Stationäre Phasen - Unics.uni-hannover.de - Leibniz Universität ...

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Stationäre Phasen - Unics.uni-hannover.de - Leibniz Universität ...

High Performance Liquid

Chromatography

HPLC

Skript zur Vorlesung „Grundlagen der Analytik“

im MSc-Studiengang „Analytik“

Prof. C. Vogt, Leibniz Universität Hannover 3.2.2007


Gliederung

Kurzportrait der Methode

Stationäre Phasen

Mobile Phasen

Retentionsmechanismen

Normalphasen-Chromatographie (NP)

Umkehrphasen-Chromatographie (RP)

Geräteaufbau

Vorbereitung des Eluenten

Pumpen

Injektor

Säule

Detektoren


HPLC heute

Moderne Flüssigchromatographie ist gekennzeichnet durch

kurze Säulen, 2 - 5 mm ID,

Stationäre Phase mit sehr kleinem Teilchendurchmesser (3 - 10µm)

große Auswahl an stationären Phasen

relativ hohe Eingangsdrücke (bis 400 bar)

reproduzierbare Injektion geringer Probemengen

geeignete Durchfluss-Detektoren mit sehr kleinen Detektorzellvolumina

hoher Automatisierungsgrad

hohe Auflösung

Moleküle der mobilen Phase können sowohl mit der stationären Phase,

als auch mit den Probemolekülen in Wechselwirkung treten – nicht inert !,

kann als variable Einflussgröße für den Trennprozess genutzt werden

Partikelgröße 5-10 µm

Innendurchmesser 1-5 mm

Länge

5-25 cm


Vergleich HPLC - GC

Probenmoleküle haben in Flüssigkeiten kleinere Diffusionskoeffizienten

als in Gasen (Nachteil, weil Austausch der Probenmoleküle zwischen

mobiler und stationärer Phase in LC viel langsamer erfolgt)

Viskosität von Flüssigkeiten ist größer als die von Gasen (Nachteil –

nur kleinere Fließgeschwindigkeiten möglich).

Flüssigkeiten lassen sich im Gegensatz zu Gasen praktisch nicht

komprimieren (Vorteil – Kontrollparameter entfällt)

Signale der Analyten sind in LC breiter → Trennstufenzahlen und

Auflösung sind geringer (Ursachen siehe van Deemter Gleichung)


Stationäre Phasen

Sehr feines Silikagel oder anderes Trägermaterial mit möglichst einheitlicher

Korngröße entweder direkt als adsorbierende stationäre Phase (Adsorbtionschromatographie)

oder als Trägermaterial (Verteilungschromatographie)

Bei Verwendung als Trägermaterial wird durch chemische Reaktionen die

Oberfläche des Silikagels modifiziert → Hydroxy-Gruppen werden durch

Alkyl-, Phenyl-, Amino-, Cyano-Gruppen u.s.w. ersetzt

→ dadurch gezielte Einstellung chromatographischer Eigenschaften möglich

Höhere Trennstufenzahl erreichbar

durch kleinere Teilchen der

stationären Phase

Kleinere Teilchen lassen mehr

Austauschschritte zwischen

stationärer und mobiler Phase zu

Säulen mit kleinerem Durchmesser benötigen bei gleicher Fließgeschwindigkeit

der mobilen Phase weniger Lösungsmittel → Mikro-HPLC


Stationäre Phasen

Irregulär geformte

Silica-Partikel

SiO 2

(Kieselgel, Kieselgur)

Al 2

O 3

ZrO 2

TiO 2

Polymere

Graphitierter Kohlenstoff

Magnesiumsilikat (Florisil)

spherische

Silica-Partikel

Organischer Polymermonolith UNO S

Organischer Polymermonolith CIM Disk

Monolith auf Silica-Basis (Chromolith)


Stationäre Phasen

Einteilung nach Polarität der stationären Phase

A stationäre Phase ist polarer als die mobile Phase

→ Normalphase NP (normal-phase), -OH, -NH 2

B stationäre Phase ist unpolarer als die mobile Phase

→ Umkehrphase RP (reversed-phase), C8, C18, Phenyl

Polare stationäre Phase

OH

OH

Unpolare stationäre Phase

CH 3

CH 3

70 - 80% aller flüssigkeitschromatographischen

Trennungen werden heute

in "reversed-phase" Technik ausgeführt

OH

OH

OH

OH

OH

OH

Unpolarer

Eluent

CH 3

CH 3

CH 3

CH 3

CH 3

CH 3

Polarer

Eluent

OH

CH 3

OH

OH

Normal-Phasen-

Chromatographie

CH 3

CH 3

Umkehr-Phasen-

Chromatographie


Stationäre Phasen – Bonded phase

Schirmen polare Silica-OF vom Analytmolekül

ab

C1

Starke polare WW an der Silica-OF

werden durch schwache Dispersionskräfte

ersetzt

C18, C8, C5, C1, Phenyl, CN, NH 2

C-18

PFP

ca. 21 Å Länge

all-trans-Konformation

Molekülvolumen ca.

700 Å 3

max. Bindungsdichte

2.5 Ketten/nm 2

Oder 4.1 µmol/m 2 auf

flacher OF

C8

Oxy-Phenyl


Stationäre Phasen – end-capping

nicht umgesetzte

Silanolgruppen

mit TMS umgesetzte

Silanolgruppen

Sekundäre Umsetzung der verbliebenen Silanolgruppen (end-capping)

mit Trimethylchlorosilan


Stationäre Phasen – Schichtdicke

Anordnung der gebundenen Phase auf der

Silica-Oberfläche

Realfall

Theoretisches Maximum

Experimentell ermittelt

Dicke [Å]

Anzahl Kohlenstoffatome in Kette

Idealfall


Stationäre Phasen

Trennung hängt von Menge und Typ der Adsorptionsplätze bzw.

WW-Plätze an der Oberfläche der stationären Phase ab

→ große Oberfläche wichtig

Parameter des Phasenmaterials, die Retention entscheidend beeinflussen

Partikelgröße → 3 – 10 µm

Partikelgrößenverteilung → so gering wie möglich, meist ≤ d ± 10%

Porendurchmesser → 70 – 300 Å

Oberfläche → 50 – 250 m 2 /g

Dichte der gebundenen Phase (Anzahl Adsorptionsplätze je

Einheitsfläche) → 1 – 5 Plätze je nm 2


Retentionsmechanismen

NP-Phasen → polare Dipol-Dipol-WW und sterische Effekte dominieren

sterischer Anspruch eines Analyten und seine Fähigkeit, mit den Hydroxylfunktionen

des Kieselgels oder des Al 2

O 3

Wasserstoffbrückenbindungen einzugehen,

sind zusätzlich entscheidend für das Maß der Adsorption auf der stationären Phase

Zwei Modelle für Mechanismus

Competition-Modell → gesamte Oberfläche der stationären Phase ist mit

einer Monoschicht aus Solvensmolekülen belegt → Retention der Analyten

erfolgt durch kompetitive Verdrängung der LM-Moleküle von der Adsorbensoberfläche

Solvent-Interaction-Modell → Bildung einer primären und einer sekundären

Schicht aus Eluensmolekülen → ZSS dieser Doppelschicht hängt vom Anteil

der polaren Komponente in der mobilen Phase ab → Retentionsvorgang

erfolgt durch Wechselwirkung der Analyten (Assoziation oder Verdrängung)

mit der zweiten Schicht der Solvensmoleküle → Substanzmoleküle haben

somit keinen Kontakt mit der Oberfläche der stationären Phase


Retentionsmechanismen

RP-Phasen

Trennmechanismus nicht allein durch einfache polare WW beschreibbar, da

Kräfte, die zwischen den Analytmolekülen und der unpolaren stationären Phase

auftreten nicht ausreichen, um das Maß der Retention auf RP-Materialien zu

erklären → Kombination aus Adsorption und Verteilung

Zwei Modelle für Mechanismus

Solvophobe Theorie → unpolare stationäre Phase verhält sich wie Feststoff →

Retention der Analyten aufgrund Adsorption über solvophobe Effekte an der OF

der Umkehrphase → Adsorption steigt mit zunehmender OF-Spannung des

Eluenten → hierdurch vermindern die Moleküle ihre Kontaktfläche mit der mobilen

Phase → Retention erfolgt deshalb primär aufgrund solvophober WW mit der

mobilen Phase und nicht aufgrund polarer WW mit der stationären Phase

Verteilungsmodell → chemisch modifizierte OF des Trägermaterials ähnelt

flüssiger stationärer Phase, in der Analyte vollständig von den an die Hydroxylgruppen

gebundenen Alkylketten umgeben sind → keine Isotropie - durch

Anbindung an die Kieselgeloberfläche ist eindeutige Vorzugsrichtung gegeben

mit zunehmender Alkylkettenlänge des RP-Materials steigt Verteilungscharakter

der Trennung, mit abnehmender Kettenlänge dominiert ein Adsorptionsmechanismus


Eigenschaften der mobilen Phase

Detektor-Kompatibilität (z.B. UV-Transparenz für UV-Detektor oder

elektrochemische Inertheit für Amperometrischen Detektor)

Siedepunkt

Siedepunkte < 100°C, damit leichter durch Destillation reinigbar

Siedepunkte < 40°C ungünstig, da beim Ansaugen durch die

Pumpe Verdampfen auftreten kann (Gasblasenbildung).

Mischbarkeit

Einphasiges System muss sich bilden

Polare und unpolare Lösungsmittel lassen sich gar nicht, oder nur

in bestimmten Verhältnissen mischen (Bsp. Methanol und Hexan)

Polarität

Löslichkeit der Probenbestandteile

Reinheit, Viskosität, Preis, …


Mobile Phase

LM MW Siedepunkt

Brechungsindex

RI

UV Viskosität µ

[°C] [nm] [cP] [Debye]

Acetonitril 41 82 1.341 195 0.358 3.37

Dioxan 88 101 1.421 215 1.26 0.45

Ethanol 46 78 1.359 205 1.19 1.68

Methanol 32 65 1.326 205 0.584 1.66

Isopropanol 60 82 1.375 205 2.39 1.68

Tetrahydrofuran 72 66 1.404 215 2.20 1.70

Wasser 18 100 1.333 185 1.00 1.84

NP-Chromatographie → nicht-polare mobile Phasen

RP-Chromatographie → polare Eluenten (Gemische aus Wasser und polaren

organischen LM)


Mobile Phase


Normalphasen-Chromatographie

Stationäre Phasen

poröse anorganische Adsorbenzien, wie Kieselgel SiO 2

oder Al 2

O 3

mit polaren Hydroxylgruppen an der Oberfläche

Mobile Phasen

Pentan, Hexan, Tetrahydrofuren, Dichlormethan, Methanol, Acetonitril

Elutrope Reihe → Lösungsmittel werden nach steigender Elutionskraft geordnet

Je größer die Elutionskraft ist desto kleiner wird der Verteilungskoeffizient und

desto schneller wandern die Analyten durch das chromatographische Bett

Reihe jeweils abhängig von Polarität der stationären Phase

Pentan/Hexan < Cyclohexan < Toluen < Trichlormethan < Dichlormethan

< Tetrahydrofuran < Dioxan < Acetonitril < Ethanol < Methanol


Umkehrphasen-Chromatographie

Stationäre Phasen

poröse anorganische Adsorbenzien auf Kieselgelbasis SiO 2

mit chemisch

modifizierten Hydroxylgruppen → Alkylketten unterschiedlicher Länge

Mobile Phasen

Wasser, Methanol, Acetonitril, Tetrahydrofuran

elutrope Reihe und Elutionsreihenfolge der getrennten Verbindungsklassen

zeigen bei Umkehrphasen inversen Verlauf verglichen mit NP-Chromatographie

Methode zur Trennung neutraler Verbindungen, die sich in Wasser oder anderen

polaren LM (z.B.Acetonitril oder Methanol) lösen

Pharmazeutische Industrie

Steroide, Vitamine, Beta-Blocker und viele andere Wirkstoffe

Umweltanalytik

Pestiziden

Biochemie

Biopolymere, wie Proteine, Peptide, Nukleinsäuren oder Oligosaccharide


Elutionstechniken

Isokratische Elution

eine Verbindung oder konstante Mischung mehrerer Verbindungen als

mobile Phase genutzt

Gradienten Elution

zwei Elutionsmittel werden stufenlos gemischt

Anwendung, wenn Verbindungen der Probe große Unterschiede in der

Polarität aufweisen

Änderung der Elutionskraft der mobilen Phase während der Laufzeit des

Chromatogramms → schärfere peaks und kürzere Laufzeiten v.a. bei komplexen

Gemischen von stark unterschiedlich polaren Substanzen

Elutionskraft der mobilen Phase wird so gesteigert, dass die Konzentration der

stärkeren Eluentien während der chromatographischen Trennung erhöht wird

Gradientenerzeugung

hochdruckseitig (nach Pumpe) oder niederdruckseitig (vor Pumpe)


Aufbau einer HPLC

Entgaste, filtrierte mobile Phase

Förderung durch Pumpen

Pulsationsdämpfung

Mischung der Eluentkomponenten

Injektion der Probe

(in mit mobiler Phase mischbarem LM)

Reinigung auf Vorsäule

Trennung auf chromatographischer Säule

(eventuell themostatierbar)

Detektion

Derivatisierung

Fraktionssammlung

Datenverarbeitung


Vorbereitung des Eluenten

Filtrieren zum Entfernen feinster Partikel → verbleiben auf stationärer Phase

und ändern deren Eigenschaften mit der Zeit

Ausgasen gelöster Gase (N 2

, O 2

) im Bereich der Pumpe oder der Mischkammer

bei Kompression möglich → Flussschwankungen → Verschlechterung der

Reproduzierbarkeit

Ausgasen gelöster Gase (N 2

, O 2

) im Bereich des Detektors beim Entspannen

→ Gasblasen in Detektorzelle → unruhige Grundlinien oder Spikes

Bei Einsatz eines Fluoreszenzsdetektors kann Sauerstoff als Quencher wirken

→ Unkontrollierte Verringerung des Analytsignals

Entgasungstechniken

Ultraschall

Vakuum-Entgasung

Helium-Entgasung

off-line

on-line

on-line


Pumpen für die Förderung des Eluenten

Anforderungen

große Flusskonstanz

großer Bereich an Flussraten

schneller Eluentwechsel

beständig gegenüber mobiler Phase

wartungsfreundlich

Schädigungen durch

hohe Chloridkonzentrationen

stark komplexierende Puffer-

Substanzen

Chlorierte KW + UV → HCl

starke Alkalien

Hohe Salzfrachten


Pumpen für die Förderung des Eluenten

Pumpenköpfe → korrosionsbeständige Edelstähle

Kolben → Saphir

Ein- und Auslassventile → Rubin- oder Saphirkugeln

Korrosionsbeständig(er) → Polyetheretherketon PEEK, Teflon

oder Titan

direkt nach Benutzung (vor Abschalten) gründlich mit inertem

Lösungsmittel spülen !

In Praxis Einsatz von Doppelkolbenpumpe → nockenwellengesteuerte

Pumpenköpfe pumpen zeitversetzt, dadurch nahezu vollkommene

Pulsationsdämpfung und sehr konstante Fließgeschwindigkeit

Maximaldruck 400 bar

Fließgeschwindigkeiten 0.1 – 10 mL/min


Einfluss der Fließrate

0.3 mL/min 1.2 mL/min 3.6 mL/min

Trennung von Phenylthiohydanthoin-Derivaten der Aminosäuren

Asn, Asp, Glu, Ala, His, Pro, Ile und Phe

Säule: 3.2 mm x 25 cm, Stationäre Phase: LiChrosorb SI 60, 5 µm

Mobile Phase: tert. Butylmethylether, Detektion: UV 254 nm


Injektionssysteme

Überführung der Probe aus Probenschleife mit definiertem Volumen in den

Eluentfluss

Schleifenvolumen 10 – 100 µL, Beladung erfolgt druckfrei mittels Spritze

Programmierbare Probenaufgabe über Autosampler (zusätzliche Arbeitsschritte

möglich, wie Verdünnung, Derivatisierung, Mischen), oft variable Probenvolumina


Trennsäule

Druck- und korrosionsbeständiger Chrom-Nickel-Molybdän-Stahl

L = 125 – 300 mm

iD = 2 – 5 mm für analytische Trennungen

iD = 10 – 25 mm für semipräparative Trennungen

Trockenpack- oder Druckfiltrationsmethode (engl. dry-fill procedure, wet-fill

procedure oder slurry-packing procedure)

kleine Teilchen haben großen Oberflächenenergie-Masse-Verhältnisse

→ neigen zur Zusammenballung → nur mit Lm wird kompaktes

chromatographisches Bett in der Säule erhalten


Detektionssysteme

Universelle und selektive Detektoren

Detektoren, die die Änderung einer physikalischen Größe der gesamten

mobilen Phase mit Analyt messen (Brechungsindex) oder die selektiv nur

die Eigenschaften der gelösten Stoffe messen

Wichtigste Kriterien zur Beurteilung eines Detektors

Nachweisgrenze, Linearer Messbereich, Selektivität, Empfindlichkeit,

Robustheit, Preis

Wichtig in der HPLC

Volumen der Messzelle muss so klein als irgend möglich gehalten werden,

damit keine Rückvermischung schon getrennter Substanzen erfolgen kann

(Peakverbreiterung)

Wichtigste Detektionssysteme für HPLC

UV/Vis, Fluoreszenz, RI, MS, EC (Leitfähigkeit), Lichtstreuung


Detektionssysteme

Detektor NWG (ng) (mol/L)

UV-Absorption 0.1 – 1 10 -6 –10 -7

Brechungsindex 100 – 1000 10 -4 –10 -5

Elektrochemie 0.01 – 1 10 -6 –10 -9

Fluoreszenz 0.001 - 0.01 10 -6 - 10 -8

Leitfähigkeit 0.5 – 1 10 -5 –10 -9

Massenspektrometrie 0.1 – 1 10 -6 –10 -8


UV-Vis-Detektor

am häufigsten eingesetzt

breites Einsatzgebiet, da die meisten organischen Verbindungen UV-Licht

absorbieren

Detektor außerdem relativ unempfindlich gegen Flussund

Temperaturschwankungen

Flächen abh. von Konzentration und

Extinktionskoeffizienten

Quecksilber- oder Deuteriumlampen

als Strahlungsquellen

Quecksilberdampflampe erzeugt

Linienspektrum - 254 nm

Deuteriumlampe erzeugt kontinuierliches

Spektrum zwischen 190 und 380 nm

Im UV-Detektor durchstrahlt die Strahlungsquelle

eine Quarzzelle, die vom Eluenten

permanent durchströmt wird → dabei wird

die Änderung der Absorption von einer

Photozelle gemessen und aufgezeichnet

Festwellenlängendetektor


UV-Vis-Detektor

Detektorzelle

1 Deuterium-Lampe

2 Spiegel

3 Probenzelle

4 Gitter

5 Diodenarray

6 Verstärker

Absorption wird mit Reihe von Photodioden, von denen jede bei einer anderen

Wellenlänge misst, in größerem Bereich gemessen (Spektrum)

Polychromatisches Licht von der UV-Strahlenquelle durch Messzelle → einzelne

Wellenlängen werden unterschiedlich absorbiert → Licht in Polychromator →

spektrale Zerlegung

Informationen zur Peakreinheit, Identifizierung von Substanzen, Spektren-

Subtraktion, Spektrenbibliotheken


Fluoreszenz-Detektor

1 Xenon-Lampe oder Laser

2 Monochromator (Filter oder

Gitter)

3 Fließzelle

hohe Selektivität und ausgezeichnete Nachweisempfindlichkeit

Anwendung aber beschränkt auf fluoreszierende Verbindungen

(Alternative → Derivatisierung)

UV-Strahlungsquelle → Filter oder Monochromatoren → eine Wellenlänge als

Anregungswellenlänge auswählen

Energieabgabe im Bereich längerer Wellenlängen als Licht

Photomultiplier rechtwinklig zur Strahlenquelle angeordnet → nur durch

Fluoreszenz ausgestrahltes Licht erreicht den Photomultiplier

Intensität abhängig von Konzentration, Extinktionskoeffizient und Quantenausbeute

des Fluorophors


Fluoreszenzdetektion

Beispiel: Trennung von (+)-FLEC-D/L-Carnitin-Diastereomeren

RP 18/Ultraspere ODS

240 mm x 4.6 mm

20 µL Injektionsvolumen

Fluoreszenzdetektion

λ ex

260 nm / λ em

310 nm

Eluent: 50 mM Triethanol-

Aminophosphat / ACN

pH 2.60

A 71.5 : 28.5

B 75.0 : 25.0


Brechungsindex-Detektor

Brechungsindex (RI)-Detektor

Deflektionstyp

Detektor

Deflektion eines Lichtstrahls ändert

sich, wenn sich ZSS der Probe in

Messzelle relativ zu der in der Vergleichszelle

ändert

Reflektionstyp

Vorteile

robust, wenig anfällig gegen Ver-

Schmutzungen, Messung über voll-

Ständigen RI-Bereich

Nachteil

relativ geringe Empfindlichkeit

Fresnel-Prinzip – Lichtstrahl wird

Von Flüssigkeits-Glas-Interface in die

Messzelle hinein reflektiert

Vorteile – sehr empfindlich, geeignet

für Miniaturisierung, preiswert

Nachteil – extrem empfindlich

Gegenüber ∆p und ∆T


Gliederung

Beispiel: Trennung physiologisch relevanter γ-Betaine

ohne Derivatisierung

Säule: LiChrosper 100 NH 2

250 mm x 4 mm, 5µm Partikel

Eluent: 50 mM NaH 2

PO 4

,

0.5 mL/min

25°C, 20 µL Injektionsvolumen

A RI-Detektion von je 1 µg

Substanz je Komponente

B UV-Detektion bei 205 nm von

0.1 µg Substanz je Komponente

C RI-Detektion von je 0.1 µg

Substanz je Komponente


Lichtstreudetektor

System besteht aus drei Teilen: Zerstäuber,

Drift-Röhre und Lichtstreu-Zelle

(1) Probe aus Trennstrecke wird mit

Zerstäuber (N 2

) in Aerosol umgewandelt

(2) LM wird verdampft (∆T) in Driftröhre

(3) Gebildete Tröpfchen streuen

Laserlicht am Ende der Driftröhre

(4) Gestreutes Licht wird im 90°-

Winkel oder bei mehreren Winkeln

detektiert


Lichtstreudetektor

Probleme

a) Verdampfung in der Driftröhre für größere

Tröpfchen schwieriger – nicht verdampftes LM erhöht

das Basislinienrauschen

b) Flüchtige Verbindungen im Aerosol verdampfen

in der Driftröhre und werden nicht mehr detektiert.

c) Intensität des Signals erhöht sich mit 6. Potenz

der Molekülgröße – ein Teilchen mit der 10fachen

Größe in Bezug auf ein anderes erzeugt ein Signal,

das 10 6 Mio mal größer ist (Gefahr von Fehlinterpretationen

hoch)

Nachweisgrenze bei Partikeldurchmessern von ca.

1/20 der verwendeten Lichtwellenlänge

Detektion von Partikeln mit wenigen nm Größe (1-10 nm) – entspricht MW von

wenigen Tausend Dalton

d) Staub kann erheblich stören

f) optimale Gasflussrate muss für jede Trennmethode ermittelt werden, bei der

das beste S/N-Verhältnis vorliegt


Beispiel 1

Trennung von Alkylphenolpolyethoxylaten in technischen Gemischen

Säule: NH 2

(250 x 4 mm); Detektion: UV 277 nm; Fluß: 1 ml/min;

Eluent: Gradiententechnik von 100 % n-Hexan/2-Propanol 9:1 zu 100 % 2-

Propanol/Wasser 9:1 (1 % pro min)

Probe: Präwozell N - Produkte, n: mittlere Anzahl der Ethoxylatgruppen

Nonylphenolpolyethoxylate

n = 2-100

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0

Präwozell N20

n=20

0 20 40 60 80


Beispiel 2

Summarische Bestimmung (A) und Oligomerentrennung (B)

von Triton X-100 in Impfstoff

(A) Säule: RP-8 (250 x 4 mm); Eluent: Acetonitril/Wasser 70:30;Fluß: 1 ml/min;

Detektion: 200 n ; (B) Säule: NH 2

(250 x 4 mm); Eluent: n-Hexan/2-Propanol 9:1

in 100 min zu 2-Propanol/Wasser 9:1; Fluß: 1 ml/min; Detektion: 277 nm

mAU

n = 9 - 10

100

A

80

60

Triton X-100

5

B

B

40

A

2,5

20

0

0 5 10 15

t (min)

0

10 20 30 40

t (min)

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