Western-Blot

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Western-Blot

Western-Blot Master-Anweisung, letzte Bearb. Mai 2009

1. Proteintransfer (Handschuhe anziehen!)

• Nach Beendigung der Elektrophorese wird die Gelkassette zerlegt und das Glasplatten-Sandwich mit dem

Gel so auf den Labortisch gelegt, dass die Beladungsreihenfolge der Geltaschen die richtige Orientierung hat.

• Mit einem Plastikspatel werden die Glasplatten vorsichtig auseinandergehebelt, so dass sich eine Glasplatte

löst und das Gel auf der anderen Glasplatte plan anliegen bleibt (falls sich das Gel an der oberen Platte

befindet, diese mit dem Gel nach oben auf den Labortisch legen, aber für alle weiteren Schritte die

Orientierung des Gels beachten!).

• Schneiden Sie mit dem Cuttermesser das Stacking-Gel von dem Trenngel ab (Gel dabei nicht zerreißen!).

• Um die Orientierung des Gels während der nachfolgenden Schritte zu bewahren, kann links oben eine kleine

Ecke des Gels abgeschnitten werden.

• Transferieren Sie das Trenngel mit der Gesichtsseite nach oben in eine Schale mit Transferpuffer und

inkubieren sie es dort für 15 min bei Raumtemperatur.

• In der Zwischenzeit:

Schneide (falls noch nicht geschehen) Nitrocellulose-Filter (Schutzpapier auf Ober- und Unterseite belassen,

Filter nicht drücken, daran kratzen o.ä.!) passend zum Gel (i.d.R. im Format 7 x 10 cm) zu.

Schneide am besten auf Vorrat (staubfrei lagern!) Filterpapier (Whatman #1) ebenfalls im passenden Format

(7 x 10 cm) zu. Alternativ kann als obere und untere Lage des Blot-Sandwiches das dicke Blotpapier von

Biorad im passenden Zuschnitt verwendet werden.

• Mit der Blotpinzette: Lege entprechend der Anzahl zu blottender Gele Nitrocellulose-Filter ohne

Schutzhülle auf die Flüssigkeits-Oberfläche in einer Schale mit Transferpuffer. Warte, bis die Filter

einheitlich grau geworden sind, dann erst tunke die Filter mit der Pinzette (nicht auf die Fläche drücken!)

unter die Flüssigkeitsoberfläche.

• Lege pro Gel 10 Blätter des Whatman-Filterpapiers (oder 2 Blätter des Biorad-Blotpapiers) luftblasenfrei in

den Transferpuffer und lasse sie vollsaugen.

• Baue nun den Blotstapel auf der unteren Elektrode (Platin-Anode) des Semi-Dry-Blotapparates zusammen:

Luftblasenfrei (durchnässte Filter abrollen!) schichten:

1) 5 x Whatmanfilter oder 1 x Biorad-Blotpapier

2) Nitrocellulosemembran

3) Polyacrylamidgel (Beladungsreihenfolge der Geltaschen von oben sichtbar, ggf. links oben Ecke

geschnitten)

4) 5 x Whatmanfilter

Wenn Nitrocellulose und Gel aufeinander liegen, Sandwich nicht mehr bewegen oder verschieben!

Das fertige Sandwich sollte am Ende so aussehen:

5 x Whatmanfilter oder 1 x Biorad-Blotpapier

Polyacrylamidgel

Nitrocellulosemembran

5 x Whatmanfilter oder 1 x Biorad-Blotpapier

• Wenn mehr als ein Gel geblottet werden soll, werden 2 oder 4 solcher Sandwiches auf der unteren Elektrode

aufgebaut (4 nebeneinander ist zur Erzielung eines gleichmäßigen Blotergebnisses besser als je 2

übereinander!). Achte darauf, dass sich die Stapel seitlich nicht berühren!

• Wenn alle Sandwiches aufgebaut sind: Mit einem Glasstab/Pasteurpipette leicht und gleichmäßig über den

Stapel rollen, um gleichmäßige Pufferverteilung zu gewährleisten.

• Mit einem Kleenex vorsichtig überschüssigen Puffer von der unteren Elektrode aufsaugen.

• Mit einer Einmal-Plastikpipette werden nun auf jedes Sandwich flächig verteilt je 6 Tropfen Transferpuffer

aufgetropft.

• Obere Elektrode (Edelstahl-Kathode) waagerecht aufsetzen und einrasten. Deckel aufsetzen.

• Elektrische Verbindung zum Netzgerät herstellen (Polung beachten!) und Netzgerät anschalten.

• Einstellungen (eine Spannung von 25 V sollte zu keinem Zeitpunkt überschritten werden!):

Blotzeit (min) konst. Stromstärke (mA)

1 Gel (7 x 10 cm) 15 300

2 Gele (7 x 10 cm) nebeneinander 30 300

4 Gele (7 x 10 cm) nebeneinander 60 300

(4 Gele (7 x 10 cm), 2 Stapel mit je 2 Sandwiches 30 300)


2. Western-Blot (Handschuhe anziehen!)

• Nach Ende der Blotzeit Gerät abschalten, obere Filter und Gele entnehmen und verwerfen.

Blots (Gesichtsseite nach oben!) in Ponceau-Lösung überführen (10 min, RT).

Blots einzeln nacheinander mit der Blotpinzette aus der Ponceau-Lösung fischen und in einer Schale mit

A.dest. kurz schwenken, bis die roten Farbstoffwolken abgeschwemmt sind.

Blot dann sofort auf ein frisches Filterpapier legen, mit Filterpapier zudecken und überstehende Flüssigkeit

absaugen.

Blot anschließend auf frisches Filterpapier überführen und mit einem weichen Bleistift (max. HB) oben das

Datum und ggf. die Blotnummer einschreiben und die Protein-Standardsignale markieren (Achtung, Blot

nicht zerreißen!).

Blots einzeln wie folgt in grauen Plastik-Containern inkubieren (mit Parafilm abdecken):

Zeit / Temp. Lösung Gele (7 x 10 cm)

blockieren 1-1 1 Blockierlösung:

/2 h / RT

TTBS-Lösung mit 3 % Milch

25 ml

über Nacht bei in

prim. Antikörper

4 °C TTBS-Lösung mit 0,1 % Milch

10 ml

3 x waschen je 5 min / 4 °C Waschlösung:

je 25 ml

sek. Antikörper

(HRP-coupled)

1 h / 4 °C

3 x waschen je 5 min / 4 °C

0,1 % Milch in TTBS-Lösung

Waschlösung:

0,1 % Milch in TTBS-Lösung

Waschlösung:

0,1 % Milch-TTBS-Lösung

letzter Waschschritt:

TTBS-Lösung ohne Milch!!

10 ml

je 25 ml

• Achte darauf, in welchem Tier der primäre Antikörper hergestellt ist (Kaninchen (rabbit), Maus (mouse),

Schaf (sheep), Ziege (goat) etc.), weil der HRP-gekoppelte Sekundärantikörper danach ausgesucht werden

muss!

• Bringe die Blots aus dem Kühlraum in die Dunkelkammer, bereite diese für den ECL-Nachweis der

Proteinbanden vor.

• Kombiniere in einem sauberen grauen Inkubationsbehälter je 5 ml der ECL-Reagenzien A und B.

• Lege die Blots nacheinander (Gesichtsseiten nach oben bzw. nach unten) ein, so dass jeder von beiden

Seiten gut benetzt wird. Achte bei mehreren Blots darauf, dass eine Flüssigkeitslamelle zwischen den Blots

existiert und die Blots nicht aneinander kleben.

• Inkubiere 1 min unter leichter Bewegung mit 1 x Umdrehen.

• Lege die Blots neben- bzw. untereinander mit der Gesichtsseite nach oben auf eine Plastikfolie (z.B. untere

Lage eines dreiseitig aufgeschnittenen klaren Müllbeutels) und decke die obere Lage durch Abrollen darüber

(keine Luftblasen fangen!).

• Wische vorsichtig (leicht und gleichmäßig) überschüssiges Reagenz mit einem Kleenex aus dem Sandwich

heraus und tupfe es auf, so das kein Reagenz an den Plastiklagen klebt (Sandwich in sich dabei nicht

verschieben!)

• Lege das Sandwich in die Belichtungskassette ein und lege einen Film auf.

• Zunächst eine Expositionszeit von 10 s ausprobieren, dann Film entfernen, in Entwicklerschale legen (gut

benetzen!) und neuen Film auf das Sandwich legen.

• Expositonszeit 30 min abwarten, dann auch diesen Film entwickeln.

• Filme nach der Entwicklung (7 – 8 min) fixieren (5 min).

• Filme wässern (15 min).

• Filme trocknen und beschriften (Datum, Blotnummern, Antikörperinkubationen, Expositionszeiten,

Gelbahnen).

• Signale einscannen und in Phoretix auswerten (optische Dichte, Molekularmasse etc.).

• Nach Ende der ECL-Prozedur werden die Blots in A.dest. gründlich gewaschen, noch einmal Ponceaugefärbt

und zwischen Filterpapieren glatt getrocknet. Die Blots werden dann ganz an der Seite mit Tesafilm

auf einem sauberen DIN A4-Blatt fixiert und dieses in eine klare Aktenhülle geschoben. Die Blots können

so, wenn sie nicht mit bloßen Händen angefasst und staubfrei gelagert werden, aufgehoben und ggf. für

spätere Nachweisreaktionen benutzt werden.

• Soll sich an die ECL-Prozedur eine weitere Nachweisreaktion anschließen, werden die Blots gründlich in

A.dest. gewaschen und anschließend für 30 min bei 50 °C in Strip-Puffer inkubiert.


• Es kann sinnvoll sein, die Abschwemmung der Primär- und Sekundärantikörper durch einen ECL-Test zu

überprüfen (dazu Blots 2 x 5 min in TTBS-Lösung ohne Milch waschen, dann ECL-Prozedur in der

Dunkelkammer ausführen).

• Zur Durchführung der zweiten Nachweisreaktion werden die Blots dann wieder in A.dest. gründlich

gewaschen und in Blockpuffer (TTBS mit 3 % Milch) bei Raumtemperatur für 1-1 1 /2 h inkubiert.

3. Lösungen

Transferpuffer ( 5 l ) (48 mmol/l Tris, 39 mmol/l Glycin, 1,3 mmol/l SDS, 20 % Methanol, pH 9,2)

Tris (free base)

29,1 g

Glycin 14,7 g • Tris und Glycin in 2 l A. dest lösen

10 % SDS-Lösung 18,75 ml • SDS-Lösung und Methanol zugeben

Methanol 1000 ml • auf 5 l mit A. dest auffüllen, bei 4 °C lagern

10 x TTBS –Lösung (End-Konz. (1 x): 0,1 mol/l Tris, 150 mmol/l NaCl, 0,1 % Tween 20, pH 7,5)

Tris 121,1 g • Tris und NaCl in 600 ml A. dest. lösen

NaCl 87,7 g • pH mit konz. HCl auf pH 7,5 einstellen ( ca. 60 ml)

Tween 20 10 ml • Tween 20 zugeben, auf 1 l mit A.dest. auffüllen

• bei 4 °C im Kühlschrank lagern

• vor Gebrauch 1 Teil TTBS (10 x) mit 9 Teilen A.dest.

verdünnen

Milch für TTBS

( 3 % (w/v) Milch – Gesamtvol. 25 ml; 0,1 % (w/v) Milch – Gesamtvol. 250 ml;

Gesamtvolumina reichen für je 2 Blots im Format 7 x 10 cm)

3 % Milchpulver 0,75 g

0,1 % Milchpulver 0,25 g • Milchpulver in 25 ml bzw. 250 ml 1 x TTBS - Lösung

lösen

• rühren auf Magnettisch, bis vollst. gelöst, nicht lange

lagern

Primär-Antikörper

Verdünnung

1:6000

1:5000

1:4000

1:3000

1:2000

1:1000

1:500

µl auf 10 ml

TTBS-Lösung

mit 0,1 %

Milch

1,7 µl

2 μl

2,5 μl

3,3 μl

5 μl

10 μl

20 μl

Sekundär-

Antikörper

Verdünnung

1:6000

1:6000

1:6000

1:6000

1:6000

1:6000

1:6000

µl auf 10 ml

TTBS-Lösung

mit 0,1 %

Milch

1,7 µl

1,7 µl

1,7 µl

1,7 µl

1,7 µl

1,7 µl

1,7 µl

Pufferlösung zum Strippen von Blots

(End-Konz.: 48 mmol/l Tris, 2 % SDS, 1 % ß-

Mercaptoethanol, pH 6,7)

Tris

10 % SDS-Lösung

ß-Mercaptoethanol

0,575 g

20 ml

1 ml

Tris in einem 250 ml Erlenmeyer-

Kolben mit 50 ml A.dest. versetzen,

pH mit konz. HCl auf 6,7 einstellen,

SDS-Lösung und Mercaptoethanol

zusetzen, mit A.dest. auf 100 ml

auffüllen. Lagere bei 4 °C.


Entwickler

Stammlösung 100 ml • mischen

A. dest 900 ml • bei RT dunkel lagern

Fixierer

Stammlösung 100 ml • mischen

A. dest 900 ml • bei RT dunkel lagern

Ponceau-Lösung

Trichloressigsäure 3 g • auf 1 l mit A. dest auffüllen

Ponceau S 2 g • lösen

• bei RT lagern

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