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Biochemische Charakterisierung der siRNA-vermittelten Erkennung ...

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2 Einleitung<br />

A<br />

Ago2<br />

k 1<br />

k ‐1<br />

Ago2<br />

+<br />

+<br />

k 2<br />

B k<br />

Ago2<br />

3<br />

Ago2<br />

+<br />

k ‐3<br />

k 4<br />

+<br />

Ago2<br />

Abbildung 2.9: Kinetische Kontrollpunkte <strong>der</strong> Assemblierung und Funktion des RISC. Vereinfachende<br />

Darstellung <strong>der</strong> RNAi in zwei kinetisch kontrollierten Schritten, die jeweils einem Kontrollpunkt unterliegen.<br />

(A) Assemblierung des RISC mit einer doppelsträngigen <strong>siRNA</strong> und Spaltung des passenger<br />

Stranges. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt kann durch die thermodynamischen Eigenschaften<br />

<strong>der</strong> <strong>siRNA</strong> beeinusst werden [178, 179, 186, 192197]. (B) Bindung <strong>der</strong> target RNA und ihre Spaltung.<br />

Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt kann durch verschiedene Faktoren wie die Sekundärstruktur<br />

<strong>der</strong> target RNA o<strong>der</strong> die Produktfreisetzung beeinusst werden [183185]. Abbildung modiziert nach<br />

Rana [22].<br />

Hierbei sind zwei Szenarien vorstellbar: Die Zugänglichkeit <strong>der</strong> <strong>Erkennung</strong>ssequenz innerhalb<br />

<strong>der</strong> target RNA und somit ihre Bindung o<strong>der</strong> die target RNA-Spaltung und Freisetzung <strong>der</strong><br />

Produkte können limitierend sein [22].<br />

2.5.2 Vergleichende Analyse <strong>der</strong> Katalyse durch RISC<br />

Erste Untersuchungen zur Beladung eines rekombinanten Ago Proteins wurden durch Rashid<br />

et al. durchgeführt. Dabei verwendeten sie das bakterielle A. aeolicus Ago in Kombination mit<br />

einzelsträngigen DNAs verschiedener Länge (9 nt, 15 nt und 21 nt). Sie beobachteten einen<br />

zweiphasigen Verlauf <strong>der</strong> Bindungsreaktion ohne Abhängigkeit von <strong>der</strong> guide DNA-Länge<br />

[198]. Lima et al. untersuchten neben <strong>der</strong> Anität von in D. melanogaster Sf9 Zellen rekombinant<br />

exprimiertem, anitätsgereinigtem GST-hAgo2 zu verschiedenen <strong>siRNA</strong>-Substraten<br />

die Kinetik <strong>der</strong> Bindungsreaktion. Für eine 19 nt lange guide RNA mit 5'-Phosphatgruppe<br />

ermittelten sie einen einphasigen Verlauf mit k 1 = 1,2 ×10 5 M -1 s -1 und k -1 = 6,8 ×10 -3 s -1 . Für<br />

das gleiche Substrat ohne Phosphatgruppe am 5'-Ende betrugen k 1 = 3,1 ×10 5 M -1 s -1 und<br />

k -1 = 9,9 ×10 -2 s -1 . Die Abwesenheit <strong>der</strong> kritischen Phosphatgruppe führte also zu einer Beschleunigung<br />

<strong>der</strong> Dissoziation um das 15-fache [199].<br />

Bei <strong>der</strong> Bestimmung biochemischer Parameter <strong>der</strong> <strong>siRNA</strong>-<strong>vermittelten</strong> target RNA-Spal-<br />

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