In-vitro-Maturation porciner Oozyten auf Feederlayer ... - Dragon IVF
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hitzeinaktiviertem Ziegenserum/Follikelflüssigkeit (v:v, 1:9) kombiniert. Weiterhin<br />
wurde der Einfluß von Kontrollgruppen ohne <strong>Feederlayer</strong> mit Proteinquelle und mit<br />
<strong>Feederlayer</strong> ohne Proteinquelle getestet. VANSTEENBRUGGE et al. (1994) zeigen,<br />
daß sowohl BRL- als auch Eileiterzellen den pH-Wert der Kulturmedien, sowie die<br />
Sauerstoff-Kohlendioxid-Verhältnis oder Ionen-, Vitamin- und Lipidkonzentrationen<br />
konstant halten können.<br />
Erneut wurden die meiotischen Phasen der <strong>Oozyten</strong> nach 46 stündiger<br />
<strong>Maturation</strong>sphase mit Hilfe der Lacmoidfärbung beurteilt.<br />
3.11. Eigene Untersuchungen zur <strong>In</strong>-<strong>vitro</strong>-Fertilisation in <strong>vitro</strong> gereifter<br />
<strong>Oozyten</strong>.<br />
<strong>In</strong> anschließenden Versuchen wurde nun auch die zytoplasmatische Reife der in <strong>vitro</strong><br />
gereiften <strong>Oozyten</strong> untersucht.<br />
Die in <strong>vitro</strong> befruchteten und kultivierten <strong>Oozyten</strong> wurden nach 2 Tagen Kultur <strong>auf</strong><br />
dreierlei Weise klassifiziert. Die erhaltenen Embryonen wurden visuell morphologisch<br />
beurteilt, mit einer FDA - Färbung <strong>auf</strong> die <strong>In</strong>tegrität ihres Zytoplasmas untersucht<br />
sowie mittels Hoechst A 33342-Fluoreszenzfärbung mitotisch intakte Kerne<br />
nachgewiesen. Diese drei Klassifizierungsmöglichkeiten wurden bei jeder<br />
Versuchsgruppe durchgeführt werden, so daß jeder einzelne Embryo der einzelnen<br />
Versuchsgruppen gleichzeitig Aussagen über drei Kriterien liefern konnte. Im letzten<br />
Versuch wurden die erhaltenen Embryonen nicht durch Färbung beurteilt, sondern<br />
<strong>auf</strong> synchronisierte Empfängersauen transferiert.<br />
3.11.1. Spermagewinnung<br />
Das Sperma für die in-<strong>vitro</strong>-Fertilisation wurde mit der Handdruckmethode von einem<br />
Minischweineber gewonnen (PAUFLER et al., 1974). Die spermareiche Fraktion (50-<br />
150ml) des Ejakulates wurde in einem sterilen, <strong>auf</strong> 35°C vorgewärmten und mit 2<br />
Lagen Gaze abgedeckten Glas <strong>auf</strong>gefangen, tropfenweise mit vorgewärmten 70µg/ml<br />
Kanamycin (Sigma, Deisenhofen) versetzt. Danach erfolgte eine Portionierung des<br />
Ejakulates in sterile 10ml Reagenzgläser, die mit Alufolie und Parafilm luftdicht<br />
verschlossen und im Reagenzglasständer für 12-16 Stunden in einer Klimabox<br />
(Experta, Tropicool P-30 -G) bei 16°C für eine Präkapazitation gelagert wurden.<br />
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