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Molekularbiologische Methoden -

Einsatzmöglichkeiten und Grenzen

„Kirby-Bauer meets Watson-Crick“,

ASM News

Peter Heisig

Universität Hamburg

PH2004, UniHH 1

PEG Resistance surveillance 04-04


Einsatzmöglichkeiten für molekulargenetische Methoden

zur Resistenzbestimmung

Bei langsam wachsenden oder nicht kultivierbaren Erregern

M. tuberculosis, HCV

Bei variabel exprimiertem Resistenzphänotyp

MRSA, β-Lactamase, vanA

Bei lebensbedrohlichen Infektionen

Sepsis

Bei molekularepidemiologischen Fragestellungen

PH2004, UniHH 2

PEG Resistance surveillance 04-04


Wodurch kommt es zur Resistenz ?

Veränderung der Zielstruktur

Bakterien, Pilze, Viren

Inaktivierung des Wirkstoffs

Bakterien, (Pilze)

Einschränkung des Zugangs zur Zielstruktur

Bakterien, Pilze

PH2004, UniHH 3

PEG Resistance surveillance 04-04


Was muß detektiert werden ?

Veränderung in vorhandener genetischer Information

DNA: Punktmutation, Deletion, Rekombination, Insertion

RNA: Veränderte Quantität

Aufnahme neuer genetischer Information

DNA: Plasmid, Genfragment, Rekombination, Insertion

Induktionsphänomene ohne genetische Veränderung

RNA: Veränderte Quantität

PH2004, UniHH 4

PEG Resistance surveillance 04-04


Resistenz durch Veränderung

vorhandener genetischer Information

Änderung einzelner Codons

in spezifischem Target

Serin-83 in gyrA

Inaktivierung eines Gens

durch diverse Mutationen

acrR

(Thr)

A

(Ala)

G

(Pro)

C

(Stop)

A

T C G

(Trp)

G

(Leu)

T

(Ser)

A

(Ser)

C

(Ser)

T

Relative Häufigkeit (Mutationsfrequenz zur Fluorchinolonresistenz)

10 -9 10 -6

punktuell

Verteilung im Genom

Austausch

Deletion

Insertion

breit

PH2004, UniHH 5

PEG Resistance surveillance 04-04


Auswirkungen von Punktmutationen

reduzierte Empfindlichkeit der Zielstruktur

rpoB (Asp-516 Tyr):

rpsL (Lys-42 Asn):

gyrA (Ser-83 Leu) :

Veränderung des Substratspektrums

TEM-2 (Arg-164 ) :

TEM-7 (Ser-164 ) :

aacA-I (Leu-119) :

aacA-II (Ser-119) :

MHK-Anstieg für Rifampicin: 2.000-fach

MHK-Anstieg für Streptomycin: 2.000-fach

MHK-Anstieg für Nalidixinsäure: 250-fach

MHK CAZ: 0,2 µg/ml

MHK CAZ. 32 µg/ml

MHK Gen: 0,25 µg/ml Ami: 16 µg/ml

MHK Gen: 8 µg/ml Ami: 1 µg/ml

Erhöhte Resistenzgenexpression durch Deregulation

Repressorinaktivierung (marR, mexR, acrR, mecI, ampD, tetR)

Promotoraktivierung (pmecA , pbla-K1)

PH2004, UniHH 6

PEG Resistance surveillance 04-04


Variabler Phänotyp als Folge von Punktmutationen

Genlocus

Expressionsstatus

Äußere

Membran

Cytoplasmamembran

Resistenzgenotyp

∆ MHK

Cip [µg/ml]

acrAB

acrEF

acrR acrA acrB tolC

acrS acrE acrF tolC

schwach

konstitutiv

acrR -

0,015 0,06

nalB

mexR mexA mexB oprM

schwach

konstitutiv

mexR -

0,125 0,5

nfxB

nfxC

nfxB mexC mexD oprJ

+

mexT mexE mexF oprN

reprimiert

nicht

aktiviert

nfxB -

PH2004, UniHH 7

PEG Resistance surveillance 04-04

?

0,125 1

0,125 1


Aufnahme von Resistenzgenen

Molekulare Epidemiologie von Resistenzeigenschaften

Konjugation

(Multiresistenzplasmide

Enterobakterien)

Transduktion

chromosomale Fragmente

(Pseudomonas)

Transformation

chromosomale Fragmente

( Pneumokokken)

PH2004, UniHH 8

PEG Resistance surveillance 04-04


Erwerb neuer genetischer Information

Erwerb eines resistenten Allels

mecA:

dfr,sul:

neues PBP2a

neue DHFR, DHPS

Alleler Austausch von Genfragmenten

pbpX:

Mosaik-Gene in S. pneumoniae

Erwerb eines Resistenzgenclusters

für enzymatische Targetmodifikation

vanA:

D-Ala-D-Lac-Ligase

PH2004, UniHH 9

PEG Resistance surveillance 04-04


Übertragung von Genfragmenten

β-Lactamresistenz bei S. pneumoniae

S. pneumoniae

S. oralis

PBP2

Mutation

PBP2-analog

Mutation

Mutation

Transformation

resistentes

PBPX

Mosaikgen

Penicillinresistenter S. pneumoniae

PEG Resistance surveillance 04-04

PH2004, UniHH 10

Hakenbeck, 1995


Spezifische Gensequenzen für

Integron-vermittelte Resistenzgenmobilisierung

R-Gen

R-Gencassetten:

aadA, aadB,

aacA, aacC,

catB, cmlA,

dfrA, dfrB

sat

qacE

Isoliertes R-Gen wird von

Integron aufgenommen

59be

IntI

Integron-codierte Integrase

schneidet R-Gen aus

IntI

pintI

Integron

attI

pant

Integron mit R-Gen

Multiresistenz durch

R-Gen-Kombinationen

PH2004, UniHH 11

PEG Resistance surveillance 04-04


Molekulare Epidemiologie der vanR-Gene bei

Glycopeptidresistenten Enterokokken

R-Gen-

Mobilisierung

intrazellulär

natürliches vanR-

Genreservoir

1. Genaustausch

interzellulär

2. Selektion durch

Futtermittelzusatz

chromosomal

..

Kontamination

1. Genaustausch

interzellulär

2. Selektion durch

Therapie

1. Aufnahme

2. Besiedlung

PH2004, UniHH 12

PEG Resistance surveillance 04-04


Mechanismen induzierbarer Genexpression

Über Attenuation (cis-Elemente)

ermC:

erm-Genexpression durch Makrolide

Über Signaltransduktionwege (trans-Elemente)

mecR:

vanS/R:

tetR, marR:

Signal-transduzierendes PBP für PBP2a

Zwei-Komponenten Signal-Transduktion für vanA

Effektorbindung an Repressor

Über Genamplifikation (cis-Elemente)

bla, dfr:

Erhöhung der Kopienzahl des Gens oder

des Plasmids

PH2004, UniHH 13

PEG Resistance surveillance 04-04


Welche genetischen Veränderungen

sind mit welcher Technik nachzuweisen ?

Genetisches Ereignis

Nachweismethode (Beispiele)

„Neue“ DNA - PCR mit spezifischen Primern

RT-PCR (Taqman, Light-Cycler)

Denaturierende HPLC-Detektion

Massenspektrometrie

Punktmutationen in residenter DNA

Sequenzhomologie - Gewinnung von Template DNA

wenige „Hotspots“ - SNP-Nachweistechniken

breite Distribution - Multiplex-PCR, Array-Techniken

erhöhte Expression - mRNA-Quantifizierungstechniken

Array-Techniken

PH2004, UniHH 14

PEG Resistance surveillance 04-04


Molekulare Detektion von Resistenz

z.B. β-Lactamresistenz

S. aureus: Pen R Nachweis des β-Lactamasegens PCR

Oxa R Nachweis des mecA-Gens PCR

Nachweis des mecA-Expressionsstatus RT-PCR

E. coli: Amp R Nachweis des β-Lactamasegens PCR

Typisierung des β-Lactamasegens PCR, Array,

Sequencing

Nachweis des bla-Expressionsstatus RT-PCR

PH2004, UniHH 15

PEG Resistance surveillance 04-04


Vor- und Nachteile

genetischer Resistenzbestimmung

schneller Befund

kombinierte Mechanismen erfassbar

epidemiologisch verwertbare Aussage

parallele Speciesidentifizierung

unabhängig von der Kultivierbarkeit eines Erregers einsetzbar

Nachweis neuartiger Mechanismen nicht gesichert

Korrelation Phäno- Genotyp nicht vorhersagbar

geringe Datenbasis

Höhere Kosten (noch ?)

PH2004, UniHH 16

PEG Resistance surveillance 04-04


Ziele der PEG-Arbeitsgruppe

Molekulare Methoden der Resistenzbestimmug

Überblick über derzeit verfügbare genetische Methoden

welche? Einsetzbarkeit? Standardisierbarkeit?

Aufgaben zur Erreichung der Ziele

Grundlagenforschung

Methoden-(weiter)entwicklung

Datenbankerstellung für Resistenzgene und -mutationen

Definition von Anwendungsbereichen (Auswahlkriterien)

klinische, diagnostische, epidemiologische Fragestellung

Definition von „Grenzwerten“ und Interpretationen

Klinische Forschung

Konsequenz aus Nachweis,

Korrelation Genotyp-Resistenz

Erarbeitung international kompatibler Daten

PH2004, UniHH 17

PEG Resistance surveillance 04-04


Cases of therapeutic failure due to salmonella isolates

with high ciprofloxacin resistance (MIC >4µg/ml)

Patient, 39y, watery diarrhoea

S. typhimurium DT204c cip R ! co-amoxiclav ! S. tym. cip R

no prior quinolone treatment, S. Tym. eliminated ! recovery

MICcip pre > 32 µg/ml to post > 32 µg/ml (gyrase, perm. n.t.)

Lontie et al., 1994

Patient, wound sepsis, nosocomial

S. typhimurium DT204c cip R ! cefotaxim! S. tym. cip R

no prior quinolone treatment S. Tym. eliminated ! recovery

MICcip pre 32 µg/ml to post 32 µg/ml (gyrase, topoIV ?)

Heisig et al., 1995

PH2004, UniHH 18

PEG Resistance surveillance 04-04


Trends in low-level fluoroquinolone resistance of

different salmonellae from human sources in UK

[% isolates with MIC Cip >0.125µg/ml]

70

60

50

40

30

20

10

S.enteritidis

S.typhimurium

S.hadar

S.virchow

0

1991 1992 1993 1994 1996 1999

PEG Resistance surveillance 04-04

Frost et al., 1996; Threlfall et al., 2000

PH2004, UniHH 19


Cases of therapeutic failure due to salmonella isolates

with low-level fluoroquinolone resistance (MIC CIP >0.125µg/ml)

Patient, 52y, aortic aneurism surgery, wound infection

S.Typhimurium cip S ! 200mg cip bid 10 d ! S.Tym. cip IR

persistence, azthreonam iv eliminated S.Tym. ! recovery

MICcip pre 0.03 µg/ml to post 0.06 -1 µg/ml (gyrase; perm?)

Piddock et al., 1990; Gensberg et al., 1996

Patient, 61 y, chronic renal failure, diarrhoea, dehydration

S.Typhimurium PT204 cip S ! 100mg cip bid 8d ! S.Tym. cip IR

elimination at 6 d, return at 8 d ! therapy stop ! recovery

MICcip pre 0.03 µg/ml to post 2 µg/ml (OmpF";gyrase ?)

Howard et al., 1990

Patient, 62 y, diarrhoea for 9 d, intestinal perforation, surgery

S.Typhimurium DT104 cip IR ! 250mg cip bid 5d ! S.Tym. cip IR

ctx/gen 4 d, cip 5 d ! dead due to multi-organ failure

MICcip pre 0.06 µg/ml to post 0.125 µg/ml (gyrase)

PEG Resistance surveillance 04-04

PH2004, UniHH 20

Mølbak et al., 1999

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