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In-vitro-Maturation porciner Oozyten auf Feederlayer ... - Dragon IVF

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6.0. Zusammenfassung<br />

<strong>In</strong> den vorliegenden Untersuchungen wurden Methoden erarbeitet, um bei porcinen<br />

<strong>Oozyten</strong> sowohl eine nukleare als auch eine synchron abl<strong>auf</strong>ende zytoplasmatische<br />

Reifung zu erreichen. Zum einen wurden dazu unterschiedliche Seren und porcine<br />

Follikelflüssigkeit eingesetzt. Einen Schwerpunkt bildet hierbei der Einsatz eines an<br />

Ziegenserum gekoppelten Antikörpers gegen das reifungshemmende Hormon <strong>In</strong>hibin.<br />

Weiterhin wurden <strong>Feederlayer</strong>systeme getestet, sowohl um <strong>Oozyten</strong> zu reifen als auch<br />

befruchtete <strong>Oozyten</strong> zu kultivieren.<br />

Die <strong>Oozyten</strong> wurden aus den Ovarien geschlachteter peripuberaler Jungsauen durch<br />

Aufschneiden der Follikel gewonnen und nach dreimaligem Waschen in PBS + 10% FKS<br />

in ein <strong>Maturation</strong>smedium (TCM199 + Proteinquelle/<strong>Feederlayer</strong>) überführt. Die<br />

<strong>Maturation</strong> der <strong>Oozyten</strong> wurde im Brutschrank bei 39°C unter 5% CO2 für 46 Stunden<br />

durchgeführt. <strong>In</strong> den Versuchen 1 bis 4 wurde die Anzahl der Metaphase II-<strong>Oozyten</strong><br />

(<strong>Maturation</strong>srate) bestimmt. Dabei wurde in Versuchen 1 und 2 die Giemsa-<br />

Färbetechnik angewendet und zusätzlich der Expansionsgrad des muzifizierten<br />

Kumulus oophorus nach der Reifung beurteilt. <strong>In</strong> den Versuchen 3 und 4 wurde die<br />

Giemsa-Färbung von der Lacmoid – Färbung abgelöst. <strong>In</strong> den Versuchen 5 bis 9 wurden<br />

die in <strong>vitro</strong> gereiften <strong>Oozyten</strong> fertilisiert, um auch die zytoplasmatische Reifung der<br />

<strong>Oozyten</strong> zu überprüfen. <strong>In</strong> diesen Versuchen wurde neben der Teilungsrate auch die<br />

<strong>In</strong>tegrität des Zytoplasmas der Blastomeren (FDA-Färbung) sowie die Anzahl der<br />

embryonalen Zellkerne (Hoechst A 33342 –Färbung) bestimmt.<br />

Im ersten Versuch ( n= 192-258 <strong>Oozyten</strong>/Gruppe) wurde der Einfluß unterschiedlicher<br />

Konzentrationen fetalen Kälberserums (FKS) <strong>auf</strong> die <strong>Maturation</strong>srate von porcinen<br />

<strong>Oozyten</strong> überprüft. Es stellte sich heraus, daß ein Zusatz von 5% FKS zum <strong>Maturation</strong>s-<br />

Basismedium TCM199 mit einer 48%igen <strong>Maturation</strong>srate und 47% vorzüglichen<br />

expandierten Kumuli die empfehlenswerte Konzentration darstellte. Der Zusatz von 1%<br />

FKS erzielt zwar tendenziell höhere Reifungsraten (50%), jedoch wurden nur 23% der<br />

<strong>Oozyten</strong> mit einem vorzüglich expandierten Kumulus oophorus eingestuft.<br />

Der allgemein übliche Zusatz von 10% FKS zum <strong>Maturation</strong>smedium erzielte nur<br />

mittelmäßige Erfolge (39% Reifungsrate, 23% <strong>Oozyten</strong> der Qualität I). Die<br />

Unerläßlichkeit eines Serumzusatzes wurde in diesem Versuch durch die erste<br />

Versuchsgruppe bestätigt, denn hier wurden bei Fehlen eines Serumzusatzes nur 27%<br />

Metaphase II-<strong>Oozyten</strong> mit 17% vorzüglich expandierten Kumuli festgestellt.<br />

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