In-vitro-Maturation porciner Oozyten auf Feederlayer ... - Dragon IVF

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In-vitro-Maturation porciner Oozyten auf Feederlayer ... - Dragon IVF

6.0. Zusammenfassung

In den vorliegenden Untersuchungen wurden Methoden erarbeitet, um bei porcinen

Oozyten sowohl eine nukleare als auch eine synchron ablaufende zytoplasmatische

Reifung zu erreichen. Zum einen wurden dazu unterschiedliche Seren und porcine

Follikelflüssigkeit eingesetzt. Einen Schwerpunkt bildet hierbei der Einsatz eines an

Ziegenserum gekoppelten Antikörpers gegen das reifungshemmende Hormon Inhibin.

Weiterhin wurden Feederlayersysteme getestet, sowohl um Oozyten zu reifen als auch

befruchtete Oozyten zu kultivieren.

Die Oozyten wurden aus den Ovarien geschlachteter peripuberaler Jungsauen durch

Aufschneiden der Follikel gewonnen und nach dreimaligem Waschen in PBS + 10% FKS

in ein Maturationsmedium (TCM199 + Proteinquelle/Feederlayer) überführt. Die

Maturation der Oozyten wurde im Brutschrank bei 39°C unter 5% CO2 für 46 Stunden

durchgeführt. In den Versuchen 1 bis 4 wurde die Anzahl der Metaphase II-Oozyten

(Maturationsrate) bestimmt. Dabei wurde in Versuchen 1 und 2 die Giemsa-

Färbetechnik angewendet und zusätzlich der Expansionsgrad des muzifizierten

Kumulus oophorus nach der Reifung beurteilt. In den Versuchen 3 und 4 wurde die

Giemsa-Färbung von der Lacmoid – Färbung abgelöst. In den Versuchen 5 bis 9 wurden

die in vitro gereiften Oozyten fertilisiert, um auch die zytoplasmatische Reifung der

Oozyten zu überprüfen. In diesen Versuchen wurde neben der Teilungsrate auch die

Integrität des Zytoplasmas der Blastomeren (FDA-Färbung) sowie die Anzahl der

embryonalen Zellkerne (Hoechst A 33342 –Färbung) bestimmt.

Im ersten Versuch ( n= 192-258 Oozyten/Gruppe) wurde der Einfluß unterschiedlicher

Konzentrationen fetalen Kälberserums (FKS) auf die Maturationsrate von porcinen

Oozyten überprüft. Es stellte sich heraus, daß ein Zusatz von 5% FKS zum Maturations-

Basismedium TCM199 mit einer 48%igen Maturationsrate und 47% vorzüglichen

expandierten Kumuli die empfehlenswerte Konzentration darstellte. Der Zusatz von 1%

FKS erzielt zwar tendenziell höhere Reifungsraten (50%), jedoch wurden nur 23% der

Oozyten mit einem vorzüglich expandierten Kumulus oophorus eingestuft.

Der allgemein übliche Zusatz von 10% FKS zum Maturationsmedium erzielte nur

mittelmäßige Erfolge (39% Reifungsrate, 23% Oozyten der Qualität I). Die

Unerläßlichkeit eines Serumzusatzes wurde in diesem Versuch durch die erste

Versuchsgruppe bestätigt, denn hier wurden bei Fehlen eines Serumzusatzes nur 27%

Metaphase II-Oozyten mit 17% vorzüglich expandierten Kumuli festgestellt.

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