In-vitro-Maturation porciner Oozyten auf Feederlayer ... - Dragon IVF

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In-vitro-Maturation porciner Oozyten auf Feederlayer ... - Dragon IVF

hitzeinaktiviertem Ziegenserum/Follikelflüssigkeit (v:v, 1:9) kombiniert. Weiterhin

wurde der Einfluß von Kontrollgruppen ohne Feederlayer mit Proteinquelle und mit

Feederlayer ohne Proteinquelle getestet. VANSTEENBRUGGE et al. (1994) zeigen,

daß sowohl BRL- als auch Eileiterzellen den pH-Wert der Kulturmedien, sowie die

Sauerstoff-Kohlendioxid-Verhältnis oder Ionen-, Vitamin- und Lipidkonzentrationen

konstant halten können.

Erneut wurden die meiotischen Phasen der Oozyten nach 46 stündiger

Maturationsphase mit Hilfe der Lacmoidfärbung beurteilt.

3.11. Eigene Untersuchungen zur In-vitro-Fertilisation in vitro gereifter

Oozyten.

In anschließenden Versuchen wurde nun auch die zytoplasmatische Reife der in vitro

gereiften Oozyten untersucht.

Die in vitro befruchteten und kultivierten Oozyten wurden nach 2 Tagen Kultur auf

dreierlei Weise klassifiziert. Die erhaltenen Embryonen wurden visuell morphologisch

beurteilt, mit einer FDA - Färbung auf die Integrität ihres Zytoplasmas untersucht

sowie mittels Hoechst A 33342-Fluoreszenzfärbung mitotisch intakte Kerne

nachgewiesen. Diese drei Klassifizierungsmöglichkeiten wurden bei jeder

Versuchsgruppe durchgeführt werden, so daß jeder einzelne Embryo der einzelnen

Versuchsgruppen gleichzeitig Aussagen über drei Kriterien liefern konnte. Im letzten

Versuch wurden die erhaltenen Embryonen nicht durch Färbung beurteilt, sondern

auf synchronisierte Empfängersauen transferiert.

3.11.1. Spermagewinnung

Das Sperma für die in-vitro-Fertilisation wurde mit der Handdruckmethode von einem

Minischweineber gewonnen (PAUFLER et al., 1974). Die spermareiche Fraktion (50-

150ml) des Ejakulates wurde in einem sterilen, auf 35°C vorgewärmten und mit 2

Lagen Gaze abgedeckten Glas aufgefangen, tropfenweise mit vorgewärmten 70µg/ml

Kanamycin (Sigma, Deisenhofen) versetzt. Danach erfolgte eine Portionierung des

Ejakulates in sterile 10ml Reagenzgläser, die mit Alufolie und Parafilm luftdicht

verschlossen und im Reagenzglasständer für 12-16 Stunden in einer Klimabox

(Experta, Tropicool P-30 -G) bei 16°C für eine Präkapazitation gelagert wurden.

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