In-vitro-Maturation porciner Oozyten auf Feederlayer ... - Dragon IVF

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In-vitro-Maturation porciner Oozyten auf Feederlayer ... - Dragon IVF

Alle weiteren Versuche beschäftigten sich schwerpunktmäßig mit der

Befruchtungsfähigkeit in vitro gereifter Oozyten, wobei im 5. und 6. Versuch lediglich

die morphologisch bestimmte Teilungsrate erfaßt wurde. Erst in den sich

anschließenden Versuchen wurden die Hoechst- und FDA-Färbungen herangezogen,

um genauere Aussagen über die Embryonenqualität zu erhalten.

3.4. Gewinnung der Oozyten

Klare, gut durchblutete Follikel mit einem Durchmesser von 2-6mm wurden in einer

auf der Wärmeplatte (Medax, Schütt,Göttingen, 39°C) stehenden Petrischale (Greiner

GmbH, Frickenhausen, Durchmesser 100mm) mit einer Skalpellkinge in 10ml

Waschmedium angeschnitten (Tabelle 1). Die Oozyten aus jeweils 10 Ovarien

gelangten auf diese Weise mit der Follikelflüssigkeit in das Waschmedium.

Das Waschmedium wurde dann mit einer sterilen Pasteurpipette aus der Petrischale

in ein steriles, im 39°C warmen Wasserbad stehendes Reagenzglas pipettiert. Nach

dem Absinken der Oozyten wurde fast der gesamte Überstand aus dem Reagenzglas

verworfen und durch frisches, 39°C warmes Waschmedium ersetzt.

Nach 7 Minuten wurde dann das Sediment unter einem Mikroskop (M8, Wild

Herrbrugg, Schweiz ) bei 12facher Vergrößerung nach Kumulus - Oozyten - Komplexen

(KOK) durchsucht. Nur Oozyten mit nicht expandiertem Kumulus oophorus wurden

mit Hilfe einer 140µm feinen, ausgezogenen Pasteurpipette mit Maturationsmedium

dreimal gewaschen und in die Kultur des jeweiligen Versuchsansatzes überführt.

Anschließend wurden mindestens 20 Kumulus-Oozyten-Komplexe in einer

Vierlochschale in 400µl Maturationsmedium für 46 Stunden im Brutschrank (Water

Jacketed Incubator, Forma Scientific, USA) bei 39°C und 5% CO2 kultiviert. Das

Medium wurde jeweils mit 400µl Mineralöl (# M-8410, Sigma, Deisenhofen)

überschichtet.

Von der Gewinnung der Oozyten bis zum Beginn der In-vitro-Maturation vergingen

weniger als zwei Stunden.

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