Untersuchungen zur Wechselwirkung zwischen dem C ... - FreiDok

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Untersuchungen zur Wechselwirkung zwischen dem C ... - FreiDok

Aus dem Institut für Experimentelle und Klinische Pharmakologie und Toxikologie

der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau

Untersuchungen zur Wechselwirkung zwischen dem

C. difficile-Toxin CDT und seinem zugehörigen Zellrezeptor

LSR an Plasmamembranen

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des medizinischen Doktorgrades

der Medizinischen Fakultät

der Albert-Ludwigs-Universität

Freiburg i. Br.

Vorgelegt 2013

von Daniel Hornuß

geboren in Waldkirch


Dekan: Prof. Dr. Dr. h.c. mult. Hubert Blum

1. Gutachter: Prof. Dr. Dr. Klaus Aktories

2. Gutachter: Prof. Dr. Matthias Müller

Jahr der Promotion 2014


Ein wesentlicher Teil dieser Arbeit wurde in der folgenden Publikation veröffentlicht:

Papatheodorou, Panagiotis*; Hornuss, Daniel*; Nölke, Thilo; Hemmasi, Sarah;

Castonguay, Jan; Picchianti, Monica; Aktories, Klaus (2013): Clostridium difficile Binary

Toxin CDT Induces Clustering of the Lipolysis-Stimulated Lipoprotein Receptor into Lipid

rafts. In: MBio 4 (3): e00244-13. doi: 10.1128/mBio.00244-13.

* geteilte Erstautorenschaft


Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

A. Einleitung 1

1. Einleitung 1

1. Clostridien 2

2. Clostridium difficile 2

2. Bakterielle Toxine 4

1. Clostridiale Rho-glukosylierende Toxine 5

2. Das binäre Aktin-ADP-ribosylierende Toxin CDT 7

3. Lipolysis-stimulated-lipoprotein-receptor (LSR) 10

4. Endozytose 11

1. Clathrin-abhängige Endozytose 11

2. Clathrin-unabhängige Endozytose 12

5. Die Rolle von lipid rafts / detergent-resistant-membranes bei der Aufnahme 14

von Iota-ähnlichen Toxinen

6. Zielsetzung der Arbeit 15

B. Materialien 16

1. Verwendete Geräte 16

2. Verbrauchsmaterialien und Chemikalien 17

3. Kits 18

4. Externe Dienstleister 19

5. Internetdatenbanken und Programme 19

6. Plasmide 20

7. Oligonukleotide 20

8. Toxine 21


Inhaltsverzeichnis

9. Kultur-Medien 21

10. Prokaryote Zellen 22

11. Eukaryote Zellen 22

12. Radioaktiv markierte Substanzen 23

13. Antikörper 23

14. Enzyme 23

C. Methoden 25

1. Molekularbiologische Verfahren 25

1. PCR 25

2. Agarose-Gelelektrophorese 25

3. Extraktion von DNA aus Agarosegelen 26

4. DNA-Konzentrationsmessung 26

5. Insertion von PCR-Produkten mithilfe von Restriktionsendonukleasen 26

und Ligationsenzymen in Plasmide

6. Transformation in chemo-kompetenten E. coli 27

7. Plasmidisolation aus chemo-kompetenten E. coli 27

2. Proteinbiochemische Verfahren 28

1. Proteinexpression in Bacillus megaterium und Aufreinigung über Nickel-Beads 28

2. Proteinkonzentrationsmessung mittels Bradford 30

3. SDS Page 30

4. Western/Immuno-Blot 31

5. Nach-ADP-Ribosylierung in-vitro 33

6. In-vitro-Translation und Aufreinigung von extrazellulären Abschnitten 33

von LSR

7. Kopplung von CDTb an Tosyl-aktivierte Magnet-Beads 34

8. Präzipitation (Pull-Down-Assay) 35

3. Zellkultur 36

1. Kultivierung von Zellen 36

2. Vergiftungsversuche mit CDT 36


Inhaltsverzeichnis

3. Isolierung von detergent-resistant-membranes 37

4. Isolierung von lipid rafts mittels Sucrose-Gradienten 38

5. Durchflusszytometrie FACS 39

6. Immunohistochemische Färbung von Zellen und laser-scanning- 40

Konfokal-Mikroskopie

D. Ergebnisse 41

1. Akkumulation von LSR in Membran-Mikrodomänen nach Bindung von CDTb 41

2. Induktion der Akkumulation von LSR in detergent-resistant-membranes durch 43

CDTb

3. Bindung von Modul 4 von CDTb an LSR und Induktion der Akkumulation in lipid 46

rafts

4. Bindung von CDTb an die IG-Domäne von LSR 50

E. Diskussion 52

1. Induktion der Akkumulation von LSR in lipid rafts durch CDTb 53

2. Bindung von CDTb an Teile der extrazellulären IG-Domäne von LSR 55

3. Ausblick 55

Zusammenfassung 57

Literaturverzeichnis 58

Danksagung 69

Curriculum Vitae 71


Einleitung

A. Einleitung

“Clostridium difficile - More difficult than ever.” (New England Journal of

Medicine, 2008)

1. Einleitung

Nosokomiale Infektionen zählen heutzutage in den Industrienationen zu den häufigsten

Komplikationen, die Patienten im Rahmen eines Krankenhausaufenthaltes erleiden (Geffers

et al., 2008). Dabei rücken Infektionen mit dem Erreger Clostridium difficile immer

mehr in den Mittelpunkt. Dieser Keim verursacht bei antibiotisch-behandelten Patienten

schwere Diarrhoen und führt in einigen Fällen zu dem sehr bedrohlichen Krankheitsbild

der Pseudomembranösen Kolitis. Im Falle einer Infektion müssen die betroffenen Patienten

isoliert und umfassende Hygienemaßnahmen getätigt werden um eine Übertragung von

Patient zu Patient zu vermeiden. So wird geschätzt, dass in den USA jedes Jahr Kosten in

Höhe von umgerechnet 3 Milliarden Euro durch Clostridium difficile-Infektionen verursacht

werden (Kyne et al., 2002). Neuere Studien aus den USA haben gezeigt, dass die

Kosten zur Versorgung eines mit Clostridium difficile infizierten Patienten nahezu doppelt

so hoch liegen wie die Kosten zur Versorgung eines Patienten, der nicht mit Clostridium

difficile infiziert ist (Wang et al., 2011).

Seit einigen Jahren zeigt sich aber nicht nur eine stetige Zunahme der Infektionen mit C.

difficile, sondern auch eine deutlich erhöhte Schwere der durch die Infektion hervorgerufenen

Erkrankungen. Dies ist auch auf die zunehmende Verbreitung neuer hypervirulenter

Stämme in Nordamerika und Europa zurückzuführen (Kuijper et al., 2006). Die hypervirulenten

Stämme zeichnen sich unter anderem durch die Produktion eines zusätzlichen Toxins,

der Clostridium-difficile-Transferase (CDT), aus. Zwar konnte vor kurzem der Zelloberflächenrezeptor,

der die Aufnahme von CDT vermittelt, identifiziert werden, die näheren

Umstände zur Bindung des Toxins an den Rezeptor und die Aufnahme des Toxin-

Rezeptor-Komplexes blieben jedoch ungeklärt (Papatheodorou et al., 2011).

Ziel dieser Arbeit war es, diese Aspekte zu beleuchten und Hinweise auf das Geschehen

nach der Bindung des Toxins an den Rezeptor zu erhalten.

1


Einleitung

1.1. Clostridien

Clostridien sind grampositive Stäbchenbakterien und zählen zu den anaeroben Sporenbildnern.

Sie sind namensgebend für die eigene Familie der Clostridiaceae und kommen

ubiquitär vor. So lassen sich Clostridien typischerweise im Erdboden, in Oberflächengewässern

und in Exkrementen von Menschen und Tieren nachweisen. Allerdings sind nur

wenige Arten für den Menschen gefährlich. Einige wichtige humanpathogene Vertreter

dieser Gruppe sind die Erreger des Gasbrandes (Clostridium perfringens), des Wundstarrkrampfes

(Clostridium tetani), des Botulismus (Clostridium botulinum) und der Erreger

der bereits genannten sogenannten Antibiotika-assoziierten Diarrhoe und der Pseudomembranösen

Kolitis (Clostridium difficile). Die Pathogenität dieser Erreger beruht dabei

im Wesentlichen auf der Produktion toxischer Proteine (Kayser et al., 2005).

1.2. Clostridium difficile

Entdeckt wurde Clostridium difficile im Jahr 1935 von Ivan C. Hall und Elizabeth O’Toole

als sie den Stuhl von Neugeborenen untersuchten. Aufgrund der Morphologie und der

Schwierigkeiten, die ihnen die Anzucht des Keimes bereiteten, bezeichneten sie den Erreger

zunächst als Bacillus difficilis (Hall, O’Toole, 1935). 1978 entdeckte man, dass dieser

Keim, der in Clostridium difficile umbenannt wurde, für das Krankheitsbild der Antibiotika-assoziierten-Diarrhoe

verantwortlich ist (Bartlett et al., 1978). Zwar bereitet die Kultivierung

des Keimes heutzutage keine Schwierigkeiten mehr, jedoch stellen die eingangs

erwähnten erhöhten Infektionsraten und die teilweise fulminanten Infektionsverläufe

schwerwiegende Probleme für Patienten und medizinisches Personal in Krankenhäusern

dar. Das Bakterium ist aufgrund des ubiquitären Vorkommens weit verbreitet. Untersuchungen

haben ergeben, dass sich bei Kleinkindern in nahezu 80 % der Fälle eine Teilbesiedelung

des Kolons mit C. difficile nachweisen lässt. Bei Erwachsenen in der Allgemeinbevölkerung

jedoch nur in knapp 5 % (Larson et al., 1982). Trifft man nun jedoch eine

engere Auswahl und betrachtet Patienten mit längerem Krankenhausaufenthalt oder Bewohner

von Altenpflegeeinrichtungen, so steigt die Häufigkeit der Kolonisation auf nahezu

40 % an (Bartlett et al. 2006).

Die meisten Patienten, die eine Besiedelung mit C. difficile aufweisen, bleiben jedoch

symptomlos. Werden kolonisierte Patienten allerdings antibiotisch behandelt, besteht die

Gefahr einer symptomatischen Infektion. Die Einnahme des Antibiotikums tötet unter an-

2


Einleitung

derem auch Bakterien der natürlichen Darmflora ab. Clostridien weisen jedoch zum einen

eine höhere Resistenz gegenüber Antibiotika auf, zum anderen sind sie in der Lage unter

dem Einfluss von Stressfaktoren Sporen auszubilden. Nach Abschluss der antibiotischen

Therapie können sich die verbliebenen, oder neu aus Sporen ausgekeimten, Clostridien

durch das Überangebot an Nährstoffen und Lebensraum rasch vermehren und das Krankheitsbild

einer C. difficile – Infektion hervorzurufen. Die Sekretion von zwei zytotoxischen

Stoffen, Toxin A und Toxin B, und deren Wirkung auf die Darmepithelzellen, rufen dabei

die klassischen Symptome der Diarrhoe und der Pseudomembranösen Kolitis hervor. Das

Robert-Koch-Institut gibt in der Ausgabe des Epidemiologischen Bulletins von 2009 an,

dass heutzutage beinahe 1 % aller mit Antibiotika behandelten Patienten eine Infektion mit

Clostridium difficile und dadurch eine Diarrhoe erleiden. Weiter schätzt man das Risiko an

einer symptomatischen Infektion mit Clostridium difficile zu versterben derzeit auf ca. 1

bis 2 %. Liegen jedoch das weitaus schwerere Krankheitsbild der Pseudomembranösen

Kolitis oder andere Komplikationen vor, erhöht sich die Letalität erheblich (Pepin et al.,

2005).

Besonders problematisch erscheint hierbei die Ausbreitung neuer hypervirulenter Stämme.

Sie weisen eine erhöhte Resistenz gegenüber Fluorchinolonen und Makroliden, eine erhöhten

Produktion von Toxinen und die Produktion eines zusätzlichen binären Toxins, der

Clostridium-difficile-Transferase auf (McDonald et al., 2005). Diese hypervirulenten

Stämme unterscheiden sich auf molekulargenetischer Ebene von den anderen C. difficile-

Spezies, weshalb eine Klassifizierung der C. difficile-Stämme gemäß ihrer molekulargenetischen

Charakteristika aber auch ihrer phänotypischen Eigenschaften erfolgt. Ein wichtiger

Vertreter der hypervirulenten Stämme ist zum Beispiel der Phänotyp NAP-I (PFGE-

Muster North-American-Pulse-Field-Type I), Ribotyp 027 oder Toxinotyp III. Dabei spielt

vor allem die Bildung des zusätzlichen Toxins eine entscheidende Rolle. Es gibt Hinweise

darauf, dass die Infektion mit CDT-produzierenden Stämmen zu einem deutlich prolongierten

und schwereren Krankheitsverlauf, aber auch zu einer erhöhten Letalität führen

(Bacci et al., 2011).

Die Übertragung der Erreger erfolgt in der Regel durch die Aufnahme kontaminierter Partikel

(fäkal-orale Schmierinfektion), unter anderem durch das Arzt- und Pflegepersonal der

entsprechenden Einrichtungen. Die vom Robert-Koch-Institut empfohlene Therapie besteht

aktuell aus der Gabe von Vancomycin, Metronidazol oder einer Kombination beider Sub-

3


Einleitung

stanzen. Dabei treten jedoch in bis zu 20 % Rezidive auf. Andere antibiotische Ansätze

bestehen in der Verabreichung von Reserveantibiotika wie Tigecyclin, Rifaximin oder des

neuen für Clostridium difficile spezifischen makrozyklischen Antibiotikums Fidaxomicin.

Alternativen zur antibiotischen Therapie sind zur Zeit der Einsatz von intravenösen Immunglobulinen

(IVIG), monoklonalen Antikörpern gegen die Toxine, aber auch die orale

Verabreichung von Probiotika wie Saccharomyces boulardii oder die Instillation aufgereinigter

Stuhltransplantate gesunder Spender. In besonders schwerwiegenden Fällen muss

jedoch, wenn die bisher genannten Therapien nicht anschlagen, auch eine operative Entfernung

des befallenen Darmabschnittes in Erwägung gezogen werden (LoVecchio et al.,

2012; Pant et al., 2011; Lowy et al., 2010; Gough et al., 2011).

2. Bakterielle Toxine

Heute ist von vielen Bakterien bekannt, dass Toxine, die von den Erregern sezerniert werden,

für das eigentliche Krankheitsbild verantwortlich sind. Botulinum-Toxin (Clostridium

botulinum), Pertussis-Toxin (Bordetella pertussis), Tetanus-Toxin (Clostridium tetani),

Diphtherie-Toxin (Corynebacterium diphtheriae), Cholera-Toxin (Vibrio cholerae) und

Anthrax-Toxin (Bacillus Anthracis) sind einige bekannte Beispiele für die Pathogenität

bakterieller Toxine (s.a. Tab. 1). In der Mikrobiologie werden Bakteriengifte grundsätzlich

in drei Gruppen unterteilt: Endotoxine, Exotoxine und Effektoren. Endotoxine sind Substanzen,

welche in den Bakterien selbst vorkommen und bei Tod oder Zerfall des Erregers

im Wirtsorganismus ihre toxischen Effekte entfalten. Das wohl bekannteste Beispiel hierfür

ist Lipopolysaccharid (LPS), das von gram-negativen Bakterien produziert wird. Bei

übermäßigem Bakterienzerfall werden große Mengen an LPS frei, das bei Bindung an

Makrophagen die Ausschüttung großer Mengen an Interleukinen, TNF-α und Interferon-γ

auslöst und somit schließlich zur Sepsis und zum Schock führen kann. Bei den Effektoren

handelt es sich um Polypeptide, die von bestimmten Bakterienspezies über Typ-III- oder

Typ-IV-Sekretionssysteme direkt in die Zielzelle injiziert werden. Exotoxine sind Stoffe,

welche von den Bakterien entweder direkt sezerniert oder in die Oberflächenmembran eingebaut

werden, um so einen Effekt auf die Wirtszelle zu erzielen (Kayser et al., 2005).

Einige Clostridien zeichnen sich durch zwei Klassen von Exotoxinen aus, den großen Rho-

4


Einleitung

glukosylierenden Toxinen und den binären Toxinen. Die Pathogenität gängiger Stämme

von Clostridium difficile beruht im Wesentlichen auf der Wirkung von zwei Rhoglukosylierenden

Toxinen, Toxin A und Toxin B. Bestimmte hypervirulente Stämme sind

jedoch in der Lage ein zusätzliches Toxin, die Clostridium difficile-Transferase (CDT) zu

produzieren. Dieses Toxin gehört zu den binären Aktin-ADP-ribosylierenden Toxinen.

Exotoxin Zielsubstrat Enzymaktivität Konsequenz

Diphtherietoxin Elongationsfaktor 2

ADP-

Hemmung der Proteinsynthese

Ribosylierung

Choleratoxin GS-Protein

ADP-

Aktivierung der Adenylylcyclase

Ribosylierung

C2-Toxin (C botulinum)

Ribosylierung Zytoskeletts

ADP-

Zerstörung des Aktin-

Aktin

Botulinum-Toxin

Spaltung synaptischer

Synaptobrevin

Peptide;

Syntaxin

Zinkendoprotease

Hemmung der Transmitterfreisetzung

SNAP 25

Pertussis-Toxin Gi/0-Protein

ADP-

Hemmung von G-

Ribosylierung Proteinen

Anthrax-Toxin

MAP-

Inaktivierung bestimmter

Zinkendoprotease

Proteinkinasen

MAP-Kinasen

Tab.1: Beispiele einiger bakterieller Exotoxine und ihre Funktion (modifiziert nach Aktories et al., 2009;

S.1122)

2.1. Clostridiale Rho-glukosylierende Toxine

Toxin A und Toxin B (früher Enterotoxin und Cytotoxin) gehören zu der Familie der clostridialen

glucosylierenden Toxine (CGT) zu denen auch andere Vertreter wie das Letale

Toxin von Clostridium sordellii und α-Toxin von Clostridium novyi gehören (Just,

Gerhard, 2004). CGTs sind einzelkettige Proteine, die aus mindestens 4 Domänen, einer N-

terminalen Enzymdomäne (Glukosyltransferase), eine daran angrenzende Cystein-

Protease, eine Translokationsdomäne und einer C-terminalen Rezeptorbindedomäne, be-

5


Einleitung

stehen (Jank, Aktories, 2008). Sie zählen zu den klassischen Exotoxinen und müssen erst

durch die Zielzelle über Endozytose aufgenommen werden. Für die Familie der CGTs

konnte gezeigt werden, dass ein Clathrin-abhängiger Endozytose-Mechanismus für die

zelluläre Aufnahme notwendig ist (Papatheodorou et al., 2010). Hierbei wird der Toxin-

Rezeptor-Komplex zunächst durch Bildung eines endozytotischen Vesikels (Endosom)

internalisiert. Nach Ansäuern des Endosoms durch den Einstrom von H + mittels Protonenpumpen

tritt eine Konformationsänderung der CGTs auf, die es dem Toxin ermöglicht eine

Pore in der Membran des Endosoms zu bilden (Barth et al., 2001). Anschließend wird die

Enzymdomäne des Toxins durch diese Poren ins Zytosol transloziert. Hier erfolgt die autoproteolytische

Abspaltung der N-terminalen Domäne durch die Cystein-Protease-

Domäne in Abhängigkeit von Inositol-Hexakisphosphat (IP6).

Im Zytosol überträgt die Glukosyltransferase unter Verwendung von UDP-Glukose Zuckerreste

auf Rho-GTPasen. Die Glukosylierung erfolgt hierbei an Threonin-37, was Threonin-35

in Rac und Cdc-42 entspricht (Just et al., 1995). Rho-GTPasen gehören zur Familie

der kleinen GTPasen und nehmen bei einer Vielzahl von zellulären Prozessen wie Entzündung,

Proliferation, Migration, Signaltransduktion und der Regulation des Umbaus des

Aktin-Zytoskeletts eine zentrale Rolle ein. Durch die Glukosylierung von Threonin-37

werden die Rho-Proteine inaktiviert und die zellulären Steuerprozesse geraten aus dem

Gleichgewicht. Letztlich führt die Inaktivierung der Rho-GTPasen zur Zerstörung des Aktin-Zytoskeletts

und zur Apoptose der Zelle. Die Wirkungsweise der Toxine erklärt auch

die Symptome des Erkrankungsbildes einer Clostridium-difficile-Infektion. Die Schädigung

der Epithelzellen führt durch den Verlust des Aktin-Zytoskeletts zur Desintegration

von tight-junctions und somit zu einer Schrankenstörung des Darmepithels, was sich als

wässrige Diarrhoe bemerkbar macht (Aktories, Barbieri, 2005). Durch die Wirkung der

Toxine wird jedoch auch eine Entzündungskaskade in Gang gesetzt, vermutlich getriggert

durch eine gesteigerte Aktivität von RhoB. RhoB wird scheinbar nicht durch die CGTs

glukosyliert und unter dem Einfluss der glukosylierenden Toxine sogar vermehrt exprimiert.

Der Inflammationsprozess führt zu einer Rekrutierung von Entzündungszellen, was

zur Exsudation von Fibrin und somit zur Bildung von Fibrin-Plaques führen kann (Gerhard

et al., 2005). Dies stellt das charakteristische Bild einer Pseudomembranösen Kolitis dar.

Werden die Epithelzellen der Darmschleimhaut im Zuge der Schädigung abgestoßen,

ergibt sich das Bild der blutig-schleimigen Diarrhoe.

6


Einleitung

2.2. Das binäre Aktin-ADP-ribosylierende Toxin CDT

Das von den hypervirulenten Stämmen produzierte zusätzliche Toxin, die Clostridiumdifficile-Transferase

(CDT), gehört zur Familie der binären Aktin-ADP-ribosylierenden

Toxine. Binäre Toxine sind aus zwei, separaten Komponenten aufgebaut, die sich später zu

einem Komplex zusammenlagern. Die A-Komponente beinhaltet die enzymatisch aktive

Domäne des Toxins und ist für den toxischen Effekt innerhalb der Zielzelle verantwortlich.

Die B-Komponente hingegen ermöglicht die Bindung an Rezeptoren der Zelloberfläche

und vermittelt sowohl die Endozytose des Toxin-Rezeptor-Komplexes als auch die

Translokation der A-Komponente ins Zytosol (Barth et al., 2000). Binäre Toxine aus der

Familie der Clostridien weisen eine hohe Homologie bezüglich ihrer Struktur zueinander

auf. So sind die B-Komponente von CDT und dem C. perfringens Iota-Toxin in ihrer Primärstruktur

zu ca. 80 % identisch. Die B-Komponente von C. spiroforme-Toxin (CST)

zeigt eine 76 %ige Sequenz-Identität und die B-Komponente des C2-Toxins von C. botulinum

weist immerhin noch eine Identität von knapp 32 % zur B-Komponente von CDT

(CDTb) auf (Sequenzvergleich der B-Komponenten mittels Uniprot.org). Iota-Toxin, CDT,

und CST werden aufgrund ihrer engen strukturellen Verwandtschaft in einer eigenen Untergruppe

zusammengefasst. Da von dieser Untergruppe das Iota-Toxin als erstes entdeckt

und erforscht wurde, werden diese Toxine als Iota-ähnliche-Toxine zusammengefasst.

Bemerkenswert ist hierbei, dass aufgrund der hohen Homologie der Toxine, die A- und B-

Komponenten dieser Untergruppe untereinander ausgetauscht werden können und dabei

trotzdem toxisch aktive Komplexe entstehen (Considine et al. 1991; Popoff et al., 1988).

Bevor das Toxin jedoch seine Wirkung entfalten kann, wird die Bindekomponente CDTb

proteolytisch aktiviert, wobei ein ca. 20 kDa großes Fragment vom N-Terminus abgespalten

wird. Bisher gibt es verschiedene Theorien, wie diese Aktivierung zustande kommt.

Einerseits wird diskutiert, dass vom Bakterium selbst sezernierte Proteasen die B-

Komponente aktivieren. Andererseits gibt es die Theorie, dass die Aktivierung durch oberflächliche

Proteasen der Zellmembran getriggert wird. Durch die Aktivierung der B-

Komponenten sind diese in der Lage oligomere Komplexe zu bilden, welche später für die

Vergiftung essentiell sind (Barth et al., 2000). Aufgrund von Untersuchungen zum C2-

Toxin ist davon auszugehen, dass es sich bei diesen Oligomeren überwiegend um Heptamere

handelt (Barth et al., 2000).

7


Einleitung

Wenn CDTb in oligomerer Form vorliegt und an den zugehörigen Zelloberflächenrezeptor

LSR (lipolysis-stimulated-lipoprotein-receptor) gebunden hat, binden Moleküle der enzymatisch-aktiven

A-Komponente CDTa an den Komplex und leiten so die Mechanismen

zur Endozytose des Toxin-Rezeptor-Holokomplexes ein. Dabei entsteht ein endozytotisches

Vesikel (Endosom), das ins Zellinnere transportiert wird. Durch physiologische Prozesse

im Endosom werden mittels H + -Pumpen Protonen aus dem Zytosol in das Vesikel

transportiert und bewirken einen Abfall des endosomalen pH-Wertes. Dadurch tritt eine

Konformationsänderung der heptameren B-Komplexe ein, so dass diese Poren in der

Membran des Endosoms bilden (Barth et al., 2000). Diese Poren dienen dazu, das enzymatisch

aktive CDTa vom Lumen des Endosoms ins Zytosol zu transportieren. An diesem

Prozess sind offenbar Hitzeschockproteine (HsP90) und Cycophilin A beteiligt (Blöcker et

al., 2001; Blöcker et al., 2003; Kaiser et al., 2011).

Im Zytosol beginnt der eigentliche Prozess der Zellvergiftung, indem das Aktin-

Zytoskelett der Zelle zerstört wird (Abb. 1). CDTa überträgt, durch Spaltung von NAD,

ADP-Ribose auf die Aminosäure Arginin an Position 177 von G-Aktin-Monomeren (Aktories

et al., 1986; Vandekerckhove et al., 1987). Ribosylierte G-Aktine können zwar noch

am wachsenden Ende des F-Aktin-Stranges angelagert werden, eine Polymerisation mit

weiteren G-Aktinen ist jedoch durch das übertragene ADP-Molekül nicht mehr möglich.

Somit werden die Polymerisation und dadurch auch das Wachstum des F-Aktin-Stranges

gestoppt. Gleichzeitig depolymerisiert der F-Aktin-Strang am sogenannten Minus-Ende,

was weitere G-Aktin-Moleküle freisetzt, die CDTa erneut als Substrat dienen. Dadurch

verstärkt sich der toxische Effekt. Zum einen wird das Wachstum des Aktin-Stranges blockiert

(capping), zum anderen werden die, durch Depolymerisation frei gesetzten, G-

Aktine ebenfalls modifiziert (trapping). Capping und trapping stören das Gleichgewicht

von Polymerisation und Depolymerisation des Aktin-Zytoskeletts und führen letztlich zur

Zerstörung und zum Zusammenbruch des Stützapparates der Wirtszelle und somit zum

Zelltod (Aktories et al., 1986; Gülke et al., 2001).

Erst kürzlich wurde noch ein zusätzlicher Effekt von CDT auf die Wirtszellen entdeckt. Es

konnte beobachtet werden, dass Zellen unter dem Einfluss von geringen Konzentrationen

an CDT Mikrotubuli-assoziierte Zellausläufer, sogenannte Protrusionen, ausbilden. Der

Mechanismus wie es zur Bildung dieser Ausläufer kommt ist bisher noch nicht endgültig

aufgeklärt worden, jedoch wurde ein direkter Zusammenhang zwischen dem Abbau des

8


Einleitung

kortikalen Aktins und der Ausbildung der Protrusionen beobachtet. Weitere Untersuchungen

haben ergeben, dass sich C. difficile-Bakterien in diesen Zellausläufern festsetzen und

somit die Adhärenz der Pathogene erhöht wird. Dies stellt ein weiteres Pathogenitätsmerkmal

der hypervirulenten Form von C. difficile dar (Schwan et al., 2009). Somit lässt

sich schlussfolgern, dass die Wirkung von CDT zum einen die Adhärenz der Keime an die

Wirtszelle erhöht, was möglicherweise die Infektionsdauer prolongiert. Zum anderen wird

die Zytotoxizität durch die Toxin-bedingte Schrankenstörung des Darmepithels verstärkt.

Abb. 1: Schematische Darstellung des Aufnahme- und Wirkmechanismus von CDT (modifiziert nach

Hornuss und Papatheodorou, 2012). Durch proteolytische Aktivierung bilden sich oligomere Komplexe

von CDTb und binden an den Rezeptor. Die enzymatische Komponente CDTa bindet an die Komplexe

und initiiert die Endozytose des Toxin-Rezeptor-Komplexes. Physiologische Ansäuerung des Endosoms

bewirkt eine Konformationsänderung der oligomeren B-Komplexe, die nun eine Pore in die Membran des

Endosoms generieren können. Dadurch wird CDTa ins Zytosol transportiert. CDTa überträgt, durch Spaltung

von NAD, ADP-Ribose auf freies G-Aktin und verhindert so die Polymerisation des Aktin-

Zytoskeletts. Durch den gleichzeitigen Abbau von F-Aktin werden freigesetzte G-Aktine ribosyliert

wodurch das Aktin-Zytoskelett zusammenbricht. Durch Modifikation des kortikalen Aktins entstehen

Mikrotubuli-assoziierte Zellausläufer, welche die Adhärenz der Bakterien erhöhen.

9


Einleitung

3. Lipolysis-stimulated-lipoprotein-receptor (LSR)

Ein wichtiger Meilenstein in der Erforschung von CDT war die Entdeckung des zugehörigen

Zelloberflächenrezeptors, der die Bindung und die Aufnahme des Toxins ins Zellinnere

vermittelt. Es war zwar schon bekannt, dass es sich bei dem CDT-Rezeptor um ein proteinogenes

Molekül handeln müsse, um welches Protein jedoch genau war bis vor kurzem

unklar (Stiles et al., 2002). Nun konnte gezeigt werden, dass es sich dabei um den Lipolysis-stimulated-lipoprotein-receptor

(LSR) handelt (Papatheodorou et al., 2011). Des Weiteren

konnte nachgewiesen werden, dass LSR auch der zugehörige Zelloberflächenrezeptor

für das C. perfringens Iota-Toxin von und für das C. spiroforme-Toxin CST ist (Papatheodorou

et al., 2011; Papatheodorou et al., 2012).

Dieser Rezeptor wurde zunächst mit dem Cholesterinstoffwechsel in Verbindung gebracht,

was ihm den Namen LSR verliehen hat. So konnte unter anderem gezeigt werden, dass der

Rezeptor die Bindung und die Aufnahme von low-density-lipoprotein (LDL) in LDL-

Rezeptor defizienten Zellen begünstigt (Yen et al., 1994). Darüber hinaus handelt es sich

bei LSR um ein für den Organismus essentielles Protein. Es zeigte sich, dass homozygote

Knock-out Mäuse für LSR nicht lebensfähig waren, heterozygote hingegen schon (Mesli et

al., 2004). Individuen mit heterozygotem Knock-out für LSR zeigten gegenüber der Vergleichspopulation

eine deutlich gesteigerte Tendenz zu Hyperlipidaemie, Gewichtszunahme

und Atherosklerose (Yen et al., 2008; Narvekar et al., 2009).

Neuere Untersuchungen gaben nun den Hinweis auf eine Beteiligung von LSR zur Ausbildung

von trizellulären tight junctions in Epithelzellen (Masuda et al., 2011). Dies ist insofern

ein interessanter Aspekt, da bereits bekannt ist, dass einige Toxine oder Viren Proteine

von tight junctions als Rezeptor benutzen (Cohen et al., 2001; Martin et al., 2011). Die

Struktur von LSR ist noch weitgehend unbekannt. Lediglich die Aminosäuresequenz lässt

einige Rückschlüsse auf den strukturellen Aufbau des Proteins zu. Es gibt 3 verschiedene

Isoformen des Proteins von verschiedener Größe und variablem Aufbau. Die Expression

erfolgt in verschiedenen Geweben, vor allem jedoch im Darmepithel und in Leberzellen.

Dabei werden je nach Gewebetyp unterschiedliche Isoformen exprimiert. Die als kanonische

Sequenz definierte Isoform 1 besteht aus 649 Aminosäuren. Die beiden anderen Isoformen

weisen gegenüber der kanonischen Sequenz verschiedene Deletionen auf. LSR ge-

10


Einleitung

hört zu der Klasse der Typ 1-Transmembranproteine mit einer, die Membran durchspannenden,

Alpha-Helix (single-pass-transmembrane-protein). Im extrazellulären, N-

Terminalen Bereich ist eine Immunglobulin-ähnliche Domäne vom Typ V annotiert

(Abb.2). Solche Domänen weisen große Ähnlichkeit mit Rezeptoren der zellulären Immunabwehr

auf und wurden in der Literatur bereits als wichtiger Bestandteil zur Anlagerung

und Aufnahme pathogener Substanzen oder Erreger wie Viren beschrieben (Fan et

al., 2010).

Abb. 2: Graphische Darstellung von LSR (modifiziert nach Masuda et al., 2011). Schematische

Darstellung der Immunglobulin-Domäne (IG) und Transmembrandomäne (TM).

4. Endozytose

Der Begriff Endozytose definiert die Aufnahme extrazellulärer oder membranständiger

Bestandteile mit Hilfe von Membranvesikeln in das Innere der Zelle. Grundsätzlich wird

zwischen Phagozytose (Aufnahme großer Bestandteile wie Bakterien), Pinozytose (Aufnahme

flüssiger Bestandteile) und rezeptorvermittelter Endozytose (signalgetriggerte Aufnahme)

unterschieden (Rassow et al., 2006). Weiterhin wird zwischen Clathrin-abhängiger

und Clathrin-unabhängiger Endozytose unterschieden (Doherty et al., 2009).

4.1. Clathrin-abhängige Endozytose

Die Clathrin-abhängige Endozytose ist die am besten erforschte und verstandene Variante

der Rezeptor-Internalisierung. Hierbei werden nach Bindung des Liganden an den zugehörigen

Rezeptor mehrere Moleküle des Proteins Clathrin, unter dem Einfluss von Adapterproteinen

wie Epsin und Amphiphysin, stimuliert, sich an der umgebenden Membran anzu-

11


Einleitung

lagern und sich miteinander zu einer netzartigen Struktur zu verbinden. Dabei entsteht ein

polygonales Gitter mit gewölbter Struktur, wodurch sich die daran anhaftende Membran

nach Innen stülpt. Es entsteht ein sogenanntes coated pit. Durch weiteres Anlagern von

Clathrin-Molekülen entsteht eine Kugelstruktur, die ein Vesikel bildet. Dynamin bildet

unter Verbrauch von GTP ein helikales Polymer, das sich membrannahe um das Vesikel

anlagert und schließlich das Vesikel von der Membran abschnürt. Schlussendlich lösen

sich die Clathrin-Moleküle durch Spaltung von ATP und mittels Hitzeschockprotein 70

(Hsp 70) wieder vom Vesikel ab (Doherty et al., 2009).

4.2. Clathrin-unabhängige Endozytose

Unter dem Begriff Clathrin-unabhängige Endozytose werden alle Mechanismen der Aufnahme

von Stoffen in die Zelle subsummiert, die ohne Clathrin funktionieren. Dabei handelt

es sich im Wesentlichen um die Makropinozytose, Caveolae/Caveolin-abhängige Endozytose,

Arf-6-abhängige, RhoA- und Cdc-42-abhängige Endozytose (Sandvig et al.,

2008; Abb. 3). Der Mechanismus dieser Endozytoseformen ist noch nicht detailliert aufgeklärt

worden, jedoch weisen sie alle eine gewisse Abhängigkeit von Cholesterin-reichen-

Membranmikrodomänen, sogenannten lipid rafts oder detergent-resistant-membranes, auf.

Bei den lipid rafts handelt es sich um ein von Kai Simons und Gerrit van Meer postuliertes

Modell für Membran-Mikrodomänen (Simons et al., 1988). Diese Mikrodomänen weisen

einen hohen Gehalt an Cholesterin und Sphingolipid auf und werden als auf der Zellmembran

schwimmende „Flöße“ dargestellt. Sie zählen aufgrund ihrer schlechten Löslichkeit in

milden Detergenzien zu den detergent resistant membranes (DRM) und zeichnen sich

durch eine gewisse Proteinselektiviät aus. Proteine mit hoher lipid rafts-Assoziation haben

oftmals charakteristische Modifikationen wie Palmitoylierungen und Acylierungen oder

GPI-Anker (Simons et al., 2000). Biochemisch lassen sich lipid rafts durch die Unlöslichkeit

in kaltem Triton-Detergenz von löslichen Membranbestandteilen trennen und beinhalten

als Markerproteine unter anderem Flotillin und Caveolin. Die Beschreibung, Funktion

und der Mechanismus der Entstehung von lipid rafts ist bisher noch nicht vollständig erforscht,

aber es wird vermutet, dass lipid rafts im Bereich der Caveolin-abhängigen Endozytose

eine zentrale Rolle spielen (Brown et al., 1998).

Caveolae (auch Caveosomen) sind Cholesterin- und Sphingolipid-reiche Einstülpungen der

Membran und stellen, abseits der Clathrin-abhängigen Endozytose, einen zusätzlichen

12


Einleitung

Weg zur zellulären Aufnahme exogener Substanzen oder membranständiger Proteine dar

(Anderson et al., 1998; Nabi et al., 2003). Der Mechanismus der Caveolin-abhängigen

Aufnahme beruht auf einer Protein-Kinase-abhängigen Aktivierung und anschließendem

lokalen Abbau des Aktin-Skeletts. Dadurch stülpt sich die Zellmembran ein und unter dem

Einfluss von Caveolin-1 und Dynamin-2 werden Vesikel abgeschnürt und ins Zellinnere

transportiert (Pelman et al., 2002; Nabi et al., 2003). Des Weiteren zeigte sich, dass die

Induktion der Caveosom-Internalisierung durch Kinase-Inhibitoren wie Staurosporin und

Genistein gehemmt konnte. Phosphatase-Inhibitoren wie Okadaic acid hingegen begünstigen

hingegen die Bildung von Caveosomen (Parton et al., 1994).

Für die Makropinozytose ist bekannt, dass der Einfluss von Rac1 zu einer Ausbildung von

Aktinfilamenten führt, welche letztendlich zur Ausbildung hochkomplexer gekräuselter

Membranvesikel führt. Dieser Prozess ist abhängig von Cholesterin und biochemische

Analysen der makropinozytotischen Membrankräusel ergaben eine Korrelation mit charakteristischen

Proteinen der Membranmikrodomänen (Doherty et al., 2009).

Die RhoA und Cdc42 abhängige Endozytose sind bezüglich ihres Mechanismus noch nicht

hinreichend erforscht. Es ergaben sich jedoch für die Aufnahme von IL-2-Rezeptoren und

IgE-Rezeptoren Hinweise auf eine RhoA-vermittelte Endozytose in Abhängigkeit von lipid

rafts (Nabi et al., 2003). Ferner scheinen lipid rafts auch eine wesentliche Rolle bei der

Signal-Transduktion des T-Zell-Rezeptors zu spielen (Field, et al., 1995; Jane et al., 2000).

Da Cdc42 eine Rolle bei der Aufnahme GPI-verankerter Proteine eine Rolle zu spielen

scheint, ist eine Korrelation mit lipid rafts ebenfalls wahrscheinlich (Sandvig et al., 2008).

So ließ sich zum Beispiel nachweisen, dass das Helicobacter pylori-Toxin VacA über einen

Cdc42-abhängigen Weg und in Abhängigkeit von lipid rafts in die Zelle aufgenommen

wird (Gauthier et al., 2005).

Lediglich der Arf6-abhängige Mechanismus nimmt eine Sonderstellung ein. Hier ist der

Zelltypus für die Funktion von Arf6 entscheidend. In HeLa- und COS7-Zellen beispielsweise

nimmt Arf6 eine zentrale Position in der Steuerung der Clathrin-unabhängigen Endozytose

ein und ist bei der Aufnahme GPI-verankerter Proteine wie CD59 beteiligt. In

MDCK- und HEK29-Zellen hingegen steuert Arf6 die Clathrin-abhängige Endozytose

wichtiger G-Protein gekoppelter Rezeptoren (Sandvig et al., 2008). Es konnte jedoch auch

hier gezeigt werden, dass die Clathrin-unabhängige, Arf-6-gesteuerte Aufnahme von β1-

13


Einleitung

Integrin ebenfalls durch lipid rafts vermittelt wird (Sandvig et al., 2008; Vassilieva et al.,

2008).

Abb. 3: Übersicht über Mechanismen der Endozytose (modifiziert nach Sandvig et al., 2008).

5. Die Rolle von lipid rafts / detergent-resistant-membranes bei der Aufnahme

von Iota-ähnlichen Toxinen

Es finden sich bereits einige Hinweise auf eine Beteiligung von lipid rafts bei der Aufnahme

verschiedener bakterieller Toxine, wie beispielsweise das bereits erwähnte VacA Toxin

von H. pylori. Aber auch binäre Toxine, wie das Anthraxtoxin, weisen bei der Endozytose

eine Affinität zu lipid rafts auf (Blank et al., 2007; Abrami et al., 2003). Da bisher noch

keine Untersuchungen zur Aufnahme von CDT veröffentlicht wurden, konnten diesbezüglich

bisher nur Rückschlüsse aufgrund der Beobachtungen zur Aufnahme des Iota-Toxins

von C. perfringens gezogen werden. Es zeigte sich, dass die oligomere Form von Iota-B

eine hohe Affinität zu lipid rafts aufwies, wohingegen monomere Formen von Iota-B in

non-rafts akkumulierten. Darüber hinaus konnte nach Destabilisierung der lipid rafts durch

Cholesterindepletion, mittels Methyl-Beta-Cyclodextrin, eine Inhibition der Vergiftung

14


Einleitung

beobachtet werden (Nagahama et al., 2004; Hale et al., 2004). Weiterhin zeigte sich interessanterweise

eine Kolokalisation des IL-2-Rezeptors mit Iota-Toxin in endozytotischen

Vesikeln (Gibert et al., 2011). Da IL-2-Rezeptoren ebenfalls über einen Clathrinunabhängigen

Endozytose-Mechanismus in die Zelle aufgenommen werden, geht man von

einem analogen Internalisierungsmechanismus aus (Lamaze et al., 2001). Aufgrund der

strukturellen Verwandtschaft der Iota-ähnlichen Toxine zueinander, wurde eine Clathrinunabhängigen

Endozytose für alle Iota-ähnlichen Toxine vermutet. Da CDT und Iota-

Toxin denselben Zelloberflächenrezeptor für die Endozytose benutzen, kann daher vermutet

werden, dass CDT ebenfalls bei der Aufnahme mit lipid rafts korreliert. Jedoch konnte

bisher nicht hinreichend geklärt werden, wie es zu dieser Affinität zu lipid rafts kommt

und welche zellulären Moleküle daran beteiligt sind.

6. Zielsetzung der Arbeit

Die Identifikation des zugehörigen Zelloberflächenrezeptors von CDT war ein bedeutender

Schritt um neue Erkenntnisse über die molekularen Interaktionen zwischen Wirtszelle und

Toxin bei einer Infektion mit hypervirulenten Stämmen von C. difficile zu erlangen. Die

Wechselwirkungen zwischen CDT und dem Zielrezeptor LSR sind jedoch bisher nicht

hinreichend erforscht worden. In der Literatur sind Hinweise über eine lipid raftsvermittelte

Clathrin-unabhängige Endozytose der Iota-ähnlichen Toxine zu finden. Jedoch

blieb bisher unklar, welche Rolle der Rezeptor LSR bei der Bildung der Oligomere von

CDTb und deren Akkumulation in den Membran-Mikrodomänen spielt. Ziel der vorliegenden

Dissertation war das Verhalten des Rezeptors nach Bindung des Liganden zu analysieren

und die Frage zu klären, ob LSR ebenfalls nach Bindung in lipid rafts akkumuliert.

Weiterhin sollte die Frage geklärt werden, ob die Akkumulation in lipid rafts durch

die Rezeptoraktivität oder durch die Bildung der oligomeren Form von CDTb hervorgerufen

wird. In einem weiteren Schritt wurde die bindende Region des Rezeptors eingegrenzt.

15


Material

B. Material

1. Verwendete Geräte

Folgende Geräte kamen im Rahmen dieser Arbeit zum Einsatz:

Pipetten von Eppendorf Research, Eppendorf, Hamburg, Deutschland

Vortex-Genie 2, Scientific Industries, Bohemia (New York), USA

Thermomixer 5436 Eppendorf / compact, Eppendorf, Hamburg, Deutschland

Heraeus pico17 centrifuge, Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Deutschland

Heraeus fresco 21 centrifuge, Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Deutschland

Heraeus multifuge 1S-R centrifuge, Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Deutschland

Heraeus Megafuge 1.0R, Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Deutschland

Sorvall RC 5B Plus, Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Deutschland

Sorvall RC 6+, Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Deutschland

Zentrifugenrotor SS34 und SLC 3000, Du-Pont, Bad Homburg, Deutschland

Beckman LE- 80 Ultracentrifuge, Beckman Coulter, Krefeld, Deutschland

Zentrifugenrotor Beckman SW32, Beckman Coulter, Krefeld, Deutschland

Wippe Heidolph Duomax 1030, Heidolph, Schwabach, Deutschland

PH-Meter: Mettler Toledo MP220 Oh Meter, Mettler Toledo, Gießen, Deutschland

Powerpacs: Bio-Rad Powerpac 300/3000, Bio-Rad, München, Deutschland

Bio-Rad Universal Hood II, Bio-Rad, München, Deutschland

Vilber Lourmat 302nm, Vilber, Eberhardzell, Deutschland

Eppendorf Mastercycler® Pro, Eppendorf, Hamburg, Deutschland

Spectrophotometer Nanodrop ND-1000, Thermo Fisher Scientific, Langenselbold,

Deutschland

Bio-Rad Gel Dryer Mofel 583, Bio-Rad, München, Deutschland

Bio-Rad Transblot SD Semi-Dry Transfer Cell, Bio-Rad, München, Deutschland

LAS-3000 mini, GE Healthcare, München, Deutschland

Storm Scanner 820, GMI, Ramsey, Minnesota USA

Molecular Dynamics Image Eraser SF, GE Healthcare, München, Deutschland

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Material

Molecular Dynamics Phosphor Screen, GE Healthcare, München, Deutschland

Becton Dickinson FACSCalibur, Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Deutschland

Labor Brand L28 Drehrad, Labor-Brand, Gießen, Deutschland

Invitrogen DynaMag TM – Magnet Spin, Life Technologies TM , Darmstadt, Deutschland

Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, GE Healthcare, München, Deutschland

Heraeus Instruments Hera cell 150 / function line, Thermo Fisher Scientific, Langenselbold,

Deutschland

New Brunswick Scientific innova 4330 incubator shaker, Eppendorf, Hamburg,

Deutschland

Zeiss Axiovert 25, Zeiss, Jena, Deutschland

Zeiss AxioCam HRc, Zeiss, Jena, Deutschland

Zeiss Axiovert 200m, Zeiss, Jena, Deutschland

Laserline 488, 561 Lasercontrol, Visitron Systems GmbH, Purchheim, Deutschland

Yokogawa CSU- X1, Amsterdam, Niederlande

2. Verbrauchsmaterialien und Chemikalien

Tabellarische Übersicht über Verbrauchsmaterialien

Material

Hersteller

Eppendorf-Gefäße Greiner bio-one, Frickenhausen, Deutschland

Polypropylen-

Mehrzweckröhrchen mit Greiner bio-one, Frickenhausen, Deutschland

konischem Boden 15/50 ml

PD 10 Säulen

GE Healthcare, München, Deutschland

Vivaspin 500

Sartorius Stedim Biotech GmbH, Göttingen, Deutschland

Objektträger

Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe, Deutschland

Coverslips rund 10 mm Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe, Deutschland

Folgende Chemikalien kamen zum Einsatz:

DynaBeads M-280 Tosylactivated, Life Technologies TM , Darmstadt, Deutschland

Nickel-Beads Protino Ni-IDA Resin, Marcherey-Nagel, Düren, Deutschland

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Material

RNAsin Ribonuclease Inhibitor, Promega, Mannheim, Deutschland

Complete® Protease Inhibitor Cocktail Tablets, Roche, Basel, Schweiz

Dapco (Triethylendiamin), Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe, Deutschland

Agarose-Pulver, Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe, Deutschland

Agar-Agar, Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe, Deutschland

Milchpulver, Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe, Deutschland

Folgende Marker wurden verwendet:

Spectra Multicolor High Range Protein Ladder, Fermentas St. Leon-Rot, Deutschland

Protein-Marker III, PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Deutschland

GeneRuler 1 kb DNA Ladder, Fermentas St. Leon-Rot, Deutschland

Puffer und weitere Chemikalien werden im Methodenteil beschrieben.

3. Kits

Die in der folgenden Tabelle aufgeführten Kits kamen zum Einsatz

Kit

Hersteller

Zero Blunt® TOPO® PCR Cloning

Kit

Invitrogen Life Technologies TM , Darmstadt,

Deutschland

Roti-Prep Mini

Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland

Jetstar Plasmid Purification MIDI

Kit

Genomed, Löhne Deutschland

DNA Clean and Concentrator TM -5 Zymo Research, Freiburg, Deutschland

ZymoClean TM Gel Recovery Kit Zymo Research, Freiburg, Deutschland

Promega TnT® T7 Coupled Reticulocyte

Lysate System

Promega, Mannheim, Deutschland

Promega MagZ TM Purification System

Promega, Mannheim, Deutschland

18


Material

4. Externe Dienstleister

Die Sequenzierung von DNA erfolgte durch die Firma GATC-Biotech AG, Konstanz,

Deutschland.

Oligonukleotide wurden bei Apara Bioscience GmbH, Denzlingen, Deutschland, bestellt.

5. Internetdatenbanken und Programme

Internetdatenbanken und Skripte:

Literaturrecherche Pubmed:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed

Gen- und Protein-Datenbank Uniprot:

http://www.uniprot.org/

Fermentas DoubleDigest TM -Tool:

http://www.fermentas.com/en/tools/doubledigest

Konvertierungsmaske für Proteinmassen und –konzentrationen:

http://molbiol.ru/eng/scripts/01_04.html

Berechnung DNA Konzentration und Massen:

http://www.promega.com/resources/tools/biomath-calculators

Folgende Programme wurden zu Auswertungen verwendet:

Programm

Hersteller

GENtle V 1.9.4

Magnus Manske , Universität Köln, Deutschland

ImageJ 1.44p

Wayne Rasband, National Institute of Health, USA

ImageQuant Version 5.2

Molecular Dynamics, GE Healthcare, München Deutschland

MultiGauge

Fujifilm Life Science, FUJIFILM Europe GmbH, Düsseldorf,

Deutschland

WinMDI 2.9

Joseph Trotter, The Scripps Research Institute, La Jolla

California, USA

Metamorph Software Molecular Devices LLC, Sunnyvale California, USA

Microsoft Office 2010 Microsoft Deutschland, Unterschleißheim, Deutschland

19


Material

6. Plasmide

Die folgenden Plasmide wurden in Klonierungsverfahren angewandt:


pCR TM -Blunt II -Topo®, Invitrogen Life Technologies TM , Darmstadt, Deutschland

pHIS1522, MoBiTec, Göttingen, Deutschland

pet28a, Novagen, Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland

7. Oligonukleotide

Primer für PCR:

Primer

BsrGI C2II fw

Sequenz

5‘-GAGTGTACAATGTTAGTTTCAAAATTTGAG-3‘

Chimäre

SacI C2II 1773 rev

SacI CDTb 2029 fw

5‘-TAGGAGCTCAGTAATTACTTTTACTAAGAT-3‘

5‘-CTTGAGCTCGATCCTTTAACATCTAATTC-3‘

BamHI CDTb dSTOP

rev

LSR39-186 fw

5‘-GGATCCCATCAACACTAAGAACTAATAAC-3‘

5‘-GTGGCCATGGCCAGGGCCATCCAGGTG-3‘

LSR pet28a

LSR39-186 rev

LSR1-192 fw

5‘-CCCTAAGCTTTGCGTAGGCCTCATTGTTCCC-3‘

5‘-ATATCCATGGCGCTGTTGGCCGGCGG-3‘

LSR1-192 rev

5‘-GTCTAAGCTTGTCAAGGACGATGAGCTCTG-3‘

Sequenzierprimer:

Primer

Sequenz

TOPO®

M13 fw Standard

M13 rev Standard

5‘-TGTAAAACGACGGCCAGT-3‘

5‘-CAGGAAACAGCTATGACC-3‘

20


Material

pHIS 1522

pet28a

pHIS fw

pHIS rev

T7 fw Standard

T7T rev

5´-GGATTAACAAACTAACTC-3´

5´-CTGCCAAGGGTTGGTTTGC-3´

5‘-TAATACGACTCACTATAGGG-3‘

5‘-GCTAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3‘

8. Toxine

Die folgenden Toxine oder Toxinkomponenten wurden verwendet:

CDTa, rekombinant hergestellt, zur Verfügung gestellt von Dr. Panagiotis Papatheodorou

CDTb, rekombinant hergestellt, zur Verfügung gestellt von Dr. Panagiotis Papatheodorou

CDTb-Dylight, rekombinant hergestellt, zur Verfügung gestellt von Dr. Panagiotis Papatheodorou

C2I rekombinant hergestellt, zur Verfügung gestellt von Dr. Alexander Lang

C2II rekombinant hergestellt, zur Verfügung gestellt von Dr. Alexander Lang

GST-CDTb(IV), rekombinant hergestellt, zur Verfügung gestellt von Sarah Hemmasi

9. Kulturmedien

Medien zur Kultur von Prokaryonten:

Medium

LB

SOC

LB-Agar

Inhaltsstoffe

Hefeextrakt 0,5 %, Trypton 1%, Natriumchlorid 10 mM

Hefeextrakt 0,5 % , Trypton 2 %, Natriumchlorid 10 mM,

Kaliumchlorid 2,5 mM, Magnesiumchlorid 10 mM,

Magnesiumsulfat 10 mM

LB-Medium + 2% Agar

21


Material

Medien zur Kultur von Eukaryonten:

Medium

Hersteller

Dulbecco’s modified Eagle’s

medium (DMEM)

Gibco, life-technologies, Darmstadt, Deutschland

10. Prokaryote Zellen

Für Klonierungsverfahren wurden die chemokompetenten E. coli – Stämme TG1 und XL1

Blue verwendet. Um Proteine zu exprimieren, wurde der Stamm Bacillus megaterium

WH320 der Firma MoBiTec verwendet.

11. Eukaryote Zellen

Die folgenden eukaryoten Zell-Linien kamen zum Einsatz:

Zell-Linie

Kulturmedium

H1 HeLa

DMEM + 10% fetales Kalbsserum (FCS) + 1% Nichtessentielle-Aminosäuren

(NEA) + 1% Penicil-

Unterform der Uteruskarzinomzelllinie

HeLa, benannt

lin/Streptomycin

nach Henrietta Lacks

H1 HeLa(+LSR)

DMEM + 10% fetales Kalbsserum (FCS) + 1% Nichtessentielle-Aminosäuren

(NEA) + 1% Penicil-

Form von H1 HeLa Zellen

Überexpression von LSR lin/Streptomycin

Vero

DMEM + 10% FCS + 1% NEA + 1% Penicillin/Streptomycin

Nierenzellen grüner Meerkatzen

CaCo-2

DMEM + 10% FCS + 1% NEA + 1% Penicillin/Streptomycin

humane kolorektale Adenokarzinomzellen

Hepa-1

DMEM + 10% FCS + 1% NEA + 1% Penicillin/Streptomycin

Murine Hepatomzellen

22


Material

12. Radioaktiv markierte Substanzen

35 S-L-Methionin, Perkin Elmer, Pfaffenhofen, Deutschland

32 P-a-NAD, Perkin Elmer, Pfaffenhofen, Deutschland

13. Antikörper

Primärantikörper Verdünnung Hersteller

Anti-LSR X25 1:200 Santa Cruz, Heidelberg, Deutschland

Anti-Flotillin-1 1:500 Sigma Aldrich, Taufkirchen, Deutschland

Anti-Caveolin-2 1:2000 Sigma Aldrich, Taufkirchen, Deutschland

Anti-Na + /K + -ATPase 1:5000 Abcam, Cambridge, UK

Sekundärantikörper Verdünnung Hersteller

Anti-Rabbit-HRP 1:3000 Rockland BioMol GmbH, Frankfurt, Deutschland

Anti-Mouse-HRP 1:3000 Rockland BioMol GmbH, Frankfurt, Deutschland

Anti-Rabbit-Alexa 1:200 Invitrogen Life Technologies TM , Darmstadt,

568

Deutschland

14. Enzyme

Polymerasen und Ligasen:

Enzym

PfuUltra Polymerase

Phusion Polymerase

T4 Ligase

Hersteller

Agilent Technologies, Böblingen, Deutschland

New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts USA

New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts USA

Restriktionsendonukleasen:

Enzym

BsrGI

SacI

BamHI

Hersteller

Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland

Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland

Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland

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Material

EcoRI

XhoI

NotI

NcoI

HindIII

Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland

Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland

Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland

Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland

Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland

24


Methoden

C. Methoden

1. Molekularbiologische Verfahren

1.1 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)

Die Polymerase-Ketten-Reaktion ist eine Methode zur Vervielfältigung von DNA bei der

in jedem Reaktionsschritt der zu amplifizierende Abschnitt verdoppelt wird. Speziell konstruierte

Primer grenzen den Abschnitt ein und dienen der Polymerase als Startpunkt der

Reaktion.

Circa 50 ng Ursprungs-DNA wird mit Primern, Desoxynukleotid-Lösung (dNTP), PCR-

Puffer (der Polymerase beiliegend) und Polymerase vermengt und mit Wasser auf 50 µl

Reaktionvolumen angeglichen. Die Mengenangaben der Zusätze sind von der verwendeten

Polymerase abhängig und richten sich nach den Hinweisen des Herstellers. Durch Erhitzen

auf 98°C wird die doppelsträngige DNA in Einzelstränge überführt (melting). Das Anlagern

der Primer (annealing) tritt nach Abkühlen auf die Primer-spezifische Temperatur ein.

Nach erneuter Erhöhung der Temperatur auf 72°C wird der von den Primern eingegrenzte

Abschnitt durch die Polymerase amplifiziert. Der Vorgang wird in 30 Zyklen wiederholt.

Die Inkubationszeiten sind von der Art der verwendeten Polymerase und der Primer abhängig

und müssen dementsprechend gemäß den Herstellerangaben angepasst werden.

1.2 Agarose-Gelelektrophorese

Mittels Elektrophorese im Agarosegel werden DNA-Fragmente gemäß ihrer Länge aufgetrennt.

Es wurden Gele aus 0,8 % Agarose und TAE-Puffer und dem Farbstoff Red-Safe TM

hergestellt. Circa 150 ng DNA wurden in 10 µl Wasser und 2 µl Ladepuffer vermengt und

anschließend in Geltaschen injiziert. Durch Anlegen einer elektrischen Spannung (110 V)

für 50 Minuten wandert die DNA zur positiv geladenen Elektrode. Das Maschennetzwerk

des Agarose-Gels trennt die DNA-Fragmente nach ihrer Größe. Unter UV-Licht wird die

mit Red-Save gefärbte DNA als Bande in dem Gel sichtbar. Die Größe der Fragmente

wurde anhand des kommerziell erhältlichen Markers Fermentas® DNA Ladder abgelesen.

25


Methoden

Material:

- TAE-Puffer: 40 mM TRIS-Acetat pH 8, 1 mM EDTA

- Ladepuffer: 0,25 % Bromphenolblau, 40 % Saccharose in Aqua bidest

1.3 Extraktion von DNA aus Agarosegelen

DNA-Fragmente, die in Agarose-Gelektrophorese nach ihrer Größe getrennt wurden, können

mittels Gel-Extraktions-Kits isoliert werden. Zunächst wurde eine Bande aus dem Gel

mit einem Skalpell ausgeschnitten und mit dem beiliegenden Puffer erwärmt. Menge des

eingesetzten Puffers, Temperatur und Dauer der Inkubation richteten sich nach den Angaben

des Herstellers. Anschließend wurde das flüssige Gel-Puffer-Gemisch in eine Säule

mit DNA-bindender Membran gegeben und zentrifugiert. Danach wurde die Säule mit 200

µl Ethanol haltigem Waschpuffer zweimal gewaschen und abschließend die an der Membran

haftenden DNA mit einer definierten Menge (12µl) destillierten Wassers eluiert.

1.4 DNA Konzentrationsmessung

Die Konzentrationsbestimmung der DNA-Lösungen wurde mithilfe des Nanodrop ND

1000 durchgeführt. Es wurde 1µl der DNA-haltigen Lösung auf die Messvorrichtung des

Gerätes aufgetragen und die Messung gestartet. Das Gerät ermittelte dabei mittels Spektrofotometrie

die Absorption der Probe und errechnete daraus direkt die Konzentration.

1.5 Insertion von PCR-Produkten mithilfe von Restriktionsendonukleasen und Ligationsenzymen

in Plasmide

Für die Klonierung und Expression von Genen wurden Plasmide verwendet. Es handelt

sich dabei um ringförmige DNA-Strukturen, die unter anderem Resistenzen gegen bestimmte

Antibiotika kodieren und von Bakterien aufgenommen und dadurch vervielfältigt

werden können. Zunächst wurden das Plasmid und das zu exprimierende PCR-Produkt mit

Restriktionsendonukleasen geschnitten. Die Auswahl der Restriktionsendonukleasen richtet

sich nach den in der multiple-cloning-site des Plasmids auftretenden palindromischen

Sequenzen. Die Enzyme wurden mit den vom Hersteller empfohlenen Reaktionspuffern

26


Methoden

und dem DNA-haltigen Material in destilliertes Wasser gelöst und bei 37°C eine Stunde,

beziehungsweise bei DNA-Mengen über 500 ng 3 Stunden, inkubiert. Die Mengen an Enzym

und Puffer richteten sich nach den Angaben der Hersteller. Danach wurde das geschnittene

PCR Produkt durch die Ligation in das geöffnete Plasmid integriert. Das geschnittene

PCR Produkt wurde im molaren Verhältnis 3:1 zu dem geöffnetem Plasmid zugegeben

und mit der Ligase, dem zugehörigen ATP-haltigen Ligationspuffer und destilliertem

Wasser gemäß Herstellerangabe vermischt. Danach wurde entweder bei 16°C über

Nacht oder bei 37°C für eine Stunde inkubiert.

1.6 Transformation in chemo-kompetenten E. coli

Nach erfolgter Klonierung des Gens in das Plasmid wird dieses nun mittels Transformation

in Chemo-kompetente Stämme von E. coli wie XL1 Blue oder TG-1 eingebracht. E. coli-

Proben wurden auf Eis aufgetaut, mit dem Ligationsprodukt vermischt und für 20 Minuten

auf Eis inkubiert. Anschließend erfolgte ein Hitzeschock bei 42°C für 50 Sekunden, bei

dem die Membran der Bakterien für Plasmide durchlässig wurde. Nach Abkühlen auf Eis

wurde dem Gemisch 500 µl SOC-Medium zugegeben und 45 Minuten bei 37°C inkubiert.

Danach wurde die Suspension bei ca. 5000 x g zentrifugiert und die Bakterien im Pellet in

50 µl Medium resuspensiert. Die Suspension wurde anschließend auf eine Antibiotikahaltige

Agarplatte ausplattiert. Die Auswahl des Antibiotikums erfolgt gemäß der vom

Plasmid kodierten Antibiotikaresistenz. Abschließend wurde die Platte über Nacht bei

37°C inkubiert bis mehrere Einzelkolonien, bestehend aus Einzelklonen, sichtbar waren.

1.7 Plasmidisolation aus chemo-kompetenten E. coli

Um die Plasmide nun wieder aus den Chemo-kompetenten E. coli zu gewinnen, wurde ein

kommerziell erhältliches Plasmid-Isolations-Kit verwendet. Zunächst wurde eine Einzelkolonie

von der Agar-Platte entnommen und eine Vorkultur aus 5 ml flüssigem Antibiotikum-haltigem

LB-Medium angelegt. Die Vorkultur wurde anschließend über Nacht bei

37°C inkubiert. Das weitere Verfahren wurde nach dem Protokoll des Herstellers durchgeführt.

Zunächst wurde die Vorkultur zentrifugiert um die Bakterien vom Medium zu trennen.

Das Pellet wurde anschließend in einem Resuspensions-Puffer, der RNAse enthielt,

27


Methoden

gelöst. Durch Zugabe eines Detergenz-haltigen Lyse-Puffers wurden die Bakterien lysiert.

Danach wurde die chromosomale DNA mittels des Neutralisationspuffers gefällt und anschließend

abzentrifugiert. Der Überstand wurde in eine Säule mit DNA-bindender Membran

überführt und diese ebenfalls zentrifugiert. Die an der Membran verbliebene DNA

wurde anschließend mit Ethanol haltigem Waschpuffer gewaschen und zum Schluss mit

Elutions-Puffer oder destilliertem Wasser eluiert und in Eppendorf-Reaktionsgefäßen aufgefangen.

Danach wurde die Konzentration des Eluats mittels Nanodrop bestimmt. Zur Kontrolle

wurde abschließend ein Verdau von 100 ng DNA mit den eingesetzten Restriktionsenzymen

und darauffolgender Gelelektrophorese durchgeführt. Zuletzt wurde ein Teil des fertigen

Konstrukts zur Sequenzanalyse verschickt.

2. Proteinbiochemische Methoden

2.1 Proteinexpression in Bacillus megaterium und Aufreinigung über Nickel-Beads

Für die Expression in Bacillus megaterium wurde der Vektor pHis 1522 verwendet, der

eine Tetracyclin-Resistenz und eine Polyhistidin-Sequenz, die an das zu exprimierende

Protein angefügt wird, kodiert. Nach erfolgreicher Klonierung des Zielgens in den Expressionsvektor

wurde dieser in Protoplasten (Zellen ohne Zellwand) von B. megaterium transformiert.

Hierfür wurden 3-5 µg des klonierten Vektors zu 500 µl Protoplastenlösung hinzugegeben

und mit 1,5 ml PEG-P bei Raumtemperatur vermischt. Anschließend wurden 5

ml SMMP hinzugegeben und vermischt. Durch 10 minütige Zentrifugation bei 1300 x g

wurden die Protoplasten sedimentiert und der Überstand abgenommen. Danach wurden

500 µl SMMP hinzugegeben und für 90 Minuten bei 37°C inkubiert. Zum Schluss wurde

dem Ansatz 2,5 ml CR5-Topagar hinzugefügt und die ganze Lösung auf eine vorgewärmte

Tetracyclin-Agar-Platte gegeben. Die Agar-Platte wurde mindestens für 24 Stunden bei

37°C inkubiert.

Als Nächstes wurde eine Vorkultur aus den gewachsenen Protoplasten-Kolonien hergestellt.

Mehrere Kolonien der Platte wurden entnommen und in 500 ml LB-Tetracyclin Medium

überführt. Die Suspension wurde dann bei 37°C über Nacht inkubiert. Danach wurde

28


Methoden

die Expressions-Kultur angelegt. Zu 1 Liter LB-Tetracyclin Medium wurden 100 ml der

Vorkultur hinzugegeben und bei 37°C inkubiert. Erreichte die optische Dichte der Kulturen

einen Wert > 0,4 gegenüber des Leerwertes des Mediums, wurde die Proteinexpression

durch Zugabe von 5 g Xylose pro Liter Kultur induziert. Zur Optimierung der Expression

wurden die Kulturen für 20 Stunden bei 16°C inkubiert.

Nach der Expression wurde das exprimierte Protein aus den Zellen aufgereinigt. Die

Hauptkultur wurde für 15 Minuten bei 6000 x g zentrifugiert. Das resultierende Pellet wurde

in Lysepuffer im Verhältnis 3 ml Puffer je 1 Gramm Pellet gelöst. Anschließend wurden

die Zellen im Mikrofluidizer bei 21000 psi aufgeschlossen und das Zelllysat für 60 Minuten

bei 40.000 x g zentrifugiert. Dabei wurde das proteinhaltige Zellplasma vom Zelldebris

getrennt. Der Überstand mit dem Expressionsprodukt wurde eine Stunde bei 4°C über

Kopf rotierend mit Nickel-Beads inkubiert um das Polyhistidinhaltige Expressionsprodukt

zu binden. Die Suspension wurde dann in eine PD-10 Säule gegeben und einige Male mit

dem Lysepuffer gewaschen. Dabei blieben die Nickel-Beads und die daran gebundenen

Proteine an einer in der Säule befindlichen Membran haften, während ungebundene Proteine

des Zelllysats durchflossen. Danach wurden 5-10 ml Imidazolhaltigen Elutionspuffer

auf die gewaschenen Nickel-Beads gegeben, um das Expressionsprodukt von den Nickel-

Beads zu trennen. Nach einer Inkubationszeit von 10 Minuten wurde das Eluat aufgefangen.

Da Imidazol die Proteineigenschaften beeinflussen kann, wurde das Protein in PBS

umgepuffert. Das Eluat wurde in eine Vivaspin 500 Säule gegeben und durch Zentrifugation

eingeengt. Danach wurde die konzentrierte Proteinlösung mit PBS verdünnt und erneut

durch Zentrifugation konzentriert. Dieser Schritt wurde einige Male wiederholt.

Material:

- LB-Tetracyclin: 10 mg/l Tetracyclin, LB Medium

- Xylose, Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe, Deutschland

- Lysepuffer pH 8: 20 mM Tris, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol, 500 µM EDTA, 10 %

Glycerin, Complete® Protease Inhibitor

- Elutionspuffer pH 8: 20 mM Tris, 300 mM NaCl, 500 mM Imidazol, 500 µM EDTA,

10 % Glycerin, Complete® Protease Inhibitor

- PBS (phosphate buffered saline): 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,4

mM KH2PO4 (pH 7,4)

29


Methoden

2.2 Proteinkonzentrationsbestimmung mittels Bradford

Der Bradford-Assay ist eine gängige Methode die Proteinkonzentration einer Lösung zu

bestimmen. Das Bradford-Reagenz besteht aus Coomassie-Brilliant-Blue, einem Farbstoff,

der sich spezifisch an Proteine anlagert. Durch die Anlagerung wird das Absorptionsmaximum

des Farbstoffes von 465 nach 595 nm verschoben. Dabei steht der Wert der Absorption

nahezu in linearer Abhängigkeit zur Proteinkonzentration. Die Proben wurden mit

1ml des Bradford-Reagenz vermengt und die Absorption bei 595 nm gemessen. Parallel

dazu wurde die Absorption von Proben mit definiertem Proteingehalt (beispielsweise Albuminlösung)

gemessen. Aus den Absorptionswerten der definierten Proben wurde eine

Eichgerade erstellt und näherungsweise deren Linearfunktion ermittelt. Mithilfe dieser

Lineargleichung wurden die Proteinkonzentrationen der zu ermittelnden Proben aus den

Absorptionswerten errechnet.

Material:

- Bradford Reagenz: 0,035 % (m/v) Coomassie Brilliant Blue G250, 25 % (v/v) Ethanol,

50 % H3PO4 (v/v), 25 % Aqua bidest.

2.3 SDS – Page

Ähnlich wie DNA-Abschnitte, lassen sich auch Proteine durch eine Gelelektrophorese

nach ihrer Größe auftrennen. Hierbei nimmt die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

(SDS-Page) die bedeutendste Rolle ein. Zunächst wurden Gele aus Acrylamid und SDS

(Sodiumdodecylsulfat) hergestellt, das durch die Polymerisierung von Acrylamid zu Polyacrylamid

ein dichtes Faser- und Maschennetzwerk ausbildet. Mit steigender Konzentration

an Acrylamid nimmt auch die Dichte des Netzwerkes und somit der Widerstand für

große Proteine zu. Proben mit Proteinen mittlerer Größe zwischen 20 und 120 kDa wurden

auf ein 12,5 % Acrylamid- haltiges Gel aufgetragen. Größere Proteine ließen sich in einem

Gradientengel mit ansteigender Acrylamidkonzentration von 3-10 % auftrennen. Die Proteinproben

wurden mit Lämmli-Puffer vermengt und bei 95°C gekocht, um die Proteine zu

denaturieren. Danach lagen die Proteine in ihrer Primärstruktur und als stark negativ geladene

Moleküle vor und ermöglichten so eine Auftrennung nach der Proteingröße. Das Gel

wurde in eine Kammer mit SDS-haltigem Laufpuffer eingespannt und die vorbereiteten

30


Methoden

Proteinproben, sowie ein handelsüblicher Proteinmarker, mit einer Mikroliterspritze (Hamilton)

in die Geltaschen injiziert. Durch Anlegen einer Stromquelle mit 35 mA für 45

Minuten an die Gelkammer wurden die Proteine aufgetrennt. Danach wurde das Gel entnommen

und in Coomassie-Färbelösung kurz erhitzt und 10 Minuten geschwenkt. Durch

mehrmaliges Waschen des gefärbten Gels mit Entfärbe-Lösung wurde der Farbstoff aus

dem Gel, jedoch nicht aus den angefärbten Proteinen, ausgewaschen. Die nun sichtbaren

Banden wurden dann mit dem Proteinmarker verglichen und so das Molekulargewicht ermittelt.

Material:

- Lämmli-Puffer: 126 mM Tris-HCl, 20 % Glycerin, 4 % SDS, 0,02 % Bromphenolblau,

0,1 mM DTT

- Sammelgellösung 5 % Acrylamid (für 10 ml): 1,7 ml 30 % wässrige Acrylamidlösung,

2 ml 0,625 M Tris-HCl (pH 6,8), 50 μl 20 % (m/v) SDS, 100 μl 10 % (m/v) Ammoniumperoxodisulfat,

10 μl TEMED (N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin), 6,14 ml

Aqua bidest .

- Trenngellösung 12,5 % Acrylamid (für 10 ml): 5 ml Tris-HCl (pH 8,8), 4,17 ml 30 %

wässrige Acrylamidlösung, 45 μl 20 % (m/v) SDS, 100 μl 10 % (m/v) Ammoniumperoxodisulfat,

5 μl TEMED, 680 μl Aqua bidest.

- Gradiententrenngel 3 % Acrylamid (für 10 ml): 5 ml Tris-HCl (pH 8,8), 1,62 ml 30 %

wässrige Acrylamidlösung, 0,05 μl 20 % (m/v) SDS, 0,15 μl 10 % (m/v) Ammoniumperoxodisulfat,

0,06 μl TEMED, 3,2 μl Aqua bidest.

- Laufpuffer: 25 mM Tris-HCl, 192 mM Glycin, 1 g/l SDS

- Färbelösung (für 1 l): 1,25 g Coomassie Brilliant Blue R 250, 92 ml Eisessig, 454 ml

Methanol, 454 ml Aqua bidest.

- Entfärbelösung (für 1 l): 100 ml Eisessig, 900 ml Aqua bidest.

2.4 Western Blot/Immunoblot

Mithilfe des Western Blots werden Proteine auf eine Membran übertragen und durch einen

anschließenden Immunoblot, über die Bindung spezifischer Antikörper identifiziert. Zunächst

wurden Proteine nach Auftrennung mittels Gelelektrophorese auf eine bindende

31


Methoden

Membran (Nitrocellulose oder PVDF) übertragen. Bei Membranen aus PVDF wurden diese

zunächst durch 10 minütiges Einlegen in Methanol aktiviert. Das ungefärbte Gel wurde

auf die proteinbindende Membran aufgelegt. Gel und Membran wurden anschließend zwischen

mehrere in Blot-Puffer getränkte Whatman-Papiere eingespannt und in die Blot-

Apparatur eingesetzt. Bei der Semi-Dry-Methode wurde eine Spannung von 12 V über 30

Minuten an die Apparatur angelegt. Bei der Wet-Blot-Methode hingegen wurde das eingespannte

Gel-Membran-Sandwich in eine Kammer mit eisgekühltem Blotpuffer eingesetzt

und eine Spannung von 100 V für 90 Minuten angelegt. Danach wurde die Membran für

60 Minuten in TBS-T mit 5 % Milchpulver geschwenkt, um Areale der Membran, an denen

kein Protein gebunden hat, abzusättigen. Im Anschluss daran wurde die überschüssige

Milchpulverlösung abgegossen und die Membran 4-5-mal mit TBS-T gewaschen. Währenddessen

wurde die vom Hersteller empfohlene Verdünnung des Primärantikörpers mit

ca. 6 ml TBS-T vermischt und nach dem letzten Waschschritt auf die Membran gegeben.

Diese wurde danach bei 4°C über Nacht auf der Wippe inkubiert. Am Folgetag wurde die

überschüssige Antikörperlösung abgegossen und die Membran erneut 3-4-mal mit TBS-T

gewaschen. Dann wurde ein Peroxidase-gekoppelter Sekundärantikörper, der spezifisch an

den Fc-Bereich des Primärantikörpers bindet, in der vom Hersteller empfohlenen Verdünnung

in TBS-T gelöst und auf die Membran gegeben. Diese wurde anschließend für 60

Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Durch die Zugabe von BSA (Bovines Serum Albumin)

zu der Lösung konnten unspezifische Antikörperbindungen minimiert werden.

Nach der Inkubation mit dem Sekundärantikörper wurde die Membran erneut 3-4-mal mit

TBS-T gewaschen und zum Abschluss mit ECL-Lösung (enhanced-chemoluminescence)

benetzt. Durch die an den Sekundärantikörper gekoppelte Peroxidase wurde Wasserstoffperoxid

in der ECL-Lösung gespalten, wodurch das ebenfalls darin enthaltene Luminol

oxidiert und zur Lumineszenz angeregt wurde. Die Emission wurde mit Hilfe einer CCD

Kamera detektiert und aufgezeichnet.

Material:

- Blotpuffer (1 l): 3 g Tris-HCl (pH 7,4), 14,4 g Glycin, 200 ml Methanol, 800 ml Aqua

bidest.

- TBS-T: 200 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 0,1 % Tween-20

32


Methoden

- ECL-Lösung: frisch anzusetzende Lösung aus 2 Lösungen zu gleichen Teilen

Lösung 1: 2,5 mM Luminol, 0,4 mM p-Cumarsäure, 100 mM Tris-HCl (pH 8,0)

Lösung 2: 5 mM H2O2, 100 mM Tris-HCl (pH 8,0)

2.5 Nach-ADP-Ribosylierung in-vitro

Durch die Nach-ADP-Ribosylierung wurde die Menge des verbleibenden Aktins einer Zelle

nach der Vergiftung mit ADP-ribosylierenden Toxinen bestimmt. Dabei wurden Zellen

nach der Vergiftung mit gekühltem PBS gewaschen und anschließend mit eisgekühltem

ADP-Ribosylierungspuffer benetzt. Mit Hilfe eines Zellschabers (cell scraper) wurden die

Zellen von den Schalen abgelöst und in Eppendorf-Gefäße überführt. Durch 10 maliges

Auf- und Abziehen der Zell-Puffer-Suspension mittels einer 1ml Spritze und einer 26G

Kanüle wurden die durchgesaugten Zellen aufgebrochen. Danach wurden Zytosol und Debris

durch Zentrifugation für 15 Minuten bei 4°C und 21.000 x g voneinander getrennt.

Auf 30 µg Gesamtprotein normierte Proben des Zytosols (Bestimmung über Bradford)

wurden anschließend 1µg C2I und [ 32 P]-NAD zugegeben und für 30 Minuten bei 37°C im

Schüttler inkubiert. Die ADP-Ribosylierung wurde durch Zugabe von SDS-Probenpuffer

und Erhitzen auf 95°C gestoppt. Das Proteingemisch wurde mittels SDS-Gelektrophorese

aufgetrennt und das Gel in der Trocknungsapparatur fixiert. Das getrocknete Gel wurde

anschließend mittels Autoradiographie ausgewertet. Das Signal auf der Fotoplatte korreliert

mit der Menge des ADP-ribosylierten Aktins, das durch den Einbau des [ 32 P]-NAD

radioaktiv markiert wurde.

Material:

- ADP-Ribosylierungspuffer: 20 mM Tris, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT,

Complete® Protease Inhibitor

2.6 In-vitro-Translation und Aufreinigung von extrazellulären Abschnitten von LSR

Zur Expression von N-terminalen Abschnitten von LSR wurde die Methode der In-vitro-

Translation in Retikulozyten-Lysaten herangezogen. Hierfür wurde ein kommerzielles Kit,

das Promega TnT® T7 Coupled Reticulocyte Lysate System, verwendet. Zunächst wurde

33


Methoden

die DNA-Sequenz des gewünschten Proteins in den pET28a Vektor kloniert, der sich für

die Expression von Proteinen sowohl in E.-coli-Systemen als auch in Retikulozyten-

Lysaten eignet. Das weitere Vorgehen orientierte sich am Protokoll des Herstellers. Nach

Auftauen auf Eis wurden 25 µl des Lysates mit 2 µl des mitgelieferten Reaktions-Puffers,

1µl des Methionin-freien Mediums, 1µl des RNAse-Inhibitors RNAsin®, und 1µg der

Template-DNA in einem low-binding Eppendorf-Reaktionsgefäß vermengt. Anschließend

wurden 2µl [ 35 S]-Methionin und 1µl der TNT® RNA Polymerase hinzugefügt und die

Mischung bei 30°C für 90 Minuten inkubiert. Die hierbei synthetisierten Proteine wurden

anschließend mithilfe des Promega MagZ TM Purification Systems von den anderen proteinhaltigen

Elementen der Retikulozyten, vor allem dem darin enthaltenen Hämoglobin,

getrennt. Dabei wurde, gemäß den Angaben des Herstellers, 50 µl des Lysates mit 100 µl

des mitgelieferten Waschpuffers vermengt und den Magnet-Beads aus 60 µl vermengt.

Durch 15-minütige Inkubation wurden die translatierten Proteine an die Beads gebunden.

Anschließend wurden die Reagenzgefäße auf einen Magnetständer platziert und somit die

Magnet-Beads und die daran gebundenen Proteine auf den Grund des Eppendorf-Gefäßes

gezogen. Danach wurde der Überstand entfernt. Im Anschluss daran erfolgten 3 Waschritte

mit jeweils 200 µl Waschpuffer. Im letzten Schritt wurden die Beads mit 100 µl 1 M

Imidazol-haltigem Elutionspuffer versetzt und für 10 Minuten inkubiert. Nach erneutem

Platzieren auf den Magnetständer wurde der Überstand, der die translatierten Proteine enthielt

entnommen und in neue Eppendorf-Gefäße überführt. Die exprimierten Proteine wurden

abschließend durch SDS-Gelelektrophorese und Autoradiographie sichtbar gemacht.

2.7 Kopplung von CDTb an Tosyl-aktivierte Magnet-Beads

Gemäß den Empfehlungen des Herstellers wurden für die Kopplung von Proteinen an die

Beads zunächst die hierfür notwendigen Puffer A – E hergestellt. Anschließend wurden

335 µl Beads (entsprechend 10 µg) mit Hilfe des Magnetständers mit Puffer B (0.1 M Natriumphosphat

Puffer pH 7,4) gewaschen. Danach wurden die Beads durch Platzieren auf

den Magnetständer vom Puffer getrennt und dieser entnommen. Daraufhin wurden den

Beads 200 µg des in Lösung befindlichen Proteins zugegeben, mit Puffer B auf ein Gesamtvolumen

von 150 µl aufgefüllt und 100 µl Puffer C (3 M Ammoniumsulfat in Puffer

B) hinzugefügt. Der Ansatz wurde dann für 18 Stunden bei 37°C im Schüttler inkubiert.

34


Methoden

Durch Platzieren auf den Magnetständer wurden die Beads und die daran gebundenen Proteine

von der Lösung getrennt und der Überstand wurde entfernt. Durch Zugabe von Puffer

D (PBS pH 7,4 + 0,5 % BSA) und einstündige Inkubation bei 37°C wurde die Oberfläche

der Beads an denen kein Protein gebunden hatte, abgesättigt. Abschließend wurden die

Beads durch Platzieren auf den Magnetständer wieder von der Lösung getrennt und zur

Lagerung in 480 µl Puffer E (PBS pH 7,4 + 0,1% BSA) überführt.

Abb. 4: Schematische Darstellung der Bindung von

Proteinen an tosyl-aktivierte Beads (modifiziert

nach Invitrogen®, life technologies).

2.8 Präzipitation (Pull-Down-Assay)

Der Pull-Down stellt eine klassische biochemische Methode zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen

dar. Im Folgenden wurden die im Retikulozyten-Lysat exprimierten

Konstrukte und die Protein-gekoppelten Magnet-Beads verwendet. Zunächst wurden

50 µl des Proteinlysates mit 20 µl der Protein-gekoppelten Magnet-Beads für 60 Minuten

bei 4°C unter Rotation inkubiert. Durch Platzieren des Ansatzes auf einen Magnetständer

wurden die Protein-gekoppelten Magnet-Beads und die daran bindenden Proteine auf

den Boden der Reaktionsgefäße gezogen und der Überstand abgenommen. Anschließend

wurden die Proben zunächst 3-mal mit 500 µl PBS, daraufhin einmal mit 500 µl PBS +

500 mM NaCl und zuletzt einmal mit 500 µl PBS + 0,1 % Tween-20 gewaschen. Die Ent-

35


Methoden

fernung der Waschsubstanzen erfolgte dabei jeweils durch Platzieren des Ansatzes auf den

Magneten. Zum Schluss wurden die Beads mit heißem Probenpuffer vermengt und für 10

Minuten inkubiert. Die Auswertung erfolgte mittels SDS-Gelelektrophorese und Autoradiographie.

3. Zellkultur

3.1. Kultivierung von Zellen

Im Rahmen dieser Arbeit wurden die bereits unter B.11 erwähnten und beschriebenen Zelllinien

verwendet. Die Zellen wurden in speziellen Kulturflaschen angesiedelt und vermehrt.

Die Teilungsrate ist dabei variabel und hängt vom jeweiligen Zelltypus ab. War

eine Stammflasche dicht bewachsen, wurde diese geteilt (splitting). Hierfür wurde das Medium

zunächst abgegossen und die Flasche mit den Zellen mit sterilem PBS gewaschen.

Die Zellen wurden anschließend mit 2 ml einer Trypsin-EDTA-Lösung durch proteolytischen

Abbau der Oberflächenproteine von der Kulturflaschenwand abgelöst und in Suspension

gebracht. Durch Zugabe von 8 ml Vollmedium wurde das Trypsin inhibiert und

jeweils 1/10 der Suspension in neue Kulturflaschen gegeben. Danach wurden die Flaschen

erneut bei 37°C und 5 % CO2 im Brutschrank inkubiert. In regelmäßigen Abständen wurde

ein Teil der Zellsuspension nach dem Ablösen mit Dimethylsulfoxid (DMSO) vermengt

und als Reserve in flüssigem Stickstoff dauerhaft eingelagert.

Material:

- Trypsin-Lösung: steriles PBS, 10 mM EDTA, 0,5 % Trypsin

3.2. Vergiftungsversuche mit CDT

Die einfachste Methode toxische Effekte oder deren Inhibition zu untersuchen bestand

darin, Zellen mit den entsprechenden Substanzen in Kultur zu inkubieren und über einen

Zeitverlauf mikroskopisch zu beobachten, ob sich die Morphologie charakteristisch verän-

36


Methoden

derte. Dazu wurden Zellen in eine 6-Well Schale ausgesät und in Medium kultiviert bis ein

semikonfluenter Zellrasen entstand. Bevor die Zellen vergiftet wurden, wurde das alte Kulturmedium

abgesaugt, die Zellen mit PBS gewaschen und 0,5-1 ml neues Medium hinzugegeben.

Anschließend wurde CDT in einer Konzentration von 2-10 nM hinzugegeben und

die Zellen bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Je nach Konzentration des Toxins zeigten

sich bereits nach 30 Minuten im Lichtmikroskop sichtbare Veränderungen der Zellmorphologie.

3.3. Isolierung von detergent-resistant-membranes

Wie in der Einleitung erwähnt, handelt es sich bei detergent-resistant-membranes um

Membrandomänen, die sich nicht in kaltem Triton lösen. Um DRMs zu isolieren, wurden

Zellen zunächst mit einem Zellschaber aus der Kulturschale abgelöst und jeweils 1-2 x 10 6

Zellen in Eppendorf-Gefäße überführt. Anschließend wurden verschiedene Proben mit

CDTb, oder als Kontrolle mit BSA, unter verschiedenen Bedingungen vorinkubiert und

anschließend mit kaltem PBS gewaschen. Nach dem Waschen wurden die Zellen in 500 µl

PBS und Complete® Protease Inhibitor resuspendiert und mit einer 1 ml Spritze und 26G

Kanüle durch 10 maliges Auf- und Abziehen aufgebrochen. Durch Zentrifugation bei

21.000 x g und 4°C für 60 Minuten sedimentierten die Membranen und Zellorganellen und

wurden vom Zytosol getrennt. Das Pellet wurde anschließend in 300 µl 4°C kaltem Triton-

Puffer gelöst und für 90 Minuten bei 4°C rotierend inkubiert. Danach wurden die löslichen

Membranabschnitte von den unlöslichen durch Zentrifugation bei 4°C und 21.000 x g für

30 Minuten voneinander getrennt. Der Überstand wurde abgenommen und mit SDS-

Probenpuffer vermengt. Das Pellet wurde mit 300 µl SDS-Probenpuffer versetzt, aufgekocht

und über Nacht rotierend inkubiert. Beide Probenanteile, Überstand und Pellet, wurden

auf SDS-Gele aufgetragen und anschließend lipid rafts-spezifische oder -assoziierte

Proteine mittels Westen-Blot detektiert.

Material:

- Triton-Puffer pH 7,5: 25 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 % Triton-Tx 100,

Complete® Protease-Inhibitor

37


Methoden

3.4. Isolierung von lipid rafts mittels Sucrose-Gradienten

Das niedere spezifische Gewicht der lipid rafts-Membrandomänen, bedingt durch den hohen

Cholesterinanteil, ermöglicht eine Auftrennung der Membrananteile im Sucrose-

Gradienten. Zellen aus 2 dicht bewachsenen Stammflaschen wurden hierfür mit PBS (+ 10

mM EDTA) abgelöst und in ein 15 ml Reaktionsgefäß überführt. Anschließend wurde

EDTA durch 3 Waschschritte mit PBS eliminiert. Das Zellpellet wurde danach in 4 ml

PBS resuspendiert und die Suspension gleichmäßig auf zwei 15 ml Reaktionsgefäße verteilt.

Die Ansätze wurden mit CDTb beziehungsweise mit BSA bei 37°C inkubiert, wobei

ein Absinken der Zellen durch regelmäßiges Invertieren verhindert wurde. Danach wurden

die Proben dreimal mit PBS gewaschen, um ungebundenes CDTb zu entfernen. Im Anschluss

wurden die Zellen mit 1,5 ml 1 %igen Triton-Puffer versetzt und das Gemisch für

45 Minuten bei 4°C rotierend inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Proben mit 3,5 ml

60 %iger Sucrose-Lösung vermengt, so dass eine Finalkonzentration von 40 % Sucrose

vorlag. Diese Lösung wurde auf den Boden eines 25 x 89 mm Beckman-Ultra-zentrifugen-

Röhrchens (38,5 ml) platziert und zunächst mit 21 ml einer 35 % und abschließend mit 7,5

ml einer 15 % Sucrose-Lösung überschichtet, so dass ein diskontinuierlicher Sucrose-

Gradient (Abb. 5) entstand.

Abb. 5: Skizzierung eines diskontinuierlichen

Sucrose-Gradienten. Cholesterinreiche lipid raft

Membrandomänen reichern sich aufgrund der

geringeren Dichte in den höher gelegenen Fraktionen

1-4 an.

38


Methoden

Danach wurde für 18 Stunden bei 32.000 rpm (ca. 200.000 x g) und 4°C in einem Ausschwing-Rotor

(SW32) zentrifugiert. Anschließend wurde der Boden des Röhrchens mit

einer Venofix-Butterfly-Kanüle angestochen. Der Gradient wurde gleichmäßig abgelassen

und auf 8 Reaktionsgefäße á 4,2 ml verteilt, so dass 8 Fraktionen aus unterschiedlicher

Höhe des Gradienten vorlagen. Proben aus jeder Fraktion wurden auf ein SDS-Gel aufgetragen

und die entsprechenden Proteine mittels Western-Blot-Analyse detektiert.

Material:

- Sucrose-Lösungen: Sucrose in entsprechender Menge, Aqua bidest., 10 nM Tris-HCl

pH 7,4

3.5. Durchflusszytometrie FACS

Mit Hilfe der Durchflusszytometrie wurde die Bindung von Dylight488-gekoppeltem CDTb

an Zellen und die kompetitive Inhibition der Bindung untersucht. Das verwendete FACS-

Gerät FACSCalibur beinhaltete einen Argon-Laser der Wellenlänge 488 nm. Der Durchfluss

von Zellen erzeugt dabei ein charakteristisches und zellspezifisches Streuspektrum.

Dylight488-gekoppeltes CDTb, das an der Zelloberfläche gebunden hatte, wurde durch den

Laser angeregt und führte somit zu einer Änderung des Streuspektrums. Der Vergleich

zwischen Zellen an denen CDTb-Dylight488 gebunden und nicht gebunden hatte, zeichnete

sich als Verschiebung zwischen den Spektren aus. Zunächst wurden Zellen aus Stammflaschen

mit 10 mM EDTA-PBS abgelöst, dreimal mit PBS gewaschen und anschließend die

Zellzahl mit Hilfe einer Zählkammer bestimmt. Je Ansatz wurden 150.000 Zellen verwendet

und in Eppendorf-Gefäße überführt. Für Untersuchungen zur Bindung von CDTb an

der Zelloberfläche wurden die Ansätze mit 2 µg CDTb-Dylight488 für 10 Minuten oder mit

PBS als Leerkontrolle inkubiert und anschließend wieder dreimal mit PBS gewaschen, um

ungebundenes CDTb zu entfernen. Zunächst wurde die Kontrolle in das FACS-Gerät eingelesen

und die Einstellungen zur optimalen Messung adaptiert. Anschließend wurden die

übrigen Proben gemessen und mit der Kontrolle verglichen.

39


Methoden

3.6. Immunohistochemische Färbung von Zellen und laser-scanning-Konfokal-

Mikroskopie

Mit der laser-scanning-Konfokalmikroskopie können bestimmte fluoreszenzmarkierte Proteine

von Zellen unter dem Mikroskop sichtbar gemacht werden. Hierfür wurden Zellen

auf Deckgläschen ausgesät und inkubiert bis darauf ein semikonfluenter Zellrasen entstand.

Dem Medium der Deckgläschen wurde CDTb-Dylight488 oder als Kontrolle PBS

zugegeben und für 20 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit

PBS gewaschen. Danach wurden die Zellen mit steril-filtrierter Paraformaldehyd-Lösung

(4 %) für 20 Minuten bei Raumtemperatur fixiert und anschließend erneut 2-mal mit PBS

gewaschen. Durch die Zugabe einer Lösung aus 15 % Triton X 100 und PBS wurden die

Zellen permeabilisiert und anschließend mit einer Lösung aus PBS, 1 % BSA und 0,05 %

Tween-20 geblockt. Danach wurde Anti-LSR X25 Antikörper auf die Deckgläschen gegeben

und über Nacht bei 4°C unter Lichtabschluss inkubiert. Am Folgetag wurden ungebundene

Antikörper durch 3-maliges Waschen mit PBS + 0,05 % Tween-20 entfernt und

die Deckgläschen für 60 Minuten bei Raumtemperatur mit Fluoreszenzfarbstoffgekoppeltem

Sekundärantikörper (Anti-Rabbit-Alexa568) inkubiert. Anschließend wurden

die Zellen dreimal mit PBS-T 0,05 % und danach 2 Minuten lang mit 70 % Ethanol gewaschen.

Daraufhin wurden die Deckgläschen für 1 Minute in 100 % Ethanol eingelegt, danach

an der Luft getrocknet und abschließend mit Dapco auf Objektträgern fixiert. Die

fertigen Objektträger wurden bei 8°C gelagert. Durch Belichten mit einem Zweifarben-

Laser mit den Wellenlängen 488 nm und 561 nm wurden sowohl das Dylight488 als auch

der gebundene Alexa-gekoppelte Sekundärantikörper angeregt. Die daraus resultierende

Lichtemission wurde über eine Kamera aufgezeichnet und gemäß der Wellenlänge als grünes

und rotes Signal im Mikroskop-Bild dargestellt.

40


Ergebnisse

D. Ergebnisse

Seit der Entdeckung der hypervirulenten Stämme von C. difficile und des binären Toxins

CDT konnten bereits zahlreiche molekulare Prozesse, die zur Pathogenese der Vergiftung

mit dem Toxin beitragen, entschlüsselt werden. Während die Wirkung der katalytischen

Komponente von CDT auf molekularer Ebene bereits weitgehend bekannt ist, waren die

Mechanismen zur Aufnahme von CDT bisher noch nicht hinreichend erforscht. Die bedeutendste

Entdeckung der letzten Jahre war hierbei die Entdeckung des Zelloberflächenrezeptors

LSR als Zielrezeptor für CDT. Jedoch blieben weiterführende Fragen zu den biochemischen

Prozessen nach der Bindung von CDTb an LSR sowie zu Mechanismen der Internalisierung

des Toxin-Rezeptor-Komplexes, weiterhin offen. Zwar wurden diesbezüglich,

aufgrund von Untersuchungen des C. perfringens Iota-Toxins, Vermutungen geäußert,

jedoch gab es bisher keine Untersuchungen bezüglich der biochemischen Interaktionen des

Rezeptors nach der Bindung des Toxins. So blieb bisher noch unklar, welchen Stellenwert

der Rezeptor LSR bei der Assoziation der oligomeren Formen der Iota-ähnlichen Toxine

zu lipid rafts innehat. Im Rahmen dieser Arbeit wurden deshalb verschiedene Analysen

von LSR getätigt, um dieser Frage nachzugehen und Erkenntnisse über die biochemischen

Interaktionen nach der Bindung von CDTb an LSR zu gewinnen.

1. Akkumulation von LSR in Membran-Mikrodomänen nach Bindung von

CDTb

Analysen zum Iota-Toxin von C. perfringens haben bereits gezeigt, dass im Zuge der Anlagerung

von Iota-B an die Zelloberfläche eine spezifische Verteilung der oligomeren Iota-

B-Komplexe in Membrandomänen zu beobachten ist. So zeigte sich, dass monomeres Iota-

B zwar in löslichen Domänen der Zellmembran vorliegt, jedoch die oligomere Form ausschließlich

in Cholesterin-reichen Mikrodomänen, den lipid rafts, zu finden ist (Nagahma

et al., 2004; Hale et al., 2004). Schon damals wurde aufgrund dieser Ergebnisse diskutiert

ob lipid rafts als Plattform für die Aufnahme von Iota-Toxin dienen könnten. Jedoch gab

es keine Hinweise darauf, ob der damals noch unbekannte Zelloberflächenrezeptor ebenfalls

in Abhängigkeit von der Bindung des Toxins in verschiedenen Membrankomparti-

41


Ergebnisse

menten vorliegt oder die Assoziation zu Membrankompartimenten ändert. Um diese Frage

zu klären, wurden zunächst H1-HeLa Zellen, die LSR an der Zelloberfläche exprimieren

(H1-HeLa(+LSR)), nach Inkubation mit CDTb-Dylight488 fluoreszenzmikroskopisch untersucht

und die Verteilung von CDTb und des LSR-Rezeptors über immunhistochemische

Färbung mit einem Anti-LSR-Antikörper analysiert. Hierbei zeigte sich ein deutlich punktförmiges

Verteilungsmuster von LSR, das sich kongruent zur Verteilung von CDTb entlang

der Zellmembran darstellte (Abb. 6). Hieraus ergaben sich erste Hinweise, dass nicht

nur oligomeres CDTb, sondern auch LSR nach der Bindung in Subkompartimenten der

Zellmembran akkumulieren (cluster).

Abb. 6: LSR und CDTb kolokalisieren in Membran-Mikrodomänen

Inkubation von H1-Hela(+LSR) Zellen mit 20 nM DyLight 488 markiertem CDTb für 30 min. bei 37°C

und anschließender immunhistochemische Färbung mit Anti-LSR-Antikörper. Die Konfokal-

Mikroskopie zeigt LSR als rotes, DyLight 488 markiertes CDTb als grünes Signal. Das gelbe Signal in

der Fusion zeigt die Kolokalisation beider Signale. Die Skala entspricht 10 µm.

Diese Verteilung konnte ebenfalls bei EGFP-gekoppeltem LSR mittels live cell imaging

beobachtet werden. Hierfür wurden H1-HeLa-Zellen mit EGFP-gekoppeltem LSR transfiziert

und für 30 Minuten bei 37°C mit CDTb inkubiert. Die Vergiftung wurde mittels

time-lapse-Mikroskopie beobachtet und dokumentiert. Innerhalb der Inkubationszeit zeigte

sich hier eine Änderung der Verteilung von EGFP-LSR von einer initial gleichmäßigen zu

einer punktförmigen Verteilung. Wurde dieser Vorgang jedoch bei 10°C wiederholt, blieb

EGFP-LSR, einhergehend mit einer Abnahme der Membran-Fluidität, gleichmäßig über

die Zellmembran verteilt (Abb. 7). Dies führte zu der Annahme, dass CDTb die Akkumulation

von LSR in Membran-Mikrodomänen induziert.

42


Ergebnisse

Abb. 7: CDTb induziert die Akkumulation von EGFP-LSR in Membran-Mikrodomänen

EGFP-LSR exprimierende H1-HeLa-Zellen wurden mit 10 nM CDTb bei 10°C und bei 37°C für 30

Minuten inkubiert und mittels time-lapse-Mikroskopie beobachtet. Es zeigt sich eine Änderung der

Verteilung von EGFP-LSR bei 37°C nach Zugabe von CDTb jedoch nicht bei 10°C.

2. Induktion der Akkumulation von LSR in detergent-resistant-membranes

durch CDTb

Um die unter D.1. beobachteten Membran-Mikrodomänen zu charakterisieren, wurde zunächst

ein vereinfachtes Membranauftrennungsverfahren gewählt, bei dem die in Triton X-

100 löslichen Membranbestandteile durch Zentrifugation von den Triton-unlöslichen

Fragmenten, zu denen auch die lipid rafts gehören, getrennt wurden. Western-Blots der

Triton-löslichen und Triton-unlöslichen Membranfraktionen von H1-HeLa(+LSR) Zellen,

die mit ansteigenden Konzentrationen von CDTb für 20 Minuten inkubiert wurden, zeigten

eine unterschiedliche Verteilung von LSR. Zellen, die nicht mit CDTb behandelt wurden,

wiesen deutlich mehr LSR in der Triton-löslichen Membranfraktion auf, aber nur ein geringes

Signal in der Triton-unlöslichen Fraktion. Mit steigender Konzentration von CDTb

zeigte sich jedoch eine Zunahme des LSR Signals in der unlöslichen Fraktion (Abb. 8A).

Dies führte zu der Schlussfolgerung, dass CDTb die Akkumulation in detergent-resistantmembranes

induziert. Des Weiteren zeigte sich, dass diese Effekte von der Inkubationsdauer

mit CDTb (Abb. 8B) und, korrelierend zu den bisherigen Ergebnissen der timelapse-Mikroskopie,

ebenfalls von der Temperatur abhängig waren (Abb. 8C).

43


Ergebnisse

Abb. 8: CDTb induziert die Akkumulation

von LSR in lipid rafts

A H1-HeLa(+LSR) Zellen wurden mit

ansteigenden Konzentrationen von CDTb

für 20 Minuten bei 37°C inkubiert. Die

isolierten Zellmembranen wurden in

Triton X-100 solubilisiert und durch

Zentrifugation in lösliche und nichtlösliche

Fraktionen getrennt. LSR wurde

mittels Western-Blot detektiert. Immunodetektion

von Flotillin-1 diente als Ladekontrolle

für die Probenmenge.

B Inkubation von H1-HeLa(+LSR) Zellen

mit 100 nM CDTb über ansteigende Inkubationszeiten

bei 37°C. Weiteres Vorgehen

wie in A beschrieben

C Inkubation von H1-HeLa(+LSR) Zellen

mit 100 nM CDTb für 20 Minuten bei

verschiedenen Temperaturen. Weiteres

Vorgehen wie in A beschrieben.

Als Nächstes wurden die als detergent-resistant-membranes identifizierten Membran-

Mikrodomänen näher analysiert. Hierfür wurden H1-HeLa(+LSR) Zellen, die mit CDTb

behandelt wurden, in Triton X-100 solubilisiert und mittels Zentrifugation in einem diskontinuierlichen

Sucrose-Gradienten in verschiedene Fraktionen aufgetrennt. Die geringe

Dichte der lipid rafts, bedingt durch den hohen Cholesterinanteil, führt zu einem gehäuften

Auftreten dieser Membrankompartimente in höher gelegenen, Sucrose-armen Schichten

des Gradienten. Lösliche Membranabschnitte, sowie Protein-Aggregate, befinden sich hingegen

in tieferen Schichten des Gradienten mit höheren Sucrose-Anteilen. SDS-PAGE und

Western-Blots der verschiedenen Fraktionen zeigten bei mit CDTb-behandelten Proben

eine Akkumulation von LSR in den oberen Schichten des Gradienten, die mit Markerproteinen

für lipid rafts wie Flotillin-1 und Caveolin-2 korrelierten. Natrium-Kalium-ATPase,

ein Markerprotein für die löslichen Membrankompartimente, wurde hingegen nur in den

unteren Gradientenschichten lokalisiert (Abb. 9).

44


Ergebnisse

Abb. 9: LSR korreliert mit lipid-rafts-spezifischen Proteinen nach Bindung von CDTb

H1-HeLa(+LSR) Zellen wurden mit 100 nM CDTb für 20 Minuten bei 37°C behandelt und

danach in Triton-Puffer solubilisiert und die Triton-löslichen von den unlöslichen Membranbestandteilen

im Sucrose-Gradienten durch Zentrifugation voneinander getrennt. Anschließend

erfolgte die Auftrennung des Gradienten in 8 Fraktionen sowie die Analyse der Proteinverteilung

mittels SDS-PAGE und Western-Blot. Die Fraktionen 1-4 korrelieren mit lipid rafts und

zeigen Signale für die lipid rafts-Markerproteine Flotillin-1 und Caveolin-2. Die Fraktionen 5-

8 entsprechen den löslichen Fraktionen und beinhalten das Markerprotein Na + /K + -ATPase.

Da die bisherigen Ergebnisse anhand von Versuchen mit H1-HeLa Zellen, die LSR künstlich

überexprimieren, zustande kamen, wurden die Effekte von CDTb auf Zelllinien mit

nativer LSR-Expression mittels der vereinfachten Membranauftrennung analysiert. SDS-

PAGE und Western-Blots von Triton-löslichen und unlöslichen Membranfraktionen von

CaCo-2, Vero und Hepa1 Zellen zeigten ebenfalls eine Akkumulation von LSR in den bereits

beschriebenen DRMs nach Behandlung mit CDTb (Abb. 10). Dies führte zu dem Ergebnis,

dass CDTb auch in Zelllinien mit nativer Expression von LSR die Akkumulation

des Rezeptors in DRMs induziert.

Abb. 10: CDTb induziert die Akkumulation

von LSR in DRMs bei nativen

Zellen

CaCo-2, Vero und Hepa1 Zellen wurden

mit 100 nM CDTb für 30 Minuten bei

37°C inkubiert und anschließend analysiert

wie in Abb. 8A beschrieben.

45


Ergebnisse

3. Bindung von Modul 4 von CDTb an LSR und Induktion der Akkumulation

in lipid rafts

Im weiteren Verlauf sollte nun geklärt werden, welche Abschnitte von CDTb notwendig

sind, um an den Rezeptor zu binden und die Ligand-Rezeptor-Interaktion zu induzieren.

Anhand früherer Studien zu Iota-ähnlichen-Toxinen geht man von einer Gliederung der B-

Komponenten in 4 Domänen oder Modulen aus, wobei die Module 1-3 die Oligomerisierung

der B-Komponente und Bindung der A-Komponente vermitteln. Das Modul 4 hingegen

soll für die Bindung und Interaktion mit dem Rezeptor verantwortlich sein. Von Iota-

Toxin war bereits bekannt, dass Konstrukte der B-Komponente, bei denen die letzten 200

Aminosäuren (entsprechend Modul 4) deletiert wurden, nicht mehr an Zellen binden konnten

(Marvaud et al., 2001). Somit stellte sich die Frage, ob das Modul 4 in der Lage ist,

suffizient an den Rezeptor zu binden und die oben beschriebenen Effekte auszulösen. Zunächst

wurde eine Chimäre konstruiert, bei der Modul 4 von CDTb mit den Modulen 1-3

des C2II Toxins von C botulinum (C2II(I-III)/CDTb(IV)-Chimäre) verknüpft wurde (Abb.

11). Da das C2-Toxin nachweislich nicht über LSR in die Zelle aufgenommen wird (Papatheodorou

et al., 2011), trotzdem jedoch eine homologe Strukturverwandschaft zu CDT

aufweist (s. Kapitel A.2.2), waren die Module 1-3 der Bindekomponente C2II geeignet um

die Effekte des Modul 4 von CDTb zu analysieren.

.

Abb. 11: Schematische Darstellung von C2II und CDTb

sowie der C2II(I-III)/CDTb(IV)-Chimäre und des GST-

CDTb(IV) Fusionsproteins

46


Ergebnisse

Als Nächstes wurde in einem Vergiftungsversuch analysiert, ob die C2II(I-III)/CDTb(IV)-

Chimäre in der Lage ist die Internalisierung von C2I in Zellen zu vermitteln und eine toxische

Reaktion auszulösen. Zwar zeigte die Chimäre mit C2-I keine toxische Wirkung auf

Zellen, jedoch konnte die Vorinkubation von Zellen mit der Chimäre eine Vergiftung mit

CDT erfolgreich inhibieren (Abb. 12). Somit hatte man den Verdacht, dass zwar eine Internalisierung

des Chimären-C2I-Komplexes nicht möglich ist, eine Bindung der Chimäre

an den Zelloberflächenrezeptor hingegen schon. Eine Erklärung hierfür könnte darin bestehen,

dass die Chimäre nicht in der Lage war, die für die Translokation der A-

Komponente notwendigen Oligomere auszubilden. C2II bildet nach der Aktivierung mit

Trypsin typischerweise SDS-stabile jedoch thermoinstabile Komplexe aus. Nicht erhitzte

Proben der C2II(I-III)/CDTb(IV)-Chimäre zeigten jedoch nach Aktivierung mit Trypsin

keine SDS-stabilen Oligomere (Abb. 13).

Abb. 12: Inhibition der Vergiftung

mit CDT durch Chimäre.

Vergiftung von H1-HeLa(+LSR)

Zellen mit 0,2nM CDT bei 30

minütiger Vorinkubation mit C2II

oder der C2II(I-III)/CDTb(IV)-

Chimäre

Abb. 13: SDS-PAGE Aktivierung der

C2II(I-III)/CDTb(IV)-Chimäre. Proben

wurden mit 0,2µg Trypsin/µg Protein bei

4°Cinkubiert und ohne Erhitzen mit Probenpuffer

vermengt und aufgetragen.

Rechts davon aktiviertes C2II ebenfalls

ohne Erhitzen aufgetragen.

47


Ergebnisse

Durch FACS-Analysen zur Bindung von CDTb-Dylight an H1-HeLa(+LSR) Zellen konnte

die kompetitive Inhibition von CDTb durch die C2II(I-III)/CDTb(IV)-Chimäre und somit

die Bindung an LSR bestätigt werden. Zellen, die mit ansteigenden Konzentrationen der

C2II(I-III)/CDTb(IV)-Chimäre vorinkubiert wurden, wiesen, im Gegensatz zu mit C2II

vorinkubierten Zellen, eine konzentrationsabhängige Inhibition der Bindung von CDTb-

Dylight488 auf (Abb. 14).

Abb. 14: FACS Analyse zur Bindung der C2II(I-III)/CDTb(IV)-

Chimäre an LSR. H1-HeLa(+LSR) Zellen wurden 10x Überschuss an

Chimäre oder C2II vorinkubiert und anschließend mit CDTb-Dylight 488

vermengt. Rot: Kontrolle; violett: H1-HeLa(+LSR) + 5 nM CDTb-

Dylight 488; grün: Vorinkubation mit 50 nM C2II; blau: Vorinkubation

mit 50 nM Chimäre.

Anhand der bisherigen Ergebnisse, entschieden wir uns deshalb dazu weitere Untersuchungen

zum direkten Einfluss des Moduls 4 von CDTb auf Zellen durchzuführen. Für die

weiteren Experimente wurde ein Fusionsprotein bestehend aus GST und dem Modul 4 von

CDTb (GST-CDTb(IV)) verwendet (Abb.11). Der Vorteil des GST-Fusionsproteins besteht

dabei darin, dass mögliche störende Einflüsse auf die Bindung des Moduls 4 an LSR

und den daraus resultierenden biochemischen Prozessen weitestgehend minimiert werden

können. In FACS-Analysen zur Bindung des hergestellten Fusionsproteins an Zellen zeigte

sich ebenfalls nach Vorinkubation mit GST-CDTb(IV) eine deutliche Inhibition der Bin-

48


Ergebnisse

dung von CDTb-Dylight488,wohingegen GST alleine nicht in der Lage war, die Bindung zu

beeinträchtigen (Abb. 15).

Abb. 15: FACS Analyse zur Bindung des GST-CDTb(IV)-

Fusionsprotein an LSR. H1-HeLa+LSR Zellen wurden mit GST-

CDTb(IV) oder GST vorinkubiert und anschließend mit CDTb-

Dylight 488 vermengt. Rot: Kontrolle; violett: H1-HeLa(+LSR) + 5

nM CDTb-Dylight 488; grün: Vorinkubation mit 10x GST; blau:

Vorinkubation mit 1x GST-CDTb(IV).

Ein weiterer interessanter Aspekt zeigte sich bei der Analyse der Membranfraktionen nach

Inkubation mit dem GST-CDTb(IV) – Fusionsprotein. Es stellte sich heraus, dass die an

GST gekoppelte Rezeptor-Binde-Domäne von CDTb alleine ebenfalls die Akkumulation

des LSR-Rezeptors in Triton-unlösliche Membranfraktionen vermitteln konnte. Experimente

zur Analyse der Membranverteilung von LSR nach der Bindung von CDTb und

GST-CDTb(IV) wurden durchgeführt und mit Kontroll-Zellen ohne Behandlung mit CDTb

oder GST-CDTb(IV) verglichen. Die Verteilung von LSR in den Triton-unlöslichen Fraktionen

wurde mittels Western-Blot ermittelt, die Signalstärke quantifiziert und gemittelt.

Eine Gegenüberstellung zeigte, dass sowohl die Inkubation mit CDTb als auch mit GST-

CDTb(IV), die Konzentration von LSR in Triton-unlöslichen Membrandomänen signifikant

erhöhten (Abb. 16). Dies ist insofern sehr bedeutend, als das GST-CDTb(IV) – Fusi-

49


Ergebnisse

onsprotein keine Oligomere bilden kann, da hierfür die Module 1-3 erforderlich sind. Somit

lässt sich daraus schlussfolgern, dass das Monomer von CDTb an den Rezeptor nicht

nur binden, sondern auch die Akkumulation des Ligand-Rezeptor-Komplexes in lipid rafts

vermitteln kann. Oligomere sind folglich für die Assoziation des Rezeptors mit lipid rafts

nicht zwingend notwendig.

Abb. 16: Statistische Darstellung der Zunahme

von LSR in Triton-unlöslichen

Membranfraktionen. Jeweils 8 Proben mit

mindestens 1 Million H1-Hela(+LSR)-

Zellen wurden mit 50 nM CDTb, 50 nM

GST-CDTb(IV) oder PBS zur Kontrolle 30

Minuten bei 37°C inkubiert und anschließend

LSR in der Triton-unlöslichen Membranfraktion

mittels Western-Blot ermittelt.

Das Signal für LSR wurde quantifiziert und

statistisch unter Berücksichtigung der Standardabweichung

ausgewertet.

4. Bindung von CDTb an die IG-Domäne von LSR

Nun stellte sich die Frage, welche Abschnitte von LSR notwendig und hinreichend für eine

Bindung von CDTb sein könnten. Hierfür wurden 4 Varianten der extrazellulären Komponente

von LSR konstruiert, die jeweils in unterschiedlicher Form die IG-Domäne beinhalteten

(Abb. 17), und diese in den pET28a-Vektor kloniert. Das Plasmid pET28a weist unter

anderem eine T7-Promotor-Region auf und eignet sich daher sowohl zur Expression in

bakteriellen Systemen als auch in Retikulozyten-Lysaten. Eine Expression im E. coli-

System scheiterte zwar, jedoch gelang es, die extrazellulären Abschnitte von LSR in-vitro

in Retikulozyten-Lysaten herzustellen. Bei der Expression im Retikulozyten-Lysat wurde

bei der Translation [ 35 S]-Methionin in die Proteine eingebaut und diese somit radioaktiv

markiert. Des Weiteren wurde bei der Translation eine Polyhistidinsequenz an die Proteine

angefügt, so dass diese durch Bindung an Magnet-Beads aufgereinigt und anschließend

mittels Autoradiogramm sichtbar gemacht werden konnten (Abb. 18).

50


Ergebnisse

Abb. 17: Schematische Darstellung der extrazellulären

LSR Konstrukte

Die Fragmente 1-186, 1-192, 39-186 und 39-192

wurden in pET28a kloniert und mittels Retikulozyten-Lysat

in-vitro translatiert.

Abb. 18: Autoradiogramm der radioaktivmarkierten

LSR-Konstrukte nach Aufreinigung

Die in-vitro-translatierten Verkürzungen wurden zur

besseren Identifikation mit dem MagZ TM Protein

Purification Kit aufgereinigt.

Darüber hinaus wurde CDTb, und als Kontrolle BSA, kovalent an spezielle Tosylaktivierte

Magnet-Beads gekoppelt. Anschließend wurden Pull-Down-Assays mit der kürzesten

Form der in-vitro hergestellten extrazellulären LSR-Konstrukte (39-186), welche

ausschließlich die IG-Domäne beinhaltete, durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass bereits

diese Form LSR(39-186), an CDTb-gekoppelte Beads, jedoch nicht an die BSAgekoppelten

Beads binden konnte (Abb. 19). Somit liegt der Schluss nahe, dass definierte

Abschnitte innerhalb der IG-Domäne für eine Bindung von CDTb verantwortlich sein

müssen.

Abb. 19: Pull-Down LSR 39-186 mit CDTb

Radioaktiv-markiertes LSR(39-186) wurde mit BSA- und

CDTb-gekoppelte Magnet-Beads für 60 Minuten inkubiert

um eine Bindung zu erreichen. Durch anschließendes

Waschen mit PBS, PBS+NaCl und PBS-T wurden nicht

spezifisch gebundene Proteine entfernt. LSR(39-186) zeigt

eine deutliche Bindung an CDTb-, jedoch nicht an BSAgekoppelte

Beads.

51


Diskussion

E. Diskussion

Um eine Erkrankung zu verstehen und adäquat zu therapieren, ist es unabdingbar die Mechanismen

der Pathogenese zu verstehen, die dem Krankheitsbild zugrunde liegen. Nur

wenn die Einzelheiten auch auf molekularer Ebene bekannt sind, können rationale Entscheidungen

über neue Therapieansätze getroffen werden. Im Laufe der letzten Jahre wurden

bereits viele biochemische Prozesse der Wirkungsweise von CDT entdeckt. Nach der

Entdeckung der Wirkung der katalytischen A-Komponente, war die Entdeckung des Zelloberflächenrezeptors

LSR (lipolysis-stimulated-lipoprotein-receptor) als Zielrezeptor,

nicht nur für CDTb, sondern für alle clostridialen binären Iota-ähnlichen Toxine, ein bedeutender

Schritt in der Erforschung der Pathogenese von CDT-produzierenden Stämmen.

Anhand früherer Studien zu Iota-B wurde die Hypothese formuliert, dass monomeres Iota-

B nach proteolytischer Aktivierung in Heptameren akkumuliert und danach an den Rezeptor

bindet. Ein weiterer diskutierter Mechanismus war die Anlagerung der monomeren B-

Komponente an den Rezeptor, der anschließenden proteolytischen Spaltung durch Zellproteasen

und daraufhin folgender Oligomerisierung. Durch die Bindung der A-Komponente

an den Ligand-Rezeptor-Komplex wird im Anschluss die Endozytose initiiert (Blöcker et

al., 2001; Stiles et al., 2000; Nagahama et al., 2002; Stiles et al., 2002). Weitere Studien

zeigten, dass Oligomere von Iota-Toxin eine Assoziation mit lipid rafts aufweisen und dass

die Depletion von zellulärem Cholesterin sowohl das Auftreten von Oligomeren als auch

die Vergiftung mit Iota-Toxin verhindern konnte (Hale et al. 2004; Nagahama et al.,

2004). Folglich wurde bereits damals spekuliert, dass lipid rafts die Aufnahme von Iota-

Toxin vermitteln könnten. Es konnte jedoch keine Aussage darüber getroffen werden, ob

diese Assoziation ebenfalls für den Rezeptor gilt und ob sie durch die Oligomere oder

durch LSR vermittelt wird. Aussagen über charakteristische bindungsrelevante Domänen

beider Interaktionspartner sind ebenfalls bisher noch nicht oder nur ungenau möglich gewesen.

52


Diskussion

1. Induktion der Akkumulation von LSR in lipid rafts durch CDTb

Die fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen zur Membranverteilung von LSR haben

gezeigt, dass LSR nach Bindung von CDTb ebenfalls in definierten Membrandomänen

anzutreffen ist. Die Membrandomänen, in denen sich LSR und CDTb anreicherten, konnten

durch die Auftrennung der Zellmembranen in Triton-lösliche und Triton-unlösliche

Fraktionen den unlöslichen Membranfraktionen zugeordnet werden. H1-HeLa Zellen, die

LSR überexprimierten und nicht mit CDTb behandelt wurden, wiesen eine deutlich höhere

Konzentration von LSR in Triton-löslichen Abschnitten der Membran auf als in Tritonunlöslichen.

Erst nach Bindung von CDTb akkumuliert LSR in den Triton-unlöslichen

Fraktionen der Zellmembran. Dieser Effekt ist sowohl von der Konzentration als auch der

Inkubationsdauer und der Inkubationstemperatur mit CDTb abhängig und konnte ebenfalls

in Zellen mit endogener LSR-Expression nachgewiesen werden. Bei Temperaturen von

10°C beziehungsweise 4°C zeigte sich sowohl in der Mikroskopie als auch in Analysen der

Membranfraktion eine Inhibition der Akkumulation von LSR in den Triton-unlöslichen

Fraktionen, so dass die fluiden Eigenschaften der Zellmembran eine Rolle bei diesen Effekten

zu spielen scheint. Durch die Auftrennung der Zellmembranen im Sucrose-

Gradienten konnte gezeigt werden, dass die Triton-unlöslichen Fraktionen charakteristische

Eigenschaften für lipid rafts aufweisen, wie niedere spezifische Dichte und Korrelation

mit lipid rafts-spezifischen Markerproteinen. Somit konnte gezeigt werden, dass LSR

ebenfalls nach Bindung von CDTb eine Assoziation zu lipid rafts aufweist. Weiterhin

konnte gezeigt werden, dass das monomere Modul-4 von CDTb ebenfalls an LSR binden

konnte und die Akkumulation von LSR in lipid rafts initiierte. Dies lässt den Schluss zu,

dass es sich bei der Akkumulation von LSR in lipid rafts um einen zellulären Prozess handelt,

der durch die Bindung des Liganden an den Rezeptor eingeleitet wird. Da die Bildung

von Oligomeren von CDTb an der Zelloberfläche ebenfalls durch niedrige Temperaturen

inhibiert wird (Nagahama et al., 2002; Stiles et al., 2002), ergibt sich in Verbindung mit

unseren Daten die Hypothese, dass die Bildung der Oligomere von CDTb und Iotaähnlichen

Toxinen durch die Bindung der monomeren Form an LSR und der daraus resultierenden

Akkumulation des Toxin-Rezeptor-Komplexes in lipid rafts erleichtert wird

(Abb. 22).

Zum gegenwärtigen Zeitpunkt ist noch unklar, welche Rolle die lipid rafts bei der Internalisierung

des Toxin-Rezeptor-Komplexes spielen. In der Literatur sind jedoch bereits Bei-

53


Diskussion

spiele beschrieben, wie Rezeptoren nach Bindung des Liganden ihre Membrankonfiguration

ändern und in lipid rafts-Mikrodomänen wechseln (oder erzeugen), um die Endozytose

einzuleiten (siehe Kapitel A.4.2). Umgekehrt sind auch Beispiele bekannt, wie Rezeptoren

nach Bindung des Liganden lipid rafts-Mikrodomänen verlassen und in löslichen Membranabschnitten

die Endozytose einleiten (Lasley et al., 2000).

Abb. 22: Modell der Akkumulation von LSR in lipid rafts Membrandomänen CDTb-Monomere

binden an LSR, werden durch Zellproteasen aktiviert und initiieren die Akkumulation des Rezeptors

in lipid rafts. Bereits vorgeformte Oligomere sind ebenfalls in der Lage an den Rezeptor zu binden.

Durch Bindung von CDTa an den CDTb-Oligomer-Rezeptor-Komplex wird die Endozytose eingeleitet.

Im Bereich der Iota-ähnlichen Toxine zeigte sich, dass Dynamin aber nicht Clathrin eine

Rolle bei deren Aufnahme spielt. Erst kürzlich wurde nachgewiesen, dass CD44, ein Protein

das in DRMs von Vero-Zellmembranen entdeckt wurde, eine wichtige Rolle bei der

Intoxikation mit Iota-ähnlichen Toxinen spielt (Wigelsworth et al., 2012). Es wäre denkbar,

dass CD44 die Akkumulation von LSR in lipid rafts begünstigt. Weiterhin wurde eine

Kolokalisation von Iota Toxin und IL-2 Rezeptoren in endozytotischen Vesikeln beobachtet

(Gibert et al., 2011). Interessanterweise wurde für IL-2-Rezeptoren ebenfalls ein Clathrin-unabhängiger

und lipid rafts-assoziierter Mechanismus der Internalisierung postuliert

54


Diskussion

(Lamaze et al., 2001), was darauf schließen lässt, dass LSR ebenfalls einen ähnlichen Mechanismus

der Internalisierung verwendet. Dies deckt sich auch mit anderen Ergebnissen

zur Aufnahme von bakteriellen Exotoxinen, die häufig mit lipid rafts-abhängiger Endozytose

in Verbindung gebracht werden. So werden zum Beispiel das Choleratoxin oder das

VacA Toxin von Helicobacter pylori über lipid rafts-vermittelte Endozytose aufgenommen.

Aber auch zu CDT strukturell verwandte Toxine wie zum Beispiel die rezeptorbindende

Komponente des Milzbrandtoxins, das Protektive Antigen (PA), von Bacillus anthracis

assoziieren bei der Internalisierung mit lipid rafts (Abrami et al., 2003). PA triggert

hierbei die eigene Aufnahme durch Phosphorylierung von src-like Kinasen und Palmitoylierungen

des Rezeptors (Abrami et al., 2010; Abrami et al., 2006). Die Aufnahme selbst

erfolgt jedoch interessanterweise zwar über einen lipid rafts-vermittelten aber Clathrinabhängigen

Endozytosemechanismus (Abrami et al., 2003).

2. Bindung von CDTb an Teile der extrazellulären IG-Domäne von LSR

Die durchgeführten Experimente zur Bindung von CDTb an Verkürzungen von LSR haben

gezeigt, dass die IG-Domäne für Bindung von CDTb an LSR ausreichend ist. Somit konnte

der extrazelluläre Bereich von LSR auf eine bindungsrelevante Domäne eingegrenzt werden.

Da die IG-Domäne mit 148 Aminosäuren eine große Region des extrazellulären Anteils

von LSR ausmacht, müssen weitere Versuche erfolgen, um die bindende Region weiter

einzugrenzen und die für die Bindung notwendigen Aminosäuren ausfindig zu machen.

Des Weiteren könnten die Ermittlung der räumlichen Struktur der IG-Domäne und Modul

4 von CDTb durch Kristallisation neue Erkenntnisse auf bindungsrelevante Strukturen und

eventuelle Möglichkeiten der Inhibition der Ligand-Rezeptor-Bindung liefern.

3. Ausblick

Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Bindung von CDTb an den Rezeptor

LSR zu einer Akkumulation in lipid rafts Mikrodomänen führt. Es konnte darüber

hinaus gezeigt werden, dass es sich bei diesem Vorgang um einen zellulären Prozess handelt,

der durch die Bindung des Liganden an den Rezeptor eingeleitet wird. Des Weiteren

55


Diskussion

ergeben sich hier bereits starke Hinweise darauf, dass die Akkumulation von LSR in lipid

rafts nicht von der oligomeren Form von CDTb abhängig ist. Diese Hinweise konnten in

später durchgeführten und in dieser Arbeit nicht dargestellten Experimenten mit der nicht

aktivierten, und damit zwangsläufig monomeren Form von CDTb (pCDTb), bestätigt

werden. Hieraus ergibt sich die Hypothese, dass monomere Formen der Iota-ähnlichen

Toxine an LSR binden und die Bildung der Oligomere durch die Akkumulation des Rezeptors

erleichtert wird. Der bisherige Kenntnisstand über die Aufnahme von Iota-ähnlichen

Toxinen und die Ergebnisse dieser Arbeit weisen auf eine lipid rafts-vermittelte Endozytose

des Toxin-Rezeptor-Komplexes hin. In der Literatur wurden bereits für viele andere

bakterielle Toxine, aber auch für Viren lipid rafts-mediierte Aufnahmewege beschrieben

(siehe Kapitel A.4.2. und E.1.). Jedoch sind die intrazellulären Signalwege, die für eine

Akkumulation von LSR in DRMs notwendig und bei der Internalisierung von CDT beteiligt

sind, immer noch unbekannt. Der Eingriff in die Signalkaskade zur Aufnahme von

CDT stellt, neben der Inhibition der Bindung der B-Komponente an den Rezeptor, einen

möglichen Ansatz für zukünftige mögliche Therapiemöglichkeiten von schwer verlaufenden

Erkrankungen mit C. difficile dar. Eine Therapie könnte zum Beispiel in der Hemmung

einzelner Moleküle des intrazellulären Signalweges bestehen. Solche Konzepte finden derzeit

großen Anklang im Bereich der Tumortherapie. So werden beispielsweise Antikörper

gegen Wachstumsfaktor-Rezeptoren und niedermolekulare Inhibitoren gegen Tyrosinkinasen

eingesetzt, um die Zellprolliferation zu inhibieren. Ein solches Konzept könnte als Reservetherapie

auch in der zielgerichteten Behandlung bakterieller Erkrankungen, welche

durch spezifische Toxine bedingt werden, eingesetzt werden. Des Weiteren könnten kompetitive

Inhibitoren auf niedermolekularer Ebene konstruiert werden, welche die Bindung

von CDTb am Rezeptor verhindern, ohne jedoch eine Signalkaskade in Gang zu setzen.

Eine weitere Option wäre die Produktion niedermolekularer hochaffiner Substanzen, die in

der Lage wären, ähnlich wie die monoklonalen Antikörper gegen Toxin A und Toxin B,

CDTb vor Anlagerung an den Rezeptor zu binden und somit abzufangen.

Diese Beispiele könnten vielleicht in Zukunft mögliche Optionen darstellen, mit der die

bisherigen Therapiemöglichkeiten ergänzt und somit Patienten schneller und zuverlässiger

geheilt und Todesfälle reduziert werden könnten.

56


Zusammenfassung

Zusammenfassung

Clostridium difficile ist der bedeutendste Erreger der Antibiotika-assoziierten-Diarrhoe und

zählt zu den häufigsten Ursachen nosokomialer Infektionen in den Industrienationen. Das

Feld der Erkrankung umfasst leichte und mittelgradige, aber auch schwerste blutigschleimige

Diarrhoen sowie das Bild der pseudomembranösen Kolitis und kann in einigen

Fällen sogar tödlich verlaufen. Für die Ausprägung der Krankheitssymptome sind die Effekte

der beiden Toxine, Toxin A und B, verantwortlich, die zur Familie der Rhoglukosylierenden

Toxine gehören. Seit einigen Jahren treten gehäuft Fälle von Infektionen

mit speziellen Ribotypen von C. difficile auf, die mit einer erhöhten Mortalität einhergehen.

Diese sogenannten hypervirulenten Stämme weisen neben einer erhöhten Antibiotika-

Resistenz und erhöhter Toxinsekretion auch die Produktion eines zusätzlichen binären Toxins,

CDT, auf. CDT gehört zur Familie der Iota-ähnlichen Toxine und überträgt ADP-

Ribose auf Aktinmonomere, was die Polymerisation des Aktinzytoskeletts inhibiert und

schlussendlich zum Zelltod führt. 2011 konnte das Zelloberflächenprotein LSR als Zielrezeptor

für die B-Komponente von CDT identifiziert werden. Die B-Komponenten von

CDT bilden Oligomere, von denen bereits bekannt war, dass sie eine Assoziation mit lipid

rafts-Mikrodomänen aufweisen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der

zugehörige Zelloberflächenrezeptor LSR nach Bindung von CDTb ebenfalls in lipid rafts-

Mikrodomänen der Zellmembran akkumuliert. Monomere CDTb-Konstrukte, bestehend

aus der Rezeptorbindedomäne, waren in der Lage an Zellen zu binden und die Intoxikation

mit CDT zu verhindern. Darüber hinaus konnten diese monomeren Formen von CDTb eine

Akkumulation des LSR-Rezeptors in lipid rafts induzieren. Somit zeigte sich, dass die Akkumulation

von LSR in lipid rafts nicht von der Ausbildung von CDTb-Oligomeren abhängig

ist, sondern einen zellulären Prozess darstellt, der durch die Bindung des Liganden

an den Rezeptor eingeleitet wird. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass CDTb an

Abschnitte der Immunglobulin-ähnlichen Proteindomäne im extrazellulären Bereich von

LSR bindet.

57


Literaturverzeichnis

Literaturverzeichnis

Abrami, Laurence; Kunz, Beatrice; van der Goot, F. Gisou (2010): Anthrax toxin triggers

the activation of src-like kinases to mediate its own uptake. In: Proc Natl Acad Sci U S A

107 (4), S. 1420–1424.

Abrami, Laurence; Leppla, Stephen H.; van der Goot, F. Gisou (2006): Receptor palmitoylation

and ubiquitination regulate anthrax toxin endocytosis. In: J Cell Biol 172 (2),

S. 309–320.

Abrami, Laurence; Liu, Shihui; Cosson, Pierre; Leppla, StephenH; van, derGootFGisou

(2003): Anthrax toxin triggers endocytosis of its receptor via a lipid raft-mediated clathrindependent

process. In: J Cell Biol 160 (3), S. 321–328.

Aktories, K.; Barmann, M.; Ohishi, I.; Tsuyama, S.; Jakobs, K. H.; Habermann, E. (1986):

Botulinum C2 toxin ADP-ribosylates actin. In: Nature 322 (6077), S. 390–392.

Aktories, K.; Wegner, A. (1992): Mechanisms of the cytopathic action of actin-ADPribosylating

toxins. In: Mol Microbiol 6 (20), S. 2905–2908.

Aktories, Klaus; Barbieri, Joseph T. (2005): Bacterial cytotoxins: targeting eukaryotic

switches. In: Nat Rev Microbiol 3 (5), S. 397–410.

Aktories, Klaus; Barth, Holger (2004): Clostridium botulinum C2 toxin--new insights into

the cellular up-take of the actin-ADP-ribosylating toxin. In: Int J Med Microbiol 293 (7-8),

S. 557–564.

Aktories, Klaus; Forth, Wolfgang; Allgaier, Clemens (2009): Allgemeine und spezielle

Pharmakologie und Toxikologie. Für Studenten der Medizin, Veterinärmedizin, Pharmazie,

Chemie und Biologie sowie für Ärzte, Tierärzte und Apotheker : mit 305 Tabellen. 10.

Aufl. München: Elsevier, Urban & Fischer.

58


Literaturverzeichnis

Anderson, R. G. (1998): The caveolae membrane system. In: Annu Rev Biochem 67, S.

199–225.

Bacci, Sabrina; Molbak, Kare; Kjeldsen, MarianneK; Olsen, KatharinaEP (2011): Binary

toxin and death after Clostridium difficile infection. In: Emerg Infect Dis 17 (6), S. 976–

982.

Barbieri, JosephT; Riese, MatthewJ; Aktories, Klaus (2002): Bacterial toxins that modify

the actin cytoskeleton. In: Annu Rev Cell Dev Biol 18, S. 315–344.

Barth, H.; Blocker, D.; Behlke, J.; Bergsma-Schutter, W.; Brisson, A.; Benz, R.; Aktories,

K. (2000): Cellular uptake of Clostridium botulinum C2 toxin requires oligomerization and

acidification. In: J Biol Chem 275 (25), S. 18704–18711.

Barth, H.; Pfeifer, G.; Hofmann, F.; Maier, E.; Benz, R.; Aktories, K. (2001): Low pHinduced

formation of ion channels by clostridium difficile toxin B in target cells. In: J Biol

Chem 276 (14), S. 10670–10676.

Barth, Holger; Aktories, Klaus; Popoff, MichelR; Stiles, BradleyG (2004): Binary bacterial

toxins: biochemistry, biology, and applications of common Clostridium and Bacillus proteins.

In: Microbiol Mol Biol Rev 68 (3), S. 373-402, table of contents.

Bartlett, J. G.; Chang, T. W.; Gurwith, M.; Gorbach, S. L.; Onderdonk, A. B. (1978): Antibiotic-associated

pseudomembranous colitis due to toxin-producing clostridia. In: N Engl J

Med 298 (10), S. 531–534.

Bartlett, John G. (2006): Narrative review: the new epidemic of Clostridium difficileassociated

enteric disease. In: Ann Intern Med 145 (10), S. 758–764.

Blank, Norbert; Schiller, Martin; Krienke, Stefan; Wabnitz, Guido; Ho, Anthony D.; Lorenz,

Hanns-Martin (2007): Cholera toxin binds to lipid rafts but has a limited specificity

for ganglioside GM1. In: Immunol. Cell Biol. 85 (5), S. 378–382.

59


Literaturverzeichnis

Blocker, D.; Barth, H.; Maier, E.; Benz, R.; Barbieri, J. T.; Aktories, K. (2000): The C

terminus of component C2II of Clostridium botulinum C2 toxin is essential for receptor

binding. In: Infect Immun 68 (8), S. 4566–4573.

Blocker, D.; Behlke, J.; Aktories, K.; Barth, H. (2001): Cellular uptake of the Clostridium

perfringens binary iota-toxin. In: Infect Immun 69 (5), S. 2980–2987.

Blocker, Dagmar; Pohlmann, Kathrin; Haug, Gerd; Bachmeyer, Christoph; Benz, Roland;

Aktories, Klaus; Barth, Holger (2003): Clostridium botulinum C2 toxin: low pH-induced

pore formation is required for translocation of the enzyme component C2I into the cytosol

of host cells. In: J Biol Chem 278 (39), S. 37360–37367.

Brown, D. A.; London, E. (1998): Functions of lipid rafts in biological membranes. In:

Annu Rev Cell Dev Biol 14, S. 111–136.

Cohen, C. J.; Shieh, J. T.; Pickles, R. J.; Okegawa, T.; Hsieh, J. T.; Bergelson, J. M.

(2001): The coxsackievirus and adenovirus receptor is a transmembrane component of the

tight junction. In: Proc Natl Acad Sci U S A 98 (26), S. 15191–15196.

Considine, R. V.; Simpson, L. L. (1991): Cellular and molecular actions of binary toxins

possessing ADP-ribosyltransferase activity. In: Toxicon 29 (8), S. 913–936.

Doherty, Gary J.; McMahon, Harvey T. (2009): Mechanisms of endocytosis. In: Annu Rev

Biochem 78, S. 857–902.

Fan, Qing; Longnecker, Richard (2010): The Ig-like v-type domain of paired Ig-like type 2

receptor alpha is critical for herpes simplex virus type 1-mediated membrane fusion. In: J

Virol 84 (17), S. 8664–8672.

Field, K. A.; Holowka, D.; Baird, B. (1995): Fc epsilon RI-mediated recruitment of

p53/56lyn to detergent-resistant membrane domains accompanies cellular signaling. In:

Proc Natl Acad Sci U S A 92 (20), S. 9201–9205.

60


Literaturverzeichnis

Gauthier, Nils C.; Monzo, Pascale; Kaddai, Vincent; Doye, Anne; Ricci, Vittorio; Boquet,

Patrice (2005): Helicobacter pylori VacA cytotoxin: a probe for a clathrin-independent and

Cdc42-dependent pinocytic pathway routed to late endosomes. In: Mol Biol Cell 16 (10),

S. 4852–4866.

Geffers, Christine; Gastmeier, Petra (2011): Nosocomial infections and multidrug-resistant

organisms in Germany: epidemiological data from KISS (the Hospital Infection Surveillance

System). In: Dtsch Arztebl Int 108 (6), S. 87–93.

Geffers, Christine; Sohr, Dorit; Gastmeier, Petra (2008): Mortality attributable to hospitalacquired

infections among surgical patients. In: Infect Control Hosp Epidemiol 29 (12), S.

1167–1170.

Gerhard, Ralf; Tatge, Helma; Genth, Harald; Thum, Thomas; Borlak, Jurgen; Fritz, Gerhard;

Just, Ingo (2005): Clostridium difficile toxin A induces expression of the stressinduced

early gene product RhoB. In: J Biol Chem 280 (2), S. 1499–1505.

Gibert, Maryse; Monier, Marie-Noëlle; Ruez, Richard; Hale, Martha L.; Stiles, Bradley G.;

Benmerah, Alexandre et al. (2011): Endocytosis and toxicity of clostridial binary toxins

depend on a clathrin-independent pathway regulated by Rho-GDI. In: Cellular Microbiology

13 (1), S. 154–170.

Giesemann, Torsten; Jank, Thomas; Gerhard, Ralf; Maier, Elke; Just, Ingo; Benz, Roland;

Aktories, Klaus (2006): Cholesterol-dependent pore formation of Clostridium difficile toxin

A. In: J Biol Chem 281 (16), S. 10808–10815.

Gough, Ethan; Shaikh, Henna; Manges, AmeeR (2011): Systematic review of intestinal

microbiota transplantation (fecal bacteriotherapy) for recurrent Clostridium difficile infection.

In: Clin Infect Dis 53 (10), S. 994–1002.

61


Literaturverzeichnis

Gulke, I.; Pfeifer, G.; Liese, J.; Fritz, M.; Hofmann, F.; Aktories, K.; Barth, H. (2001):

Characterization of the enzymatic component of the ADP-ribosyltransferase toxin CDTa

from Clostridium difficile. In: Infect Immun 69 (10), S. 6004–6011.

Hale, Martha L.; Marvaud, Jean-Christophe; Popoff, Michel R.; Stiles, Bradley G. (2004):

Detergent-resistant membrane microdomains facilitate Ib oligomer formation and biological

activity of Clostridium perfringens iota-toxin. In: Infect Immun 72 (4), S. 2186–2193.

Hall, Ivan C.; O'Toole, Elizabeth (1935): Intestinal flora in newborn infants with a description

of a new pathogenic anaerobe Bacillus difficilis. In: Am J Dis Child (American journal

of diseases of children (1935)) (49), S. 390.

Hardesty, JenniferS; Juang, Paul (2011): Fidaxomicin: a macrocyclic antibiotic for the

treatment of Clostridium difficile infection. In: Pharmacotherapy 31 (9), S. 877–886.

Hornuss, Daniel (2012): Rezeptor für das binäre Toxin hypervirulenter Clostridium difficile-Stämme

entdeckt. In: Hygiene + Medizin: Zeitschrift für angewandte Hygiene in Krankenhäusern

und Praxis 37 (3), S. 68–71.

Janes, P. W.; Ley, S. C.; Magee, A. I.; Kabouridis, P. S. (2000): The role of lipid rafts in T

cell antigen receptor (TCR) signalling. In: Semin Immunol 12 (1), S. 23–34.

Jank, Thomas; Aktories, Klaus (2008): Structure and mode of action of clostridial glucosylating

toxins: the ABCD model. In: Trends Microbiol 16 (5), S. 222–229.

Just, I.; Gerhard, R. (2004): Large clostridial cytotoxins. In: Rev Physiol Biochem Pharmacol

152, S. 23–47.

Just, I.; Selzer, J.; Wilm, M.; Eichel-Streiber, C. von; Mann, M.; Aktories, K. (1995): Glucosylation

of Rho proteins by Clostridium difficile toxin B. In: Nature 375 (6531), S. 500–

503.

62


Literaturverzeichnis

Just, I.; Selzer, J.; Wilm, M.; von, Eichel-StreiberC; Mann, M.; Aktories, K. (1995): Glucosylation

of Rho proteins by Clostridium difficile toxin B. In: Nature 375 (6531), S. 500–

503.

Kaiser, Eva; Kroll, Claudia; Ernst, Katharina; Schwan, Carsten; Popoff, Michel; Fischer,

Gunter et al. (2011): Membrane translocation of binary actin-ADP-ribosylating toxins from

Clostridium difficile and Clostridium perfringens is facilitated by cyclophilin A and

Hsp90. In: Infect Immun 79 (10), S. 3913–3921.

Kayser, Fritz H. (2005): Medizinische Mikrobiologie. [Immunologie, Hygiene, Infektiologie,

Bakteriologie, Mykologie, Virologie, Parasitologie]. 11. Aufl. Stuttgart [u.a.]: Thieme.

Kelly, CiaranP; LaMont, JThomas (2008): Clostridium difficile--more difficult than ever.

In: N Engl J Med 359 (18), S. 1932–1940.

Kuijper, E. J.; Coignard, B.; Tull, P. (2006): Emergence of Clostridium difficile-associated

disease in North America and Europe. In: Clin Microbiol Infect 12 Suppl 6, S. 2–18.

Kyne, Lorraine; Hamel, MaryBeth; Polavaram, Rajashekhar; Kelly, CiaranP (2002):

Health care costs and mortality associated with nosocomial diarrhea due to Clostridium

difficile. In: Clin Infect Dis 34 (3), S. 346–353.

Lamaze, C.; Dujeancourt, A.; Baba, T.; Lo, C. G.; Benmerah, A.; Dautry-Varsat, A.

(2001): Interleukin 2 receptors and detergent-resistant membrane domains define a clathrin-independent

endocytic pathway. In: Mol. Cell 7 (3), S. 661–671.

Larson, H. E.; Barclay, F. E.; Honour, P.; Hill, I. D. (1982): Epidemiology of Clostridium

difficile in infants. In: J Infect Dis 146 (6), S. 727–733.

Lasley, R. D.; Narayan, P.; Uittenbogaard, A.; Smart, E. J. (2000): Activated cardiac adenosine

A(1) receptors translocate out of caveolae. In: J Biol Chem 275 (6), S. 4417–4421.

63


Literaturverzeichnis

Lo, VecchioAndrea; Zacur, GeorgeM (2012): Clostridium difficile infection: an update on

epidemiology, risk factors, and therapeutic options. In: Curr Opin Gastroenterol 28 (1), S.

1–9.

Louie, ThomasJ; Miller, MarkA; Mullane, KathleenM; Weiss, Karl; Lentnek, Arnold; Golan,

Yoav et al. (2011): Fidaxomicin versus vancomycin for Clostridium difficile infection.

In: N Engl J Med 364 (5), S. 422–431.

Lowy, Israel; Molrine, DeborahC; Leav, BrettA; Blair, BarbraM; Baxter, Roger; Gerding,

DaleN et al. (2010): Treatment with monoclonal antibodies against Clostridium difficile

toxins. In: N Engl J Med 362 (3), S. 197–205.

Martin, TraceyA; Harrison, GregoryM; Mason, MalcolmD; Jiang, WenG (2011): HAVcR-

1 reduces the integrity of human endothelial tight junctions. In: Anticancer Res 31 (2), S.

467–473.

Marvaud, J. C.; Smith, T.; Hale, M. L.; Popoff, M. R.; Smith, L. A.; Stiles, B. G. (2001):

Clostridium perfringens iota-toxin: mapping of receptor binding and Ia docking domains

on Ib. In: Infect Immun 69 (4), S. 2435–2441.

Masuda, Sayuri; Oda, Yukako; Sasaki, Hiroyuki; Ikenouchi, Junichi; Higashi, Tomohito;

Akashi, Masaya et al. (2011): LSR defines cell corners for tricellular tight junction formation

in epithelial cells. In: J Cell Sci 124 (Pt 4), S. 548–555.

McDonald, LClifford; Killgore, GeorgeE; Thompson, Angela; Owens, RobertCJr; Kazakova,

SophiaV; Sambol, SusanP et al. (2005): An epidemic, toxin gene-variant strain of

Clostridium difficile. In: N Engl J Med 353 (23), S. 2433–2441.

Mesli, Samir; Javorschi, Sandrine; Bérard, Annie M.; Landry, Marc; Priddle, Helen; Kivlichan,

David et al. (2004): Distribution of the lipolysis stimulated receptor in adult and

embryonic murine tissues and lethality of LSR-/- embryos at 12.5 to 14.5 days of gestation.

In: Eur. J. Biochem. 271 (15), S. 3103–3114.

64


Literaturverzeichnis

Nabi, IvanR; Le, PhuongU (2003): Caveolae/raft-dependent endocytosis. In: J Cell Biol

161 (4), S. 673–677.

Nagahama, Masahiro; Nagayasu, Koichi; Kobayashi, Keiko; Sakurai, Jun (2002): Binding

component of Clostridium perfringens iota-toxin induces endocytosis in Vero cells. In:

Infect. Immun. 70 (4), S. 1909–1914.

Nagahama, Masahiro; Yamaguchi, Akiwo; Hagiyama, Tohko; Ohkubo, Noriko; Kobayashi,

Keiko; Sakurai, Jun (2004): Binding and internalization of Clostridium perfringens

iota-toxin in lipid rafts. In: Infect Immun 72 (6), S. 3267–3275.

Narvekar, P.; Berriel Diaz, M.; Krones-Herzig, A.; Hardeland, U.; Strzoda, D.; Stohr, S. et

al. (2009): Liver-Specific Loss of Lipolysis-Stimulated Lipoprotein Receptor Triggers Systemic

Hyperlipidemia in Mice. In: Diabetes 58 (5), S. 1040–1049.

Pant, Chaitanya; Sferra, ThomasJ; Deshpande, Abhishek; Minocha, Anil (2011): Clinical

approach to severe Clostridium difficile infection: update for the hospital practitioner. In:

Eur J Intern Med 22 (6), S. 561–568.

Papatheodorou, Panagiotis; Carette, JanE; Bell, GeorgeW; Schwan, Carsten; Guttenberg,

Gregor; Brummelkamp, ThijnR; Aktories, Klaus (2011): Lipolysis-stimulated lipoprotein

receptor (LSR) is the host receptor for the binary toxin Clostridium difficile transferase

(CDT). In: Proc Natl Acad Sci U S A 108 (39), S. 16422–16427.

Papatheodorou, Panagiotis; Hornuss, Daniel; Nolke, Thilo; Hemmasi, Sarah; Castonguay,

Jan; Picchianti, Monica; Aktories, Klaus (2013): Clostridium difficile Binary Toxin CDT

Induces Clustering of the Lipolysis-Stimulated Lipoprotein Receptor into Lipid Rafts. In:

MBio 4 (3).

Papatheodorou, Panagiotis; Wilczek, Claudia; Nolke, Thilo; Guttenberg, Gregor; Hornuss,

Daniel; Schwan, Carsten; Aktories, Klaus (2012): Identification of the cellular receptor of

Clostridium spiroforme toxin. In: Infect Immun 80 (4), S. 1418–1423.

65


Literaturverzeichnis

Papatheodorou, Panagiotis; Zamboglou, Constantinos; Genisyuerek, Selda; Guttenberg,

Gregor; Aktories, Klaus (2010): Clostridial glucosylating toxins enter cells via clathrinmediated

endocytosis. In: PLoS One 5 (5), S. e10673.

Parton, R. G.; Joggerst, B.; Simons, K. (1994): Regulated internalization of caveolae. In: J

Cell Biol 127 (5), S. 1199–1215.

Pelkmans, Lucas; Puntener, Daniel; Helenius, Ari (2002): Local actin polymerization and

dynamin recruitment in SV40-induced internalization of caveolae. In: Science 296 (5567),

S. 535–539.

Pepin, Jacques; Valiquette, Louis; Cossette, Benoit (2005): Mortality attributable to nosocomial

Clostridium difficile-associated disease during an epidemic caused by a hypervirulent

strain in Quebec. In: CMAJ 173 (9), S. 1037–1042.

Popoff, M. R.; Boquet, P. (1988): Clostridium spiroforme toxin is a binary toxin which

ADP-ribosylates cellular actin. In: Biochem. Biophys. Res. Commun. 152 (3), S. 1361–

1368.

Rassow, Joachim (2006): Biochemie. 50 Tabellen. Stuttgart: Thieme.

Robert Koch-Institut (RKI): Epidemiologisches Bulletin 24/2009, zuletzt geprüft am

06.05.2012.

Sandvig, Kirsten; Torgersen, Maria Lyngaas; Raa, Hilde Andersen; van Deurs, Bo (2008):

Clathrin-independent endocytosis: from nonexisting to an extreme degree of complexity.

In: Histochem Cell Biol 129 (3), S. 267–276.

Schneider, T.; Eckmanns, T.; Ignatius, R.; Weist, K.; Liesenfeld, O. (2007): Clostridium

Difficile Associated Diseases – an Emerging Problem. In: Dtsch Arztebl (Deutsches Arzteblatt)

104 (22), S. A 1588-94.

66


Literaturverzeichnis

Schwan, Carsten; Stecher, Barbel; Tzivelekidis, Tina; van, HamMarco; Rohde, Manfred;

Hardt, Wolf-Dietrich et al. (2009): Clostridium difficile toxin CDT induces formation of

microtubule-based protrusions and increases adherence of bacteria. In: PLoS Pathog 5

(10), S. e1000626.

Simons, K.; Ikonen, E. (1997): Functional rafts in cell membranes. In: Nature 387 (6633),

S. 569–572.

Simons, K.; Toomre, D. (2000): Lipid rafts and signal transduction. In: Nat Rev Mol Cell

Biol 1 (1), S. 31–39.

Simons, K.; van Meer, G. (1988): Lipid sorting in epithelial cells. In: Biochemistry 27

(17), S. 6197–6202.

Sowa, Grzegorz (2012): Caveolae, caveolins, cavins, and endothelial cell function: new

insights. In: Front Physiol 2, S. 120.

Stiles, B. G.; Hale, M. L.; Marvaud, J. C.; Popoff, M. R. (2000): Clostridium perfringens

iota toxin: binding studies and characterization of cell surface receptor by fluorescenceactivated

cytometry. In: Infect Immun 68 (6), S. 3475–3484.

Stiles, Bradley G.; Hale, Martha L.; Marvaud, Jean Christophe; Popoff, Michel R. (2002):

Clostridium perfringens iota toxin: characterization of the cell-associated iota b complex.

In: Biochem J 367 (Pt 3), S. 801–808.

Vandekerckhove, J.; Schering, B.; Barmann, M.; Aktories, K. (1987): Clostridium

perfringens iota toxin ADP-ribosylates skeletal muscle actin in Arg-177. In: FEBS Lett

225 (1-2), S. 48–52.

Vandekerckhove, J.; Schering, B.; Barmann, M.; Aktories, K. (1987): Clostridium

perfringens iota toxin ADP-ribosylates skeletal muscle actin in Arg-177. In: FEBS Lett

225 (1-2), S. 48–52.

67


Literaturverzeichnis

Vassilieva, Elena V.; Gerner-Smidt, Kirsten; Ivanov, Andrei I.; Nusrat, Asma (2008): Lipid

rafts mediate internalization of beta1-integrin in migrating intestinal epithelial cells. In:

Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 295 (5), S. G965-76.

Wang, Li; Stewart, DavidB (2011): Increasing hospital costs for Clostridium difficile colitis:

type of hospital matters. In: Surgery 150 (4), S. 727–735.

Wegner, A.; Aktories, K. (1988): ADP-ribosylated actin caps the barbed ends of actin filaments.

In: J Biol Chem 263 (27), S. 13739–13742.

Wigelsworth, Darran J.; Ruthel, Gordon; Schnell, Leonie; Herrlich, Peter; Blonder, Josip;

Veenstra, Timothy D. et al. (2012): CD44 Promotes intoxication by the clostridial iotafamily

toxins. In: PLoS One 7 (12), S. e51356.

Yen, F. T.; Mann, C. J.; Guermani, L. M.; Hannouche, N. F.; Hubert, N.; Hornick, C. A. et

al. (1994): Identification of a lipolysis-stimulated receptor that is distinct from the LDL

receptor and the LDL receptor-related protein. In: Biochemistry 33 (5), S. 1172–1180.

Yen, FrancesT; Roitel, Olivier; Bonnard, Lionel; Notet, Veronique; Pratte, Dagmar; Stenger,

Christophe et al. (2008): Lipolysis stimulated lipoprotein receptor: a novel molecular

link between hyperlipidemia, weight gain, and atherosclerosis in mice. In: J Biol Chem 283

(37), S. 25650–25659.

68


Danksagung

Danksagung

An dieser Stelle möchte ich mich bei allen bedanken, die mich während meiner Tätigkeit

im Labor und beim Schreiben meiner Dissertation unterstützt haben.

Zuerst möchte ich Herrn Professor Dr. Dr. Aktories danken, dass er es mir ermöglicht hat

in seiner Abteilung zu promovieren und die hervorragende Laborausstattung zur Verfügung

gestellt hat.

Herrn Prof. Dr. Müller möchte ich vorab danken, dass er sich bereit erklärt, die Mühen der

Zweitkorrektur auf sich zu nehmen.

Der größte Dank gebührt meinen Eltern und meiner Schwester, die immer zu mir gehalten

haben und mich auch in schwierigen Zeiten unterstützt haben. Ohne sie und ohne ihre Unterstützung

wäre ich heute sicherlich nicht in der Position, eine Danksagung in einer Dissertationsschrift

zu verfassen. Selbiges gilt für Martin Rupp, M.A., der sich als Politologe

in den letzten Jahren vermutlich täglich allerlei Probleme aus fachfremden Bereichen anhören

musste und trotzdem immer zu mir gehalten und mir Kraft gegeben hat, wenn ich

welche brauchte.

Besonderer Dank gilt auch all den Kollegen aus der Abteilung 1 der Pharmakologie, die

mir Mut gemacht haben, auch wenn die Thematik sich als schwierig erwies. Allen voran

Jan Castonguay, der mir mit viel Hilfe und Unterstützung im Bereich der Methodik zur

Analyse von Membranen zur Seite stand. Thilo Nöhlke möchte ich für seine Hilfe bei der

Erstellung von Fluorezenzaufnahmen und für die Übernahme der Versuche zur time-lapse-

Mikroskopie danken. Ebenso meinen Kollegen aus meiner Arbeitsgruppe, Gregor Guttenberg,

Sven Hornei, Otilia Wunderlich, Björn Schorch, Bernd Czulkies, Sarah Hemmasi

und Claudia Wilczek, die immer ein offenes Ohr für Probleme im Labor und im Privaten

hatten und mich mit Hilfe und gutem Rat unterstützten. Besonders Sarah möchte ich noch

für ihre große Unterstützung danken, als ich nicht mehr täglich im Labor arbeiten konnte.

All den anderen Mitarbeitern der AG Schmidt, Schwan, Lang, Orth und Klugbauer möchte

ich für die herzlichen Runden am Mittags- und Kaffeetisch danken. Die Gespräche die dort

während der Pausen geführt wurden, haben einen oft den ganzen Stress im Alltag vergessen

lassen.

69


Danksagung

Zuletzt möchte ich ganz herzlich meinem Betreuer Dr. Panagiotis Papatheodorou danken.

Durch seine stets herzliche Art, sein Engagement und seinen Enthusiasmus hat er es immer

wieder geschafft, mich für die Arbeit im Labor zu motivieren, nach Rückschlägen neue

Wege einzuschlagen und mit Kraft und Energie von neuem zu beginnen. Eine bessere Betreuung

hätte ich mir nicht wünschen können.

70


Curriculum Vitae

Curriculum Vitae

Schulische Ausbildung

Sept. 1992 – Juli 1996

Sept. 1996 – Juni 2005

Neunlinden Grund- und Hauptschule Elzach

Geschwister Scholl Gymnasium Waldkirch

Zivildienst

01.09.2005 – 31.05.2006 Zivildienst im Krankentransport und Rettungsdienst

des DRK Emmendingen

Studium

Oktober 2006 – November 2013

Oktober 2013

Studium der Humanmedizin an der Albert-Ludwigs-

Universität Freiburg im Breisgau

Staatsexamen Medizin

Berufliche Tätigkeiten

August 2006 – Mai 2011 Teilzeitbeschäftigung als Rettungssanitäter im Kreisverband

Emmendingen

Dezember 2009 – Juli 2012 Studentische Aushilfe im Zentrum für ambulante Diagnostik

und Chirurgie in Freiburg im Bereich Aufwachraum

und stationäre Versorgung operierter Patienten

27. 08. - 09. 12. 2012 PJ-Student im Fachbereich Innere Medizin der Helios-

Klinik Titisee-Neustadt

10. 12. 2012 - 17. 03. 2013 PJ-Student im Fachbereich Anästhesie des Kantonsspitals

Baselland Standort Bruderholz

18. 03. - 16. 06. 2013 PJ-Student im Fachbereich Chirurgie der Helios-Klinik

Titisee-Neustadt

71


Curriculum Vitae

Praktika

14.09.09 – 10.10.09 Famulatur im Fachbereich Anästhesie im Zentrum für

ambulante Diagnostik & Chirurgie in Freiburg

01.03.10 – 31.03.10 Famulatur im Fachbereich Innere Medizin an der Helios-Klinik

in Titisee-Neustadt

04.12.10 – 02.01.11 Famulatur im Fachbereich Pathologie am Universitätsklinikum

Freiburg

14.02.11 – 27.02.11 Famulatur im Fachbereich Mikrobiologie am Universitätsklinikum

Freiburg

01.04.12 – 15.04.12 Famulatur im Fachbereich der Rechtsmedizin am Universitätsklinikum

Freiburg

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