MIKROBIOLOGISCHES PRAKTIKUM FÜR STUDIERENDE DER ...

MIKROBIOLOGISCHES PRAKTIKUM
FÜR STUDIERENDE DER
LEBENSMITTELCHEMIE
WS 2011/2012
Institut fürAngewandte Biowissenschaften
Abteilung Mikrobiologie
KIT Campus Süd

Sicherheit im Labor
• Bitte bereiten Sie sich auf jeden Kurstag durch das Lesen der betreffenden
Versuchsanleitung vor und machen Sie sich auf diese Weise mit den Prinzipien und
methodischen Ansätzen vertraut. Wenn Ihnen der Versuchsansatz vor Beginn der
Arbeiten bekannt ist, verringern Sie damit die Wahrscheinlichkeit eines Unfalls.
Darüber hinaus ermöglicht Ihnen eine solche Vorbereitung, die Zeit im Labor
effizienter zu nutzen.
• Vor Beginn des ersten Kurstages wird die Anordnung der Fluchtwege, Feuerlöscher,
Notbrausen und Augenduschen sowie das Verhalten bei einem Unfall besprochen. Im
Falle einer Verletzung ist sofort der beaufsichtigende Assistent zu informieren.
• Im Labor ist Essen, Trinken, Rauchen oder das Auftragen von Kosmetika nicht gestattet.
Beim Arbeiten nicht mit den Händen in das Gesicht oder die Haare greifen.
Nach jedem Kurs und beim Verlassen des Kursraumes sind die Hände zu waschen.
• Im Labor muß bei allen Arbeiten ein Kittel getragen werden. Dies stellt sicher, daß
kein Kulturmaterial versehentlich auf die Kleidung kommt und so das Labor verläßt,
und schützt außerdem Ihre Kleidung vor Verschmutzung durch Chemikalien und
Färbelösungen.
• Auf die Laborarbeitstische darf nur solches Material abgelegt werden, das für die Versuchsdurchführung
nötig ist. Das schließt Anleitungen, Protokollhefte und Schreibzeug
ein. Dagegen sollen Bücher und Hefte nur auf den Tischen des Seminarraums
bzw. Kleidungsstücke und Taschen in den Spinten gelagert werden.
• Wenn Lebendmaterial versehentlich verschüttet oder verschmiert wurde, muß es sofort
mit Desinfektionsmittel und Papierhandtüchern aufgenommen werden und die betroffenen
Arbeitsflächen, Gerätschaften und/oder Hautflächen desinfiziert werden.
• Alle Gefäße mit Kulturmaterial und Chemikalien müssen entsprechende Beschriftungen
erhalten; ebenso müssen alle Kulturgefäße, die über Nacht inkubiert werden
sollen, mit Namen bzw. Arbeitsgruppennummer, Inhalt, Versuchsnummer und Datum
gekenn zeichnet sein, um eine korrekte Behandlung bzw. Entsorgung zu erlauben.
• Mit dem Bunsenbrenner ist sehr sorgsam umzugehen. Bei Nichtbenutzung ist er
abzudrehen oder kurzfristig auf Sparflamme zu stellen. Keine halbe Flamme bei voller
Luftzuführ einstellen: Gefahr des Zurückschlagens der Flamme zur Brennerdüse und
Verbrennungen beim Anfassen! Nicht über die Flamme hinweg nach Dingen greifen!
Eine weitere Gefahr für Verbrennungen besteht beim Abflammen der Drigalskispatel;
die Benutzung ist genau nach der Anleitung des Assistenten vorzunehmen.
• Alle kontaminierten Gefäße und nicht mehr gebrauchtes Kulturmaterial muß korrekt
entsorgt bzw. sterilisiert werden. Dazu muß dieses Material in die dafür vorgesehenen
Behälter gelegt werden. Pipettenspitzen sind nur in die dafür vorgesehenen Abfallbehälter
abzuwerfen; benutzte Glaspipetten sind mit der Spitze nach oben in die
Pipettenbehälter mit Reinigungs-/ Sterilisationsmittel zu stellen.
• Am Ende jeden Kurstages sind die Arbeitsplätze aufzuräumen und die Arbeitsflächen
und Geräte auf Kontamination zu prüfen und gegebenenfalls zu desinfizieren.

M-1
Prinzipien des sterilen Arbeitens
- Im Labor ist Zugluft zu vermeiden, Türen und Fenster sind zu schließen.
- Die Sedimentation von Mikroorganismen aus der Luft auf oder in Medien wird verringert,
wenn am Arbeitsplatz durch die Flamme eines Bunsenbrenners stetig Heißluft aufsteigt.
- Alle sterilen Gegenstände, wie z.B. Verschlußkappen, Stopfen, Pipetten und Impfösen,
dürfen nicht auf den Tisch gelegt werden.
- Die entnommene Pipette ist in der Hand zu halten und vor dem Gebrauch kurz durch die
Gasflamme zu ziehen. Nach Benutzung wird die Pipette in Desinfektionslösung
eingestellt.
- Impfösen und Impfnadeln werden nach dem Übertragen von Mikroorganismen zunächst
im unteren, kälteren Teil der Gasflamme oder in der Sparflamme getrocknet, um ein
Verspritzen des infektiösen Materials zu verhindern. Danach wird die Öse oder Nadel in
ihrer ganzen Länge bis zur Rotglut ausgeglüht.
- Beim Ausgießen steriler Medien ist auch der Glasrand abzuflammmen.
- Desgleichen werden Verschluß und Glasrand von Reagenzröhrchen beim Öffnen und
Verschließen abgeflammt.
- Sprechen, Husten und Niesen vermeiden. Es können dadurch winzige Tröpfchen mit
Mikroorganismen übertragen werden (in besonderen Fällen, z. B. bei Erkältung, Mund- u.
Nasenschutz verwenden).
- Gefäße nur solange öffnen, wie unbedingt erforderlich ist. Dabei Gefäße möglichst schräg
halten. Auch Petrischalen nur kurz öffnen.

M-2
VERSUCH
Morphologie der Bakterienzelle
VERSUCHSZIEL
Mit speziellen Färbemethoden und Untersuchungstechniken sollen lichtmikroskopisch
sichtbare Strukturen und Einschlüsse der Bakterienzelle dargestellt werden. Die
morphologische Untersuchung erfolgt entweder an lebenden Zellen mit dem
Phasenkontrastverfahren oder bei gefärbten Mikroorganismen mit Ölimmersion im Hellfeld.
VERSUCHSAUFBAU
Geräte:
Bunsenbrenner, Impföse, Objektträger und Deckgläser, Pasteurpipetten,
Hellfeld/Phasenkontrastmikroskop
Chemikalien und Reagenzien:
Färbelösungen, Immersionsöl
Organismen:
Bacillus subtilis
Staphylococcus epidermidis
Micrococcus luteus
Escherichia coli
DURCHFÜHRUNG
Zu Beginn jedes Praktikumstages sollte das Mikroskop geköhlert werden, um eine
optimale Ausleutung und Kontrastierung der Objekte zu gewährleisten.
Kurzanleitung Köhlern
- Präparat auflegen und Lampe einschalten
- Leuchtfeldblende im Mikroskop-Fuß ganz öffnen
- Kondensor nach oben stellen
- schwaches Objektiv einstellen, Phasenkontrast rausnehmen
- bei Hellfeld-Phasenkontrast-Kondensoren Irisblende für Hellfeld einstellen
- Objekt scharf stellen
- Leuchtfeldblende schließen, bis achteckiger Ausschnitt zu sehen ist
- Kondensor geringfügig absenken, bis der Rand des Achtecks scharf abgebildet ist
- Bild mittels der Zentrierschrauben im Sehfeld mittig ausrichten
- Leuchtfeldblende soweit öffnen, bis der Rand des Achtecks gerade aus dem Sehfeld
- verschwindet
- Bildkontrast mit der Aperturblende und Bildhelligkeit mit der Lampenspannung regeln
- beim Objektwechsel, Leuchtfeldblende dem Sehfeld anpassen und Kontrast mit
Aperturblende nachregeln

M-3
Phasenkontrastverfahren
Mit diesen Verfahren werden ungefärbte transparente Objekte kontrastreich dargestellt.
- Zur Lebendbetrachtung wird mit der Öse ein Tropfen Bouillonkultur auf einen
Objektträger vorsichtig suspendiert.
- Auf den Tropfen wird ein Deckglas gelegt.
- Auf das Deckglas kommt bei Verwendung eines Ölimmersionsobjektivs ein Tropfen
Öl.
- Zur Beurteilung der Zellform und zum Nachweis von Sporen eignet sich besonders
das Phasenkontrastverfahren.
Untersuchung gefärbter Mikroorganismen
Die Färbung ist erforderlich, wenn keine Phasenkontrast- oder Interferenzkontrasteinrichtungen
vorhanden sind. Am häufigsten werden verwendet die Methylenblaufärbung,
die Gramfärbung und die Sporenfärbung. Gefärbte Präparate können ohne Deckglas direkt
mit Öl mikroskopiert werden.
Herstellung des Ausstrichpräparates
Ausstriche von Kulturen, die sich auf festen Medien befinden, werden auf Objektträgern wie
folgt durchgeführt:
- Ein Tropfen steriler physiologischer Kochsalzlösung (0,9 %) wird auf den entsprechenden
Teil des Objektträgers gesetzt.
- Mit der abgeflammten und abgekühlten Öse oder Nadel wird ein sehr geringer Teil der
Kolonie entnommen.
- Die Kultur wird mit der Flüssigkeit vorsichtig unter kreisenden Bewegungen verrieben.
Der Ausstrich soll sehr dünn sein (getrocknete Ausstriche dürfen nicht grau aussehen).
- Die Öse oder Nadel wird abgeflammt.
- Der Objektträger ist an der Luft zu trocknen und in der Hitze zu fixieren, indem er dreimal
mit dem Ausstrich nach oben durch den heißen Teil der Flamme des Bunsenbrenners
gezogen wird.
Übersichtsfärbung mit Methylenblau
Dieses Verfahren wird dann eingesetzt, wenn nachgewiesen werden soll, ob überhaupt
Mikroorganismen vorhanden sind.
- Die auf dem Objektträger fixierten Mikroorganismen werden mit Löffler's
Methylenblaulösung überdeckt.
- Nach einer Einwirkungszeit von 3 min wird die Farblösung mit Leitungswasser abgespült.
- Der Objektträger wird vorsichtig mit Filterpapier getrocknet.
Gramfärbung
Die Gramfärbung ergibt nur mit jungen Zellen (logarithmische Vermehrungsphase) bei
genauer Einhaltung der Färbevorschriften reproduzierbare Ergebnisse. So muß z.B. der
Ausstrich völlig lufttrocken sein, da sonst die noch feuchten Bakterien bei der Hitzefixierung
quellen, wodurch chemische Veränderungen eintreten; grampositive Zellen werden
gramnegativ. Auch bei der Alterung der Zellen kann sich das Färbeverhalten ändern. Alte

M-4
grampositive Zellen können gramnegativ werden. Für die Gramfärbung sollten 24 h alte
Kulturen verwendet werden.
- Ausstrich lufttrocknen, hitzefixieren
- Ausstrich mit Kristallviolettlösung bedecken.
- Nach 1 min abkippen und Objektträger vorsichtig mit Leitungswasser abspülen (Wasser
nur auftropfen lassen), Wasser abkippen.
- Objektträger mit Lugolscher Lösung bedecken, 1 min einwirken lassen, abkippen und
abtropfen lassen.
- Objektträger mit Aceton/Ethanol (1:3) abspülen bis Farbwolken verschwinden
- Objektträger gut mit Wasser abspülen.
- Gegenfärbung mit Safranin 30 s.
- Abspülen mit Leitungswasser und Trocknen des Objektträgers mit Fließpapier.
- Restwasser über der Sparflamme des Bunsenbrenners verdunsten lassen.
Ergebnis
Grampositive Bakterien = blauviolett
Gramnegative Bakterien = rot
Sporenfärbung nach SHAEFFER-FULTON
Bakterien der Genera Bacillus, Alicyclobacillus, Clostridium, Desulfotomaculum,
Sporolactobacillus und Sporosarcina bilden Sporen, die bei der Methylenblau und
Gramfärbung nur als helle ovale oder runde Zellen zu erkennen sind. Bei der Sporenfärbung
sind die Sporen grün und die vegetativen Zellenrot.
- Einen Tropfen einer Bacillus cereus - Flüssigkultur auf einem mit Alkohol entfetteten
Objektträger ausstreichen;
- lufttrocknen und hitzefixieren;
- ein ca 2x2 cm großes Filterpapierplättchen auf die Präparation legen und mit einigen
Tropfen Malachitgrün (0.5%) gut sättigen;
- 1 min bei Zimmertemperatur einwirken lassen;
- in der Zwischenzeit ca 25 ml A.dest.(evtl. mit einem Siedesteinchen) in einem 100 ml
Weithals-Erlenmeierkolben auf einem Dreifuß über dem Bunsenbrenner zum Kochen
bringen;
- den Objektträger über die Öffnung des Kolbens legen und über strömendem Wasserdampf
5 min erhitzen; die Färbelösung darf dabei nicht eintrocknen (die verdunstete Menge
durch Nachtropfen ergänzen);
- abkühlen lassen und das Filterpapierplättchen durch Anheben vorsichtig entfernen;
- mit destilliertem Wasser abspülen wie unter beschrieben bis keine Farbwolken mehr im
Spülwasser sichtbar sind;
- mit Safranin für 30 sec gegenfärben;
- mit A.dest. abspülen und überschüssige Flüssigkeit vom Rand her absaugen; lufttrocknen;
- Ergebnis: untersuchen im Hellfeld: Endosporen erscheinen grün, vegetative Zellen
braunrot
AUSWERTUNG
Versuchsprotokoll mit den Färbeergebnissen

M-5
VERSUCH
Züchtung von Mikroorganismen
VERSUCHSZIEL
Es sollen spezielle Methoden erlernt werden, um Mikroorganismen zu kultivieren, sowie
Steriltechniken, um eine reine Population des betreffenden Organismus zu erhalten.
VERSUCHSAUFBAU
Geräte:
Brutschrank, Kulturgefäße, Impföse, Bunsenbrenner, Anaerobiertopf, Gasentwickler,
Teelicht
Chemikalien und Reagenzien:
LB-Agar, LB-Boullion, LB-Schrägarar, LB-Stichagar,
Organismen:
Serratia marcescens
DURCHFÜHRUNG
Aseptische Beimpfung der Medien
- Das Übertragen der Kultur geschieht in der Regel mit einer Impföse oder einer Impfnadel.
- Vor jeder Benutzung werden Öse oder Nadel vertikal im heißen Teil der
Bunsenbrennerflamme ausgeglüht.
- Nach einigen Sekunden der Abkühlung kann die Öse oder Nadel verwendet werden. Die
Reagenzglaskappen werden vor und nach der Beimpfung abgeflammt, wie auch das obere
Reagenzglasende.
- Die Reagenzglaskappen nicht auf den Arbeitstisch legen.
- Die Beimpfung hat grundsätzlich dicht an der Bunsenbrennerflamme zu erfolgen.
Plattenkultur
- Deckel nur soweit anheben wie es erforderlich ist, um mit der Öse ausstreichen zu
können; nach dem Ausstreichen sofort wieder auflegen;
- beim Ausstreichen die Impföse wie folgt über den Agar führen (Drei-Ösenausstrich):
oder

M-6
- Bei der Bebrütung von Petrischalen muß der Deckel unten liegen, damit kein
Kondenswasser auf die Kultur tropft
Bouillonkultur
- 2 x 5 mL Medium durch Eintauchen mit der Impföse beimpfen
Agarschrägkultur
- Die Schrägfläche wird entweder mit der Öse beimpft oder mit der Nadel
- Es erfolgt zunächst eine Beimpfung des unteren Nährbodenteils im Stich und dann eine
Beimpfung der Schrägfläche.
Stichkultur
- Beimpfung eines festen oder halbfesten Mediums im Reagenzglas durch Einstechen mit
der Impfnadel.
Schüttelkultur
- Beimpfung eines flüssigen Mediums (3 ml LB-Medium im Erlenmeyerkolben) mit ca. 20
µl der Übernachtkultur
Kultur unter anaeroben Bedingungen (Demonstration)
- LB-Agarplatte im Drei-Ösenausstrich beimpfen und in einen Anaerobentopf platzieren
- Neben die Platten wird ein Gasentwickler gestellt. Nach Zugabe einer definierten Menge
Wasser (10 ml) und luftdichtem Verschließen des Topfes entwickelt sich ein anaerobes
Milieu (Eh-Wert unter –100 mV).
Kultur unter mikroaerophilen Bedingungen (Demonstration)
- LB-Agarplatte im Drei-Ösenausstrich beimpfen und in einen Anaerobentopf platzieren
- Auf die Platten wird ein brennendes Teelicht gestellt und der Topf luftdicht verschlossen.
Durch die Reduktion des Sauerstoffgehalts und die Erhöhung der CO 2 -Konzentration
durch die Flamme bildet sich ein mikroaerophiles Milieu.
Inkubation der Kulturen:
- Eine der Bouillonkultur bei 30°C, 240 rpm im Orbitalschüttler die andere stehend im
Brutschrank inkubieren
- Die Petrischalen, Agarschräg- und Stichkultur bei 30°C im Brutschrank.

M-7
VERSUCH
Methoden der Keimzahlbestimmung
VERSUCHSZIEL
Die mikrobiologische Diagnostik dient dem Ziel, Keime zu isolieren und zu identifizieren. In
der Lebensmittelhygiene spielt aber nicht nur die Klassifizierung, sondern auch die
Quantifizierung der Mikroorganismen eine entscheidende Rolle. Es sollen daher Methoden
erlernt werden, die zur Bestimmung der Keimzahl im Untersuchungsgut dienen.
VERSUCHSAUFBAU
Geräte:
Bunsenbrenner, Impföse, Drigalskispatel, THOMA-Zählkammer, Hellfeld/Phasen
kontrastmikroskop, Membranfilter, Saugflasche, Wasserstrahlpumpe, Metalltrichter
Chemikalien und Reagenzien:
LB-Platten, LB-Boullion für MPN-Bestimmung, 36%-ige Formaldehydlösung
Organismen:
Escherichia coli
DURCHFÜHRUNG
- Zur Bestimmung der Keimzahl einer E. coli Übernachtkultur eine Verdünnungsreihe bis
10 –10 in steriler 0,9 %-iger NaCl-Lösung herstellen.
- Zur Keimzahlbestimmung werden die Verdünnungsstufen 10 –7 -10 –10 eingesetzt.
- Die beimpften Medien werden 24 h bei 37°C inkubiert.
Oberflächenplattierung
Für eine Lebendkeimzahlbestimmung wird die Bakteriensuspension auf einer Agarplatte
gleichmäßig ausgespatelt, Bei nachfolgender Bebrütung sollte die Dichte zwischen 10 und
100 einzeln liegenden Kolonien betragen.
1.Tag
- Von den Verdünnungen 10 –7 -10 –9 , beginnend mit der höchsten, werden 0,1 ml auf der
Oberfläche eines festen Nährbodens ausgespatelt:
- Mit einem sterilen Drigalski-Spatel wird die Menge gleichmäßig unter kreisenden
Bewegungen verteilt. Für jede Platte ist ein steriler Spatel zu verwenden.
2. Tag
- Auswertung der Oberflächenplattierung
- Die Anzahl der Mikroorganismen wird pro ml angegeben:
N = ∑c x d x 1000: V
N
∑c
d
V
Anzahl der Kolonien pro ml
Summe der ausgezählten Kolonien
Faktor der Verdünnungsstufe
Auftragsvolumen [µl]

M-8
Gußkultur
1. Tag
- Die Verdünnungen 10 –7 -10 –9 werden mit einem geschmolzenen Nährboden (ca. 47 °C)
vermischt:
- Mit einer sterilen Pipette werden in je eine Petrischalen jeweils 0,1 ml Probe der
entsprechenden Verdünnung pipettiert. Mit der höchsten Verdünnung ist zu beginnen, so
daß mit einer Pipette gearbeitet werden kann.
- Anschließend werden ca. 20 ml des geschmolzenen und im Wasserbad auf etwa 45 °C
abgekühlten Nährbodens in die Petrischale gegossen und mit der Probe bzw. den
Verdünnungen gleichmäßig vermischt.
- Eine gleichmäßige Durchmischung kann durch kreisende, 8-förmige Bewegungen erzielt
werden.
- Anschließend die Perischalen ruhen lassen, bis der Agar ausgehärtet ist
2. Tag
- Auswertung der Keimzahlbestimmung mittels Gußkultur siehe Oberflächenplattierung
Tropfplattenverfahren (Miles Misra)
1. Tag
- Von den Verdünnungen 10 –7 -10 –9 werden je 0,05 ml auf die an der Unterseite der
Petrischalen markierten Sektoren aufgetropft.
- Der Tropfen sollte mit der Pipettenspitze kreisförmig in einem Durchmesser von ca. 18–
20 mm ausgezogen werden.
- Die Platten bleiben nach der Beimpfung so lange stehen, bis die verteilte Impfmenge
angetrocknet ist.
2. Tag
- Auswertung der Keimzahlbestimmung mittels Tropfplattenverfahren siehe Oberflächenplattierung
Membranfiltration (Demonstration)
Eine flüssige Probe passiert eine Membran mit bekannten physikalischen Eigenschaften
(Zusammensetzung, Porengröße). Die Mikroorganismen, deren Durchmesser größer ist als
der Durchmesser der Poren, werden zurückgehalten und auf einem Medium nach Bebrütung
als Kolonien nachgewiesen.
1. Tag
Sterilisation des Filtrationsgerätes
- Es wird ein Filtrationsgerät aus Stahl verwendet.
- Das Unterteil des Gerätes wird mit Hilfe eines Stopfens auf die Saugflasche gesetzt.
- Diese wird durch einen Vakuumschlauch mit einer Wasserstrahlpumpe verbunden und die
Pumpe in Betrieb gesetzt.
- Mit dem Bunsenbrenner werden Filtriertisch und Metallfritte (vorher mit Spiritus
abreiben) so abgeflammt, daß die Flamme auch in die Fritte gesaugt wird.
- Den Aufsatz mit der Hand anfassen das Unterteil abflammen und auf den Filtriertisch
setzten
- Der Aufsatz wird mit einem Hebelverschluß am Unterteil befestigt.
- Den Aufsatz mit Spiritus auswischen und ausflammen.

M-9
- Durch Eingießen von sterilem destilliertem Wasser kann das Gerät gegebenenfalls
ausgekühlt werden.
Filtration
- Um eine Verunreinigung mit Luftkeimen zu verhindern, ist in einem Raum ohne Luftzug
neben einer brennenden Bunsenbrennerflamme zu arbeiten.
- Mit einer sterilen Pinzette wird ein steriler Membranfilter nach Abnehmen des Aufsatzes
auf den Filtertisch des Geräteunterteils gelegt und der Aufsatz wieder aufgesetzt.
- Eine undefinierte Menge an sterilem Wasser in den Trichter gießen und 1 ml der
Verdünnung 10 -9 dazu pipettieren
- Die Flüssigkeit absaugen, den Aufsatz entfernen und den Filter mit einer sterilen Pinzette
abnehmen.
- Den Filter mit der unsterilen Seite nach oben, luftblasenfrei in das Zentrum einer
Agarplatte legen
- Die Koloniezahl sollte zwischen 30 und 200 pro 12,5 cm 2 wirksamer Filtrationsflächen
liegen. Die maximale Belegungsdichte sollte 200 Kolonien nicht überschreiten. Bei
höherer Keimzahl muß man die Probe verdünnen.
2. Tag
- Auswertung der Keimzahlbestimmung mittels Membranfiltertechnik siehe Oberflächenplattierung
Wahrscheinlichste Keimzahl, MPN-Verfahren
Mittels des MPN-Verfahren (MPN = Most Probable Number) wird auf statistischem Wege
die „wahrscheinlichste Keimzahl“ bestimmt. Dabei werden von jeder Verdünnung mehrere
Röhrchen parallel nebeneinander beschickt. Mit steigender Zahl der Parallelen nimmt die
Genauigkeit zu. Entscheidend ist immer, daß genügend weit verdünnt worden ist und
eindeutig negative Ergebnisse vorliegen. Nach der Bebrütung werden alle Röhrchen
ausgewertet. Aus der Anzahl der positiven Röhrchen ergibt sich die Stichzahl (significant
number).
1. Tag
- MPN-Röhrchen (4,5 ml LB) werden mit 0,5 ml Probe beimpft
- Es werden pro Verdünnung 3 Parallelröhrchen angesetzt
- Für die MPN-Bestimmung werden die Verdünnungen 10 -7 – 10 -10 verwendet
2.Tag
Auswertung:
- Keimzahlangabe in MPN/ml:
- Ermittlung der Stichzahl: Anzahl der bewachsenen Röhrchen, in der Reihenfolge
fortschreitender Verdünnung geschrieben
- MPN-Index der Stichzahl aus der jeweiligen MPN-Tabelle ablesen
- Muliplikation des MPN-Index mit dem Verdünnungsfaktor
Gesamtkeimzahlbestimmung mit der Zählkammermethode:
Die Bestimmung der Gesamtkeimzahl erfolgt durch direktes Auszählen der Bakterienzellen in
einer mit 5% Formol konservierten Probe. Eine Suspension mit wird in einer Zählkammer
unter dem Mikroskop bei 400-facher Vergrößerung mit Phasenkontrast ausgezählt. Die
Zählkammer nach THOMA ist ein Glasobjektträger mit einem in einer eingeschliffenen

M-10
Vertiefung markierten Liniennetz. Das Netz enthält 400 Kleinquadrate mit je 50 µm
Kantenlänge und mit einer darüberliegenden Wassersäule von 100 µm, wenn die Kammer
nach oben durch ein aufgelegtes Deckglas begrenzt wird. Zur besseren Orientierung sind
jeweils 16 Kleinquadrate durch vergrößerte Abstände zu einem Großquadrat zusammengefaßt.
Das Volumen über einem Großquadrat ist demnach 0.004 µl. Um eine ausreichende
Genauigkeit zu erhalten, sollten mindestens zwei Proben ausgezählt und diese soweit
verdünnt werden, daß die Bakterien nicht dichter als 100 pro Großquadrat liegen. Pro Probe
sollten nicht weniger als 200 Bakterienzellen und nicht weniger als 4 Großquadrate gezählt
werden. Aus den Ergebnissen wird ein Mittelwert als Gesamtkeimzahl pro ml berechnet.
- Pro 0,5 ml Probe der 10 -2 Verdünnung wird 50 µl 36%-ige Formaldehydlösung zugesetzt
und sorgfältig gemischt,
- mit einer Pasteurpipette die THOMA-Zählkammer (mit aufgelegtem Deckglas) vom Rand
her soweit füllen, daß der Steg mit dem Strichnetz einen geschlossenen Flüssigkeitsfilm
zeigt;
- Zählkammer für 3 min ruhig liegen lassen; dann unter dem Phasenkontrastmikroskop mit
dem 40x Objektiv vier Großquadrate auszählen;
Auswertung:
Gesamtkeimzahl pro ml Bakteriensuspension berechnen:
N = ∑c x 10 6 x d
4
N Anzahl der Kolonien pro ml
∑c Summe der ausgezählten Bakterien pro Großquadrat
d Faktor der Verdünnungsstufe
AUSWERTUNG
Berechnung der Keimzahl der E. coli Übernachtkultur mittels der durchgeführten Methoden.
Vergleich der Methoden untereinander bezüglich der Messgenauigkeit.

M-11
VERSUCH
Nachweis von Mikroorganismen durch Kultivierung:
Identifizierung von Enterobacteriaceae
VERSUCHSZIEL
Enterobacteriaceen sollen isoliert und identifiziert werden. Die Identifizierung erfolgt anhand
morphologischer und biochemischer Merkmale. Die Gruppe der Enterobacteriaceen ist
charakterisiert durch Vergärung von Glucose, den Besitz von Katalase und das Gestaltmerkmal
gramnegativer Stäbchen. Die einzelnen Gattungen der Enterobacteriaceen unterscheiden
sich unter anderem auf Grund der Lactoseverwertung, Beweglichkeit, Wasserstoff-, Indolund
Acetoinbildung, H2S-Bildung und Harnstoffverwertung
VERSUCHSAUFBAU
Geräte:
37°C-Brutschrank, Impföse, Bunsenbrenner
Chemikalien und Reagenzien:
McC, Glucose-Boullion, MRVP, SIM, SIMMONS-Citrat, Harnstoffagar, Ehrlich’s
Reagenz, Methylrot, 40% KOH, α-Naphtol
Organismen:
Enterobacter cloacae
Escherichia coli
Proteus mirabilis
(E1-E3)
DURCHFÜHRUNG
1. Tag:
- Bakterienmaterial von der Stammplatte abnehmen (möglichst eine gut isolierte Kolonie )
und in 500 ul 0,9 %ige NaCl-Lösung einrühren (Stammlösung von E1, E2 und E3 ) und
damit folgende Medien beimpfen:
o Jeweils 1 LB- und 1 McC-Platte in 3 Sektoren teilen. 50 ul als Tropfen auftragen,
einziehen lassen, dann mit der Impföse das Probenmaterial (E1, E2, E3) auf einem
Sektor ausstreichen (2-Ösen-Ausstrich);
o 50 ul µl in ein Glucose-Bouillonröhrchen mit Gährrörchen (nicht vortexen!)
o 50 µl in 2 MRVP-Bouillon röhrchen,
o als Stichkultur in halbfestes SIM-Medium,
o auf SIMMONS-Citrat-Schrägagar,
o auf Harnstoff-Schrägagar
- 24 h bei 37°C inkubieren;
2. Tag:
Auswerten der Differenzierungsmedien:
- Glucose-Bouillonröhrchen auf Gasentwicklung prüfen;
- SIMMONS-Citrat-Agar auf Blaufärbung prüfen;

M-12
- SIM-Medium auf H2S-Bildung und Beweglichkeit prüfen; durch Zugabe von einigen
Tropfen EHRLICH-Reagenz auf Indolproduktion prüfen;
- Harnstoff-Agar auf Rotfärbung prüfen;
- ein MRVP-Bouillonröhrchen durch Zugabe von 5 Tropfen Methylrot auf
Säurebildung testen;
- das zweite MRVP-Röhrchen durch Zugabe von 0.5 ml 40% KOH und 1.0 ml α-Naphtol
auf Acetoinbildung testen;
- Gramfärbung durchführen.
- Identifizierung der Isolate anhand des Vergleichs der tabellarisch aufgelisteten
biochemischer Merkmale folgender Enterobacteriaceae:
Gas Bewegl. Glucose Laktose Indol Voges-P. Urease Gelatine H 2 S Citrat
Escherichia + + + + + - - - - -
Enterobacter + + + + - + (+) - - +
Salmonella + + + - - - - + + -
Klebsiella + - + + +/- +/- - +/- - +
Citrobakter + + + +/- - - - - +/- +
Proteus + + + - +/- - + + +/- +/-
Serratia + + + - - +/- + + - +
AUSWERTUNG
- Versuchsprotokoll mit den Ergebnissen der biochemischen Differenzierung.
- Unter Berücksichtigung der wenigen, simplifizierenden Differenzierungsmethoden
Zuordnung eines Gattungsnamen.

M-13
VERSUCH
Nachweis von Mikroorganismen durch Kultivierung:
Differenzierung von Pseudomonaden und Aeromonaden
VERSUCHSZIEL
Pseudomonaden und Aeromonaden sollen isoliert und identifiziert werden. Die
Identifizierung erfolgt anhand biochemischer Merkmale.
Pseudomonaden/Aeromonaden sind Gramnegative, stäbchenförmige Bakterien, welche
Oxidase und Katalase besitzen. Sie unterscheiden sich durch die Fähigkeit, Stärke zu
hydrolysieren und lassen sich auf dem GSP-Agar (Pseudomonaden-Aeromonaden-Selektiv-
Agar nach Kielwein) unterscheiden.
GSP-Agar: Pseudomonas hydrolysiert keine Stärke. Der Agar um die Kolonie wird durch
Ammoniakbildung des Mediums rotviolett. Aeromonas hydrolysiert Stärke und vergärt die
entstehende Glucose. Der Agar um die Kolonie wird durch Säurebildung daher gelb.
Ein weiterer Test zur Differenzierung ist der OF-Test. Aeromonas vergärt Glucose zu Säure
fermentativ, Pseudomonas oxidativ.
VERSUCHSAUFBAU
Geräte:
30°C-Brutschrank, Impföse, Bunsenbrenner, UV-Leuchttisch
Chemikalien und Reagenzien:
Nährmedienbestandteile, Kulturmedien, Cytochrom-c-oxidase Reagenz, 3 % H 2 O 2 ,
GSP, OF, LB, F-Agar
Organismen:
Aeromonas hydrophila
Pseudomonas stutzeri oder Ps.putida
Pseudomonas fluorescens
(P1 bis P3)
DURCHFÜHRUNG
1.Tag:
- Jeweils 1 LB-, 1 GSP-, 1 F-Agarplatte in 3 Sektoren teilen, jeweils ein Bakterium (P1, P2,
P3) pro Sektor mit der Impföse im 2-Ösenausstrich ausstreichen
- OF-Agar per Stich beimpfen
- über Nacht bei 30°C inkubieren;
- 24 h bei 30°C inkubieren;
2.Tag:
- Medien auswerten;

M-14
- auf jeweils der Hälfte der LB Platte auf Oxidase bzw. Katalase testen. Dazu die
entsprechenden Reagenzien (Cytochrom-c-oxidase Reagenz bzw. 3% H 2 O 2 -Lösung)
auftropfen.
- OF-Röhrchen auf Säurebildung aus Glucose (Gelbfärbung) prüfen.
- F-Agar auf fluoresziierende Pigmente prüfen (UV-Licht).
AUSWERTUNG
- Versuchsprotokoll mit den Ergebnissen der biochemischen Differenzierung.
- Unter Berücksichtigung der wenigen, simplifizierenden Differenzierungsmethoden
Zuordnung eines Gattungsnamen.

M-15
VERSUCH
Nachweis von Mikroorganismen durch Kultivierung:
Identifizierung von Staphylokokken und Mikrokokken
VERSUCHSZIEL
Staphylokokken und Mikrokokken sollen isoliert und identifiziert werden. Die Identifizierung
erfolgt anhand morphologischer, biochemischer und physiologischer Merkmale. Beide
Gattungen sind grampositive, Katalase positive Kokken, lassen sich aber anhand ihrer
Toleranz gegenüber Furazolidon (FTO-Agar), Lysostaphin (L-Agar) und Sauerstoff
(Thioglykolat-Medium) gut unterscheiden. Im mikroskopischen Bild ist die Zellanordnung
bei Staphlokokken traubenförmig, bei Mikrokokken paketförmig.
S.aureus unterscheidet sich von S .epidermidis auf Grund der Koagulase, DN-ase, Bildung
von Säure aus Mannit (VJ-Agar) und der positiven Eigelbreaktion/Proteolyse auf Baird
Parker (BP-Agar)
VERSUCHSAUFBAU
Geräte:
37°C-Brutschrank, Impföse, Bunsenbrenner
Chemikalien und Reagenzien:
FTO-Agar, OF, BP-Agar, VJ-Agar
Organismen:
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Micrococcus luteus
(K1 bis K3)
DURCHFÜHRUNG
1. Tag:
- BP-, VJ-, FTO- und LB-Platte dritteln und jeweils einen Vertreter der Kokken (K1,
K2, K3) auf einem Sektor ausstreichen..
- Jeweils 1 OF Röhrchen mit ca.30 ul einer Flüssigkultur von K1, K2 oder K3
beimpfen
,
2. Tag:
Auswertung der Differenzierungsmedien
BP-Platte auf Schwarzfärbung, positive Eigelbreaktion und Proteolyse testen
VJ –Agar auf Mannitverwertung und Schwarzfärbung testen
FTO-agar auf Wachstum testen
OF-Röhrchen auf Wachstum und Gelbfärbung testen
Vergleich mit LB-Platte

M-16
VERSUCH
Nachweis von Mikroorganismen durch Kultivierung:
Identifizierung von Bacillen
VERSUCHSZIEL
Bacillen sollen aus Erde isoliert und identifiziert werden. Die Identifizierung erfolgt
anhand morphologischer und biochemischer Merkmale.
Bacillen und Clostridien sind grampositive Endosporen bildende Stäbchen. Bacillen
wachsen aerob bzw. fakultativ anaerob, Clostridien dagegen strikt anaerob.
Die in Lebensmitteln wichtigsten Sporenbildner sind Bacillus cereus, Bacillus
staerothermophilus (thermophil) und Bacillus coagulans (fakultativ thermophil).
B.staerothermophilus und B.coagulans verursachen bei Konserven den „flat sour“
Verderb. Man weist sie aufgrund der starken Säurebildung auf Dextrose-Trypton-Agar
(DTA) bei 55-60°C nach.
Der Nachweis von B. cereus (Verursacher von Lebensmittelvergiftungen) erfolgt auf
dem Cereus-Agar nach Mossel (CER). Kolonien von B. cereus bilden aus Mannit keine
Säure ( Nährboden um Kolonie nicht gelb) und zeigen positive Eigelbreaktion (großer
Trübungshof um Kolonie).
Bacillen sind auch als Exoenzym-Produzenten bekannt.Proteasen werden den
Waschmitteln zugesetzt. Amylasen finden u.a. in der Lebensmittelindustrie
Verwendung. Exoenzyme lassen sich auf geeigneten Agarplatten (mit Stärke bzw.
Milchprotein) durch Verschwinden des Substrats leicht nachweisen.
Clostridien sind strikt anaerob und die meisten reduzieren Sulfit zu Sulfid. Der
Nachweis erfolgt in „Differential Reinforced Clostridial Medium (DRCM)“ (wird nicht
durchgeführt!).
VERSUCHSAUFBAU
Geräte:
30°C- Brutschrank, 80°C-Wasserbad, Impföse, Bunsenbrenner, Thermometer,
Anerobiertopf, Gasentwickler
Chemikalien und Reagenzien:
Kulturmedien (CER-Platten, LB-Platten), Erdprobe
Stärke-bzw. Milchagarplatten (Nachweis von Exoenzymen)
Organismen:
B.cereus
B.subtilis
(B1 bis B2)
DURCHFÜHRUNG
1. Tag:
Aerobe Sporenbildner:
Eine CER-Platte, eine LB-Platte, eine Stärke-und eine Milchagarplatte in zwei
Hälften einteilen.

M-17
Das Probenmaterial (wenig!) (B1,B2) auf jeweils einer Hälfte der Platten
strichförmig ausstreichen und bei 37 °C inkubieren
2. Tag:
- CER-Platte auf rote Kolonien mit positiver Eigelbreaktion prüfen.
- LB-Platten auf Wachstum prüfen.
- Milchagarplatten auf „Fresshöfe“ (heller Bereich um Ausstrich) testen
- Stärkeagarplatten auf Hydrolyse von Stärke testen (nach Zugabe von Lugolscher
Lösung),
- Von beiden Hälften Bakterienmaterial abnehmen und im Phasenkontrast auf Sporen
testen und Grampräparat anfertigen
.
AUSWERTUNG
- Versuchsprotokoll mit den Ergebnissen der biochemischen und morphologischen
Differenzierung.
- Identifizierung der Isolate soweit wie möglich anhand der morphologischen und
biochemischen Differenzierungsmerkmale
- Konnten Exoenzyme nachgewiesen werden?.

M-18
VERSUCH
Nachweis von Mikroorganismen durch Kultivierung:
Identifizierung von Milchsäurebakterien im Joghurt oder
Sauerkraut
VERSUCHSZIEL
Milchsäurebakterien sind unbewegliche Katalase negative grampositive Kokken bzw.
Stäbchen. Sie wachsen anaerob (mikroaerophil), können aber Sauerstoff tolerieren.
Aufgrund der Endprodukte der Glucosevergärung lassen sich homo-und
heterofermentative Milchsäurebakterien unterscheiden. Sie werden am besten im
Anaerobiertopf auf MRS-Agar gezüchtet.
Enterokokken kann man von den Laktokokken durch das Wachstum bei 45 °C
differenzieren.
Vertreter der Streptokokken, Laktokokken und Laktobazillen werden den
verschiedensten Nahrungsmitteln als Starterkulturen zugesetzt.
VERSUCHSAUFBAU
Geräte:
30°C-Brutschrank, Impföse, Bunsenbrenner, Anaerobiertopf, Gasentwickler
Chemikalien und Reagenzien:
Joghurt und/oder Sauerkraut, MRS-Agar, MRS-Medium (Durhamröhrchen), LB-Agar
DURCHFÜHRUNG
1. Tag:
- Joghurt bzw. Sauerkraut Probe etc. per Dreiösenausstrich auf den LB- und MRS-
Platten ausstreichen und im Anaerobiertopf mit Kerze bei 30 °C mikroaerophil
inkubieren
-
2. Tag:
Platten auf Einzelkolonien testen, eine beliebige Kolonie isolieren, diese auf MRSund
LB-Platte ausstreichen und ein MRS-Röhrchen (mit Durham) beimpfen
3. Tag:
- Grampräparat von der LB-Platte anfertigen, Katalasetest durchführen
- MRS-Röhrchen auswerten. (Homo/Heterofermentative Glucosevergärung)
AUSWERTUNG
- Versuchsprotokoll mit den Ergebnissen der morphologischen und biochemischen
Differenzierung.

M-19
-
Psychrotrophe Bakterien
Psychrotrophe Bakterien, Vertreter von Pseudomonas, Psychrobacter; Acinetobacter,
Brochothrix, Carnobacterium etc., spielen beim Lebensmittelverderb im Kühlschrank
eine große Rolle. Man kann sie auf LB-Agar züchten (1Woche bei 4°C).
Zwei wichtige Vertreter Brochothrix thermosphacta und Carnobacterium werden
besprochen.
Brochothrix thermosphacta spielt für den Verderb von Kühlfleisch, auch
vakuumverpackt, durch die Bildung von Milch- u. Essigsäure, flüchtiger Fettsäuren und
Acetoin eine große Rolle. Es ist ein grampositives Stäbchen, eng verwandt mit Listerien
und Laktobacillen, fakultativ anaerob, Katalase positiv (im Unterschied zu
Laktobacillus), der Glucoseabbau erfolgt fermentativ ohne Gasbildung.
Das Carnobacterium ist ein Grampositives Milchsäurebakterium (Stäbchen), das zum
Verderb von Frischfleisch und –fisch (auch vakuumverpackt) führt.

M-20
VERSUCH
Antibakterielle Substanzen
VERSUCHSZIEL
Einführung in die Filterplättchenmethode zur Bestimmung der bakteriostatischen
Wirksamkeit von Konservierungsstoffen, Antiseptika, Desinfektionsmittel und Antibiotika.
Im Röhrchentest wird über die ausbleibende Trübung einer beimpften Nährlösung die
bakteriostatische Wirkung dieser Hemmstoffe nachgewiesen. Demonstration des
wachstumshemmenden Effekts von Lebensmittelzusatzstoffen (bzw. Antiseptika,
Desinfektionsmittel) auf verschiedene Mikroorganismen.
VERSUCHSAUFBAU
Geräte:
LB-Agar, sterile Filterplättchen, Drigalskispatel, Pinzette, Bunsenbrenner
LB-Röhrchen (3 ml),
Reagenzien
Konservierungsmittel: (Sacch. Cerevisiae?)
Borax [240 mg/ml]
Na-benzoat [50 mg/ml]
Natriumsulfit [150 mg/ml]
Natriumnitrit [200 mg/ml]
Essigsäure[30 %]
Na-propionat [300 mg/ml]
Antibiotika: (E.coli/B.subtilis)
Streptomycin
Kanamycin
Ampicillin
Penicillin
Antiseptika und Desinfektionsmittel: (E.coli/B.subtilis)
Alkylbenzyldimethylammoniumchlorid (10%)
Ethanol (70 %)
Sterilisationsmittel
Antibakterielle Substanzen
(E.coli/B.subtilis)
Mitgebrachte Proben
Lysozym (10 mg/ml)
Furazolidon ( 0,02 %) (siehe FTO-Agar)

M-21
Teststämme:
Bacillus subtilis
Escherichia coli
Saccharomyces cerevisiae
- jeweils eine Übernachtkultur, verdünnt mit frischem LB bis zur leichten Trübung
- bzw.1 Bakterienkolonie in 3 ml LB oder 0,9% NaCl suspendieren bis leicht trübe
Suspensiion entsteht
DURCHFÜHRUNG
1. Wirksamkeit bakteriostatischer Stoffe (Filterblättchenmethode)
- Mit einem Filzschreiber wird der Boden einer Nähragarplatte in vier Teile geteilt; jedes
Viertel wird mit dem Namen oder der Codezahl eines zu testenden Konservierungsmittel
bezeichnet;
- Die Oberfläche der Platte wird mit einem sterilen Wattestäbchen gleichmäßig mit jeweils
einer Bakteriensuspension von B. subtilis, E.coli oder Saccharomyces cerevisiae (OD 660

M-22
Agens
1
2
3
4
5
6
7
Hemmhofdurchmesser
E.coli B.subtilis
2. Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK)
- Die zu testende antibakterielle Substanz (z.B. Alkylbenzyldimethylammoniumchlorid) in
sterilem dest. Wasser verdünnen z.B. 1:20, 1:50, 1:100, 1:200, 1:300, 1:400, 1:500,
1:1000 verdünnen (Volumen jeweils 1 ml);
- Nähragarplatten wie unter Punkt 1 beschrieben mit der dünnen B. subtilis- -Suspension
bespateln;
- die in den seriellenVerdünnungen getränkten Filterplättchen auflegen;
- bei 30°C für 24-48 h inkubieren.
AUSWERTUNG
• Tabellieren der Ergebnisse der Hemmhofbestimmungen und Trübung.
• Vergleich der Methoden untereinander
• Welches Agens ergab den größten Hemmhof?
• War ein Stamm empfindlicher als der andere gegen die unterschiedlichen Agenzien?
• Tabellieren der Ergebnisse der Hemmhofbestimmungen und Berechnung der MHK.

M-23
THEMENKREIS Wachstum und Vermehrung
VERSUCH
METHODIK
Aufnahme einer Wachstumskurve von Escherichia coli
Sterilanzucht; Trübungsmessung mit dem Spektralphotometer; mikroskopische
Bestimmung der Gesamtkeimzahl mittels Zählkammer; Bestimmung
der Lebendkeimzahl durch die Plattierungsmethode
VERSUCHSZIEL Der zeitliche Verlauf des Bakterienwachstums in einer "Batch"-Kultur
von E. coli soll durch die Aufnahme des Kurvenverlaufs der optischen
Dichte (O.D.) gegen die Zeit gemessen und die O.D. der E. coli Kultur in
der exponentiellen Wachstumsphase mit Hilfe einer Gesamtkeimzahl
und einer Lebendkeimzahl bestimmt werden. Die Parameter der exponentiellen
Wachstumsphase sind durch die Bestimmung der mittleren
Generationszeit, Verdopplungszeit und mittleren Wachstumsrate zu charakterisieren.
EINFÜHRUNG
Das Wachstum einer Bakterienkultur besteht in einer Zunahme der
Masse der Proteine und Nukleinsäuren und ist im typischen Fall von einem
Anwachsen der Gesamtzellmasse und einer Vermehrung der Zellen
in der Kultur begleitet.
Für eine quantitative Messung bestimmt man die Absorption einfallenden,
monochromatischen Lichtes in der Kultur ("optische Dichte", O.D.,
Trübung) und eicht die für einen bestimmten Organismus und eine bestimmte
Wachstumsphase spezifischen Ergebnisse durch eine Bestimmung
der Zellmasse (als Trockengewicht oder Proteinkonzentration) und
der Zelldichte (mikroskop. Auszählung). Die Einfachheit und Schnelligkeit
der Trübungsmessung erlaubt so das Verfolgen des zeitlichen Verlaufs
des Wachstums (Wachstumskurve).
Unter optimalen Bedingungen verdoppeln sich einzellige mikrobielle
Populationen in regelmäßigen Zeitabständen. Die Zellzahl N o in einer
Kultur vermehrt sich in einer Zeitspanne t auf die Zellzahl N t nach einem
exponentiellen Funktion:
N t = N 0 2 kt
Darin bedeutet k die Verdopplungsrate einer Kultur in einer Zeiteinheit
(gebräuchlicherweise: 1 h) und berechnet sich als:
k = ( ln N t - ln N 0 )/ 0.693 t
Die mittlere Generationszeit g der Population ist:
g = 1/k

M-24
Infolge der raschen Zunahme der Zellzahl in einer nicht-kontinuierlichen
("batch") Kultur in der exponentiellen Wachstumsphase kommt es bald
zu Bedingungen, die das weitere Wachstum limitieren (z.B. abnehmende
Substratkonzentrationen, Sauerstoffmangel, pH-Änderungen, hemmende
Stoffwechselprodukte). Die Kultur wechselt von der exponentiellen
(logarithmischen) Wachstumsphase in eine Phase retardierten Wachstums,
danach in eine stationäre Phase und schließlich zur Sterbephase.
Die mittlere Wachstumsrate µ einer Kultur berechnet sich aus der Zunahme
der Proteinmasse M, die sowohl proportional zur Zeit als auch
zur Ausgangsmenge erfolgt:
dM/dt = µM
Integriert über einen Zeitraum t, in dem die Proteinausgangsmenge M o
auf die Masse M t anwächst, gilt:
M = e µt M o
Die mittlere Wachstumsrate µ ist also:
Trübungsmessung:
µ = (ln M t - ln M o )/ t
Die optische Methode der Bestimmung der Zellmasse in einer Kultur
beruht auf der Streuung einfallenden Lichtes durch die suspendierten
Bakterienzellen (und anderer makromolekularer Bestandteile). Innerhalb
gewisser Grenzen ist die durch Streuung erfolgte Extinktion eines einfallenden
Lichtstrahles proportional zur Dichte der Zellen in der Kultur.
Die Sensitivität der Methode hat eine untere Grenze von etwa 10 6
Zellen/ml und eine obere, die von der Empfindlichkeit des Detektors
bestimmt wird. Um verlässliche Werte zu erhalten, wählt man
Verdünnungsstufen, die eine Extinktion unter 0.5, aber von mindestens
0.05 haben. Gemessen wird eine homogene Suspension in einer 1cm
Küvette bei einer Wellenlänge von 660nm gegen sterile, partikelfreie
Nährlösung als Standard.

M-25
VERSUCHSAUFBAU
Geräte:
500ml Erlenmeyerkolben als Kulturgefäß, Magnetrührer, Wasserbad,
Einstrahlspektralphotometer, 4 Kunststoffküvetten (d = 1 cm), THOMA-
Zählkammer, Phasenkontrastmikroskop, Petrischalen mit Nähragar,
Pipetten, Pasteurpipetten, Zentrifugenröhrchen.
Organismus: E.coli
DURCHFÜHRUNG
- Einen 500ml-Erlenmeyerkolben, der 200 ml sterile Nährlösung enthält,
mittels einer Stativklammer in ein Wasserbad von 37°C über einen Magnetrührer
hängen;
- etwa 10 min warten, um die Nährlösung auf Wasserbadtemperatur zu
bringen;
- mit einer sterilen Pipette mit 2 ml eines E. coli-Inoculats beimpfen;
Stoppuhr starten;
- mit einem abgeflammten Uhrglas bedecken und Rührgeschwindigkeit so
einstellen, daß kräftig Luft in die Kultur gerührt wird;
- erstmals nach 10 min und dann in weiteren 10 min-Abständen (bis max.
240 min) mit einer sterilen 2 ml Pipette 2 ml Probe entnehmen;
- sofort in eine 1 cm Plastikküvette füllen und im Spektralphotometer bei
660 nm die Extinktion messen; gemessen wird gegen eine (zur Verfügung
gestellte) Küvette mit steriler, partikelfreier Nährlösung als Nullwert;

M-26
AUSWERTUNG 1. Die Wachstumskurve ist in einem semi-logarithmischen Diagramm
graphisch darzustellen: O.D. in logarithmischen
Werten auf der Ordinate gegen die Inkubationszeit auf der
Abszisse.
Bestimmung der Generationszeit aus der Wachstumskurve
LITERATUR DREWS,G. (1976)
Mikrobiologisches Praktikum, 3. Auflage, Springer Verlag, Berlin-Heidelberg
GERHARDT, P.; R.G.E. MURRAY; R.N. COSTILOW; E.W. NESTER;
W.A. WOOD; N.R. KRIEG; G.B. PHILLIPS (1981)
Manual of Methods for General Bacteriology, American Society for
Microbiology, Washington (524 pp.)

M-27
PUFFER UND REAGENZIEN
Oxidase-Reagenz
VP-Reagenz
Gram-Färbung
Differenzierlösung
Indolreagenz
MR-Lösung:
0,10 g Tetramethylparaphenylendiamin
0,01 g Ascorbinsäure
A.dest. 10 ml
5 g a-Naphtol
100 ml absol. Ethanol
1 g Kristallviolett in 100 ml A.dest.
2 g Safranin-O in 100 ml A.dest.
Aceton/Ethanol 1:3
5 g Dimethylaminobenzaldehyd in 100 ml 1 M HCL
0.01 g in 30 ml 95 %igem Ethanol lösen, dann mit dest. Wasser
auf 50 ml auffüllen
H 2 O 2 3 %
Safranin: 0, 2 %
27

M-28
MEDIEN
LB-Boullion
LB-Agar
Trypton
10.0 g
Hefeextraktextrakt 5.0 g
NaCl
10.0 g
A. dest. 1000 ml pH 6.8
Trypton
10.0 g
Hefeextraktextrakt 5.0 g
NaCl
10.0 g
Agar
15.0 g
A. dest. 1000 ml pH 6.8
Glucose-Bouillon-Gärröhrchen
Trypton
10.0 g
Glucose
5.0 g
NaCl
5.0 g
A. dest. 1000 ml pH 7.3
Bromthymolblau-Agar
Polypepton 5.0 g
Rindfleischextrakt 3.0 g
Lactose
10.0 g
Bromthymolblau 0.17 g
Agar
15.0 g
A. dest. 1000 ml pH 8.6
SIMMONS-Citrat-Agar
K2HPO4 1.0 g
(NH4)H2PO4 1.0 g
NaCl
5.0 g
Na-citrat 2.0 g
MgSO4
0.2 g
Bromthymolblau 0.08g
Agar
15.0 g
A.dest. 1000 ml pH 6.9
MRVP-Medium
Pepton
7.0 g
Glucose
5.0 g
K2HPO4 5.0 g
A.dest. 1000 ml pH 6.9
28

M-29
SIM - Medium
Harnstoff-Agar
Pepton aus Fleisch 6.6 g
(NH4)Fe-citrat 0.2 g
Na-thiosulfat 0.2 g
Agar
3.0 g
A.dest. 1000 ml pH 7.3
Pepton
1.0 g
Glucose
1.0 g
NaCl
5.0 g
KH2PO4 2.0 g
Harnstoff 20.0 g
Phenolrot 0.012g
Agar
15.0 g
A.dest 1000 ml pH 6.8
Harnstoff besser als 20 %ige Lösung steril filtrieren und dem Medium aseptisch zugeben.
D.h. die Grundsubstanzen für den Agar für 1 L berechnen, allerdings dann nur in 900 ml
lösen, nach dem Autoklavieren noch 100 ml 20 %ige Harnstofflösung zugeben
Medium sollte gelb-orange sein, keines falls pink!
F- Agar
FTO-Agar
Pepton
20 g
K 2 HPO 4
1,5 g
MgSO 4 *7H 2 O 1,5
Glycerin
10 g
Agar
15 g
A.dest. 1000 ml pH7,2 – 7,4
Pepton
10 g
Hefeextrakt 5 g
Glucose
1g
Agar
15 g
A.dest. 900 ml pH 7,2
Nach dem Autoklavieren heiß zusetzten (Aceton verdampft):
100 ml 0,02 %ige Furazolidon-Lösung (in Aceton)
OF-Medium/Agar
Trypton
1g
Hefeextrakt 1g
NaCl
5g
K 2 HPO 4
0,3 g
Bromthymolblau 0,15 g
Agar
4,5 g (Hochschichtagar)
Agar
15 g (Agarplatten)
A.dest. 900 ml pH 7,2
Nach dem Autoklavieren zusetzten:
29

M-30
100 ml 10 %ige Glucoselösung (separat autoklaviert), mischen und
heiß in Röhrchen (für Hochschichtagar) portionieren oder Platten
gießen.
StärkeAGAR
NB oder LB-Agar
Zusatz von 0,5 % löslicher Stärke
Casein oder Milchagar: Grundagar mit Zusatz von 0,5 – 1,0 % Milcheiweiss (Casein)
10 % ige Magermilchpulver-Lösung extra autoklavieren
und dem Grundmedium insteril zusetzen
(d.h. Grundmedium z.B. für 500 ml berechnen, dann aber nur
in 450 ml lösen und nach dem Autoklavieren noch 50 ml 10
%ige Caseinlösung zugeben (1 % Casein im Medium)
Trockennährböden (McC, GSP, BP, VJ, CER, DTB, DRCM, MRS) entsprechend
der Anleitung auf der Verpackung ansetzen
30