In-vitro-Maturation porciner Oozyten auf Feederlayer ... - Dragon IVF

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In-vitro-Maturation porciner Oozyten auf Feederlayer ... - Dragon IVF

Inhaltstverzeichnis

Übersicht der verwendeten Abkürzungen _______________________________________ 1

1. Einleitung ______________________________________________________________ 3

2. Literaturübersicht ________________________________________________________ 4

2.1. Oozytentwicklung in vivo und in vitro _________________________________________ 4

2.1.1. Oogenese und Follikulogenese _____________________________________________________ 4

2.1.1.1. Oogenese (Eizellbildung) _______________________________________________ 5

2.1.1.2. Follikulogenese _________________________________________________________ 6

2.1.2. Nukleus- und Zytoplasmareifung ___________________________________________________ 7

2.1.2.1. Inhibin als lokaler Regulator der Follikulogenese ______________________ 10

2.2. Maturation in vitro ________________________________________________________ 11

2.3. Mechanismen, die den meiotischen Block der Oozyten beenden ___________________ 13

2.4. Gewinnung und Selektion der Kumulus-Oozyten-Komplexe _____________________ 14

2.5. Spermatozoenreifung ______________________________________________________ 15

2.5.1. Kapazitation mit anschließender Akrosomenreaktion ___________________________________ 15

2.5.2. In-vitro- Kapazitation beim Schwein________________________________________________ 16

2.6. Reifung, Befruchtung und Kultur porciner Oozyten in vitro _____________________ 17

2.7. Anforderungen und Möglichkeiten der frühen Embryokultur ______________________________ 22

2.7.1 1. Energetische Versorgung ______________________________________________ 24

2.7.1.1.1. Aminosäuren ___________________________________________________________ 24

2.7.1.1.2. Glucose und Phosphat ____________________________________________________ 25

2.7.1.1.3. Serumalbumin __________________________________________________________ 25

2.7.1.1.4. Wachstumsfaktoren ______________________________________________________ 26

2.8. Proteinzusätze ____________________________________________________________ 26

2.8.1. Follikelflüssigkeit ______________________________________________________________ 26

2.9. Kultursysteme ____________________________________________________________ 28

2.9.1. Kokultursysteme _______________________________________________________________ 28

2.9.1.1. Eileiterfeederzellen als Kokultur ______________________________________ 29

2.9.1.2. Buffalo-Rat-Liver-Zellen als Feederlayer ______________________________ 31

2.10. Beurteilungsmöglichkeiten der Embryonenqualität ____________________________ 31

2.10.1. Morphologische Beurteilung _____________________________________________________ 31

2.10.2. Beurteilung durch Essisäure/Alkohol-Präparation ____________________________________ 31

2.10.3. Fluoreszenzfärbung mit Hoechst A 33342 __________________________________________ 32

2.10.4. Fluoreszenzfärbung mit FDA ____________________________________________________ 32

3.0. Material und Methoden ____________________________________________________ 33

3.1.Tiermaterial ______________________________________________________________ 33

3.2. Medien __________________________________________________________________ 33

3.2.1. Transport - und Waschmedium für Ovarien und Oozyten ________________________________ 33

3.2.2. Maturationsmedium_____________________________________________________________ 35

3.2.3. Waschmedium für Spermatozoen __________________________________________________ 36

3.2.4. Kapazitationsmedium ___________________________________________________________ 36

3.2.5. Befruchtungsmedium ___________________________________________________________ 36

3.2.6. Medien der frühen Embryokultur __________________________________________________ 36

3.2.6.1. NCSU-23 ______________________________________________________________ 37

3.3. Eigene Untersuchungen zur In-vitro-Maturation porciner Oozyten _______________ 37

3.4. Gewinnung der Oozyten ___________________________________________________ 38

3.4.1. Klassifizierung der Kumulus - Oozyten - Komplexe ____________________________________ 39

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