Zentralbereich Geschäftsleitung

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Zentralbereich Geschäftsleitung

Institut für

Medizinische Genetik

und Angewandte

Genomik

Diagnostisches Next-Generation-Sequencing Panel

XLMR Sequenzierung bei mentaler Retardierung

Hintergrundinformation und Methodenbeschreibung

Version 4; Stand 28.06.2013; freigegeben von Peter Bauer

Prof. Dr. med. Olaf Riess (Direktor)

Kontaktinformationen

Klinische Fragestellungen, Einschlusskriterien

Dr. med. Andreas Tzschach

Tel: 07071 29 72288

Fax: 07071 29 5171

Email: andreas.tzschach@med.uni-tuebingen.de

Laborleitung

Prof. Dr. med. Peter Bauer

Tel: 07071 29 77692

Fax: 07071 29 5172

Email: peter.bauer@med.uni-tuebingen.de

Calwerstrasse 7

DE 72076 Tübingen

Prof. Dr. med. Peter Bauer

Leiter Molekulargenetik

Tel. 07071/29-77692

Fax 07071/29-5172

peter.bauer@med.uni-tuebingen.de

Kurzbeschreibung

Bei Patienten mit Verdacht auf X-chromosomale mentale Retardierung (XLMR)

werden 107 bekannte XLMR-Gene durch spezifische Anreicherung (Agilent X-Seq

SureSelect) und Next-Generation-Sequencing (Illumina GAIIx 2x 76 bp paired-end)

analysiert.

Einschlusskritierien / mitgeforderte Unterlagen

• Analysen dürfen nur durch Fachärzte für Humangenetik veranlasst werden

• Als Voruntersuchungen sind erforderlich:

o Klinisch-genetische Begutachtung (Ausschluss einer syndromalen

Erkrankung)

o Hochauflösende Chromosomenuntersuchung (SNP-Array oder Array-

CGH)

o Ausschluss Fragiles-X-Syndrom

• DNA (Blut) Proben des Patienten und der Mutter (mindestens 20 µg DNA bzw. 5

ml EDTA-Blut)

• Relevante klinische Angaben (z.B. Kopie des genet. bzw. pädiatrischen

Gutachtens)

• Fotografien des Indexpatienten

• GenDG konformes schriftliches Einverständnis

• Kostenübernahmeerklärung der Krankenkasse (ein Begründungsschreiben stellen

wir gerne zur Verfügung)

Analysedauer / Technischer Ablauf / Datenspeicherung / Resultate

Analysedauer: Sobald die Analyse im Labor begonnen werden kann (der Auftrag

vollständig vorliegt) benötigen wir etwa 8 Wochen für die Sequenzierung, 4 Wochen

für die Datenanalyse und ggfs. weitere 4-8 Wochen für Validierungssequenzierungen.

Insgesamt dauert die Analyse also 12-20 Wochen.

Universitätsklinikum Tübingen

Anstalt des öffentlichen Rechts

Sitz Tübingen

Geissweg 3 • 72076 Tübingen

Tel. 07071/29-0

www.medizin.uni-tuebingen.de

Steuer-Nr. 86156/09402

USt.-ID: DE 146 889 674

Aufsichtsrat

Hartmut Schrade (Vorsitzender)

Vorstand

Prof. Dr. Michael Bamberg (Vorsitzender)

Gabriele Sonntag (Stellv. Vorsitzende)

Prof. Dr. Karl Ulrich Bartz-Schmidt

Prof. Dr. Ingo B. Autenrieth

Jana Luntz

Baden-Württembergische Bank Stuttgart

BLZ 600 501 01 Konto-Nr. 7477 5037 93

IBAN: DE41 6005 0101 7477 5037 93

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BLZ 641 500 20 Konto-Nr. 14 144

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Institut für

Medizinische Genetik &

Angewandte Genomik

Technischer Ablauf: Die Sequenzierung umfasst die (1) Fragmentierung der DNA (Covaris) auf 200-500 bp Bibliotheken, (2)

die Ligation von Sequenzieradapter, die auch Molekulare Barcodes (MIDs) enthalten, (3) das Anreichern von X-

chromosomalen Exonen mittels Agilent SureSelect in-solution Technologie, (4) Qualitätskontrolle und Quantifizierung der X-

ome Bibliothek, (5) paired-end Sequenzierung der DNA-Bibliothek durch Illumina GAIIx Technologie (mindestens 2x 76 bp).

Die bioinformatische Analyse der Sequenzierdaten geschieht durch folgende Schritte:

• Mapping der Reads auf das hg19 Referenzgenom (Stampy)

• Detektion von Varianten: SNPs, SNVs, kleine Deletionen und Insertionen (SAMtools)

• Annotation der Varianten mit Daten aus den Datenbanken dbSNP und 1000 Genomes (Annovar).

• Extraktion aller Varianten, die in CCDS-Regionen der XLMR-Genliste liegen.

Neben der Suche nach kleinen intra-exonischen Deletionen wird mittels einer statistischen Analyse nach Deletionen von

kompletten Exons gesucht. Diese Analyse erfasst keine Duplikationen und ist auch bei Frauen nicht verlässlich anwendbar.

Resultate: Mit Abschluss der Analysen wird ein schriftlicher Befund erstellt.

Pathogene Mutationen sowie unklassifizierte Varianten in den benannten 102 Genen werden tabellarisch mitgeteilt und

hinsichtlich ihrer möglichen Pathogenität gewertet. Ebenso werden nicht-ausreichend analysierte Teilbereiche

(„Analyselücken“) exakt benannt. Alle plausibel pathogen gewerteten Varianten werden durch konventionelle

Sequenzierung bestätigt. In einigen Fällen wird es für die Beurteilung der Krankheitsrelevanz von Varianten notwendig sein,

molekulargenetische Tests auch bei Angehörigen durchzuführen (Ko-Segregations-Analysen).

Limitationen:

• Die NGS-Diagnostik ist nicht in der Lage, Repeat-Expansions-Mutationen (FMR1, AR, ARX) abzubilden.

• Potentielle Splice-Site Mutationen werden nur innerhalb der hochkonservierten Konsensus-Bereiche (+/- 5 Basen vom

Exon-Intron-Übergang) analysiert.

• Das publizierte XLMR-Gen ABCD1 kann wegen homologer Geninformationen nicht spezifisch sequenziert werden und

wurde deshalb von der Panel-Liste genommen.

• Bei Männern sind regelmäßig 2-4% aller kodierenden Basen mit weniger als 10 unabhängigen Sequenzierungen (Reads)

abgedeckt. Diese Regionen werden im Befund detailliert. Krankheitsverursachende Mutationen in diesen Regionen

können technisch nicht sicher gefunden werden. Insbesondere das ARX- und IKBKG-Gen (sehr GC-reich) können kaum

beurteilt werden. Für acht Gene (IKBKG, IQSEC2, ARX, MBTPS2, PCDH9, SLC16A9, SOX3 und ZNF81) können weniger als

80% des Leserahmens vollständig ausgewertet werden. Sie 2% der fehlenden Abdeckung aus und sollten bei gezieltem

Verdacht konventionell komplettiert werden.

• Das DMD-Gen wird nur in die Auswertung aufgenommen, wenn das Einverständnis die Möglichkeit einschließt, zufällig

Exon-Deletionen zu finden, die nicht zu einer mentalen Retardierung wohl aber zu einer Muskelerkrankung führen

können.

Genliste (107 publizierte XLMR Gene)

ACSL4, AFF2, AGTR2, AIFM1, AP1S2, ARHGEF6, ARHGEF9, ARX * , ATP6AP2, ATP7A, ATRX, BCOR, BRWD3, CASK, CDKL5, CLCN4,

CUL4B, DCX, DKC1, DLG3, DMD * , EIF2S3, FANCB, FGD1, FLNA, FMR1, FTSJ1, GDI1, GK, GPC3, GRIA3, HCCS, HCFC1, HDAC8,

HPRT1, HSD17B10, HUWE1, IDS, IGBP1, IKBKG * , IL1RAPL1, IQSEC2 * , KDM6A, KDM5C, KIAA2022, KLF8, L1CAM, LAMP2, LAS1L,

MAGT1, MAOA, MBTPS2, MECP2, MED12, MID1, MTM1, NAA10, NDP, NDUFA1, NHS * , NLGN3, NLGN4X, NSDHL, NXF5, OCRL, OFD1,

OPHN1, OTC, PAK3, PCDH19, PDHA1, PGK1, PHF6, PHF8, PLP1, PORCN, PQBP1, PRPS1, PTCHD1, RAB39B, RAB40AL, RBM10,

RPL10, RPS6KA3, SHROOM4, SLC6A8, SLC9A6, SLC16A2, SMC1A, SMS, SOX3, SRPX2, SYP, SYN1, THOC2, TIMM8A, TSPAN7,

UBE2A, UPF3B, WDR45, ZDHHC15, ZDHHC9, ZMYM3, ZNF41, ZNF674, ZNF711, ZNF81

* Siehe „Limitationen“

Referenzen

Lubs et al. (2012) Am J Hum Genet; 90: 579-590; Tarpey et al. (2009) Nat Genet; 41: 535-543. Rinaldi et al. (2012) Am J Hum Genet;

91:1095-1102.Haak et al (2012) Am J Hum Genet: 91: 1144-1149.

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