In-vitro-Maturation porciner Oozyten auf Feederlayer ... - Dragon IVF

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In-vitro-Maturation porciner Oozyten auf Feederlayer ... - Dragon IVF

verwendet. Das Medium enthielt die Aminosäuren Glutamin, Taurin und Hypotaurin

(PETTERS et al., 1990; PETTERS & REED, 1991; ILLERA et al., 1992).

3.2.6.1. NCSU-23

500ml Ampuwa (Fresenius AG, Bad Hamburg) wurden 114,73mM NaCl (Sigma,

Deisenhofen), 4,78mM KCl (Sigma, Deisenhofen), 1,70mM CaCl2 (Sigma, Deisenhofen)

wasserfrei, 1,19mM KH2PO4*2 H2O (Sigma, Deisenhofen),1,19mM MgCl2*7H2O

(Sigma, Deisenhofen) und 25,07mM NaHCO3 (Sigma, Deisenhofen)zugesetzt. Diese

NCSU-23-Basislösung wurde steril filtriert und bei 5-8°C im Kühlschrank gelagert.

Vor Gebrauch des Kulturmediums wurden 5,5mM Glucose (Sigma, Deisenhofen), 4%

BSA (Sigma, Deisenhofen), 10% FKS (Gibco BRL, Eggenstein), 7,0mM Taurin (Sigma,

Deisenhofen), 5,0mM Hypotaurin (Sigma, Deisenhofen), 1,0mM Glutamin (Sigma,

Deisenhofen) sowie 5µg/ml Insulin (Sigma, Deisenhofen) und Transferrin (Sigma,

Deisenhofen) als auch 5ng/ml Natriumselenit (Sigma, Deisenhofen) hinzugefügt.

Dieses komplette Medium wurde mit einem 0,2µm Spritzenfilter steril filtriert. Jeweils

400µl des Embryokulturmediums wurden in 4-Loch Schalen (NUNC, Wiesbaden,

GLW, Würzburg) gegeben und für mindestens 4 Stunden im Brutschrank bei 5% CO2,

39°C und 100% Luftfeuchte äquilibriert.

3.3. Eigene Untersuchungen zur In-vitro-Maturation porciner Oozyten

Die im Folgenden vorgestellten Versuche sowie die Etablierung von Methoden

erstreckten sich über einen Zeitraum von 3 ½ Jahren.

Es wurden insgesamt 10011 Oozyten der Klassen I und II aus Schweineovarien vom

Rosdorfer Schlachthof gewonnen.

In allen Versuchen wurden die Oozyten nach Gewinnung aus den Ovarien klassifiziert.

Es wurden nur Oozyten der Klassen I und II (vgl. Kap. 3.4.1.) in die Versuchsgruppen

aufgenommen. In Versuch 1 und 2 wurden die Oozyten auch nach der Reifung

aufgrund ihres morphologischen Erscheinungsbildes der Kumulusexpansion erneut

beurteilt. Hierbei wurde die Intensität der Expansion des Kumulus oophorus beurteilt

(vgl. Kap. 3.6., Abb. 1). Innerhalb der ersten 4 Versuche wurde weiterhin das

Erreichen der Metaphase II, also eine abgeschlossene nukleare Reifung der Oozyten

beurteilt. Dazu wurde für die Versuche 1 und 2 die Giemsa-Färbung herangezogen, die

dann von der Lacmoid-Färbung abgelöst wurde.

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