,54

- 40 -


4.4.1.2 SOX 9-Expressionsvergleich nach detaillierteren Haarfarben (Schema 2)

Im Folgenden analysierten wir Unterschiede bezüglich der SOX 9-Expression zwischen den

neun detailliert eingeteilten Haarfarbengruppen (Schema 2). Hier sehen wir zunächst die

Rohdaten der Haarfarben in neun Gruppen (Tabelle 4), den dazugehörigen Box-Whiskers-Plot

(Abbildung 16) und die statistische Gegenüberstellung der Daten (Tabelle 5).

Tabelle 4: SOX 9-Expression bei unterschiedlichen Haarfarben

Haarfarben N Mittelwert SD

Rötlich 1 18,30 3,50

Blond 8 16,70 5,49

Dunkelblond 13 14,82 4,25

Braun 13 10,99 4,38

Dunkelbraun 9 13,09 5,76

Schwarz 3 12,89 2,92

Grau (beginnend) 8 11,65 3,46

Grau 16 10,16 4,83

Alopezie 8 12,06 5,33

Vergleichen wir die Gruppen zunächst visuell, fallen von „blond“ nach „dunkelblond“ und

„braun“ absteigende Minima, Maxima, Mittelwerte und Quantile auf. Gehen wir weiter

Richtung „braun“, „schwarz“, „grau“ und „weiß“ ergibt sich kein klarer auf- oder

absteigender Trend der Zahlenwerte. Braunhaarige, sowie Probanden mit Alopezie bewegen

sich im mittleren Bereich der SOX 9-positiven Zahlenwerte. Es fällt erneut auf, dass bei den

(beginnend) grauhaarigen Probanden eine breite Streuung der Mittelwerte vorliegt (Tabelle 4,

Abbildung 16). Da diese Arbeit nur einen Probanden mit rötlichen Haaren einschließt, fehlt

diese Haarfarbe in der visuellen Darstellung.

- 41 -


Abbildung 16: Box-Whiskers-Plot zur Darstellung der Mittelwerte SOX 9-positiver

Zellen bei detailierter Haarfarbeneinteilung (Schema 2)

Signifikante Unterschiede in der SOX 9-Expression sind in Tabelle 5 zusammengefasst. Hier

zeigen sich Unterschiede zwischen den Gruppen „rötlich“ und „braun“, „blond“ und „braun“,

„dunkelblond“ und „schwarz“, „dunkelblond“ und „grau“, sowie zwischen „blond“ und

„grau“ (rot markiert). Dabei haben Probanden mit blonder oder rötlicher Haarfarbe signifikant

höhere Mittelwerte als braunhaarige. Ferner haben Blonde und Dunkelblonde verglichen mit

Grauhaarigen höhere Mittelwerte SOX 9-positiver Zellen. Und schließlich erkennen wir beim

Gegenüberstellen von dunkelblonden und schwarzhaarigen Probanden, dass erstere

signifikant höhere Mittelwerte aufweisen. Beginnendes Haarergrauen, sowie beginnender

Haarverlust liefern keine signifikanten Unterschiede. Auch Probanden mit Alopezie

unterscheiden sich nicht signifikant von den anderen Gruppen.

- 42 -


Tabelle 5: Signifikante Unterschiede der SOX 9-Expression der unterschiedlichen Haarfarben

Blond

Braun

Schwarz

Grau

(beginn.)

Grau

Alopezie

Rötlich p=0,78 p=0,2 p=0,04 p=0,15 p=0,10 p=0,16 p=0,07 p=0,09

Blond p=0,24 p=0,01 p=0,12 p=0,23 p=0,08 p=0,02 p=0,07

p=0,06 p=0,42 p=0,5 p=0,22 p=0,049 p=0,22

Braun p=0,39 p=0,59 p=0,82 p=0,73 p=0,67

Dunkelblond

Dunkelbraun

Dunkelblond

Dunkelbraun

p=0,96 p=0,65 p=0,30 p=0,71

Schwarz p=0,79 p=0,53 p=0,83

Grau

(beginnend)

Grau

p=0,63

p=0,90

p=0,52

4.4.1.3 Vergleich der Haarfarben unter verschiedenen Aspekten

A) SOX 9-Expression entlang des Haarschaftes (ohne Papillenanschnitte)

Die Papille stellt die Hauptwachstumszone dar, während Stammzellen ihre Stammzellnische

innerhalb des Haarschaftes haben. Um einen Unterschied zwischen Proliferationszone und

Stammzellreservoir zu erkennen ist es sinnvoll, das Haar in Stamm und Papille zu unterteilen

und diese, die SOX 9-positiven Zellen betreffend, getrennt zu betrachten (Tabelle 6,

Tabelle 8).

Tabelle 6: SOX 9-Expression entlang des Haarschaftes ohne Papillenanschnitte

bei Probanden unterschiedlicher Haarfarben

Haarfarben N Mittelwert SD

Rötlich 1 18,30 3,50

Blond 8 16,70 5,47

Dunkelblond 13 14,23 4,34

Braun 13 10,90 4,45

Dunkelbraun 9 12,44 5,86

Schwarz 3 12,67 3,20

Grau (beginnend) 8 12,09 3,19

Grau 16 10,25 4,64

Alopezie 8 12,20 5,44

- 43 -


Wird die SOX 9-Expression entlang der Haarschaftanschnitte isoliert betrachtet, d.h. unter

Aussparen aller Mittelwerte von Papillenanschnitten, zeigten sich Signifikanzen bei der

Gegenüberstellung von „blond“ und „braun“, sowie von „blond“ und „grau“ (rot markiert)

(Tabelle 7). Diese unterscheiden sich nicht, von den bisher gewonnenen Ergebnissen ohne

diese anatomisch getrennte Betrachtung.

Tabelle 7: Vergleich der Haarfarben ohne Papillenanschnitte (p-Werte)

Blond

Braun

Schwarz

Grau

(beginn.)

Grau

Alopezie

Rötlich p=0,70 p=0,17 p=0,08 p=0,18 p=0,17 p=0,31 p=0,15 p=0,19

Blond p=0,23 p=0,03 p=0,13 p=0,28 p=0,19 p=0,04 p=0,13

p=0,09 p=0,38 p=0,55 p=0,41 p=0,09 p=0,35

Braun p=0,52 p=0,61 p=0,68 p=0,80 p=0,61

Dunkelblond

Dunkelbraun

Dunkelblond

Dunkelbraun

p=0,95 p=0,91 p=0,44 p=0,93

Schwarz p=0,91 p=0,60 p=0,90

Grau

(beginnend)

Grau

p=0,58

p=0,97

p=0,52

B) SOX 9-Expression in der Papillenregion

Nicht alle Probanden dieser Arbeit wiesen Papillenanschnitte auf, sodass hier die Rohdaten

von nur 38 Probanden verwendet werden konnten (Tabelle 8). Teilweise fand sich nur ein

Papillenanschnitt pro Proband.

- 44 -


Tabelle 8: Nur Papillenanschnitte, Einteilung nach Haarfarben,

n= 38 Probanden (51 Papillenanschnitte)

Haarfarben N Mittelwert SD

Rötlich 1 16,0 0

Blond 2 13,0 5,67

Dunkelblond 7 13,71 6,58

Braun 3 15,33 2,08

Dunkelbraun 8 14,94 7,74

Schwarz 1 17,5 0,71

Grau (beginnend) 6 12,92 5,14

Grau 8 9,63 4,11

Alopezie 2 16 8,49

Beim isolierten Studieren der SOX 9-Expression der Papillenanschnitte, fand sich lediglich

eine signifikant höhere Anzahl SOX 9-positiver Zellen bei schwarzhaarigen gegenüber

grauhaarigen Probanden (rot markiert) (Tabelle 9). Die übrigen Gegenüberstellungen der

Haarfarben lieferten keine signifikanten Ergebnisse, wobei die statistische Relevanz bei den

niedrigen Probandenzahlen in Frage zu stellen ist, da sich nur bei 38 Probanden

Papillenanschnitte fanden, teilweise sogar nur einer pro Proband.

Tabelle 9: Vergleich der Haarfarben (p-Werte), nur Papillenanschnitte

Blond

Braun

Schwarz

Grau

(beginn.)

Grau

Alopezie

Rötlich p=0,53 p=0,65 p=0,70 p=0,86 p=0,10 p=0,45 p=0,07 p=1

Blond p=0,89 p=0,54 p=0,75 p=0,38 p=0,99 p=0,35 p=0,72

p=0,70 p=0,75 p=0,46 p=0,81 p=0,17 p=0,69

Braun p=0,93 p=0,27 p=0,47 p=0,05 p=0,90

Dunkelblond

Dunkelbraun

Dunkelblond

Dunkelbraun

p=0,67 p=0,59 p=0,11 p=0,87

Schwarz p=0,28 p=0,03 p=0,83

Grau

(beginnend)

Grau

p=0,21

p=0,54

p=0,14

- 45 -


Betrachtet man die Papillenregion separat, zeigte sich lediglich ein signifikanter Unterschied

in der SOX 9-Expression zwischen schwarzem und grauem Haar (Tabelle 9). Die bei

Auswertung des gesamten Haares signifikanten Unterschiede zwischen Blond/Braun und

Blond/Grau konnten in der Papillenregion nicht aufgezeigt werden und umgekehrt. Es gilt

jedoch hervorzuheben, dass die Anzahl der zur Untersuchung gekommenen Papillenregionen

möglicherweise zu niedrig war, um hier kleinere Expressionsunterschiede signifikant

aufzeigen zu können.

C) Signifikanzberechung unter Streichung von Ausreißern

Bei den Rohdaten pro Proband wurden die zwei auffälligsten „Ausreißer“, d.h. die zwei am

weitesten vom Mittelwert abweichenden Werte SOX 9-positiver Zellen, für die weitere

Berechnung gestrichen. Die statistischen Auswertungen wurden mit den verbleibenden vier

Mittelwerten pro Proband durchgeführt (Daten nicht aufgeführt). Dabei konnten die bereits

gewonnenen Ergebnisse bestätigt werden.

Es zeigte sich unter Streichung der niedrigsten zwei Mittelwerte pro Proband eine signifikante

Unterscheidung zwischen „blond“ und „braun“, sowie zwischen „blond“ und „grau“. Wieder

wiesen blonde Probanden höhere SOX 9-positive Mittelwerte auf.

Wurden jeweils der niedrigste und höchste Mittelwert SOX 9-positiver Zellen pro Proband

weggelassen, erkannten wir signifikante Unterschiede zwischen den Haarfarben „rötlich“ und

„grau“, „blond“ und „grau“, „dunkelblond“ und „grau“, sowie „blond“ und „braun“ im Sinne

der bereits gewonnenen Ergebnisse.

Zusammengefasst stellen sich keine statistisch relevanten Unterschiede ein, ob die

zugrundeliegenden Berechnungen auf allen sechs Rohwerten oder den am engsten

zusammenliegenden vier Rohwerten unter Streichung von zwei Ausreißern basieren. Dies

bekräftigt die Verwendung aller Rohwerte bei der Auswertung.

- 46 -


4.4.1.4 SOX 9-Expression bei Probanden mit Haarausfall

Beim Vergleich der Probanden mit und ohne Haarausfall findet sich kein signifikanter

Unterschied bezüglich der SOX 9-positiven Zellen (Tabelle 10). Zwar ist die Gesamtanzahl

der vorzufindenden Haare bei Probanden mit Haarausfall reduziert, bezüglich der SOX 9-

positiven Zellen der vorhandenen Haare finden sich jedoch keine Unterschiede zwischen

Probanden mit und ohne Haarausfall. Der Altersdurchschnitt beträgt bei Probanden mit

Alopezie 60,75 Jahre, bei den übrigen 45,76 Jahre.

Tabelle 10: Probanden mit und ohne Haarausfall (p-Wert)

Haarausfall Nein Ja t-Test

N 71 8

Mittelwert 12,67 12,06 p=0,79

SD 4,58 5,33

4.4.1.5 Grau versus nicht-grau

Entscheidend ist die Gegenüberstellung der beiden Kollektive der nicht-Grauhaarigen (hell,

dunkel) und Grauhaarigen. Hierbei zeigt der Vergleich aller grauhaarigen Probanden mit den

noch nicht ergrauten einen statistisch signifikanten Unterschied bezüglich der Anzahl SOX 9-

positiver Zellen (Tabelle 11). Die Haaranschnitte von Probanden mit grauen Haaren besitzen

mit einem Mittelwert von 10,98 signifikant weniger SOX 9-positive Zellen als die der

anderen Haarfarben (blonden, braun-, rot- oder schwarzhaarigen), die zusammen einen

Mittelwert von 13,60 aufweisen. Interessant sind auch die Altersdurchschnitte von

35,64 Jahren bei Probanden ohne graue Haare und 73,96 Jahren bei ergrauten Probanden.

Tabelle 11: Probanden mit und ohne Haarergrauen und deren Vergleich (p-Wert)

Grau Nein Ja t-Test

N 51 28

Mittelwert 13,60 10,98 p=0,035

SD 4,70 4,59

- 47 -


4.4.2 Altersabhängigkeit von SOX 9

Hat das Alter einen Einfluss auf die SOX 9-Expression? Zur genaueren Beurteilung einer

Altersabhängigkeit wurde im Weiteren die SOX 9-Expression bezogen auf vier verschiedene

Altersgruppen betrachtet. Die Einteilung war dabei wie folgt: 0-14 Jahre, 15-40 Jahre,

41-60 Jahre, älter als 60 Jahre.

Betrachten wir nun die Mittelwerte der Gruppen, ist ein Trend zu abnehmenden Mittelwerten

mit steigendem Alter offensichtlich, was für die Altersabhängigkeit der SOX 9-Expression

sprechen würde (Tabelle 12).

Tabelle 12: SOX 9-Expression in den verschiedenen Altersgruppen

Alter 0-14 15-40 41-60 >60

N 10 26 13 30

Mittelwert 14,3 13,4 12,3 11,4

SD 5,2 4,9 4,35 4,4

Vergleichen wir die verschiedenen Altersgruppen mittels t-Test, zeigen die ermittelten

p-Werte jedoch keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Alterskategorien

(Tabelle 13), sodass wir die zunächst angenommene Altersabhängigkeit der SOX 9-

Expression statistisch nicht bekräftigen können.

Tabelle 13: Vergleich der Altersgruppen (p-Werte)

0-14 vs. 15-40 0-14 vs. 41-60 0-14 vs. >60

p=0,64 p=0,38 p=0,24

15-40 vs. 41-60 15-40 vs. >60 41-60 vs. >60

p=0,53 p=0,24 p=0,69

- 48 -


4.4.3 SOX 9-Expression abhängig von Alter und Geschlecht

Hier wurden dieselben vier Altersgruppen, diesmal unter Trennung nach Geschlechtern,

betrachtet. Bei den männlichen Probanden sahen wir hierbei einen Trend zur Abnahme der

Mittelwerte mit steigendem Alter (Tabelle 14).

Tabelle 14: Altersgruppen bei Männern

Alter 0-14 15-40 41-60 >60

N 5 12 5 13

Mittelwert 16,5 12,4 11,7 11,3

SD 5,1 3,6 4,4 5,3

Statistisch zeigte der Vergleich der einzelnen Altersgruppen beim männlichen Geschlecht

jedoch keine Signifikanz (Tabelle 15), womit die geschlechtsneutralen Ergebnisse bezüglich

Altersabhängigkeit der SOX 9-Expression bekräftigt sind.

Tabelle 15: Vergleich der Altersgruppen bei Männern (p-Werte)

Alter 0-14 vs. 15-40 0-14 vs. 41-60 0-14 vs. >60

t-Test p=0,078 p=0,14 p=0,12

Alter 15-40 vs. 41-60 15-40 vs. >60 41-60 vs. >60

t-Test p=0,78 p=0,64 p=0,916

Bei den Altersgruppen der Frauen zeigt sich im Gegensatz zu den männlichen Probanden kein

Trend zu absinkenden Mittelwerten SOX-9 positiver Zellen mit steigendem Alter. Den

höchsten Mittelwert wiesen Probandinnen in der Altersgruppe 15 bis 40 Jahre auf

(Tabelle 16). Auch hier findet sich keine statistische Signifikanz beim Vergleich der

Altersgruppen (Tabelle 17).

- 49 -


Tabelle 16: Altersgruppen bei Frauen

Alter 0-14 15-40 41-60 >60

N 5 14 8 17

Mittelwert 12,2 14,3 12,7 11,5

SD 5,2 6,1 4,3 3,7

Tabelle 17: Vergleich der Altersgruppen bei Frauen (p-Werte)

Alter 0-14 vs. 15-40 0-14 vs. 41-60 0-14 vs. >60

t-Test p=0,47 p=0,87 p=0,87

Alter 15-40 vs. 41-60 15-40 vs. >60 41-60 vs. >60

t-Test p=0,53 p=0,26 p=0,70

Auch eine Gegenüberstellung beider Geschlechter innerhalb der jeweiligen Altersgruppen

zeigt im t-Test keine signifikanten Unterschiede (Tabelle 18).

Tabelle 18: Vergleich der Geschlechter innerhalb der Altersgruppen

Alter 0-14 15-40 41-60 >60

t-Test p=0,19 p=0,34 p=0,76 p=0,93

So können wir festhalten, dass zwar ein gewisser Trend zu sinkenden SOX 9-positiven

Mittelwerten mit steigendem Alter zu erkennen ist, dieser jedoch mittels statistischer

Untersuchungen, auch nach Hinzuziehen der Variable „Geschlecht“, zu keinen signifikanten

Ergebnissen führt.

- 50 -


4.4.4 Differenzierung nach Geschlecht

4.4.4.1 Vergleich von Männern und Frauen unabhängig von der Haarfarbe

Stellen wir Männer und Frauen unabhängig der Haarfarben gegenüber, sehen wir fast

identische Gruppenmittelwerte. Auch im t-Test ergibt sich bei einem p-Wert von p=0,86 kein

signifikanter Unterschied zwischen beiden Geschlechtern hinsichtlich ihrer SOX 9-

Expression (Tabelle 19).

Tabelle 19: Einteilung nach Geschlecht und Vergleich von Männern und Frauen

(p-Wert)

Geschlecht N Mittelwert SD t-Test

M 35 12,5 4,6 p=0,86

W 43 12,7 4,7

4.4.4.2 Vergleich von Männern und Frauen innerhalb der einzelnen Haarfarben

Betrachten wir Männer und Frauen getrennt, diesmal aufgeteilt in die drei Haarfarbengruppen

(Schema 1) sehen wir nahezu identische Mittelwerte innerhalb der einzelnen Farbgruppen. Es

ergeben sich bei hohen p-Werten keine signifikanten Unterschiede zwischen beiden

Geschlechtern (Tabelle 20). Das Geschlecht scheint demnach keinen Einfluss auf die SOX 9-

Expression zu haben.

- 51 -


Tabelle 20: a) Hell-, b) dunkel- und c) grauhaarige Probanden nach Geschlecht getrennt

a

Geschlecht Anzahl Mittelwerte SD t-Test

w 13 16,03 4,72 p=0,49

m 10 14,63 4,62

23

b

Geschlecht Anzahl Mittelwerte SD t-Test

w 13 11,85 5,73 p=0,89

m 13 12,13 3,72

26

c

Geschlecht Anzahl Mittelwerte SD t-Test

w 18 10,94 4,04 p=0,97

m 12 11,04 5,41

30

- 52 -


5. Diskussion

Die Kopfhaare sind eines der wichtigsten äußeren Erscheinungsmerkmale eines jeden

Individuums. Sie unterscheiden sich in ihrer Farbe, ihrer Festigkeit, ihrer Neigung eher glatt,

gewellt oder gelockt zu sein. Mit zunehmendem Alter mischen sich die farbigen Haare mit

weißen Haaren, bis man über ein meliertes Zwischenstadium zunehmend weiße Kopfhaare

bekommt. Parallel verläuft während des Alterungsprozesses der langsam zunehmende Verlust

der Haare, welcher in erster Linie beim Mann zur Glatzenbildung bis hin zum vollständigen

Haarverlust führen kann. Individuelle wie generelle Faktoren herauszufinden, welche die

Entstehung unterschiedlicher Haarfarben, sowie Faktoren, welche das Haarergrauen und den

primär genetisch bedingten Haarverlust beeinflussen, sind Gegenstand langjähriger

Forschung. Neben genetischen Faktoren hat die Stammzellforschung in den letzten ein bis

zwei Jahrzehnten zunehmend Bedeutung in dieser Fragestellung erhalten.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es auf relativ einfache methodische Weise, sprich unter

Verwendung immunhistochemischer Methoden, screeningartig herauszufinden, welche

Stammzellmarker auf die Entstehung der Haarfarbe, sowie auf Haarergrauen und Haarausfall

Einfluss nehmen könnten.

Dieses Screening wurde mit einer Literaturrecherche zu den Themen „Stammzellen und

Haarfarbe, Haarergrauen und Haarausfall“ begonnen. Aus der Vielzahl der sich hieraus

ergebenden Faktoren bzw. Moleküle wurden jene ausgewählt, welche immunhistochemisch

detektierbar waren und für die kommerziell erhältliche Antikörper zur Verfügung standen.

Dies führte zu einer ersten Selektion folgender Moleküle: SOX 9, SOX 10, PAX 3 und

CLIM 2.

Die Probandenauswahl erfolgte anhand bereits vorhandener Schnittpräparate aus dem Archiv

der dermatologischen Universitätsklinik Freiburg. Es wurde in einem umschriebenen

Zeitraum nach Präparaten gesucht, welche aus der Kopfhaut stammten. Dabei war es von

Wichtigkeit, dass mehrere Haarfollikel möglichst tangential zu deren Verlaufsrichtung im

histologischen Präparat getroffen und ohne pathologischen Prozess waren. Insgesamt konnten

79 Probanden in die Studie eingeschlossen werden. Die Haarfarbe der Probanden, sowie das

Vorhandensein einer androgenetischen Alopezie wurden aus der

Patientenphotodokumentation übernommen oder telefonisch bei den Probanden erfragt.

- 53 -


Hieraus ergab sich eine Zuordnung der Probanden in unterschiedliche Gruppen entsprechend

ihrer Haarfarben bzw. Haardichte.

Es folgte die Etablierungsphase der immunhistochemischen Färbemethoden von SOX 9,

SOX 10, PAX 3 und CLIM 2 an einzelnen Gewebeschnitten. Bei den Etablierungsversuchen

wurden unterschiedliche Konzentrationen der Primär- und Sekundärantikörper in

ansteigenden Konzentrationsreihen ausgetestet. Zudem wurden unterschiedliche

Demaskierungsverfahren, wie Vorkochen in Citrat- und Tris-EDTA-Puffer, zur Optimierung

der Färbeergebnisse eingesetzt. Bei den Versuchsreihen zeigte sich, dass die Verwendung der

Antikörper gegen SOX 10, PAX 3 und CLIM 2 keine spezifischen Resultate erbrachte –

entweder kam es zu einer überschießenden Backgroundfärbung (PAX3/7 und CLIM 2) oder

zu so inkonstanten Färbeergebnissen (SOX 10), dass man die Zuverlässigkeit der Aussage

anzweifeln musste. Ausnahme war SOX 9 – hier zeigten die Vorversuche reproduzierbare und

spezifische Ergebnisse. Aus diesem Grunde wurden in der weiteren Arbeit ausschließlich

Färbungen mit Antikörpern gegen SOX 9 durchgeführt.

Im Vergleich der SOX 9-Expression bei Probanden mit unterschiedlichen Haarfarben bzw.

Haardichte zeigten sich folgende Ergebnisse:

Blonde Probanden unterschieden sich signifikant aufgrund einer erhöhten SOX 9-Expression

sowohl von braun-, als auch von grauhaarigen Individuen. Im Vergleich von Grauhaarigen zu

Nicht-Grauhaarigen zeigte sich ebenfalls eine höhere SOX 9-Expression bei nichtgrauhaarigen

als bei grauhaarigen. Mit zunehmendem Alter zeigte sich ein Trend zu einer

kontinuierlichen Abnahme von SOX 9, dieser erreichte jedoch keine statistische Signifikanz.

Geschlechtsspezifische Unterschiede konnten nicht aufgezeigt werden. Die acht untersuchten

Individuen mit Alopezie zeigten keine signifikante Reduktion von SOX 9.

5.1 Der Haarapparat und Stammzellen

In den vergangenen zwei Jahrzehnten wurden die funktionellen Abläufe der

Haarmorphogenese, Einflussfaktoren auf den Haarzyklus, das Phänomen des Haarverlustes,

wie des Haarergrauens in zahlreichen wissenschaftlich höchst anspruchsvollen Arbeiten

untersucht. Hierzu zählten unterschiedlichste Knockout-Mausmodelle, in denen unter

anderem der Einfluss von Genen wie Ragged/Opossum, Tabby, Waved 2, Fuzzy, Hairless,

Angora, Nude, Balding oder Lethal spotting beleuchtet und in einer Übersichtsarbeit von

- 54 -


Schneider et al. (2009) zusammengefasst wurden. Mehr als 120 genetische Susceptibility-

Loci zur Haarfarbendetermination konnten identifiziert werden (Bennett and Lamoreux,

2003). Und zahlreiche Regulationsmoleküle der Haarmorphogenese und des Haarzyklus

konnten aufgedeckt werden, wie von Schneider et al. (2009) tabellarisch zusammengefasst

(Tabelle 21). Eine entscheidende Rolle im Entstehungs-, sowie vor allem auch im

Erhaltungsprozess von Haaren kommt Stammzellen zu (Fuchs E., 2009). Regulatorischen

Einfluss auf Stammzellen wird unter anderem den Molekülen SOX 9, SOX 10, PAX 3 und

CLIM 2 beigemessen (Nishimura et al., 2010; Xu et al., 2007).

Tabelle 21: Zusammenfassung der am besten definierten molekularen Regulatoren der

Haarfollikelmorphogenese nach Schneider et al., 2009

Haarfollikelmorphogeneseschritt

Äußere Wurzelscheide

Innere Wurzelscheide

Haarschaft

Polarität, Form

(Wellen/Locken)

Innervation

Pigmentation

Wulst (Bulge region)/

Erhaltung der Haarstammzellen

Genprodukt

Sox9, Shh/Smo

GATA3, Cutl1 (CDP)

BMPs/BMPR1a

Shh/Smo

Notch1/Jagged/Delta/RBP-Jk für IRS

b-catenin, Wnt’s und Lef-1

VDR (Vitamin D-Rezeptor)

BMPs/BMPR1a

Shh/Smo

msx1 und 2

FoxN1/Nude

HoxC13

Notch1/Jagged/Delta/RBP-Jk

Shh

Igfbp5

Eda A1

Krox-20

FoxE1

Runx3

Sox18

b-catenin

NCAM

FoxN1/Nude

SCF/c-kit

Notch

BMPs/BMPR1a

Lhx2

Sox9

NFATc1

p63

Tcf3

Rac1

integrins a3b1 und a6b4

- 55 -


5.1.1 SOX 9

SOX 9 ist essentiell für die Entwicklung und Differenzierung zahlreicher Zellreihen, unter

anderem dieser, die embryologisch gesehen von Neuralleiste (Cheung et al., 2005) und

Neuralrohr (Stolt et al., 2003) abstammen. Aus der Neuralleiste entwickeln sich insbesondere

Gewebe des Nervensystems und der Haut und Hautanhangsgebilde, zu denen auch die Haare

zählen. Für diese Arbeit von besonderem Interesse ist, dass SOX 9 in der äußeren

Wurzelscheide des Haarfollikels exprimiert und in allen Stadien des Haarzyklus nachweisbar

ist (Vidal et al., 2005). Die fundamentale Bedeutung von SOX 9 für den Haarapparat zeigt

sich in SOX 9-Knockout-Mäusen, bei denen es zu einem vollständigen Verlust der Haare und

des Haarfollikel-Stammzellkompartiments kommt (Cook et al., 2005; Vidal et al., 2005).

Außerdem ist es bei der Genese von Tumoren epidermalen Ursprungs, nämlich des

semimalignen Basalzellkarzinoms und der benignen Trichoepitheliome und Trichilemmome

(Vidal et al., 2008), sowie bei der embryologischen Entwicklung des Nagelbettes und der

ekkrinen Schweissdrüsen plantar (Krahl and Sellheyer, 2010) involviert.

5.1.2 SOX 10

SOX 10 reguliert über die Expression des Endothelin-Rezeptor-B (EDNRB)-Gens die

terminale Migration von Melanoblasten und anderen Melanozytenvorläuferzellen (Yokoyama

et al., 2006; Cook et al., 2005). Mutationen von SOX 10-kodierenden Genen ergeben

Syndrome, die mit Hautpigmentationsabnormitäten assoziiert sind, wie das Waardenburg

Syndrom und das „Yemenite Deaf-Blind Hypopigmentation“ Syndrom (Pingault et al., 2010).

Ferner wird SOX 10 von relativ differenzierten Tumoren neuroektodermalen Ursprungs, wie

malignen Melanomen und Gliomen, produziert (Gershon et al., 2005; Ferletta et al., 2007).

5.1.3 PAX 3

PAX 3 ist essentiell für die Differenzierung von Melanozytenstammzellen, da es die

melanogene Kaskade initiiert (Lang et al., 2005; Nishimura et al., 2005; Steingrímsson et al.,

2005). Als Schlüsselmolekül aktiviert es einerseits synergistisch zu SOX 10 direkt die

Expression von Mitf und konkurriert andererseits um die Bindung an einen für die Dct-

Expression erforderlichen Enhancer und hemmt somit die Mitf-/ SOX 10-vermittelte

Aktivierung. Dct kodiert für das Enzym Dopachrom-Tautomerase, das einen wichtigen

- 56 -


Reaktionsschritt bei der Melaninentstehung katalysiert und führt über Verdrängung von

PAX 3 zur Anregung von Melanozytenstammzellen (Lang et al., 2005; Nishimura et al.,

2005; Steingrímsson et al., 2005; Prince et al., 2001; Smit et al., 2000; Vachtenheim and

Novotná, 1999). In Analogie zu SOX 10 führen Mutationen in PAX 3 ebenfalls zum

Depigmentations-Syndrom Waardenburg. PAX 3 und sein Homolog PAX 7 werden

desweiteren von schlecht differenzierten und malignen Tumoren neuroektodermalen

Ursprungs produziert. In Studien konnten die Isoformen PAX 3 a-e in Hautmelanomzelllinien

nachgewiesen werden (Gershon et al., 2005; Parker et al., 2004).

5.1.4 CLIM 2

CLIM 2 wird hauptsächlich von Gewebe mit mehrschichtigem Epithel exprimiert, das in der

Lage ist sich selbst zu erneuern, wie beispielsweise Epidermis, Haarfollikel und Kornea

(Sugihara et al., 1998). Als Co-Faktor von LIM-Domänen ist es an der Erhaltung von

Haarfollikelstammzellen im Wulstbereich der äußeren Wurzelscheide verantwortlich (Xu et

al., 2007). Mäuse mit dominant negativer CLIM-Expression zeigten eine progressive

Haarfollikeldysfunktion mit Haarausfall (Xu et al., 2007).

Wie bereits erwähnt, stammt der überaus größte Teil der wissenschaftlichen Erkenntnisse zum

Haarapparat und zum Haarwachstum aus (transgenen) Mausstudien oder unter Verwendung

aufwendiger molekularer Methoden von humanem Gewebe, dann meist von nur wenigen

Probanden.

Daher war die Zielsetzung in der vorliegenden Arbeit, die Bedeutung von Stammzellfaktoren

auf relativ einfache methodische Weise, nämlich unter Verwendung immunhistochemischer

Anfärbungen von humanem Gewebe, quasi als Screeningmethode zu evaluieren. Ein

Entscheidungsmerkmal zugunsten der Faktoren SOX 9, SOX 10, PAX 3 und CLIM 2 war das

Vorhandensein käuflich erhältlicher Antikörper. Obwohl eine Anwendbarkeit in Formalinfixiertem

und Paraffin-eingebettetem Gewebe nur für SOX 9 in der Literatur nachlesbar war,

wollten wir für die weiteren Antikörper zumindest einen Nachweisversuch in Formalinfixiertem

Paraffin-eingebettetem Gewebe durchführen. Trotz Austesten unterschiedlicher

Konzentrationsreihen und Demaskierungsverfahren blieben die Versuchsreihen unter

Anwendung der Antikörper gegen SOX 10, PAX 3 und CLIM 2 ohne spezifischen Nachweis

der entsprechenden Faktoren. Bei SOX 10 ließ sich zwar eine Positivität von Zellen im

- 57 -


Bereich des Haarfollikels nachweisen, doch war dieser Nachweis in

Bestätigungsuntersuchungen so inkonstant, dass auch für SOX 10 eine zuverlässige

Anwendung des Antikörpers in Frage gestellt werden musste. Aufgrund der fehlenden

Spezifität für die Antikörper gegen PAX 3 und CLIM 2, sowie der inkonstanten

Färbeergebnisse des SOX 10-Antikörpers wurden weiterreichende Untersuchungen mit diesen

Antikörpern eingestellt.

Die SOX 9-Antikörper waren dagegen spezifisch und zeigten wiederholt kongruente

Ergebnisse, sodass sich die weitere Studie auf die Expression von SOX 9 im Haarfollikel

fokussiert.

5.2 SOX 9-Expression im Haarfollikel

In der vorliegenden Studie wurde die Expression von SOX 9 an den Haarfollikeln von 79

nicht verwandten Probanden immunhistochemisch bestimmt. Expressionsunterschiede

wurden hinsichtlich der Haarfarbe der Probanden, des Ergrauens, des Vorhandenseins einer

Alopezie, sowie der Alters- und Geschlechtsunterschiede statistisch miteinander verglichen.

Als positiv wurde eine Anfärbung des Zellkernes von Zellen innerhalb des Haarfollikels

gewertet, ähnlich den Ergebnissen aus der Arbeit von Krahl und Sellheyer (2010). Pro

Proband wurden zwei voneinander unabhängig gefärbte Präparate mikroskopisch ausgewertet.

Von jedem Präparat wurden die drei 40x-Gesichtsfelder mit der höchsten Anzahl SOX 9-

positiver Zellen ausgezählt. Der Mittelwert aus der Gesamtheit der sechs Gesichtsfelder

diente als Vergleichszahl zwischen einzelnen Probanden.

5.2.1 SOX 9-Expression und Haarfarbe

In einer ersten Analyse wurden die unterschiedlichen Haarfarben in helle und dunkle

aufgeteilt. Hierbei zeigte sich ein signifikanter Expressionsunterschied zwischen hellen und

dunklen Haaren, wobei die hellen Haare eine höhere SOX 9-Expression aufwiesen.

- 58 -


Bei einer Unterteilung der Haarfarben in die Gruppen rötlich, blond, dunkelblond, braun,

dunkelbraun und schwarz zeigte sich eine signifikant höhere Expression von SOX 9 bei

Blonden gegenüber Braunhaarigen, bei Rötlichen gegenüber Braunhaarigen, sowie

Dunkelblonden gegenüber Schwarzhaarigen.

Tendenziell zeigten somit Hellhaarige eine höhere SOX 9-Expression als Dunkelhaarige.

Interessanterweise ergab eine Pubmedrecherche mit den Suchworten „hair color“ and

„SOX 9“ keine einzige Publikation und eine Suche mit „hair color“ and „SOX“ nur eine

einzige Arbeit über SOX 10 bei Waardenburg Syndrom (Hwang et al., 2009). Somit geben

diese immunhistochemischen Expressionsdaten erste Hinweise auf einen Einfluss von SOX 9

auf die Haarfarbe, wobei weiterreichende Untersuchungen zum Einen eine Bestätigung der

Daten, zum Anderen detaillierter funktionelle Zusammenhänge liefern müssen.

Bislang sind klare Vorstellungen zu Einflussfaktoren auf die Haar- und auch auf die

Pigmentierungsfarbe der Haut eher rar. Im Fokus stehen die sogenannten „Pigmentation

Genes“, von denen ca. 150 unterschiedliche bekannt sind, wobei MC1R (Melanocortin-1-

Rezeptor), ASIP (agouti-signaling protein), Mitf (Mikrophthalmie-assoziierter

Transkriptionsfaktor) und Enzyme der Melanogenese (Tyrosinase, Trp1 (Tyrosinase-related

protein 1), Dct (Dopachrom-Tautomerase)) im Vordergrund des Interesses stehen (Ito and

Wakamatsu, 2010; Harris et al., 2010; Millar et al., 1995). Beispielsweise wurden in Genomweiten

Assoziationsstudien über 80 Single-Nucleotide-Polymorphismen (SNP) in MC1R,

sowie in TYP, TYRP1, ASIP und anderen mit Einfluss auf die Pigmentierung gefunden

(Sturm R. A., 2009; Han et al., 2008; Ito and Wakamatsu, 2010).

Chemische Untersuchungen am Haarfollikel von Ito und Wakamatsu (2010) zeigten

Unterschiede im Verhältnis von Eumelanin (braun bis schwarz) zu Pheomelanin (blond bis

rötlich) bei unterschiedlich gefärbten Haaren. Hierbei scheint auch der pH-Wert innerhalb des

Melanosoms eine wichtige Rolle zu spielen, der bei hellen Haaren eher im saueren Milieu, bei

dunklen im neutralen Bereich liegt.

- 59 -


5.2.2 SOX 9-Expression und Haarergrauen

Ein Vergleich der SOX 9-Expression von Nicht-Grauhaarigen im Vergleich zu Grauhaarigen

zeigte eine signifikant niedrigere Expression von SOX 9 bei Grauhaarigen. Hierbei fällt ein

tendenzieller Abfall der SOX 9-Expression von Hellhaarigen zu Dunkelhaarigen und weiter

zu Grauhaarigen auf, wobei ersterer im Einzelvergleich der Gruppen zueinander signifikant

ist, zweiterer nicht.

SOX 9 ist nicht nur in der äußeren Haarwurzelscheide nachweisbar, sondern hat auch

wesentlichen Einfluss auf die Melanogenese (Harris et al., 2010). Die Expression von SOX 9

steigt mit der Differenzierung vom Melanoblasten zum Melanozyten an, wohingegen

diejenige von SOX 10 abnimmt. Nach UV-Exposition steigt die Expression von SOX 9 in

Melanozyten an und aktiviert über Mitf, Dct und Tyr die Melaninproduktion (Passeron et al.,

2007). Somit könnte SOX 9 indirekt über seine aktivierende Regulation auf die Melanozyten

und die Melaninsynthese Einfluss auf den Grad der Pigmentierung von Haaren nehmen,

wobei jedoch derzeit keine Daten von SOX 9 zum Agingprozess des Haares und seiner

Pigmentierung vorliegen.

Bislang aus mehreren Studien bekannt ist die Tatsache, dass mit abnehmender

Haarpigmentierung auch die Anzahl der Melanozyten abnimmt (Tobin D. J., 2009; Commo et

al., 2004). Tobin (2009) spricht davon, dass graue Haare weniger, weiße sogar gar keine

Melanozyten enthalten. Commo et al. (2004) berichten von nur wenigen im Bulbus

vorhandenen Melanozyten bei grauhaarigen Probanden, die aber noch in der Lage sind,

Tyrosinase und Trp 1 und somit Melanin zu produzieren. Im Unterschied dazu sind bei

weißen Haaren im Bulbus keine Melanozyten mehr auffindbar. Zudem besitzt pigmentiertes

Haar ruhende Melanozyten in der äußeren Wurzelscheide. Dieselben inaktiven, nicht-

Melanin-produzierenden Melanozyten finden sich auch bei Grau- bzw. Weißhaarigen, jedoch

in niedrigerer Anzahl (Horikawa et al., 1996; Takada et al., 1992). Andere wissenschaftliche

Arbeiten gehen von Funktionseinbußen der Melanozyten als Grund des Haarergrauens aus,

anstatt oder zusätzlich zu ihrem zahlenmäßigen Untergang. Vermutlich als Folge einer

eingeschränkten Tyrosinaseaktivität zeigte graues Haar eine Abnahme der Menge an

Melaninkörnchen (Sato et al., 1973; Lloyd et al., 1987). Tobin und Paus (2001) machen neben

einer verringerten Tyrosinasefunktion, suboptimale Melanozyten-Kortexkeratinozyten-

- 60 -


Interaktionen und eine fehlerhafte Migration der Melanozyten vom Reservoir in die obere

äußere Wurzelscheide für Pigmentverdünnung und Haarergrauen verantwortlich. Es ist

denkbar, dass solche funktionseingeschränkten Melanozyten ein anderes Färbeverhalten

aufweisen als normal funktionsfähige und wir deshalb bei ergrauten Haaren weniger SOX 9-

Posivität feststellten.

Darüber hinaus scheinen Melanozytenvorstufen mit zunehmendem Ergrauen der Haare an

Zahl abzunehmen. Mit zunehmendem Alter kommt es zu stressinduzierten Veränderungen der

pigmentproduzierenden, reparierenden und antioxidativ wirksamen Enzyme, Co- und

Wachstumsfaktoren, wie Bcl 2 und die c-Kit. Der oxidative Stress führt zu Schädigung und

zum Zusammenbrechen der Redoxkapazitäten der Haarfollikelmelanozyten und so kommt es

folglich mit sinkender Haarpigmentation zur Reduktion der Melanozytenstammzellen (MSZ)

im Wulst der äußeren Wurzelscheide (Arck et al., 2006). Das Fehlen von frisch

differenzierten Melanozyten, die in den Haarbulbus einwandern können, ist Folge dieses

Stammzellenmangels (Steingrímsson et al., 2005). In Anlehnung an Stammzellen anderer

Gewebe wird vermutet, dass die Melanozytenstammzellen im Alter zwar teilweise noch

vorhanden sind, jedoch veränderte Eigenschaften besitzen (Commo et al., 2004).

SOX 9 spielt eine Schlüsselrolle bei der Erhaltung von Melanozytenstammzellen (MSZ) und

Melanozytenvorläuferzellen (Cook et al., 2005; Vidal et al., 2005) und ist essentiell für deren

Differenzierung (Nowak et al., 2008). So lässt sich die hier gezeigte reduzierte SOX 9-

Expression bei grauhaarigen Probanden auch auf eine herabgesetzte Anzahl von

Melanozytenstammzellen bei grauen Haaren zurückführen, was als eine Ursachen

menschlichen Haarergrauens gilt (Nishimura E. K., 2011).

Im „ergrauenden Mausmodel“ zeigte sich mit jedem Haarzyklus eine graduelle Abnahme der

Melanozytenstammzellen. Dieses Verhalten fand sich auch beim Menschen. Hier wurden

mehr Melanoblasten in den Bulbi der pigmentierten Follikel als in denen der ergrauten

gefunden. Daraus lässt sich folgern, dass Haarergrauen einen Defekt in der

Melanozytenstammzellerhaltung beinhaltet und in einem mit dem Alter voranschreitenden

stufenweisen Verlust der pigmentierten Tochterzellen resultiert (Nishimura et al., 2005;

Vachtenheim and Novotná, 1999). Wichtig für das Überleben der Melanozytenvorstufen und

MSZ sind neben SOX 9 der Notch-Signalweg (Moriyama et al., 2006; Schouwey et al., 2006),

sowie die Faktoren Mitf und Bcl 2. Letztere zwei sorgen für eine Abnahme der MSZ (Veis et

al., 1993; Nishimura et al., 2005).

- 61 -


5.2.3 SOX 9-Expression und altersbedingte Alopezie

Neben Haarergrauen ist Haarausfall (Alopezie) eines der Kennzeichen menschlichen Alterns.

Studien zeigen, dass mit zunehmendem Alter die Kopfhaardichte abnimmt. Bezogen auf den

Wachstumszyklus des Haares bedeutet dies eine verkürzte Anagenphase und eine längere

Telogenphase. Die normalerweise auf der Kopfhaut vorherrschenden Terminalhaare werden

lokal durch feines Vellushaar ersetzt. Eine wichtige Rolle dabei spielt die graduelle Abnahme

von Haarfollikelstammzellen (Leirós et al., 2012; Al-Refu K., 2012). Bei Männern zeigt sich

hauptsächlich androgenbedingter Haarausfall, der vor allem genetisch bedingt ist. Im

Gegensatz dazu scheinen bei Frauen eher Umwelteinflüsse eine Rolle für das Entwickeln der

Alopezie zu spielen (Messenger A. G., 2011).

Im hier untersuchten Klientel waren acht Probanden mit Alopezie. Bei diesen war keine

signifikante Abnahme in der SOX 9-Expression feststellbar. Zufälligerweise handelte es sich

ausschließlich um Frauen, sodass eine Interpretation dieser sowieso schon niedrigen Anzahl

an Probanden nur unter größtem Vorbehalt zu sehen ist.

5.2.4 SOX 9-Expression in Abhängigkeit vom Alter

Obwohl keine signifikanten SOX 9-Expressionsunterschiede beim Vergleich von Probanden

mit und ohne Alopezie gefunden wurden, wäre eine Abnahme der SOX 9-Expression mit

zunehmendem Alter ein Kriterium für androgenetische Alopezie und Canities. Eine

Unterteilung unserer Probanden in vier Altersgruppen und deren Vergleich erbrachte keine

konkreten signifikanten Expressionsunterschiede von SOX 9, zeigte aber einen absteigenden

Trend der SOX 9-Expression mit zunehmendem Alter.

5.2.5 Geschlechtsabhängigkeit der SOX 9-Expression

Ein Geschlechtsvergleich der SOX 9-Expression durch alle Altersgruppen zeigte im

vorliegenden Klientel keinerlei Unterschiede.

- 62 -


Geschlechtsspezifische Untersuchungen bezüglich Haarergrauens zeigten ebenfalls keine

Unterscheide zwischen Männern und Frauen die Ausprägung oder das Alter, in dem

Haarergrauen auftritt betreffend (Trueb R. M., 2005; Lapeere et al., 2008; Keogh and Walsh,

1965; Cline D. J., 1988). Jo et al. (2011) zeigen geschlechtsspezifisch lediglich eine

Verschiedenheit in der Verteilung der ergrauenden Haare. So beginnt das Ergrauen bei Frauen

vor allem frontal, während Männer temporal und occipital zuerst ergrauen.

5.3 Methodische Schwächen

5.3.1 Einschränkungen bei den Färbeergebnissen

Von den verwendeten Antikörpern gelangen die Färbungen nur mit dem Antikörper SOX 9,

sodass sich sämtliche Ergebnisse dieser Arbeit auf mittels SOX 9-Antikörper angefärbte

Zellen des Haares beziehen. Doch warum haben die Färbungen mit SOX 10-, PAX 3- und

CLIM 2-Antikörpern nicht funktioniert? Für das Misslingen der Färbungen mit den übrigen,

oben genannten Antikörpern kommen mehrere Ursachen in Frage.

Konservierung

Eine Überlegung bezüglich der misslungenen Färbungen mit den anderen Antikörpern bezieht

sich auf die Dauer und Art der Konservierung. Die Idee dabei ist, dass zum einen durch eine

jahrelange Konservierung in Paraffin ein Teil der Gewebeeigenschaften verloren geht.

Zum anderen ist möglicherweise die Paraffinart nicht kompatibel zur Färbemethode und den

ausgewählten Antikörpern. In einigen Studien werden die Untersuchungen anstelle von

Paraffin- an Gefrierschnitten durchgeführt. In diesem Fall kommt es sofort nach Entnahme

aus der Körperregion zum Einsatz flüssigen Stickstoffs (Arck et al., 2006; Moriyama et al.,

2006). An diesen Arbeiten konnten wir uns aufgrund der grundsätzlich anderen Methodik

nicht orientieren.

Demaskierung

Eine weitere Ursache für das Misslingen der Färbungen ist, dass wir aufgrund der

verwendeten Demaskierungsmethoden keine spezifischen Ergebnisse erzielen konnten. So

war entweder zu viel Backgroundfärbung zu sehen oder es war nichts angefärbt, zum Beispiel

- 63 -


weil spezifische Antigenstrukturen nicht freigelegt wurden und die Antikörper somit nicht an

ihre Zielstruktur andocken konnten. Ein längeres Vorkochen beispielsweise hatte jedoch zur

Folge, dass die Präparate verkocht und für weitere Färbungen nicht verwertbar waren.

Antikörper

Möglicherweise waren die eingesetzten Primär- oder Sekundärantikörperkonzentrationen

nicht richtig gewählt, was zu einer zu hohen Hintergrundfärbung führen kann.

Gehen wir davon aus, dass es sich bei den SOX 9-positiven Zellen um weit differenzierte

Zellen der Melanozytenzellreihe handeln könnte, ist eine mögliche Erklärung für das

Nichtanfärben mittels SOX 10-Antikörper, dass es mit zunehmender

Melanozytendifferenzierung zu steigendem SOX 9- und gleichzeitig abfallendem SOX 10-

Gehalt kommt (Cook et al., 2005; Gershon et al., 2005).

5.3.2 Einschränkungen bei der Ergebnisinterpretation

Subjektivität der Haarfarbe

Die Gruppenzugehörigkeit einzelner Probanden war zum Teil nicht eindeutig beurteilbar,

insbesondere bei den telefonisch nach ihrer Haarfarbe befragten Probanden, welche ca. die

Hälfte des Kollektivs ausmachen. Die Haarfarbe könnte dabei subjektiv eingeschätzt werden

und es würde beispielsweise der dunkelblonde Proband in die Gruppe „braun“ gelangen. Ein

ähnliches Problem ergibt sich auch bei der Einschätzung des Grauanteils. Hat der Proband nur

vereinzelt graue Haare oder ist schon die Hälfte oder mehr ergraut? Oder kennt der Proband

womöglich das Ausmaß des eigenen Ergrauens gar nicht, weil er sich schon seit Jahren die

Haare färbt?

Desweiteren taucht die Problematik der „grauen Haare“ auf. Diese sind nicht ausnahmslos

grau, sondern oft „meliert“, das heißt der Proband hat gleichzeitig neben grauen und weißen

Haaren auch Haare seiner Ursprungshaarfarbe. Da bei der Auswertung der histologischen

Präparate pro Proband die sechs Haare mit den meisten SOX 9-positiven Zellen ausgewählt

- 64 -


wurden, ist davon auszugehen, dass diese, auch bei Probanden, die größtenteils graue

beziehungsweise weiße Haare besitzen, eher die pigmentierten als die grauen waren. So

lassen sich auch die Ergebnisse der Minima und Maxima erklären. Die Maxima erreichen bei

allen drei Gruppen annähernd dieselben Werte, da, wie eben erörtert, auch pigmentierte Haare

in die Auswertung einbezogen wurden. Die Minima hingegen unterscheiden sich deutlich. Da

vermutlich hier tatsächlich auch graue und weiße Haare erfasst sind, kommen Haare mit

ausschließlich negativem Färbeergebnis, sprich ohne SOX 9-positive Zellen, in die

Berechnungen mit hinein und es ergeben sich Werte von annähernd Null als Minima.

Statistik

Die relativ hohen Standardabweichungen sprechen dafür, dass bei den einzelnen Probanden

von Haar zu Haar hohe Schwankungen der SOX 9-positiven Zellzahlen vorkommen

(Vgl. Kapitel 4. Ergebnisse). In der vorliegenden Arbeit müssen einige Einschränkungen bei

den Aussagen der Ergebnisse gemacht werden. Zum einen ist die Anzahl der Probanden mit

n = 79 relativ gering, was die Wahrscheinlichkeit für statistische Fehler 1. oder 2. Art erhöht.

Zum anderen wären Färbungen mit mehreren Antikörpern anstatt nur mit einem

aussagekräftiger gewesen. Größere Datensammlungen, sowie weitere

Antikörperetablierungsversuche und -testreihen hätten allerdings den Rahmen der

Doktorarbeit gesprengt.

- 65 -


5.4 Ausblick

In der vorliegenden Arbeit wurde die SOX 9-Expression in Probandengruppen verschiedener

Haarfarben, sowie von Gruppen nach dem Vorhandensein von Haarergrauen oder Alopezie

eingeteilt und verglichen.

Aufgrund des relativ kleinen Probandenkollektivs sind einige Aussagen leider wenig

repräsentativ. Beispielsweise sind lediglich acht Probanden mit Alopezie in die Studie

eingeschlossen, welche auch noch zufällig alle weiblichen Geschlechts sind. Auch bei der

Einteilung in die detaillierteren Haarfarbengruppen ergeben sich geringe Probandenzahlen.

Neben einem größeren Probandenpool sollten zukünftige Studien zu diesem Thema

objektivere Methoden zur Haarfarbeneinstufung und Einteilung in die Gruppen verwenden.

Wo liegt beispielsweise die Grenze zwischen blond und dunkelblond oder ab welchem Anteil

grauer Haare zählt der Proband zu den Grauhaarigen?

Es gibt bislang wenige Publikationen, die sich mit den Unterschieden zwischen den

verschiedenen Haarfarben auf der Ebene der Stammzellmarker beschäftigen. Hierfür wäre

neben SOX 9 der zuverlässige Einsatz anderer Stammzellfaktoren hilfreich, sei es in

immunhistochemischen Färbungen oder anderen experimentellen Methoden.

- 66 -


6. Zusammenfassung

Die Haare gehören mit ihrer vielfältigen Farbigkeit, Form und vielseitigen Gestaltbarkeit zu

den wichtigsten äußeren Erkennungsmerkmalen der Menschen. Im Alter kommt es

zunehmend zu Haarergrauen, sowie vornehmlich bei Männern auch zu Haarverlust. Schon

seit Jahrzehnten interessiert sich die Forschung für Faktoren, welche die verschiedenen

Haarfarben und den Prozess des Haarergrauens und –verlusts beeinflussen.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, anhand immunhistochemischer Färbungen an

Kopfhautpräparaten den Einfluss von Stammzellmarkern auf die Entstehung der Haarfarbe,

sowie bei den Prozessen des Haarergrauens und Haarverlusts herauszufinden. Basierend auf

Literaturrecherche zu diesen drei Themen suchten wir Stammzellmarker heraus, die sich für

immunhistochemische Färbungen eigneten und deren zugehörige Antikörper käuflich zu

erwerben waren. Die Auswahl führte zu den Faktoren SOX 9, SOX 10, PAX 3 und CLIM 2.

Die Selektion der 79 in die Studie eingeschlossenen Probanden erfolgte anhand bereits

vorhandener Schnittpräparate. Aus dem Archiv der dermatologischen Universitätsklinik

Freiburg wurden der Kopfhaut entstammende Präparate aus einem bestimmten Zeitraum

herausgesucht. Voraussetzung war, dass mehrere Haarfollikel möglichst tangential zu deren

Verlaufsrichtung im histologischen Präparat getroffen waren. Informationen wie Haarfarbe

und Vorhandensein einer Alopezie wurden aus der Photodokumentation übernommen oder

telefonisch bei den Probanden erfragt.

Während einer Etablierungsphase immunhistochemischer Färbemethoden mit den SOX 9-,

SOX 10-, PAX 3- und CLIM 2-Antikörpern wurden verschiedene Konzentrationen der

Primär- und Sekundärantikörper, sowie unterschiedliche Demaskierungsverfahren

ausprobiert. Lediglich die Färbungen mit SOX 9-Antikörpern ergaben reproduzierbare und

spezifische Resultate, sodass sämtliche weiteren Färbungen dieser Arbeit nur mit SOX 9-

Antikörpern durchgeführt wurden.

Beim Vergleich der unterschiedlichen, nach Haarfarbe und –dichte eingeteilten Gruppen

bezüglich ihrer SOX 9-Expression zeigten hellhaarige Probanden signifikant höhere Zahlen

SOX 9-positiver Zellen im Vergleich zu dunkel- und grauhaarigen. Auch wiesen nicht-

Grauhaarige eine signifikant höhere SOX 9-Positivität als Grauhaarige auf. Zwar zeigt sich

mit zunehmendem Alter eine Tendenz zur sinkenden SOX 9-Expression, statistisch war diese

jedoch nicht von Signifikanz. Zudem schien die SOX 9-Expression unabhängig von

Geschlecht und Haarausfall zu sein. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit können die

wichtige Rolle von SOX 9 in Bezug auf Haarfarbe und Haarergrauen somit bestätigen.

- 67 -


7. Literaturverzeichnis

A

Al-Refu K. (2012) Stem Cell and Alopecia: A Review to Pathogenesis. Br J Dermatol. j.

1365-2133

Arck P. C., Overall R., Spatz K., Liezman C., Handjiski B., Klapp B. F., Birch-Machin M. A.,

Peters E. M. J. (2006) Towards a “free radical theory of graying”: melanocyte apoptosis in the

aging human hair follicle is an indicator of oxidative stress induced tissue damage. The

FASEB Journal 20: 908-920

Aubin-Houzelstein G., Djian-Zaouche J., Panthier J. J. (2008) Melanocyte stem cells in

adults. J Soc Biol. 202(1): 25-32

B

Barsh G. S. (1996) The genetics of pigmentation: From fancy genes to complex traits. Trends

in Genetics 12: 299-305

Bennett D. C., Lamoreux M. L. (2003) The color loci of mice – a genetic century. Pigment

Cell Res. 16: 333-344

Boenisch T., Farmilo A. J., Stead R. H., Key M., Welcher R., Harvey R., Atwood K. N.,

Tscherkassy M., Henne C. (2003) Immunchemische Färbemethoden, Handbuch, 3. Aufl.

DakoCytomation Corp. Carpinteria, CA, USA

Botchkareva N. V., Botchkarev V. A., Gilchrest B. A. (2003) Fate of melanocytes during

development of the hair follicle pigmentary unit. J Invest Dermatol Symp Proc 8: 76-79

Botchkareva N. V., Khlgatian M., Longley B. J., Botchkarev V. A., Gilchrest B. A. (2001)

SCF/c-kit signaling is required for cyclic regeneration of the hair pigmentation unit. The

FASEB Journal 15: 645-658

Braun-Falco O., Plewig G., Wolff H. H., Burgdorf W. H. C., Landthaler M. (2005)

Dermatologie und Venerologie, 5. Aufl. Springer, Heidelberg

- 68 -


C

Chang S., Multani A. S., Cabrera N. G., Naylor M. L., Laud P., Lombard D., et al. (2004)

Essential role of limiting telomeres in the pathogenesis of Werner syndrome. Nature Genetics

36: 877-882

Cheung M., Chaboissier M. C., Mynett A., Hirst E., Schedl A., Briscoe J. (2005) The

transcriptional control of trunk neural crest induction, survival, and delamination. Dev Cell 8:

179-192

Cline D. J. (1988) Changes in hair color. Dermatol Clin, 6: 295-303

Commo S., Gaillard O., Bernard B. A. (2004) Human hair graying is linked to a specific

depletion of hair follicle melanocytes affecting both the bulb and the outer root sheath. Fr J

Dermatol 150(3): 435-443

Cook A. L., Smith A. G., Smit D. J., Leonard J. H., Sturm R. A. (2005) Co-expression of

SOX 9 and SOX 10 during melanocytic differentiation in vitro. Exp Cell Res 308(1): 222-235

F

Ferletta M., Uhrbom L., Olofsson T., Pontén F., Westermark B. (2007) Sox 10 has a broad

expression pattern in gliomas and enhances platelet-derived growth factor-B-induced

gliomagenesis. Mol Cancer Res 5(9): 891-897

Fuchs E. (2009) The Tortoise and the Hair: Slow-Cycling Cells in the Stem Cell Race. Cell

137: 811-819

G

Gershon T. R., Oppenheimer O., Chin S. S., Gerald W.L. (2005) Temporally Regulated

Neural Crest Transcription Factors Distinguish Neuroectodermal Tumors of Varying

Malignancy and Differentiation. Neoplasia 7(6): 575-584

Goethe J. W. (1827) Gedichte (Ausgabe letzter Hand. 1827), Weissagungen der Bakis, 22.

Bd. 1-4: Gedichte, Cotta, Stuttgart und Tübingen

- 69 -


H

Han J., Kraft P., Nan H., Guo Q., Chen C., Qureshi A., Hankinson S. E., Hu F. B., Duffy D.

L., Zhao Z. Z., Martin N. G., Montgomery G. W., Hayward N. K, Thomas G., Hoover R. N.,

Chanock S., Hunter D. J. (2008) A Genome-Wide Association Study Identifies Novel Alleles

Associated with Hair Color and Skin Pigmentation. PLoS Genet 4(5): e1000074

Harris M. L., Baxter L. L., Loftus S. K., Pavan W. J. (2010) Sox proteins in melanocyte

development and melanoma. Pigment Cell Melanoma Res. 23(4): 496-513

Horikawa T., Norris D. A., Johnson T. W. et al. (1996) DOPA-negative melanocytes in the

outer root sheath of human hair follicles express premelanosomal antigens but not a

melanosomal antigen or the melanosome-associated glycoproteins tyrosinase, TRP-1 and

TRP-2. J Invest Dermatol 106: 28-35

Hwang K. C., Cho S. K., Lee S. H., Park J. Y., Kwon D. N., Choi Y. J., Park C., Kim J. H.,

Park K. K., Hwang S., Park S. B., Kim J. H. (2009) Depigmentation of skin and hair color in

the somatic cell cloned pig. Dev Dyn 238(7): 1701-8

I

Ito S., Wakamatsu K. (2010) Human hair melanins: what we have learned and have not

learned from mouse coat color pigmentation. Pigment Cell Melanoma Res. 24(1): 63-74

Ito S., Wakamatsu K. (2011) Diversity of human hair pigmentation as studied by chemical

analysis of eumelanin and pheomelanin. JEADV 25: 1369-1380.

J

Jo S. J., Paik S. H., Choi J. W., Lee J. H., Cho S., Kim K. H., Eun H. C., Kwon O. S. (2011)

Hair Graying Pattern Depends on Gender, Onset Age and Smoking Habits, Acta Derm

Venereol 92: 160-161

Johnson R., Jackson I. J. (1992) Light is a dominant mouse mutation resulting in premature

cell death. Nature Genetics 1: 226-229

Junqueira L. C., Carneiro J. (1991) Histologie, 3. Aufl., Springer, Berlin

- 70 -


K

Kaplan P. D., Polefka T., Grove G., Daly S., Jumbelic L., Harper D., Nori M., Evans T.,

Ramaprasad R., Bianchini R. (2011) Grey hair: clinical investigation into changes in hair

fibres with loss of pigmentation in a photoprotected population. International Journal of

Cosmetic Science 33: 171-182

Keogh E. V., Walsh R. J. (1965) Rate of greying of human hair. Nature 207: 877-878

Kordes U., Hagel C. (2006) Expression of SOX9 and SOX10 in central neuroepithelial tumor.

J Neurooncol 80: 151-155

Krahl D., Sellheyer K. (2010 a) Sox9, more than a marker of the outer root sheath:

spatiotemporal expression pattern during human cutaneous embryogenesis. J Cutan Pathol 27:

350-356

Kumano K., Masuda S., Sata M., Saito T., Lee S.Y., Sakata-Yanagimoto M., Tomita T.,

Iwatsubo T., Natsugari H., Kurokawa M., Ogawa S., Chiba S. (2008) Both Notch1 and

Notch2 contribute to the regulation of melanocyte homeostasis. Pigment Cell Melanoma Res.

21 (1): 70-78

L

Lang D., Lu M. M., Huang L., Engleka K. A., Zhang M., Chu E. Y., Lipner S., Skoultchi A.,

Millar S. E., Epstein J. A. (2005) Pax3 functions at a nodal point in melanocyte stem cell

differentiation. Nature 433: 884-887

Lapeere H., Boone B., Schepper S. D., Verhaeghe E. (2008) Hypomelanoses and

hypermelanoses. Fitzpatrick’s dermatology in general medicine, 7th Edition McGraw-Hill

(622-640), New York City

Leirós G. J., Attorresi A. I., Balan͂á M. E. (2012) Hair follicle stam cell differentiation is

inhibited through cross-talk between Wnt/β-catenin and androgen signaling in dermal papilla

cells from patients with androgenetic alopecia. Br J Dermatol 166 (5): 1035-42

- 71 -


Lloyd T., Garry F. L., Manders E. K. et al. (1987) The effect of age and hair colour on human

hair bulb tyrosinase activity. Br J Dermatol 116: 485-489

M

Messenger A. G. (2011) Hair through the female life cycle. Br Jour Dermatol 165(3): 2-6

Millar S. E., Miller M. W., Stevens M. E., Barsh G. S. (1995) Expression and transgenic

studies of the mouse agouti gene provide insight into the mechanisms by which mammalian

coat color patterns are generated. Development 121: 3223–3232

Moriyama M., Osawa M., Mak S. S., Ohtsuka T., Yamamoto N., Han H., Delmas V.,

Kageyama R., Beermann F., Larue L., Nishikawa S. I. (2006) Notch signaling via Hes1

transcription factor maintains survival of melanoblasts and melanocyte stem cells. The

Journal of Cell Biology 173(3): 333–339

Mosley J.G., Gibbs A.C. (1996) Premature grey hair and hair loss among smokers. A new

opportunity for health education? BMJ 313: 1616

N

Nishimura E. K. (2011) Melanocyte stem cells: a melanocyte reservoir in hair follicles for

hair and skin pigmentation. Pigment Cell Melanoma Re 24: 401-410

Nishimura E. K., Suzuki M., Igras V., Du J., Lonning S., Miyachi Y., Roes J., Beermann F.,

Fisher D. E. (2010) Key roles for transforming growth factor beta in melanocyte stemm cell

maintenance. Cell Stem Cell 6(2): 130-140

Nishimura E. K., Granter S. R., Fisher D. E. (2005) Mechanism of Hair Graying: Incomplete

Melanocyte Stem Cell Maintenance in the Niche. Science 307: 720-723

Nowak J. A., Polak L., Pasolli H. A., Fuchs E. (2008) Hair Follicle Stem Cells are Specified

and Function in Early Skin Morphogenesis. Cell Stemm Cell 3(1): 33-43

- 72 -


O

Oshima H., Rochat A., Kedzia C., Kobayashi K., Barrandon Y. (2001) Morphogenesis and

renewal of hair follicles from adult multipotent stem cells. Cell 104: 233-245

P

Parker C. J, Shawcross S. G., Li H., Wang Q. Y., Herrington C.S., Kumar S., MacKie R. M.,

Prime W., Rennie I. G., Sisley K., Kumar P. (2004) Expression of PAX3 alternatively spliced

transcripts and identification of two new isoforms in human tumors of neural crest origin. Int

J Cancer 108: 314-320

Passeron T., Valencia J. C., Bertolotto C., Hoashi T., Le Pape E., Takahashi K., Ballotti R.,

Hearing V. J. (2007) Sox9 is a key player in ultraviolet B-induced melanocyte differentiation

and pigmentation. Proc Natl Acad Sci USA 104(35): 13984-9

Paus R., Cotsarelis G. (1999) The biology of hair follicles. N Engl J Med 341: 491-497

Pingault V., Ente D., Dastot-Le Moal F., Goossens M., Marlin S., Bondurand N. (2010)

Review and update of mutations causing Waardenburg syndrome. Hum Mutat 31(4): 391-406

Prince S., Illing N., Kidson S. H. (2001) SV-40 large T antigen reversibly inhibits expression

of tyrosinase, TRP-1, TRP-2 and Mitf, but not Pax-3, in conditionally immortalized mouse

melanocytes. Cell Biol Int 25(1): 91-102

R

Rando T. A. (2006) Stem cells, ageing and the quest for immortality. Nature 441: 1080-1086

Rudolph K. L., Chang S., Lee H. W., Blasco M., Gottlieb G. J., Greider C., et al. (1999)

Longevity, stress response, and cancer in aging telomerase-deficient mice. Cell 96: 701-712

S

Sarin K. Y., Artandi S. E. (2007) Aging, Graying and Loss of Melanocyte Stem Cells. Stem

Cell Rev 3(3): 212-217

- 73 -


Sato K, Kukita A., Jimbow K. (1973) Electron microscopic studies of dendritic cells in the

human grey and white hair matrix during anagen. Pigment Cell 1: 20-26

Schneider M. R., Schmidt-Ullrich R., Paus R. (2009) The Hair Follicle as a Dynamic

Miniorgan. Current Biology 19: 132-142

Schouwey K., Delmas V., Larue L., Zimber-Strobl U., Strobl L. J., Radtke F., Beermann F.

(2006) Notch1 and Notch2 receptors influence progressive hair graying in a dose-dependent

manner. Dev Dyn 236(1): 282-289

Schumacher M., Schulgen G. (2008) Methodik klinischer Studien, 3. Aufl., Springer, Berlin,

Heidelberg

Sharpless N. E., De Pinho R. A. (2004) Telomeres, stem cells, senescence and cancer. J Clin

Invest. 113(2): 160-8

Smit D. J., Smith A. G., Parsons P. G., Muscat G. E. O., Sturm R. A. (2000) Domains of Brn-

2 that mediate homodimerization and interaction with general and melanocytic transcription

factors. Eur J Biochem 267: 6413-6422

Steingrímsson E., Copeland N. G., Jenkins N. A. (2005) Melanocyte Stem Cell Maintenance

and Hair Graying. Cell 121: 9-12

Stenn K. S., Paus R. (2001) Controls of hair follicle cycling. Physiol Rev 81: 449-494

Stolt C. C., Lommes P., Sock E., Chaboissier M. C., Schedl A., Wegner M. (2003) The Sox9

transcription factor determines glial fate choice in the developing spinal cord. Genes Dev 17:

1677-1689

Sturm R. A. (2009) Molecular genetics of human pigmentation diversity. Hum Mol Genet

18(1): R9-R17

- 74 -


Sugihara T. M., Bach I., Kioussi C., Rosenfeld M. G., Andersen B. (1998) Mouse deformed

epidermal autoregulatory factor 1 recruits a LIM domain factor, LMO-4, and CLIM

coregulators. Proc Natl Acad Sci USA 95: 15418-15423

T

Takada K., Sugiyama K., Yamamoto I. et al. (1992) Presence of quiescent melanocytes within

the outer root sheath in senile white hair. J Invest Dermatol 99: 629-633

Tobin D. J. (2011) The cell biology of human hair follicle pigmentation. Pigment Cell

Melanoma Res. 24 (1): 75-88

Tobin D. J. (2009) Aging of the Hair Follicle Pigmentation System. Int J Trichology 1(2): 83-

93

Tobin D. J. (2008) Human hair pigmentation – biological aspects. International Journal of

Cosmetic Science 30: 233-257

Tobin D.J., Bystryn J. C. (1996) Different populations of melanocytes are present in hair

follicles and epidermis. Pigment Cell Research 9: 304-310

Tobin D. J., Paus R. (2001) Graying: gerontobiology of the hair follicle pigmentary unit. Exp

Gerontol 36(1): 29-54

Trueb R. M., (2005) Aging of hair. J Cosmet Dermatol 4: 60-72

V

Vachtenheim J., Novotná H. (1999) Expression of genes for microphthalmia isoforms, Pax3

and MSG1, in human melanomas. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand) 45(7): 1075-1082

Van Zant G., Liang Y. (2003) The role of stem cells in aging. Experimental Hematology 31:

659-672

- 75 -


Veis D. J., Sorenson C. M., Shutter J. R., Korsmeyer S. J. (1993) Bcl-2-deficient mice

demonstrate fulminant lymphoid apoptosis, polycystic kidneys, and hypopigmented hair. Cell

75(2): 229-240

Vidal V. P. I., Chaboissier M. C., Lützkendorf S., Cotsarelis G., Mill P., Hui C. C., Ortonne

N., Ortonne J. P., Schedl A. (2005) Sox9 Is Essential for Outer Root Sheath Differentiation

and the Formation of the Hair Stem Cell Compartment. Current Biology 15: 1340-1351

Vidal V. P. I., Ortonne N., Schedl A. (2008) SOX9 expression is a general marker of vasal

cell carcinoma and adnexal-related neoplasms. J Cutan Pathol 15: 373-379

W

Wagner R., Joekes I. (2007) Hair medulla morphology and mechanical properties. J Cosmet

Sci. 58(4): 359-368

Wu X., Shen Q. T., Oristian D. S., Lu C.P., Zheng Q., Wang H. W., Fuchs E. (2011) Skin

Stem Cells Orchestrate Directional Migration by Regulating Microtubule-ACF7 Connections

through GSK3β. Cell 144 (3): 341-352

X

Xu S., Mannik J., Kudryavtseva E., Lin K. K., Flanagan L. A., Spencer J., Soto A., Wang N.,

Lu Z., Yu Z., Monuki E. S., Andersen B. (2007) Co-factors of LIM domains (Clims/Ldb/Nli)

regulate corneal homeostasis and maintenance of hair follicle stem cells. Developmental

Biology 312: 484-500

Y

Yokoyama S., Takeda K., Shibahara S. (2006) SOX10, in combination with Sp1, regulates the

endothelin receptor type B gene in human melanocyte lineage cells. FEBS Journal 273: 1805-

1820

- 76 -


An dieser Stelle ist im Original die Danksagung.

- 77 -


An dieser Stelle ist im Original der Lebenslauf.

- 78 -


10. Anhang

Abkürzungen

Abb.

AB

ACTH

AP

Aqua dest.

ASIP

CLIM

Dct

HE

HMG

LIM

m

Mitf

Mitf vit

MB

MC1R

MSH

MSZ

MZ

s

PAX

SD

SOX

SRY

TNF α

Trp

vgl.

VK

w

Abbildung

Antibody

Adrenocorticotropes Hormon

Alkaline Phophatase

Aqua destillata

agouti-signaling protein

Co-Faktor von LIM-Domänen

Dopachrom-Tautomerase

Hämatoxylin-Eosin

high-mobility group

Lin11, Isl-1 und Mec-3

männlich

Mikrophthalmie-assoziierter Transkriptionsfaktor

Mitf vitiligo

Melanoblasten

Melanocortin-1-Rezeptor

Melanozyten-stimulierendes Hormon

Melanozytenstammzellen

Melanozyten

siehe

Paired-box

Standardabweichung

SRY-type HMG box

sex-determining region on Y chromosome

Tumornekrosefaktor α

Tyrosinase-related protein

vergleiche

Variationskoeffizienten

weiblich

- 79 -

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