Kein Folientitel - TCI @ Uni-Hannover.de

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Instrumentelle Methoden

Teil I: Gelelektrophorese

TCI PD Dr. Cornelia Kasper SoSe 2007

Institut für

Technische Chemie


Gliederung

Theoretische Grundlagen

Gelmedien

Nachweis/Färbemethoden

Instrumentierung

Elektrophoretische Grundlagen und Durchführung

Präparative Methoden

Hochauflösende zweidimensionale Elektrophorese

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Technische Chemie


Definition

Unter Elektrophorese versteht man die Wanderung von

Teilchen im elektrischen Feld.

Eigenschaften der Teilchen (Ladung, Größe) bewirken

eine unterschiedliche elektrophoretische Beweglichkeit.

Die verschiedenen Teilchen werden getrennt und

sammeln sich dabei in einzelnen Zonen.

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Theoretische Grundlagen

In einem elektrischen Feld wirken unterschiedliche Kräfte auf ein

geladenes Teilchen:

Beschleunigende Kraft:

Reibungskraft:

Fe

F

tr

= q ⋅ E mit

q = z ⋅ e

=

f

c

⋅v

q: Ladung E: elektrische Feldstärke

fc: : Reibungskoeffizient v: Wanderungsgeschwindigkeit

Stehen die Kräfte im Gleichgewicht, bewegen sich Teilchen mit

einer konstanten Geschwindigkeit im elektrischen Feld.

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Theoretische Grundlagen

F

e

=

F

fr


q


E

=

f

c


v

q


E

v

=

=

u


E

f

c

Der Faktor u ist ein Proportionalitätsfaktor tsfaktor zwischen

Wanderungsgeschwindigkeit und Feldstärke.

Er wird als Mobilität t bezeichnet und ist

substanzspezifisch.

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Theoretische Grundlagen

Effekte auf das Teilchen im elektrischen Feld

F e

: Beschleunigungskraft

F RET : Retardationskraft

F REL : Relaxationskraft

F r : Reibungskraft

Auf Grund beider Effekte nimmt die Mobilität bei zunehmender

Ionenstärke ab.

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Theoretische Grundlagen

Retardationseffekt

Nach der Debye-Hückel

Theorie ist um das Zentralion

eine Ionenatmosphäre entgegengesetzter Ladung

aufgebaut. Sie bewirkt, das das Teilchen durch eine

Lösung wandert, die entgegengesetzt fließt. →

Retardationseffekt

Relaxationseffekt

Durch Anlegen eines elektrischen Feldes wird die

Ionenwolke hinter dem Zentralion her gezogen, das Ion

wird abgebremst. → Relaxation

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Theoretische Grundlagen

Bei schwachen Basen und Säuren ist nicht die

Mobilität des vollständig dissozierten Teilchens wichtig,

sondern die effektive Mobilität ueff.

Sie wird über den Dissoziationsgrad α mit der

Ionenmobilität verknüpft:

α: Dissoziationsgrad

ueff

= ∑ α ⋅

Die Wanderungsgeschwindigkeit kann bei schwachen

Säuren und Basen über pH-Werteinstellungen

optimiert werden.

ui

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Theoretische Grundlagen

Puffersysteme

Bei Durchführung einer Elektrophorese wandern nicht

nur die Probenionen, , sondern auch die dissozierten

Pufferionen.

An beiden Elektroden müssen daher Pufferreservoirs mit

ausreichend Puffer vorhanden sein.

Verwendet werden Säure/ Base- Systeme (z.B. Tris-

Chlorid, Tris-Borid

Borid)

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Theoretische Grundlagen

Wärmeabfuhr

Durch den Einsatz von Strom wird bei

einer Elektrophorese Joul´sche

Wärme entwickelt. Pro Volumeneinheit

entwickelte Wärme W gilt:

W

= E²

⋅λ


c

c = molare Konzentration des Elektrolyten

λ = Äquivalenzleitfähigkeit

F = Faraday- Konstante

E = elektrische Feldstärke

ui = Mobilität

zi = Anzahl

Für λ gilt:

λ =

u

i


z

i


F

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Theoretische Grundlagen

Die Wärmeabfuhr erfolgt über die Wände oder eine Seite

des Systems

Ein Temperaturgradient entsteht

Bei trägerfreier Elektrophorese kommt es zur

Durchmischung

Bei einer Kapillar- oder Gelelektrophorese sollten

geringe Innendurchmesser bzw. dünne Schichten

verwendet werden, damit die Temperaturdifferenz gering

gehalten werden kann.

Die Materialien sollten eine gute Wärmeleitfähigkeit

haben.

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Elektrochemische Doppelschicht

Auf der Oberfläche vieler Materialien ( Glas, Teflon,

Papier, Agarose) ) bildet sich bei Kontakt mit

Elektrolytlösungen eine elektrochemische Doppelschicht.

Grund : Oberflächenladungen

Erläuterungen am Beispiel einer fused Silica–Kapillare

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Theoretische Grundlagen

Aufbau und Potentialverlauf der

elektrochemischen Doppelschicht

•Bei der Dissoziation von

Silanolgruppen werden negative

Ladungen an der Wand ausgebildet.

• Diese werden durch positive

Gegenladungen aus der Lösung

kompensiert.

•Die Abbildung zeigt einen

Potentialabfall.

•In der starren Schicht an der

Wandung ist der Abfall linear.

•In diffusen Schicht in der Lösung liegt

ein exponentieller Abfall vor.

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Elektroosmotischer Fluß (EOF)

Durch die Doppelschicht bedingt wird bei Anlegen einer

elektrischen Spannung das Lösungsmittel in einen Fluß (EOF) in

Richtung der Kathode gebracht. Eine Strömung in der flüssigen

Phase tritt auf.

Grund: positive Gegenladungen der Doppelschicht.

Geschwindigkeit des EOF: abhängig vom ζ-Potential

vEOF

Theoretische Grundlagen

ε ⋅ζ

⋅ E

= 4 ⋅∏⋅η

ε: Dielektrizitätskonstante

tskonstante

ζ: Zeta-Potential

E: elektrische Feldstärke

η: : Viskosität

In der Gelelektrophorese tritt die Elektroendosmose auf.

Folgen: da der EOF der Richtung der Probenionen

entgegengesetzt ist, sind Verzerrungen und Verdünnungen der

Zonen die Folge.

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Theoretische Grundlagen

Elektroendosmose: Aufgrund fixierter Ladungen an der Matrixoberfläche

entsteht im elektrischen Feld ein der Elektrophoreserichtung entgegengesetzter

osmotischer Fluß.

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Gelmedien

Agarose

•Einfache Handhabung

•Ungiftig

•Werden eingesetzt zur

Trennung hochmolekularer

Proteine über 500 kDa

•Niedrige Siebwirkung für

kleine Proteine

•Gele sind nicht klar

•Sind nicht Elektroendosmose

frei

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Gelmedien

Polyacrylamid

Vernetzungsmuster des Polyacrylamids (PA)

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Gelmedien

PA ist chemisch inert und stabil (Gele reißen nicht so leicht)

Geringe Elektroendosmose

Klare Gele auf Grund Vernetzer N,N´-Methylenbisacrylamid

Porengröße der Gele ist von der Konzentration und dem

Vernetzungsgrad abhängig

Eignen sich für viele Färbemethoden

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Gelmedien

Nachteile:

Monomer ist toxisch

Proteine über 800 kDa können nicht

getrennt werden

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Nachweis/Färbemethoden

Qualitativer Nachweis: Färbung oder radioaktive

Markierung

Quantitativer Nachweis: Densitometrie (Lichtabsorption)

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Nachweis/Färbemethoden

Coomassie-Brilliant

Blue

Einfachste Methode, kurze Färbemethode

Proteine werden blau angefärbt

Empfindlichkeit: 100 ng – 1 µg pro Bande

Silberfärbung

Silberionen werden von Proteinen gebunden und durch

Reduktion in Silber umgewandelt. Mechanismus ähnlich

dem der Fotografie

Empfindliche Methode, längere Färbezeiten

Empfindlichkeit: ng-Bereich pro Bande

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Nachweis/Färbemethoden

Coomassie

1 2 3

Die Banden in den Taschen/Spuren 1-3 sind

Markerproteine.

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Nachweis/Färbemethoden

Agarosegel

Dargestellt sind PCR-Produkte. Links befindet sich ein

Standard.

Die Färbung erfolgte mit Ethidiumbromid und wird unter

UV-Licht (254 nm) fotographiert.

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Instrumentierung

Grundsätzlich finden horizontale und vertikale Systeme

Verwendung.

Vertikale Systeme: : Die Gele sind in Kassetten oder auf

Trägermaterial (Glasplatten, Polycarbonatplatten)

befestigt und von flüssigem Puffer umgeben. Die Proben

werden in Taschen am oberen Ende der Gele

aufgegeben. Die Proben laufen von oben nach unten.

Die schweren und großen Proteine befinden sich im

oberen Teil des Gels.

Die Wärmeabfuhr wird durch Kühlung mittels der Puffer

geregelt.

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Instrumentierung

Vertikale Elektrophoreseapparatur

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Instrumentierung

Horizontale Systeme: : Die Gele können auf einem Trägermaterial

aufgetragen sein. Die Versorgung mit Pufferionen erfolgt entweder

durch Filterpapierstreifen, die in Flüssigpuffertanks hängen oder

durch getränkte Filterpapierstreifen.

Moderne Systeme verwenden Gelstreifen die mit den Pufferionen

versetzt sind. Das Verfahren ist als semidry anzusehen.

Die Probe kann über einen aufliegenden Filterstreifen aufgebracht

werden oder sie werden in eingegossene Taschen pipettiert.

Die entstehende Wärme muss abgeführt werden, daher haben

solche Systeme eine Wasserkühlung.

Die Elektrophorese wird mit Spannungen von 200V durchgeführt

werden.

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Instrumentierung

Horizontales Elektrophorese Systeme

B: statt Filterpapierstreifen werden

auch Gelstreifen mit Puffer verwendet

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Grundprinzipien und Durchführung

Zonenelektrophorese: : Trennprinzip beruht auf

unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeiten der

geladenen Teilchen im Feld. Grundlage jeder

Elektrophorese

Isotachophorese: : Die geladenen Teilchen wandern alle

mit der gleichen Geschwindigkeit im diskontinuierlichen

System.

Isoelektrische

Focussierung: : Trennung der Teilchen

nach dem isoelektrischen Punkt innerhalb eines pH-

Gradienten

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Grundprinzipien und Durchführung

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Grundprinzipien und Durchführung

Zonenelektrophorese

Grundprinzip der Elektrophorese

Trennung eines Proteingemisches in Zonen

Das Trennprinzip beruht auf den unterschiedlichen

Wanderungsgeschwindigkeiten (→Mobilit(

Mobilität) t)

Beeinflussung der Ladung durch Temperatur und pH-

Wert des Puffers

Unveränderlicher nderlicher pH-Wert des Gels

Bestimmung nach Molekulargewicht, Molekülgr

lgröße e oder

isoelektrischer Punkt

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Grundprinzipien und Durchführung

• Probenauftrag der gemischten

Proteine

•Auftrennung in Zonen

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Grundprinzipien und Durchführung

Porengradientengele

Dienen zur Ermittlung von Molekülgrößen eines Proteins.

Durch eine kontinuierliche Veränderung der Vernetzung

eines Gels erhält man einen Gradienten.

Die Proteine bleiben in der enger werdenden Poren des

Gels je nach Größe stecken.

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Grundprinzipien und Durchführung

Herstellung eines linearen

Porengradientengels

Zwei Polymerisationslösungen mit

unterschiedlicher

Monomerkonzentration werden mit

Hilfe eines Gradientenmischers

vermischt. Dabei wird der

höherkonzentrierten Lösung die

niederkonzentrierte Lösung

zugemischt.

Um ein Vermischen in der

Gelkassette zu verhindern wird die

konzentrierte Lösung Glycerin

überschichtet.

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Grundprinzipien und Durchführung

Disk-Elektrophorese

Disk steht für diskontinuierlich

Gelmatrix ist in zwei Bereiche geteilt:

weitporiges Sammelgel und engporiges

Trenngel

Vorteil : die Aggregation der Proteine wird

verhindert, man erhält schärfere Banden

Kombination zweier Puffersysteme: Tris-Chlorid

Chlorid/

Tris-Glycin

Glycin-System

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Grundprinzipien und Durchführung

Sammelgel pH 6,8 und Trenngel pH 8,8

Glycin

hat auf Grund des pH-Wertes eine

niedrige elektrophoretische Mobilität und fungiert

als Folge-Ion, Chlorid hat eine hohe Mobilität

und dient als Leit-Ion.

Die Mobilitäten der aufzutrennenden Proteine

liegen zwischen denen der Leit- und Folge-

Ionen.

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Grundprinzipien und Durchführung

Prinzip der diskontinuierlichen Elektrophorese

Nach Anlegen des elektrischen Feldes setzt die Isotachophorese ein: alle Ionen

wandern mit der gleichen Geschwindigkeit und bilden einen Proteinstapel in

Reihenfolge ihrer Mobilitäten.

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Grundprinzipien und Durchführung

Proteinstapel wandert langsam in Richtung

Anode.

Bei dem Übergang in das engporige Trenngel

bildet sich eine Art „Stau“.

Proteine erfahren einen Reibungswiderstand.

Der Stapel löst sich im homogenen Puffer auf.

Die einzelnen Komponenten trennen sich nun

nach dem Zonenprinzip auf.

Die Proteinenfolge ändert sich, da im Trenngel

die Molekülgröße einen großen Einfluß auf die

Mobilität hat.

TCI

TCI

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Grundprinzipien und Durchführung

Saure Nativelektrophorese

Methode zur Trennung von basischen Proteinen

(z.B. Getreideproteine)

Saures Puffersystem (z.B. HEPES –Puffer

pH 5,5)

Proteine sind positiv geladen und wandern zur

Kathode

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Grundprinzipien und Durchführung

SDS-PAGE

SDS steht für Sodium dodecyl sulfate

Anionisches Detergenz

Überdeckt die Eigenladungen der Proteine →

Entstehung von Micellen mit konstanter negativer

Ladung pro Masseneinheit

1,4 g SDS pro g Aminosäure

PAGE steht für Polyacrylamidgel-Elektrophorese

Standardmäßig wird eine diskontnuierliche

Elektrophorese mit SDS-haltigen

Tris-HCL

HCL/ Tris-Glycin

Puffern nach Laemmli durchgeführt.

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Grundprinzipien und Durchführung

Probenvorbereitung

Proben werden mit einem Puffer versetzt, der die nötige

Menge SDS im Überschuß enthält

Zusätzlich wird Mercaptoethanol frisch dazu gegeben

→ Aufspaltung von Schwefelbrücken cken zwischen Cysteinen

Die Proben werden für f r 5 min auf 95°C C erhitzt

→ es erfolgt eine Streckung des Moleküls, ls, Sekundär- und

Tertiärstrukturen rstrukturen werden aufgebrochen

Proben werden nach Erhitzen abzentrifugiert und

können auf das Gel pipettiert werden.

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Grundprinzipien und Durchführung

Vorteile der SDS-PAGE

Proteinaggregation wird verhindert

Schnelle Trennungen, da die Micellen hohe Ladungen

tragen

Trennung erfolgt nur nach einem Parameter

(Molekulargewicht)

Es gehen auch sehr hydrophobe und denaturierte Proteine

in Lösung

Nachteile der SDS-PAGE

Denaturierung ist irreversibel

SDS ist nicht kompatibel mit nicht-ionischen

ionischen Detergenzien

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Grundprinzipien und Durchführung

SDS-PAGE

Spur 3 enthält ein

Markergemisch

Rechts Angabe der

Molmassen der

Markerproteine in kDa

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Grundprinzipien und Durchführung

silbergefärbtes SDS-Gel

1 2

In den Spuren 1 und 2 sind Markerproteine

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Grundprinzipien und Durchführung

Isoelektrische Fokussierung (IEF)

Protein wandert im elektrischen Feld durch einen pH-

Gradienten

An dem Punkt, an dem die Nettoladung gleich Null ist

befindet sich sein isoelektrischer Punkt

Nettoladung eines Protein = Summe aller negativen und

positiven Ladungen an den Aminosäuregruppen

IEF ist im Gegensatz zu den anderen

elektrophoretischen Methoden eine Endpunktmethode

→ die Proteine können k

nicht mehr weiter wandern

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Grundprinzipien und Durchführung

A: Nettoladungskurven zweier Proteine A und B

B: Fokussierung der Probenproteine A und B im Feld

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Grundprinzipien und Durchführung

Bestimmt man die Nettoladungen der Proteine bei

unterschiedlichen pH-Werten erhält man eine

charakteristische Kurve.

Der Schnittpunkt der Kurve mit der x-Achse x

gibt den

isoelektrischen Punkt des Proteins an.

Als Trennmedien dienen auch hier Agarosegele und PA-

Gele.

In den Gelen muß der Gradient stabil sein und eine

gleichmäßige Leitfähigkeit vorweisen

Zwei Konzepte finden Verwendung:

pH-Gradienten

aus freien Trägerampholyten und

immobilisierte pH-Gradienten

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Grundprinzipien und Durchführung

Trägerampholyte

Ideale Trägerampholyte weisen folgende Eigenschaften

aus:

Hohe Pufferkapazität und Löslichkeit am pI

Gleichmäßige Leitfähigkeit

Frei von biologischen Effekten

Niedriges Molekulargewicht

Trägerampholyte bestehen aus mehreren hundert

unterschiedlichen aliphatischen Oligoamino-

Oligocarbonsäuren mit unterschiedlichen pI-Werten

Werten.

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Grundprinzipien und Durchführung

Konzentrationen der Ampholyte muß gleich im Gel sein,

sonst treten Lücken im pH Spektrum auf.

2% Ampholyte im Gel

Nach anlegen des elektrischen Feldes richten sich die

geladenen Teilchen aus und bilden den Gradienten

Die Trägerampholyte mit dem niedrigsten pI wandern bis

an das anodische Ende des Gels, die Ampholyte mit

dem höchsten pI wandern an das kathodische Ende.

Der Gradient kann nach langer Focussionszeit anfangen

zu driften (Kathodendrift). Banden werden unscharf,

basische Proteine gehen verloren.

Vorteil: Trägerampholyte wirken als Zwitterionen und

halten Proteine in Lösung

TCI

TCI

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Grundprinzipien und Durchführung

Immobilisierte pH-Gradienten

(IPG)

IPG sind in die Gelmatrix einpolymerisiert

Eingesetzt werden dazu bifunktionelle Immobiline

H2C=CH-C=O C=O (–NHR)(

Immobiline sind Acrylamidderivate und somit schwache

Säuren oder schwache Basen.

Definition der Immobiline erfolgt über ihre pK-Werte

Man benötigt zwei unterschiedliche Immobiline.

Der zu puffernde pH-Wert ergibt sich aus dem

Mischungsverhältnis.

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Grundprinzipien und Durchführung

Immobilisierte puffernde Gruppen in

einem Polyacrylamidnetzwerk.

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Grundprinzipien und Durchführung

Herstellung immobilisierter pH-Gradienten

Mischen von unterschiedlichen Polymerisationslösungen

mit Gradientenmischer

Lösungen enthalten Acrylamidmonomere zur

Polymerisation einer Matrix auf einer Trägerfolie.

Die Immobiline werden kovalent an das

Polyacrylnetzwerk gebunden.

Nach der Polymerisation müssen die Katalysatoren mit

Wasser aus der Matrix entfernt werden.

Gel wird getrocknet und kann bei -20

o C gelagert werden.

Vor Gebrauch wird das Gel in Additiva (Harnstoff,

Dithiothreitol, Detergenzien) ) wieder gequollen.

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Grundprinzipien und Durchführung

Vorteile:

Endpunktmethode mit hoher Auflösung

IP läßt sich dirket ablesen

Kombination mit SDS-Elektrophorese

Elektrophorese→ 2D-Elektrophorese

Nachteile:

Aufwendigere Färbtechniken F

als bei der

Zonenelektrophorese

Aufwendiges Herstellungsverfahren

Aggregierende Proteine (Membranproteine) können k

nicht in

das Gel einwandern

Lange Trennzeiten

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Grundprinzipien und Durchführung

A: IEF im Bereich pH 4,35-4,55 B: IEF im Bereich pH 4-10

Isoelektrische Fokussierung:

TCI

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Titrationkurvenanalyse

Bestimmung von Nettoladungskurven von Proteinen

Durchführung:

IEF ohne Probe wird auf einem Trägerampholytgel

durchgeführt→ Bildung des pH-Gradienten

Gel wird um 90° gedreht

Probe wird in eine Gelrinne pipettiert

Nach Anlegen eines elektrischen Feldes wandern die

Proteine in Abhängigkeit ihres pH-Wertes mit

unterschiedlichen Mobilitäten.

Bildung von Titrationskurven mit Schnittpunkt des pI des

Proteins an der Gelrinne

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Grundprinzipien und Durchführung

A: Probenaufgabe auf ein vorfokussiertes Gel

B: Nettoladungskurven nach Anlegen des elektrischen

Feldes

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Präparative elektrophoretische Verfahren

Elektroelution aus Gelen

Präparative Zonenelektrophorese

Präparative isoelektrische Focussierung

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Präparative elektrophoretische Verfahren

Elektroelution aus Gelen

Dient zur Gewinnung von Proteinen aus PA-Gelen zur

weiteren Analyse

Methode A: Protein aus einem ausgeschnittenen

Gelstückchen wird in einer Vertikalelektrophorsekammer

in eine Dialysemembran transportiert.

Methode B: Das Protein wird mittels Puffer ohne

Dialysemembran in einer Miniapparatur in ein

Reaktiongefäß hineineluiert.

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Präparative elektrophoretische Verfahren

Elektroelution aus Gelen

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Präparative Zonenelektrophorese

Reinigungsmethode für

mg-Mengen Protein

Elektrophorese und

Trennung in einzelne

Zonen wird mit

Polyacrylamidgelen in

einem Glasrohr

durchgeführt.

Ankommende Zonen

werden durch

kontnuierlichen

Pufferstrom abgeführt.

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Präparative IEF

Aufreinigungsmethode für größere Mengen Protein

Kein Gel mit immobilisierten pH-Gradienten

Mehrkammer-Focussierungsapparatur

mit gepufferten

isoelektrischen Polyacrylamidmembranen

Zur Probenauftrennung gibt man ein Proteingemisch in

eine Kammer

Die Proteine wandern nach Anlegen eines Feldes in die

benachbarten Kammern gemäß ihren isoelektrischen

Werten

Das aufgereinigte Protein kann der Kammer entnommen

werden

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Präparative IEF

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2D Gelelektrophorese

Sehr großes Auflösungsvermögen

Auftrennung der Proteine erfolgt nach zwei Kriterien:

isoelektrischer Punkt und Molmasse

Proteine mit gleicher Molmasse oder gleichem pI-Wert

können durch die zweite Dimension aufgetrennt werden.

Trenntechnik zur qualitativen und quantitativen

Untersuchung der Proteinexpression von Zellen,

Geweben und Organismen (Proteomics(

Proteomics)

mikropräparative Reinigung von Proteinen aus

komplexen Proteingemischen für deren nachfolgende

Charakterisierung und Identifizierung

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Prinzip

2D Gelelektrophorese

1.Dimension

Durchführen einer isoelektrischen Fokussierung: die

Proteine ordnen sich gemäß ihrem pI-Wert

auf dem

Trägerampholyten oder IPG Streifen an

2. Dimension

der Trägerampholyt/Gelstreifen

wird um 90% gedreht auf

das SDS-Gel gelegt:

die Proteine werden gemäß ihrer Masse getrennt

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2D Gelelektrophorese

1.Dimension:

•Rehydrieren

der IPG-Streifen

mit Probe

•Durchführen der IEF, Trennung

nach IP

•Umpuffern mit DTT und

anschließend mit IAA

2.Dimension:

•Auflegen des IPG-Streifens

Streifens,

quer zur Laufrichtung der

Proteine

•Auftrennen nach Molmasse

•Fixierung und Färbung

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2D Gelelektrophorese

Abbildung eines 2-D-SDS2

SDS-PAGE einer Mäuseleberprobe ( Görg A., Biochem.Soc. . Trans., 21 (1993)

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2D-Gel einer Probe mit Standardproteinen

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