Biochemie Praktikum I

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Biochemie Praktikum I

Biochemie Praktikum I

Biologen / Bachelor

SS 2012


Praktikumsskript Biochemie für Biologen-Bachelor SS2012

Institut für Biochemie, PD. Dr. Wolfgang Hilt, 18. Januar 2012


Praktikumsskript Biochemie für Biologen-Bachelor SS2011

Sicherheitsinstruktionen

Sicherheitsinstruktionen

Allgemeine Sicherheit

Informieren Sie sich bei Praktikumsbeginn über die Sicherheitseinrichtungen im

Praktikumslabor: Feuerlöscher, Brandmelder, Brandduschen, Augenduschen,

Not-Aus-Schalter, Erster Hilfe Kasten, Fluchtwege (siehe mündliche Instruktion)

Ein Übersichtsplan und Notfallalarmplan befindet sich beim Telefon

Bei Alarm das Gebäude auf dem kürzesten Weg umgehend verlassen

Bei Brand oder Unfall im Praktikumsraum: Treffpunkt am Audimax gegenüber (wie in

der mündlichen Belehrung besprochen)

Tragen Sie im Labor Schutzkleidung

Labormantel, flache Schuhe; bei Bedarf: Schutzbrille, Handschuhe

Im Praktikumslabor ist Essen, Trinken, Rauchen verboten

Mit dem Mund Pipettieren ist grundsätzlich verboten

Gefährliche oder toxische Stoffe

Beachten Sie die Hinweise im Skript

Folgen Sie den Hinweisen / Anweisungen der Assistenten

Gentechnische Arbeiten

Wir führen gentechnische Arbeiten der niedrigsten Sicherheitsstufe durch

Einzelheiten in der Betriebsanweisung S1 Labor

gentechnisch veränderte Organismen werden gesammelt und vor der

Entsorgung autoklaviert.

Unfälle und Notfälle müssen sofort gemeldet werden

bei Assistenten vor Ort sowie bei:

Dr. Wolfgang Hilt 0711 685 64388 oder

Dr. Hans Rudolph 0711 865 64389

Verhalten Sie sich generell umsichtig!


Praktikumsskript Biochemie für Biologen-Bachelor SS2011

Sicherheitsinstruktionen


Praktikumsskript Biochemie für Biologen-Bachelor SS2012

Programm

PROGRAMM

Tag Gruppe A Gruppe B

1 SDS-Gelelektrophorese LDH-Aktivität, Proteinkonzentration

2 PAGE & Blotten Michaelis-Menten-Kinetik

3 Western-Blot > Entwicklung

DNA-Elektrophorese

SDS-Gelelektrophorese

4 LDH-Aktivität, Proteinkonzentration PAGE & Blotten

5 Michaelis-Menten-Kinetik Western-Blot > Entwicklung

DNA-Elektrophorese


Praktikumsskript Biochemie für Biologen-Bachelor SS2012

Inhaltsverzeichnis

Enzyme: Aktivität und Stabilität 7

LDH-Aktivitätstest 10

Proteinbestimmung (Bradford) 13

Enyzmkinetik (Michaelis-Menten) 16

Elektrophorese / Biosynthese von CPY 22

Herstellung Proteinrohextrakt (TCA-Fällung) 23

SDS-Elektrophorese 24

Immunoblotting (Western-Blot) 30

Restriktionsverdau, DNA-Elektrophorese 33


Enzyme: Aktivität und Stabilität

Basiswissen: Proteine, Struktur, Enzymaktivität

Praktikumsskript Biochemie für Biologen-Bachelor SS2012

LDH-Test / Proteinbestimmung

Proteine sind die wichtigsten Funktionseinheiten der lebenden Zelle. Sie sind aus

Aminosäuren aufgebaut, die über Peptidbindungen zu Ketten verknüpft sind. Die

Peptidketten haben üblicherweise Längen von mindestens 50 bis über mehrere hundert

Aminosäuren. Für den Aufbau von Proteinen werden in der Zelle 20 verschiedene

Aminosäuren verwendet. Diese besitzen Seitenketten unterschiedlicher Eigenschaft (sauer,

basisch, polar, hydrophob, aromatisch). Die Abfolge der Aminosäuren in einem Protein

(Primärstruktur) ist über die genetische Information genau definiert. Im wässrigen Medium

falten sich die Peptiketten im Verlauf ihrer Synthese in definierte Strukturen. Kürzere

Abschnitte nehmen dabei entweder schraubenartige Strukturen (α-Helices) oder gestreckte,

übereinander geschichtete Strukturen (β-Faltblätter) ein (Sekundärstrukturen). Diese ordnen

sich (zur Erreichung eines Energieminimums) in eine genau definierte 3D-Struktur

(Tertiärstruktur). Hydrophobe Bereiche werden dazu im Kern des Proteins verborgen, polare

und geladene Gruppen sind in Richtung Lösungsmittel exponiert und vermitteln Bindungen

zu den Wassermolekülen. Ionische Bindungen, van-der-Waals-Kräfte und H-

Brückenbindungen - in besonderen Fällen auch kovalente Bindungen - innerhalb der

Peptidkette stabilisieren zusätzlich die native Struktur des Proteins. Korrekt gefaltete

Proteinketten können sich zu Komplexen aus mehreren (auch unterschiedlichen)

Untereinheiten zusammenlagern (Quartärstruktur). Proteine erfüllen nur in der korrekten

Nativstruktur ihre biologischen Aufgaben / Aktivität.

Abb. 1: Lactatdehydrogenase aus Skelettmuskeln

Proteine sind relativ labil. Unter bestimmten Bedingungen (z.B. extreme pH-Werte, erhöhte

Temperaturen, Detergenzien, hydrophobe Lösungsmittel, mechanische Kräfte) kann die

native Struktur zerstört werden. Die Peptidketten entfalten dann zu Zufallsstrukturen; die

biologische Funktion / Aktivität geht verloren. Zumeist verlieren die entfalteten Moleküle

zusätzlich ihre Löslichkeit, bilden Bindungen zu anderen Peptidmolekülen und damit

Aggregate, die aus der wässrigen Phase ausfallen. Organismen die in relativ lebensfeindlicher

7


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LDH-Test / Proteinbestimmung

Umgebung existieren (zum Beispiel thermophile Bakterien) sind aber durchaus in der Lage

Proteine zu synthetisieren, die auch unter solch extremen Bedingungen ihre Struktur und

damit biologische Aktivität bewahren.

Viele Proteine, so genannte Enzyme 1 , wirken in der Zelle als hocheffiziente Biokatalysatoren.

Diese beschleunigen (bio)-chemische Reaktionen 2 und ermöglichen so die Umsetzung von

Stoffen unter den milden Temperaturbedingungen des Lebens. Enzyme enthalten zusätzlich

zur Pepidkette oft Cofaktoren. Diese sind für den Katalysemechanismus wichtig. Cofaktoren

sind oft komplexe organische Moleküle oder Metallionen (z.B. Mg 2+ , Ca 2+ , Mn 2+ , Fe 2+ , Zn 2+ ,

Co 2+ ). Sind Cofaktoren fest an das Enzym gebunden spricht man von prostethischen Gruppen,

transient bindende Cofaktoren nennt man Coenzyme. Enzyme sind wichtig für den

chemischen Stoffwechsel der Zelle (Metabolismus), haben aber auch eine zentrale Bedeutung

in der Regulation zellulärer Prozesse.

Im vorliegenden Versuch sollen Enzymreaktionen am Beispiel der Lactatdehydrogenase

(LDH) untersucht werden.

Biowissen: Physiologische Bedeutung der Lactatdehydrogenase

Lactatdehydrogenase (LDH) ist ein wichtiges Enzym des Energiestoffwechsels der Zelle. Die

Zelle gewinnt Energie 3 durch Spaltung von Glucose 4 zu Pyruvat 5 , der sogenannten Glykolyse

(siehe Abb. 2). In einem Zwischenschritt dieses metabolischen Weges wird Gycerinaldehyd-

3-Phosphat oxidiert. Dazu werden Reduktionsäquivalente (in Form von negativ geladenem

Wasserstoff H - (Proton + 2 Elektronen) auf das Coenzym NAD + übertragen und dieses zu

NADH reduziert. Unter aeroben Bedingungen (Vorhandensein von O 2 ) werden diese

Redoxäquivalente im Citratzyklus und der Atmungskette regeneriert. Unter anaeroben

Bedingungen ist dies so nicht möglich. Um dennoch ein Zusammenbrechen der Reaktion

durch vollständigen Verbrauch der in der Zelle nur begrenzt vorhandenen NAD + -Moleküle zu

verhindern, wird NAD + durch Oxidation regeneriert. Die Reduktionsäquivalente werden dazu

durch das Enzym LDH auf Pyruvat übertragen und dieses zu Lactat 6 reduziert.

Dieser Fall tritt beim Menschen bei kurzzeitiger Überlastung der Skelettmuskeln zum

Beispiel beim Sport ein. Bei Sauerstoffmangel gewinnen die Muskelzellen weiter ATP durch

Glykolyse und produzieren über den oben beschriebenen Mechanismus als Endprodukt

Lactat. Der Milchsäurespiegel steigt an (der Athlet übersäuert). Die Bildung von Milchsäure

in Reaktion auf Muskelbeanspruchung dient deshalb in der Sportmedizin als Maß der

Belastung bzw. Belastbarkeit. In der Regenerationsphase wird Lactat mit Hilfe der LDH in

der Leber zu Pyruvat oxidiert, welches dann in den aeroben Energiestoffwechsel

eingeschleust und "verbrannt" werden kann 7 .

Bestimmte (fakultativ anaerobe) Mikroorganismen, z.B. Milchsäurebakterien setzen die

LDH-Reaktion zur ständigen Energiegewinnung unter Sauerstoffmangel ein; diesen Prozess

nennt man Milchsäuregärung. Hefen haben eine alternativen Weg entwickelt: Sie reduzieren

Pyruvat unter Abspaltung von CO 2 zu Ethanol (alkoholische Gärung) 8 .

1 εν ζψµe (en zyme): in Hefe (Wilhelm Kühne,1876)

2 um mindestens den Faktor 10 6

3 gespeichert in Form von ATP-Molekülen

4 Traubenzucker

5 Brenztraubensäure

6 Milchsäure

7 vollständiger Abbau zu CO 2 und Reduktionsäquivalenten, letztere werden in der Atmungskette der Mitochondrien unter

Reduktion von O 2 zu H 2 O zur Synthese von ATP-Molekülen verwendet.

8 Beide Mechanismen sind von zentraler Bedeutung in bestimmten "biotechnologischen" Prozessen der

Nahrungsmittelbereitung: Milchsäuregärung: Joghurt, Sauermilch, Käse, Sauerkraut,

Alkoholische Gärung: Wein, Bier, Spirituosen, Backen

8


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LDH-Test / Proteinbestimmung

Abb 2: Glykolyse

9


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LDH-Test / Proteinbestimmung

Versuchsdurchführung: Lactatdehydrogenase (LDH)-Enzymaktivitätstest

Folgende LDH katalysierte Reaktion liegt dem Test zugrunde (vgl. Stryer, Biochemie):

Pyruvat +NADH + H + ⇔ Lactat + NAD +

LDH

Den Verlauf dieser Reaktion kann man mit Hilfe eines Photometers anhand der Oxidation von

NADH zu NAD + verfolgen. Bei 366 nm absorbiert nur NADH.

Abb. 3. Struktur von NAD + und NAD + /NADH Redoxreaktion

Die Geschwindigkeit der Reaktion - d.h. die zeitliche Änderung der Konzentration eines

Reaktionsteilnehmers (Substrat) im Verlauf der Reaktion – kann anhand der Änderung der

Extinktion gemessen werden. Die Extinktion (optische Auslöschung eines Lichtsignals durch

Absorption von Lichtquanten an Molekülen) ist proportional zur Konzentration der

absorbierenden Moleküle. E ist also ein Maß für die Konzentration (c) des verfolgten Stoffes

(Lambert-Beersches Gesetz):

E = -log I 1 / I 0 = ε ⋅ d ⋅ c (1)

I 0 : Intensität des eingestrahlten Lichts

I 1 : Intensität des austretenden Lichts

c: Konzentration des absorbierenden Stoffes

d: Schichtdicke der Lösung

ε: Absorptionskoeffizient

Aus der Steigung der erhaltenen Messkurve kann man die Geschwindigkeit (v) der Abnahme

der NADH Konzentration errechnen. Diese ist ein direktes Maß für die vorhandene

10


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LDH-Test / Proteinbestimmung

Enzymmenge und wir in der Enzymologie deshalb auch als Volumenaktivität (A V)

bezeichnet.

Durch Auflösen von (1) nach c erhält man

E

c = –––––

ε ⋅ d

daraus folgt für die Reaktionsgeschwindigkeit (dc/dt)

∆c ∆E

v = A V = ––– = –––––– (2)

∆t ∆t ⋅ ε ⋅ d

v : Reaktionsgeschwindigkeit

Av: Enzymaktivität (in der Küvette [1 µmol Substratumsatz / (min ⋅ ml) = U (unit) / ml]

∆E : Extinktionsänderung (2 cm = 0,1 bei 100mV, 2 cm = 0,01 bei 10mV)

∆t : Zeitänderung [min]

ε 366nm : 3,3 ml / (µmol ⋅ cm)

d : Lichtweg durch Küvette (1 cm)

Da uns eigentlich die Enzymaktivität in der Probe (nicht in der Messküvette interessiert) muss

die Verdünnung mit einberechnet werden. Gleichung (2) erweitert sich zu:

∆E V T

A V = –––––––

∆t ε ⋅ d

––––

V P

V T : Testvolumen (1000 µl)

V P : Probenvolumen (20 µl)

Quotient entspricht dem Verdünnungsfaktor

Durchführung des LDH-Aktivitätstests

Das Spektrometer wird im abs-Modus (absorbance (engl)= Extinktion 9 ) betrieben. Vor

Beginn der Messung wird das Spektrometer und der angeschlossene Schreiber mit dem

Nullwert geeicht (set reference am Photometer + Schreiber auf Nulllinie; Eingangsspannung

10 mV: Papierbreite entspricht einer Extinktionseinheit). Der Maximalausschlag des

Schreibers (Startposition zu Beginn der Reaktion) wird mit dem Maximalwert festgelegt.

Zur Messung wird folgender Testansatz verwendet:

67 mM Phosphatpuffer pH 7.2 940 µl

Pyruvatlösg. (2,75 mg / ml)

20 µl

NADH-Lösg. (11 mg / ml)

20 µl

Probenlösung (LDH) 20 µl

Zur Herstellung der Pyruvatlösung ca. 1 mg einwiegen und mit der zum Erreichen der

geforderten Konzentration notwendigen Menge Puffer auffüllen.

Zur Herstellung der NADH-Lösung ca. 4 mg einwiegen und mit der zum Erreichen der

geforderten Konzentration notwendigen Menge Puffer auffüllen.

9 unterscheide dazu: absorption (engl) = Absorption

11


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LDH-Test / Proteinbestimmung

Um Pipettierfehler möglichst gering zu halten kann für den Testansatz folgende Lösung (Mix)

vorbereitet werden (bei RT aufbewahren!):

Versuchsdurchführung:

67 mM Phosphatpuffer pH 7.2 9.4 ml

Pyruvatlösg. (2,75 mg / ml)

200 µl

NADH-Lösg. (11 mg / ml) 200 µl

LDH aus Schweinherzmuskel so verdünnen 10 , dass die Ausgangslösung eine

Volumenaktivität von ca. 2 – 4 U/ml (ΔE/min = 0,13 – 0,26) hat.

Die Reaktion wird mit der Zugabe der LDH-Probenlösung gestartet. Dafür werden in die

Küvette 980 µl Testlösung vorgelegt und 20 µl LDH-Probenlösung dazu pipettiert. Die

Küvette mit Parafilm abdichten, mischen, zum Entfernen von Luftbläschen einige Male auf

den Tisch klopfen ins Photometer stellen und sofort mit Hilfe des Schreibers die Abnahme der

Extinktion verfolgen.

Es werden mehrere Tests (>3) zur Messung der Volumenaktivität in der Ausgangslösung

durchgeführt. Dazu wird ΔE/min ermittelt und die Volumenaktivität errechnet 11 .

10 wird in kristalliner Form als Suspension in Ammoniumsulfat gelagert.

Herstellung der Testlösung: 400 µl Suspension 10 min bei 13 000 Rpm zentrifugieren, Niederschlag in 200 µl

Phosphatpuffer aufnehmen und zum Erreichen der geforderten Volumenaktivität verdünnnen.

11 die Vorgehensweise beim Test sollte danach verinnerlicht sein. Abweichungen in der Messwerte sollte < 10% sein.

12


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LDH-Test / Proteinbestimmung

Bestimmung der Proteinkonzentration (Gesamtprotein) nach Bradford

Neben der Proteinbestimmung nach der Biuret-, bzw. der Lowry-Methode stellt die

Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford eine geeignete Möglichkeit dar, auch

sehr kleine Proteinkonzentrationen (10-100 µg/ml) zu ermitteln. Zur Messung der

Proteinkonzentration werden Proteinlösungen mit dem blauen Farbstoff Coomassie Brillant

Blue R250 versetzt. Die Farbstoffmoleküle binden adsorptiv an die Proteinmoleküle; dadurch

tritt eine Verschiebung des Absorptionsmaximum nach 595 nm auf (vgl. Lottspeich,

Bioanalytik). Diese wird anhand von Extinkitionsmessungen ermittelt und daraus die

Proteinkonzentration bestimmt:

SO 3 Na

H 3 C

N

HN CH 3

H 3 C

CH 3

O CH 3

N +

SO

- 3

Abb. 3: Coomassie Brillant Blue R 250

Gegenüber anderen Proteinbestimmungen hat die Bradford -Methode folgende Vorteile:

- hohe Empfindlichkeit Proteinkonzentration im Test 1-10 µg (Biuret ca 100 µg)

- kurze Reaktionszeit (ca. 2 min)

- geringe Störanfälligkeit: keine Beeinflussung des Testergebnisses durch K + -, Mg 2+ -

Ionen, EDTA, TRIS, Thiolreagentien und Kohlenhydrate

Versuchsdurchführung

Erstellen einer Eichgerade

Um die ermittelten Extinktionswerte einer Proteinkonzentration c zuweisen zu können, muß

eine Eichgerade erstellt werden. Eine Verdünnungsreihe mit Rinderserumalbumin (BSA)

ansteigender Konzentration (10 – 100 µg/ml) wird zur Verfügung gestellt.

Von den Verdünnungen werden nun jeweils 100µl zu 1 ml Bradford-Stammlösung (vorgelegt

in Küvetten) gegeben (Verdünnungsfaktor 1 : 11). Die Küvetten mit Parafilm abdichten, gut

vermischen, 10 min inkubieren und anschließend messen

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LDH-Test / Proteinbestimmung

Gemessen wird bei 595 nm. Vor Beginn der Messung wird das Spektrometer mit 1 ml

Bradford-Stammlösung + 100 µl H 2 O auf Null gestellt (Extinktion der Negativkontrolle

entspricht dem Nullwert).

Durch Auftragen der bekannten Proteinkonzentrationen gegen die zugehörigen

Extinktionswerte erhält man eine Eichgerade.

Proteinverdünnungen zur Ermittlung der Eichgerade (2 mal unabhängig voneinander ansetzen

und messen):

Konz. c [µg/ml]

Eichlösungen

Extinktion

1. Messung

Extinktion

2. Messung

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Auswertung:

Erstellen der Eichgeraden auf Millimeterpapier:

Extinktion

Konzentration [ µg / ml ]

Messung der Proteinkonzentration der LDH-Lösung / spezifische Aktivität

Messung der Proteinkonzentratoin der LDH-Lösung mit Hilfe der Bradford-Methode. LDH-

Probe so vorverdünnen, dass die Extinktion im Bereich der Eichkurve liegt. Extinktion

bestimmen; Konzentration aus der Eichgerade ablesen.

Aus der Volumenaktivität (VA; [U/ml]) und Proteinkonzentration (PK [mg/ml]) kann die

spezifische Aktivität der Enzymlösung ermittelt werden.

VA : PK = SA [U/mg] 12

diese kann ein Maß für den Reinheitsgrad des Enzyms sein

Bei bekanntem MW 13 kann die Proteinkonzentration in µmol/ml umgerechnet werden. Bei

Bildung des Quotienten erhält man die Umsatzzahl:

K cat = VA[µmol/(ml • s) : PK [µmol/ml];

[µmol • ml / µmol • ml • s] = [1/s]

K cat gibt an wie viele Substratmoleküle ein Enzymmoleküle in der Sekunde umsetzt

12 entsprechende Rechnungen wurden in den Übungen zur Biochemie I Vorlesung durchgeführt

13 LDH: 135 000 Da

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LDH-Test / Proteinbestimmung

Fragen zur Überprüfung ihres Wissensstandes / zum Nachdenken

Wie sind Proteine aufgebaut?

Was ist wichtig für die biologische Funktion von Proteinen?

Was ist ein Enzym?

Welche Bedingungen sind von Bedeutung für die Stabilität eines Proteins?

Wie kann man die Änderung der Konzentration eines Substratmoleküls und damit die

Reaktionsgeschwindigkeit messen?

Welche Geräte werden dafür benötigt?

Ist K cat ein Maß für die Effektivität eines Enzyms?

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Enzymkinetik: Michaelis-­‐Menten-­‐Kinetik

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Michaelis-Menten-Kinetik

Die Abhängigkeit einer Enzym-­‐katalysierten Umsetzung von der Substratkonzentration bei

konstanter Enzymmenge ist in Abb. 1 dargestellt. Im Bereich niedriger

Substratkonzentrationen zeigt sich eine nahezu lineare Beziehung. Bei höheren

Konzentrationen nimmt die Reaktionsgeschwindigkeit nur noch langsam zu und nähert sich

schließlich einem Grenzwert, der maximalen Geschwindigkeit v max .

Abb.1.

Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration

MICHAELIS MENTEN KINETIK

Die mathematische Beschreibung dieses Verhaltens erfolgt nach MICHAELIS und MENTEN.

Dabei werden folgende Abkürzungen verwendet.

E = Enzym C = Symbol für Konzentrationen

S = Substrat k x = Geschwindigkeitskonstanten

ES = Enzymsubstrat-­‐Komplex

P

E t

v

= Produkt

= Gesamte Enzymmenge

= Reaktionsgeschwindigkeit

KM = Michaelis-­‐Konstante

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Michaelis-Menten-Kinetik

Für die Enzymreaktion wurde folgendes Modell aufgestellt:

k 1

k 2

E + S ES E + P

k -1

k 2 = k cat = Wechselzahl

Die Reaktionsgeschwindigkeit v zur Bildung des Produkts P ist gleich dem Produkt aus der

Geschwindigkeitskonstanten k 2 und der Konzentration des Enzymsubstratkomplexes:

v = k 2 ·∙ C ES

(1)

C ES kann folgendermaßen bestimmt werden:

Die zeitliche Änderung der Konzentration des Enzymsubstratkomplexes ergibt sich aus seiner

Bildungsgeschwindigkeit (1. Term der folgenden Gleichung) vermindert um die

Geschwindigkeit des Zerfalls von ES (2.+3. Term):

dC ES /dt = k 1 C E C S -­‐ k -­‐1C ES -­‐ k 2 C ES

(2)

Kurze Zeit nach Beginn der Umsetzung erreicht die ES-­‐Konzentration nach der "steady-­‐state"

Theorie von Briggs und Haldane einen konstanten Wert. Daraus folgt:

dC ES /dt = 0

Aus (2) folgt damit

k 1 C E C S -­‐ k -­‐1 C ES -­‐ k 2C ES = 0

mit C E =C Et -­‐C ES folgt

k 1 (C Et -­‐C ES )C S -­‐ k -­‐1C ES -­‐ k 2 C ES = 0

k 1 C Et C S -­‐ k 1C ES C S -­‐k -­‐1C ES -­‐ k 2 C ES = 0

k 1 C Et C S = C ES (k 1C S + k -­‐1 + k)

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Michaelis-Menten-Kinetik

Mit

K M = k -1+k 2

k 1

unter Berücksichtigung von Gl. (1) folgt

v= k 2 C ES = k 2C ET

(1+K M /C S )

(3)

Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit wird erreicht wenn alle Enzymmoleküle als Enzym-­‐

substratkomplex vorliegen, d.h. C ES =C Et

Daraus folgt: v max = k 2 C Et in (3)

Dies ist die so genannte MICHAELIS-­‐MENTEN-­‐Gleichung

Durch Umformung ergibt sich auch

Was lässt sich aus dieser Formel ableiten:

1. Bei konstanter Enzymmenge ist v nur von der Substratkonzentration C S abhängig, da

K M und v max Konstanten sind.

2. Die Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration zeigt

zwei charakteristische Bereiche:

a) Ist C S sehr klein gegenüber K M so kann dieser Summand unter dem Bruchstrich

der Michaelis-­‐Menten Gleichung gegenüber K M vernachlässigt werden und es ergibt

sich eine Geradengleichung mit der Steigung v max /K M

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Michaelis-Menten-Kinetik

b) Für sehr große Werte der Substratkonzentration geht kann K M gegenüber C S und

man erhält: v = v max C S / C S

Zur Auswertung von Messergebnissen wird meistens die Auftragung nach Lineweaver-­‐Burk

verwendet. Dazu wird die Michaelis-­‐ Menten Gleichung wie folgt umgeformt:

v=

v max

(1+K M /C S )

= v max

K M +C S

C S

Der reziproke Ausdruck hiervon lautet:

1 K M +C S K = M 1 1

= +

V v max C S v max C v S max

Mit 1/v und 1/C S als Variable erhält man eine Gerade mit der Steigung K M /v max und dem

Achsenabschnitt 1/v max.

Das heißt:

Trägt man gemessene Werte für 1/v über 1/C S auf, so kann man aus Steigung und

Achsenabschnitt K M und v max ermitteln (siehe Abb. 2).

Abb.2: Auftragung nach Lineweaver-­‐Burk

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Michaelis-Menten-Kinetik

Versuchsdurchführung:

Zur Ermittlung der MICHAELIS-­‐MENTEN Kinetik der LDH für das Coenzym NADH/H + misst

man die Enzymaktivität analog dem LDH-­‐Test, allerdings mit unterschiedlicher NADH/H + -­‐

Konzentration.

Der Test wird in 1 ml Plastikküvetten am Eppendorf-­‐Photometer bei 366 nm und

Raumtemperatur durchgeführt.

Die Testlösung enthält: 67 mM Phosphatpuffer pH 7.2 950 µl

Pyruvatlösg (2.75 mg/ml)

20 µl

Enzymlösg. (25 µg/ml)

10 µl

NADH-­‐Lösg. aus Verdünnungsreihe

20 µl

Stammlösung vorbereiten: 67 mM Phosphatpuffer pH 7.2 9.5 ml

Pyruvatlösg (2.75 mg/ml)

200 µl

Enzymlösg. (25 µg/ml)

100 µl

Start der Reaktion durch Zugabe der NADH-­‐Lösung.

Verdünnungsreihe:

NADH-­‐Stammlösg: 15,5 mM (11 mg/ml)

Verdünnungsfaktor: 1 2 4 8 10 20 30 40

__________________________________________________________________________

Schreiberempfindlichkeit

__________________________________________________________________________

NADH-­‐Konz. [mM]:

__________________________________________________________________________

NADH-­‐Konz. im Test [mM]:

__________________________________________________________________________

Reaktionsgeschw. V [U/ml]:

Bestimmumg der Reaktionsgeschwindigkeit (d.h. Volumenaktivität)

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Michaelis-Menten-Kinetik

Extinktionskoeffizient: 3.3 l/(mmol⋅cm)= 3.3 ml/(µmol⋅cm)

Schichtdicke d= 1 cm

A V =

∆E


∆t

V T ⋅ n

ε ⋅ d ⋅ V P

Achtung: Hier keine Verdünnung des Enzyms einberechnen, da für diesen Versuch die

Aktivität in der Küvette relevant ist!

Graphische Ermittlung von v max und K M :

1. v in U/ml gegen Substratkonzentration C S in µmol/l auftragen

2. Auftragung nach Lineweaver-­‐Burk: d.h. 1/v gegen 1/C S

K M = _________

v max = ___________

3. Ermittlung der katalytischen Konstante

v max in Küvette (in U/ml=µmol/ml*min)

K 2 = K cat = __________________________________________

Enzymkonzentration in Testküvette (µmol/ml)

Molekulargewicht der LDH = 130 000 g / mol

K cat

= _________

Achtung: Überlegt Euch, ob sich alle Werte auf das gleiche Volumen beziehen!

Die Auswertung findet im Praktikum statt. Die Michaelis-­‐Menten -­‐ und Lineweaver-­‐Burk –

Diagramme werden den Assistenten vorgelegt.

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Elektrophorese / CPY-Synthese

Biosynthese von CPY

Carboxypeptidase yscY (CPY) ist eine Exopeptidase, die in der Vakuole (entspricht dem

Lysosom) der Hefe Saccharomyces cerevisiae lokalisiert ist. Es handelt sich um eine

unspezifisch agierende Peptidase, welche ihre natürlichen Substrate, d.h. in die Vakuole

eingeschleuste Proteine, vom Carboxy-Terminus her durch Spaltung von Peptidbindungen

abbaut. Dabei spaltet sie bevorzugt hinter hydrophoben Aminosäuren.

So lässt sich ihre Aktivität mit Hilfe synthetischer Peptidsubstrate, in denen z.B. an ein

Phenylalanin oder ein Tyrosin carboxyterminal ein Chromophor gekoppelt ist, durch die

Freisetzung dieser gefärbten Komponente verfolgen. Für die Spaltung des Substrats ist u. a.

ein Serin-Rest im aktiven Zentrum des Enzyms erforderlich, die CPY wird deshalb zu den

Serin-Peptidasen gerechnet.

Die Carboxypeptidase yscY durchläuft nach ihrer Synthese einen Teil des sekretorischen

Weges der Zelle (Endoplasmatisches Retikulum; Golgi-Apparat) und wird von dort in die

Vakuole sortiert. Sie wird als ein höher-molekulares Vorläufermolekül (61 kDa) hergestellt,

das nach seiner Modifizierung mit 4 Kohlenhydratketten im ER ein Molekulargewicht von 67

kDa erreicht (p1-Form) und später durch weitere „outer-chain“-Mannosylierung im Golgi als

69 kDa (p2)-Form vorliegt. In der Vakuole erfolgt die proteolytische Reifung zur aktiven

Carboxypeptidase yscY mit einem Molekulargewicht von 61 kDa.

Die proteolytische Reifung des Enzyms wird durch zwei weitere vakuoläre Peptidasen,

Proteinase yscA und Proteinase yscB, katalysiert. Eine mutierte Form des Proteins, CPY*,

wird im ER als falsch gefaltet erkannt und durch retrograden Transport aus dem ER hinaus

dem Abbau durch das Proteasomen zugeführt. Für den Ablauf dieses Prozesses wird u. a. das

Der3 Protein benötigt.

In diesem Versuch sollen die verschiedenen Reifestadien der CPY mit Hilfe eines Immuno-

Blots visualisert werden. Dazu werden Proteinextrakte von mutierten Hefestämmen

verwendet.

YWO 342 (WT); YWO 1527 (prc1-1 Δder3 Δdoa10); YWO 664 (Δpep4); YWO 636

(Δprc1)

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Elektrophorese / TCA-Fällung

TCA Fällung/ Herstellung eines Proteinrohextrakts

Im folgenden Versuch soll ein Proteinextrakt von Hefezellen für die spätere Auftrennung in

einer SDS-Elektrophorese (PAGE) hergestellt werden.

Versuchsdurchführung

Ca. 1,5 ml einer über Nacht gewachsenen Hefekultur werden in 1,5 ml Reaktionsgefäßen

(Eppendorf Tubes) geerntet. Dazu wird die Flüssigkultur in das Tube überführt, 1min bei

4000 rpm in der Tischzentrifuge zentrifugiert und der Überstand anschließend verworfen.

Das Zellpellet wird nun in 300µl Kaliumphoshatpuffer (50mM K 2 PO 4 , pH 7,5) resuspendiert.

Anschließend werden der Suspension 100µl 50%ige TCA (Trichloressigsäure) zugegeben und

die Probe nochmals im Vortexer geschüttelt 1 .

Durch die Zugabe von TCA wird den Proteinen u.a. die Wasserhülle entzogen: dies führt zur

Denaturierung und Ausfällung der Proteine führt.

Die Proben werden nun > 30 min bei -80°C inkubiert.

Dieser Schritt wird benötigt um die Zellen aufzubrechen und die ausgefallenen Proteine

freizusetzen,

Nach der Inkubation werden die Proben bei 37°C im Thermoblock aufgetaut und die

ausgefallenen Proteine in der Tischzentrifuge präzipitiert (8 min, 13 000 rpm).

Der Überstand wird verworfen und das Pellet mit 500µl eiskaltem 80%igem Aceton

gewaschen. Bei diesem Schritt ist es besonders wichtig jede Probe gut zu vortexen, damit das

Pellet resuspendiert wird und ihm die verbliebene TCA und die Membranfette entzogen

werden.

Durch erneute Zentrifugation (8 min, 13 000 rpm) werden die ausgefallenen Proteine erneut

pelletiert. Der Überstand wird vollständig mit der Vakuumpumpe abgenommen (! Mit der

Spitze nicht zu nah an das Pellet kommen, da dieses sonst mit eingesaugt wird und die Probe

verloren geht!).

Das Pellet wird nun an der Luft getrocknet, bis kein Acetongeruch mehr vorhanden ist.

Bei unvollständigem Trocknen löst sich das Pellet nur schlecht oder gar nicht.

Das getrocknete Pellet wird in 80µl 1% SDS 0,1N NaOH aufgenommen. Nach 5 min

Inkubation bei Raumtemperatur wird das Pellet durch vortexen resuspendiert.

Der Lösung werden 20µl 5fach SDS-Probenpuffer zugesetzt und die Probe anschließend für

5min bei 95°C inkubiert. Nach einem Zentrifugationsschritt (1 min, 13 000 rpm) ist die Probe

für den Auftrag auf das SDS-Gel bereit. Alternativ kann sie bei -20°C gelagert werden. Vor

dem Auftrag muss sie dann nochmals gekocht und nicht gelöste Anteile durch Zentrifugation

abgetrennt werden.

1 Laborjargon: Vortexen

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Praktikumsskript Biochemie für Biologen-Bachelor SS2012

SDS-Elektrophorese

SDS-Elektrophorese

Neben der Gelfiltration wird die Polyacrylamid-Gel-Electrophorese (PAGE) in SDS

(Natriumdodecylsulfat) zur Molekulargewichtsbestimmung von Proteinen benutzt. Zur Trennung

von Proteinen im Polyacrylamidgel wird einerseits der Siebeffekt des Gels, zum anderen die

Ladung der Proteine ausgenutzt. Für die Molekulargewichtsbestimmung in der PAGE muss die

unterschiedliche individuelle Ladung (stammt von den geladenen Aminosäureseitenketten des

jeweiligen Proteins) der Proteine ausgeschaltet werden, damit die elektrophoretische Trennung

allein von der Größe des Moleküls abhängt. Dies wird durch Verwendung des Detergens SDS

erreicht. Durch Bindung von SDS werden Proteine:

1. denaturiert, d.h. von der nativen Struktur zu einer frei beweglichen Kette

entfaltet und

2. durch Anlagerung des hydrophoben Teils des SDS an hydrophobe Bereich der Proteine

wird dieses mit negativen Ladungen beladen, d.h. zu Polyanionen.

+SDS

natives Protein

SDS-beladenes entfaltetes Protein

SDS (Sodiumdodecylsulfate): Na + SO 4 - -CH 2 -(CH 2 ) 10 -CH 3

Da Proteine mit Disulfidbrücken in der SDS-PAGE häufig ein anormales Verhalten zeigen,

werden die Disulfidbrücken vor der Elektrophorese mit β-Mercaptoethanol reduziert. Die

Vorinkubation mit SDS und Mercaptoethanol schafft die Vorrausetzung für die Molekulargewichtbestimmung

im SDS-Gel, da jetzt die Beweglichkeit der Proteine nur eine Funktion der

Größe des Moleküls darstellt.

Für die Molekulargewichtsbestimmung wird die relative Beweglichkeit von Proteinen mit

bekanntem Molekulargewicht in Bezug auf einen internen Standard (meist Bromphenolblau)

verglichen und eine Eichkurve aufgestellt, indem der Logarithmus des Molekulargewichts gegen

den Rf-Wert (relative Beweglichkeit) aufgetragen wird. Aus dem Rf Wert des unbekannten

Proteins kann somit dessen Molekulargewicht ermittelt werden.

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Praktikumsskript Biochemie für Biologen-Bachelor SS2012

SDS-Elektrophorese

Das Trennmedium

Durch Polymerisation des monomeren Acrylsäureamids und eines quervernetzenden

bifunktionellen Reagenzes, meist Bis-Acrylsäureamid, wird ein dreidimensionales Netzwerk

aufgebaut.

Stryer, Biochemistry, Fifth Edition, 2002

Die Porengröße ist in einem weiten Bereich variabel: Die Polyacrylamidkonzentration kann in

einem Bereich zwischen 2% und 30% liegen. Bei zu geringer Konzentration zerfließen die Gele,

bei zu hoher Konzentration werden sie brüchig. Ein 7.5%iges Gel entspricht einem

Porendurchmesser von 5 nm, ein 30% iges Gel einem Porendurchmesser von 2nm. Um schärfere

Protein-Banden und damit eine bessere Auflösung zu erzielen, wird eine diskontinuierliche

Elektrophorese durchgeführt (SDS-DISC-PAGE). Dazu wird ein diskontinuierliches Gel,

bestehend aus einem kleinporigen Trenngel und einem großporigen Sammelgel, hergestellt.

Die Polymerisationsreaktion verläuft radikalisch und wird durch Zusetzen eines Radikalbildners

(Ammoniumpersulfat, TEMED) gestartet.

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Praktikumsskript Biochemie für Biologen-Bachelor SS2012

SDS-Elektrophorese

Versuchsdurchführung

[SDS-Page nach U. Laemmli (1970) Nature 227,680-685]

Lösungen:

30% Acrylamid (29,22% Acrylamid 4x, 0,78% Bisacrylamid 4x)

Vorsicht: monomeres Acrylamid ist stark toxisch !

Trenngelpuffer:

18.17 g Tris

(1.5 M Tris / 0.4 % SDS) mit 6N HCl auf pH 8.8 einstellen add 100 ml H 2 O

Sammelgelpuffer:

6.06 g Tris

(0.5 M Tris / 0.4 % SDS) mit 6N HCl auf pH 6.8 einstellen add 100 ml H 2 O

Elektrophoresepuffer:

12 g Tris

57.6 g Glycin add 1000 ml H 2 O

Elektrophoresepuffer für den Lauf: 125 ml Elektrophoresepuffer

5 ml 10 % SDS add 500 ml H 2 O

Probenpuffer:

Konz in der Probe

20 ml Glycerin 10 %

10 ml β-Mercaptoethanol 5 %

40 ml 10 % SDS 2 %

25 ml Sammelgelpuffer 0.0625 M add 100 ml H 2 O

Ammoniumpersulfatlösg. 100 mg add 1 ml H 2 O (genau wiegen !!)

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Praktikumsskript Biochemie für Biologen-Bachelor SS2012

SDS-Elektrophorese

Durchführung

1. Zwei unterschiedliche Glasplatten werden mittels Abstandhalter (Spacer) zusammengesetzt.

2. Die Trenngellösung wird entsprechend oben stehendem Rezept angerührt und zwischen die

Glasplatten gegossen (bis 2 cm unter den Rand) und bis zur Polymerisation mit Isopropanol

oder Wasser überschichtet (vermeidet die Ausbildung von Blasen sowie das Austrocknung

des Gels, dadurch wird eine möglichst ebene Grenzfläche zum Sammelgel erhalten).

3. Nach der Polymerisation wird die überstehende Flüssigkeit entfernt.

4. Danach wird das Sammelgel aufgetragen und ein Plastikkamm in die Sammelgelschicht

eingesetzt. Dadurch bilden sich Taschen zum Auftragen der Proteinproben.

5. Nach der Polymerisation wird vorsichtig der Kamm herausgezogen und das Gel mit der

kompletten Halterung inklusive Elektroden in eine Pufferkammer eingesetzt.

6. Beide Pufferkammern (innen und außen) werden mit Elektrophoresepuffer befüllt.

7. Proteinproben und Proteinstandard in Probentaschen auftragen:

• Proben vor dem Auftragen 3 min bei 90°C denaturieren, anschließend 1 min bei 13000rpm

zentrifugieren.

• 2 µl Proteinstandard in die erste Geltasche einfüllen, in die folgenden Taschen die

vorbereiteten Proben (10 µl) geben.

8. Elektrophorese durch Anlegen einer Spannung von 150 V starten (Polung beachten).

9. Die Elektrophorese ist beendet, wenn die Bromphenolblau-Bande das untere Ende des Gels

erreicht hat (ca. 70 min).

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Proteinstandard zur Bestimmung der molekularen Masse der Proteine:

Praktikumsskript Biochemie für Biologen-Bachelor SS2012

SDS-Elektrophorese

Gelzubereitung

(für 2 kleine Gele mit 10er Kämmen;

für 2 große Gele mit 15er Kämmen doppelte Menge ansetzen)

Trenngel

10%

H 2 O

4ml

30% Acrylamid 3,3ml

Trenngelpuffer 2,5ml

10% SDS 100µl

10% APS 50µl

TEMED 10µl

Sammelgel

5%

H 2 O

3ml

30% Acrylamid 850µl

Sammelgelpuffer 1,25ml

10% SDS 50µl

10% APS 25µl

TEMED 10µl

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Praktikumsskript Biochemie für Biologen-Bachelor SS2012

SDS-Elektrophorese

SDS-Gelelektrophorese

Gel nach Coomassie-Färbung

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SDS-Elektrophorese

Immunoblotting (Western-Blotting) und Immunodetektion

Theorie

Durch Western-Blotting können Antigene spezifisch durch poly- und monoklonale Antikörper

erkannt und damit sichtbar gemacht werden. Proteinproben werden beim SDS-PAGE mit Hilfe

von Detergenzien wie Sodiumdodecylsulfat (SDS) und reduzierenden Reagenzien wie

Dithiothreitol (DTT) oder 2-Mercaptoethanol (b-ME) solubilisiert und denaturiert. Anschließend

werden die Proteine durch SDS-PAGE Gelelektrophorese aufgetrennt und mit Hilfe einer Wet

tank Blotting Apparatur auf eine Nitrozellulose, PVDF oder Nylonmembran transferiert. Die auf

der Membran gebundenen Proteine können dann bei Verwendung einer Nitrozellulosemembran

durch reversible Anfärbung mit Ponceau S-Lösung sichtbar gemacht werden.

Die auf der Membranoberfläche fixierten Proteine können jetzt mit Antikörpern detektiert werden.

Aufbau des Blot-"Sandwichs" und Transfer der Proteine auf Nitrozellulose

Im Anschluss an die Elektrophorese werden die aufgetrennten Proteine aus dem Gel auf

Nitrozellulose-Membran überführt. Dazu werden pro Gel 2 Blatt Filterpapier und 1 Blatt

Nitrozellulose-Membran in Blotting-Puffer getränkt. Achtung, die Nitrozellulose darf nur mit

Handschuhen angefasst werden. Vorher die Membran auf einer Seite mit der Gruppennummer

beschriften !!

Blotting-Puffer:

20 mM Tris

150 mM Glycin

20 % MeOH

Dann wird ein "Sandwich" aufgebaut (Handschuhe tragen):

Kathode

2 Lagen Filterpapier (Whatman-Papier)

Gel

Nitrozellulose Membran

2 Lagen Filterpapier (Whatman-Papier)

Anode

Luft- und Pufferblasen beim Auflegen der Filter vermeiden!

Es wird 30 min bei einer Stromstärke von 360 mA geblottet. Anschließend wird das Gel zur

Kontrolle, ob noch Proteine darin enthalten sind, 10 min lang in Coomassie-Brillant-Blue-Lösung

gebadet und über Nacht in Entfärbungslösung (45 % Methanol, 7,5 % Essigsäure in H2O)

geschüttelt.

Die Nitrozellulose Membran wird in Ponceau S Färbelösung 1-2 min geschüttelt, dann wird die

Membran mit H 2 O gewaschen. Die Proteine sollten sichtbar werden. (Die Membran kann

zwischen Whatman Papier trocken gelagert werden.)

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Praktikumsskript Biochemie für Biologen-Bachelor SS2012

SDS-Elektrophorese

Immunodetektion von CPY mit einem spezifischen Antikörper

Die Nitrozellulose wird zur Abdeckung unspezifischer Bindestellen 1 h lang (oder über Nacht) in

Blocking-Lösung gebadet.

Blocking-Lösung: 5 % Milchpulver in TBS-T

TBS-T: 20 mM Tris/HCl, pH 7,5

137 mM NaCl

0,1 % Tween-20

Anschließend wird die Blocking-Lösung verworfen, die Membran 3 mal 10 Minuten mit 15 ml

TBS-T gewaschen und der anti-CPY Antikörper (monoklonal, aus Maus) 1:10.000 verdünnt in

TBS-T zugegeben. Nach 1-stündiger Inkubation wird 3 mal 10 Minuten mit 15 ml TBS-T

gewaschen. Dann erfolgt die Zugabe von in TBS-T verdünntem Peroxidase-markiertem anti-

Maus Antikörper, (1:10000). Erneut wird 1 Stunde inkubiert und gewaschen wie zuvor. Die

Entwicklung erfolgt mit dem ECL-Detektionskit (Prinzip: Chemolumineszenz, Details siehe Abb.

ECL) auf einem lichtempfindlichen Film (mit Hilfe der Assistenten im Institut für Biochemie,

Dunkelkammer)

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SDS-Elektrophorese

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DNA-Restriktionsanalyse & Elektrophorese

Schneiden von DNA mit Restriktionsenzym Pvu I/Gelelektrophorese

Zwei Eppendorf-Reaktionsgefässe vorbereiten:

14 µl Wasser

2 µl 10x Restriktionspuffer

2 µl DNA (jede Gruppe erhält eine andere DNA-Probe)

beide Ansätze kurz mischen, abzentrifugieren

Ansätze entsprechend beschriften:

ein Ansatz erhält 2 µl Pvu I – Enzym-Lösung (wird ausgegeben)

ein Ansatz erhält 2 µl Wasser, dient als Negativkontrolle

beide Ansätze 1 h bei 37°C inkubieren

in dieser Zeit müssen die Agarose-Gele gegossen werden

3 Gruppen giessen 1 Gel:

0,4 g Agarose in 50 ml 1x TAE-Puffer aufkochen

in der Mikrowelle, Assistenten VORHER fragen

zur klaren Lösung 5 µl Ethidiumbromid (Handschuhe!) zugeben, mischen

Gel giessen

nach Ablauf der Inkubationszeit (1h, 37°C):

zu beiden Ansätzen 2 µl der 10x dye-Lösung zugeben

beide Proben auf das Gel auftragen,

auf jedes Gel auch einen Längenstandard (10 µl) auftragen

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