Mikrobiologisches Praktikum im Grundmodul GM12 - Universität ...

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Ausplattieren mit dem Drigalski Spatel: 1. Bakteriensuspension auf die Mitte einer Agar Platte geben. Sofort weiterarbeiten. Nicht lange stehen lassen, da die Flüssigkeit einziehen könnte. 2. Drigalski Spatel in eine Schale mit reinem Ethanol tauchen. Ethanol abtropfen lassen. 3. Spatel durch die Flamme eines Bunsenbrenners ziehen. Am Spatel verbliebenes Ethanol abbrennen lassen. Spatel nicht extrem erhitzen. 4. Spatel am Rand auf den Agar auftupfen, um den Spatel Glas vollständig abzukühlen. Bakteriensuspension gleichmäßig auf dem Agar verteilen. Eine Weile aufrecht stehen lassen. Danach umdrehen und inkubieren. 1.2 Anreicherung aerober Sporenbildner (Bacillus) Aus rohen Kartoffeln werden etwa 5 cm lange, keilförmige Stücke geschnitten und in Reagenzgläser gestellt. Die schrägen Schnittflächen der Kartoffelstücke werden mittels einer Impföse mit Erde beimpft. Nach Verschluss der Gläser werden diese für 10 Minuten bei 100°C im Wasserbad erhitzt und anschließend über Nacht bei 37°C bebrütet. Falls sich auf den beimpften Schnittflächen der Kartoffelkeile schleimige Kolonien gebildet haben, werden diese auf eine LB-Agar Platte überimpft. Hierzu wird ein Verdünnungsausstrich mit einer Impföse durchgeführt. Die Platten werden bei 37°C über Nacht inkubiert. Einige Kolonien der bewachsenen Platten werden werden einem Katalase Test (5.2) und einem Gram- Schnelltest (6.) unterzogen. Verdünnungsaustrich mit einer Impföse: 3. Abnehmen einer Einzelkolonie oder der Probe 1. Ausglühen im Bunsenbrenner 2. Abkühlen im Agar 4. Verdünnungsausstrich Bebrüten Einzelkolonien Zwischen den Schritten A, B, C und D die Impföse jeweils ausglühen und abkühlen. 4
2. Untersuchung der Flora des Mund- und Nasenraumes 2.1 Isolierung von oralen Streptokokken (Streptococcus spp.) Mit einem sterilen Wattestäbchen werden Abstriche von der Mundschleimhaut auf einer D-Blutagar Platte ausgestrichen.. Weitere Ausstriche werden auf einer D-Blutagar Platte mit Tetracyclin (5µg/ml) und einer weiteren D-Blutagar Platte mit Kanamycin (5µg/ml) angefertigt. Alle Platten werden bei 37°C über Nacht inkubiert. Nach der Inkubation sollen die Kolonien der unterschiedlichen Ausstriche verglichen werden. Die Koloniemorphologie und und eventuell auftretende Hämolyse sollen beschrieben werden. Die Zellen von unterschiedlichen Kolonien werden einem Katalasetest unterzogen. In diesen Ausstrichen können sich verschiedene Streptokokken, wie z.B. Streptococus mitis, S. oralis, S. mutans, S. salivarius befinden. Andere bakterielle Spezies können unter Umständen ebenfalls vorhanden sein. 2.2 Isolierung von Staphylokokken Mit einem sterilem Wattestäbchen wird ein Abstrich des Nasenraumes auf einer Baird-Parker-Agar Platte ausgestrichen. Zusätzlich können weitere Abstriche, z.B. Ohr, Haut, Haaransatz angefertigt werden. Platten über Nacht bei 37°C bebrüten. Schwarze, gut wachsende Kolonien auf Baird-Parker-Agar stellen Staphylococcus aureus dar, graue, langsamer wachsende Kolonien sind wahrscheinlich Staphylococcus epidermidis oder andere Staphylokokken. werden einem Katalase Test (5.2) und einem Gram-Schnelltest (6.) unterzogen 3. Wachstum von Bakterien. Erstellen einer Wachstumskurve In dem Versuch soll das Wachstum bakterieller Kulturen durch die Messung der optischen Dichte verfolgt werden. In einer wachsenden Bakterienkultur wird durch Zellteilung die Zahl der Organismen erhöht, was zu einer Zunahme der Trübung des Mediums führt. Die Messung der Trübung, d.h. der optischen Dichte kann daher zur Bestimmung des bakteriellen Wachstums genutzt werden. Drei Röhrchen mit 5 ml Kulturmedium werden mit je 0.5 ml Übernachtkultur oder Glycerinkultur von drei Test Bakterien, Escherichia coli, Staphylococcus carnosus und Streptococcus pneumoniae, beimpft. Von den beimpften Kulturen wird im Photometer die optische Dichte bei 600 nm (OD 600 ) bestimmt.. Danach werden die Kulturen ohne Belüftung bei 37°C im Wasserbad inkubiert und in Intervallen von. 45 Min. – 60 Min. wird die OD 600 gemessen. Die erhaltenen Werte werden auf sog. Halb-logarithmisches Papier aufgetragen. Die Einteilung der Zeitachse erfolgt linear, das Auftragen der OD 600 erfolgt dagegen logarithmisch. Im linearen Teil der Kurve kann die Verdopplungszeit abgelesen und damit die Wachstumsrate bestimmt werden. Die Kulturen werden nach dem Ende der Messungen am Nachmittag in den 37°C Brutraum gestellt. Am nächsten Morgen werden die Bakterien durch Vortexen resuspendiert. Zum Abschluss der Wachstumskurve wird noch einmal die OD 600 gemessen. Zwei der Kulturen werden für die Versuche zur Antibiotikaresistenz und für den Lantibiotikaversuch weiterverwendet. 4. Antibiotische Substanzen 4.1 Erstellen eines Antibiogramms In diesem Versuch wird das Antibiogramm von Escherichia coli als Vertreter Gram-negativer Bakterien und von Staphylococcus carnosus als Vertreter Gram-positiver Bakterien erstellt. Für diesen Test werden die E. coli und S. carnosus Kulturen der ersten Wachstumskurve benutzt. Jeweils 0,1 ml der Kulturen werden auf je eine LB-Agar Platte mit dem Drigalski-Spatel ausgestrichen. Die ausplattierte Flüssigkeit soll dann für ca. 1 Stunde in den Agar einziehen.. Danach werden 6 Filterplättchen, die verschiedene Antibiotika enthalten, auf die Platte aufgebracht und diese über Nacht bei 37°C bebrütet. Zur Auswertung wird die Größe der Hemmhöfe bestimmt. In diesem Versuchsteil wird die Wirkung von Cephalotin (ein Cephalosporin), Chloramphenicol, Erythromycin , Rifampin, Streptomycin und Tetracyclin untersucht. 4.2 Produktion von Lantibiotika durch Staphylococcus Eine Gruppe von antibakteriellen Peptiden zeichnet sich durch das Vorhandensein von Lanthionin aus und werden deshalb als Lantibiotika bezeichnet. Lantibiotika werden von einer Reihe von Bakterien produziert, unter anderem von verschiedenen Staphylokokken. In dem Versuch werden vier Staphylokokken auf die Produktion von Lantibiotika untersucht. Dazu werden je 0.1 ml der unter 3. beschriebenen Kulturen von E. coli und von S. carnosus auf eine LB-Agar Platte ausgestrichen (Drigalski). Nach Eintrocknen (ca. 1 Stunde) werden die verschiedenen Staphylokokken mit einem sterilen Zahnstocher oder mit der Impföse von der Agar Platte abgenommen und in einer Linie über die vorplattierten Testplatten gestrichen. Die Platten werden über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Hemmhöfe zeigen die Produktion von Lantibiotika an. 5
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