In-vitro-Maturation porciner Oozyten auf Feederlayer ... - Dragon IVF

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In-vitro-Maturation porciner Oozyten auf Feederlayer ... - Dragon IVF

In Versuch 3 mit vier Wiederholungen wurde die nukleare Reifung von 483

Schweineoozyten nach Kultur in Maturationsmedien mit verschiedenen Serumanteilen

bzw. pFF oder 10% reiner pFF (Tabelle 4) überprüft. Nach Ablauf der Reifungszeit

wurden die expandierten Kumulus-Oozyten-Komplexe nach Entfernung der

Kumulusmassen (vgl. Kap. 3.6.1) fixiert und mit Lacmoid gefärbt, um ihren

meiotischen Status zu untersuchen.

3.8. 1. Fixierung und Färbung der Oozyten mit Lacmoid

Nach der Maturation der Oozyten über einen Zeitraum von 46 Stunden, wurden die

expandierten Kumulus-Oozyten-Komplexe für 30 Sekunden in 80 I.E. Hyaluronidase

(Sigma, Deisenhofen) inkubiert und durch Auf- und Abpipettieren mit einer fein

ausgezogenen Pasteurpipette von noch anhaftenden Kumuluszellen befreit. Danach

wurden sie in einem 10µl Tropfen PBS-Medium ohne Serumzusatz zu maximal 20

Oozyten auf einem fettfreien Objektträger (Vgl. Kap. 3.6.1.) positioniert. Eine

Fettmischung aus Vaseline und Paraffin (9:1 w/w) wurde mit einer 10ml Spritze und

21g Kanüle beiderseits des Tropfens aufgetragen, um das Deckgläschen über den

Oozyten zu fixieren. Um einem Abschwemmen der Deckgläschen in der Fixierlösung

vorzubeugen, wurden zwei Streifen 60°C warmes Vaseline/Paraffin-Gemisch (1:1 w/w)

auf die Kanten des Deckgläschens mit einer großlumigen Pasteurpipette aufgetragen.

Die Objektträger wurden anschließend 24 Stunden in Essigsäure - Alkohol (1:3) fixiert

und mit 1% (v/w) Essigsäure-Lacmoid (Sigma, Deisenhofen) gefärbt.

Die Beurteilung der meiotischen Phasen der angefärbten Oozyten erfolgte am frischen

Präparat unter einem Phasenkontrasmikroskop (Zeiss Axioskop, Göttingen) bei

400facher Vergrößerung.

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