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In-vitro-Maturation porciner Oozyten auf Feederlayer ... - Dragon IVF

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Alle weiteren Versuche beschäftigten sich schwerpunktmäßig mit der<br />

Befruchtungsfähigkeit in <strong>vitro</strong> gereifter <strong>Oozyten</strong>, wobei im 5. und 6. Versuch lediglich<br />

die morphologisch bestimmte Teilungsrate erfaßt wurde. Erst in den sich<br />

anschließenden Versuchen wurden die Hoechst- und FDA-Färbungen herangezogen,<br />

um genauere Aussagen über die Embryonenqualität zu erhalten.<br />

3.4. Gewinnung der <strong>Oozyten</strong><br />

Klare, gut durchblutete Follikel mit einem Durchmesser von 2-6mm wurden in einer<br />

<strong>auf</strong> der Wärmeplatte (Medax, Schütt,Göttingen, 39°C) stehenden Petrischale (Greiner<br />

GmbH, Frickenhausen, Durchmesser 100mm) mit einer Skalpellkinge in 10ml<br />

Waschmedium angeschnitten (Tabelle 1). Die <strong>Oozyten</strong> aus jeweils 10 Ovarien<br />

gelangten <strong>auf</strong> diese Weise mit der Follikelflüssigkeit in das Waschmedium.<br />

Das Waschmedium wurde dann mit einer sterilen Pasteurpipette aus der Petrischale<br />

in ein steriles, im 39°C warmen Wasserbad stehendes Reagenzglas pipettiert. Nach<br />

dem Absinken der <strong>Oozyten</strong> wurde fast der gesamte Überstand aus dem Reagenzglas<br />

verworfen und durch frisches, 39°C warmes Waschmedium ersetzt.<br />

Nach 7 Minuten wurde dann das Sediment unter einem Mikroskop (M8, Wild<br />

Herrbrugg, Schweiz ) bei 12facher Vergrößerung nach Kumulus - <strong>Oozyten</strong> - Komplexen<br />

(KOK) durchsucht. Nur <strong>Oozyten</strong> mit nicht expandiertem Kumulus oophorus wurden<br />

mit Hilfe einer 140µm feinen, ausgezogenen Pasteurpipette mit <strong>Maturation</strong>smedium<br />

dreimal gewaschen und in die Kultur des jeweiligen Versuchsansatzes überführt.<br />

Anschließend wurden mindestens 20 Kumulus-<strong>Oozyten</strong>-Komplexe in einer<br />

Vierlochschale in 400µl <strong>Maturation</strong>smedium für 46 Stunden im Brutschrank (Water<br />

Jacketed <strong>In</strong>cubator, Forma Scientific, USA) bei 39°C und 5% CO2 kultiviert. Das<br />

Medium wurde jeweils mit 400µl Mineralöl (# M-8410, Sigma, Deisenhofen)<br />

überschichtet.<br />

Von der Gewinnung der <strong>Oozyten</strong> bis zum Beginn der <strong>In</strong>-<strong>vitro</strong>-<strong>Maturation</strong> vergingen<br />

weniger als zwei Stunden.<br />

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