In-vitro-Maturation porciner Oozyten auf Feederlayer ... - Dragon IVF

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Versuchsgruppe FKS-Konzentrationen (%) 1 0 2 1 3 5 4 10 Tabelle 2: Reifung follikulärer Oozyten des Schweines in unterschiedlichen Konzentrationen fetalen Kälberserums (Versuch 1) Abb.1: Ausgezeichnet (I), gut (II), mäßig (III) expandierte Kumulus- Oozyten- Komplexe, sowie eine Oozyte ohne Expansion des Kumulus oophorus (IV) 3.6.1. Fixierung und Giemsa-Färbung gereifter Oozyten Die für die Färbung vorgesehenden Objektträger wurden für 15 Minuten in einem Färbekasten Hellendahl (GLW, Würzburg) mit einen Äther-Alkohol-Gemisch (1:1, Merck, Darmstadt) gereinigt. Danach wurden die Objektträger mit einem staub- und 42
fusselfreien Tuch getrocknet und bis zur Verwendung in einer Objektträgerbox gelagert. Die in vitro gereiften und expandierten Oozyten wurden für 30 Sekunden in 50µl PBS +2%FKS + 80I.E Hyaluronidase-Drops (# H-2251 aus Schafhoden, Sigma, Deisenhofen) inkubiert und die anhaftenden Kumulusmassen mit einer Mikropasteurpipette entfernt. Bei besonders fest anhaftenden Zellen, insbeondere der Corona radiata, wurden die Oozyten in 1ml 2% FKS-haltigem PBS-Medium mit 80I.E. Hyaluronidase für 3 Minuten im Reagenzglas geschüttelt (Mixomat, Hersel, Bonn). Die Darstellung der Metaphase II geschah nach der Tarkowski-Methode (TARKOWSKI, 1966). Dazu wurden die Oozyten in 2ml 39°C warmer, hypotoner 1,1%iger Natriumcitratlösung für 5 Minuten inkubiert. Danach wurden sie zentral auf dem Objektträger so plaziert, daß sie nur noch mit wenig hypotonem Natriumcitrat benetzt waren, allerdings ohne auszutrocknen. Das Auftropfen von 50µl eiskalter Eisessig/Alkohollösung (1:3, v:v) auf die Oozyten brach das Zytoplasma der Oozyten auf und schwemmte die Chromosomen aus. Nach Trocknung auf der Wärmepatte wurden die Objektträger mit den Chromosomen für 5- 6 Minuten in frischer 2%iger Giemsalösung gefärbt, mit Aqua Dest gespült und erneut getrocknet. Anschließend wurden die Präparate mit einem Tropfen Eindeckmedium (DPX, Gurr, BDH, England) und Deckgläschen fixiert. Die Chromosomenuntersuchung fand auf einem Phasenkontrastmikroskop (Axioskop Zeiss, Göttingen) bei 400facher Vergrößerung statt. 3.7. Einfluß von Anti-hInhibinα Ziegenserum (Versuch 2) In einem zweiten Versuch sollte der Einfluß eines Ziegenserums, das Antikörper gegen Inhibin (Anti-hInhibinα Ziegenserum) enthielt, untersucht werden (Tabelle 3.). In diesem Versuch wurden von 1872 mit Giemsa angefärbten Oozyten (Abb. 2) 1430 wiedergefunden und deren Chromosomenkonstellation beurteilt (Tabelle 9). Das entspricht einer Wiederfindungsrate von 76%. Der Versuch wurde neunmal wiederholt. Das verwendete „Anti-Inhibin“ wurde von immunisierten Ziegen gewonnen und lag somit als Bestandteil von Ziegenserum vor, welches nicht hitzeinaktiviert wurde, um so einer eventuellen Zerstörung der Antikörper vorzubeugen (Anti-INH). Dieses antikörperhaltige Serum wurde einem hitzeinaktivierten östrischen antikörperfreiem Ziegenserum (ZS) in den Konzentrationen von 0,1 und 1% zugesetzt, so daß die Proteinquelle im Medium in der Summe 10% ergab. Als Kontrolle diente Ziegenserum 43
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6.0. Zusammenfassung In den vorlieg
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Versuchsgruppen ohne Antikörper ge
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7.0. Summary The present investigat
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division was determined (n = 109 -
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Einfriermedium für Eileiterzellen,
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