In-vitro-Maturation porciner Oozyten auf Feederlayer ... - Dragon IVF
In-vitro-Maturation porciner Oozyten auf Feederlayer ... - Dragon IVF
In-vitro-Maturation porciner Oozyten auf Feederlayer ... - Dragon IVF
Erfolgreiche ePaper selbst erstellen
Machen Sie aus Ihren PDF Publikationen ein blätterbares Flipbook mit unserer einzigartigen Google optimierten e-Paper Software.
Alle weiteren Versuche beschäftigten sich schwerpunktmäßig mit der<br />
Befruchtungsfähigkeit in <strong>vitro</strong> gereifter <strong>Oozyten</strong>, wobei im 5. und 6. Versuch lediglich<br />
die morphologisch bestimmte Teilungsrate erfaßt wurde. Erst in den sich<br />
anschließenden Versuchen wurden die Hoechst- und FDA-Färbungen herangezogen,<br />
um genauere Aussagen über die Embryonenqualität zu erhalten.<br />
3.4. Gewinnung der <strong>Oozyten</strong><br />
Klare, gut durchblutete Follikel mit einem Durchmesser von 2-6mm wurden in einer<br />
<strong>auf</strong> der Wärmeplatte (Medax, Schütt,Göttingen, 39°C) stehenden Petrischale (Greiner<br />
GmbH, Frickenhausen, Durchmesser 100mm) mit einer Skalpellkinge in 10ml<br />
Waschmedium angeschnitten (Tabelle 1). Die <strong>Oozyten</strong> aus jeweils 10 Ovarien<br />
gelangten <strong>auf</strong> diese Weise mit der Follikelflüssigkeit in das Waschmedium.<br />
Das Waschmedium wurde dann mit einer sterilen Pasteurpipette aus der Petrischale<br />
in ein steriles, im 39°C warmen Wasserbad stehendes Reagenzglas pipettiert. Nach<br />
dem Absinken der <strong>Oozyten</strong> wurde fast der gesamte Überstand aus dem Reagenzglas<br />
verworfen und durch frisches, 39°C warmes Waschmedium ersetzt.<br />
Nach 7 Minuten wurde dann das Sediment unter einem Mikroskop (M8, Wild<br />
Herrbrugg, Schweiz ) bei 12facher Vergrößerung nach Kumulus - <strong>Oozyten</strong> - Komplexen<br />
(KOK) durchsucht. Nur <strong>Oozyten</strong> mit nicht expandiertem Kumulus oophorus wurden<br />
mit Hilfe einer 140µm feinen, ausgezogenen Pasteurpipette mit <strong>Maturation</strong>smedium<br />
dreimal gewaschen und in die Kultur des jeweiligen Versuchsansatzes überführt.<br />
Anschließend wurden mindestens 20 Kumulus-<strong>Oozyten</strong>-Komplexe in einer<br />
Vierlochschale in 400µl <strong>Maturation</strong>smedium für 46 Stunden im Brutschrank (Water<br />
Jacketed <strong>In</strong>cubator, Forma Scientific, USA) bei 39°C und 5% CO2 kultiviert. Das<br />
Medium wurde jeweils mit 400µl Mineralöl (# M-8410, Sigma, Deisenhofen)<br />
überschichtet.<br />
Von der Gewinnung der <strong>Oozyten</strong> bis zum Beginn der <strong>In</strong>-<strong>vitro</strong>-<strong>Maturation</strong> vergingen<br />
weniger als zwei Stunden.<br />
38