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Biochemie Praktikum I

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<strong>Praktikum</strong>sskript <strong>Biochemie</strong> für Biologen-Bachelor SS2012<br />

SDS-Elektrophorese<br />

Immunoblotting (Western-Blotting) und Immunodetektion<br />

Theorie<br />

Durch Western-Blotting können Antigene spezifisch durch poly- und monoklonale Antikörper<br />

erkannt und damit sichtbar gemacht werden. Proteinproben werden beim SDS-PAGE mit Hilfe<br />

von Detergenzien wie Sodiumdodecylsulfat (SDS) und reduzierenden Reagenzien wie<br />

Dithiothreitol (DTT) oder 2-Mercaptoethanol (b-ME) solubilisiert und denaturiert. Anschließend<br />

werden die Proteine durch SDS-PAGE Gelelektrophorese aufgetrennt und mit Hilfe einer Wet<br />

tank Blotting Apparatur auf eine Nitrozellulose, PVDF oder Nylonmembran transferiert. Die auf<br />

der Membran gebundenen Proteine können dann bei Verwendung einer Nitrozellulosemembran<br />

durch reversible Anfärbung mit Ponceau S-Lösung sichtbar gemacht werden.<br />

Die auf der Membranoberfläche fixierten Proteine können jetzt mit Antikörpern detektiert werden.<br />

Aufbau des Blot-"Sandwichs" und Transfer der Proteine auf Nitrozellulose<br />

Im Anschluss an die Elektrophorese werden die aufgetrennten Proteine aus dem Gel auf<br />

Nitrozellulose-Membran überführt. Dazu werden pro Gel 2 Blatt Filterpapier und 1 Blatt<br />

Nitrozellulose-Membran in Blotting-Puffer getränkt. Achtung, die Nitrozellulose darf nur mit<br />

Handschuhen angefasst werden. Vorher die Membran auf einer Seite mit der Gruppennummer<br />

beschriften !!<br />

Blotting-Puffer:<br />

20 mM Tris<br />

150 mM Glycin<br />

20 % MeOH<br />

Dann wird ein "Sandwich" aufgebaut (Handschuhe tragen):<br />

Kathode<br />

2 Lagen Filterpapier (Whatman-Papier)<br />

Gel<br />

Nitrozellulose Membran<br />

2 Lagen Filterpapier (Whatman-Papier)<br />

Anode<br />

Luft- und Pufferblasen beim Auflegen der Filter vermeiden!<br />

Es wird 30 min bei einer Stromstärke von 360 mA geblottet. Anschließend wird das Gel zur<br />

Kontrolle, ob noch Proteine darin enthalten sind, 10 min lang in Coomassie-Brillant-Blue-Lösung<br />

gebadet und über Nacht in Entfärbungslösung (45 % Methanol, 7,5 % Essigsäure in H2O)<br />

geschüttelt.<br />

Die Nitrozellulose Membran wird in Ponceau S Färbelösung 1-2 min geschüttelt, dann wird die<br />

Membran mit H 2 O gewaschen. Die Proteine sollten sichtbar werden. (Die Membran kann<br />

zwischen Whatman Papier trocken gelagert werden.)<br />

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