In-vitro-Maturation porciner Oozyten auf Feederlayer ... - Dragon IVF

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In-vitro-Maturation porciner Oozyten auf Feederlayer ... - Dragon IVF

3.11.2. Spermaaufbereitung

Nach der Präkapazitation wurden die Reagenzgläser mit dem Ejakulat sowie das

Spermawasch-und Kapazitationsmedium (Vgl. Kap. 3.2.3. und 3.2.4.) langsam auf 20-

25°C erwärmt.

Das Ejakulat wies nach der 12-16 stündigen Präkapazitaionsphase in den

Reagenzgläsern zwei Spermafraktionen auf. Der plasmareiche Überstand wurde mit

einer sterilen Pasteurpipette abgenommen und verworfen. Das spermareiche Sediment

wurde nun behutsam mit dem erwärmten Spermawaschmedium versetzt bevor die

Suspension bei 200 x g für 8 Minuten zentrifugiert wurde.

Nach der Zentrifugation bildeten sich aus der Suspension erneut zwei Phasen. Das

Sediment enthielt tote, immotile Spermatozoen. Im Überstand befanden sich die

vitalen, motilen Spermatozoen, die abgenommen und erneut bei 600 x g für 10

Minuten zentrifugiert wurden. Während dieser Zentrifugation wurde der pH-Wert des

erwärmten Kapazitiermediums überprüft und mit 1M NaOH oder HCL auf pH 7,8

eingestellt.

Nach der zweiten Zentrifugation wurde das Spermapellet erneut mit 10ml

Spermawaschmedium resuspendiert und bei 600 x g für 10 Minuten zentrifugiert, der

Überstand verworfen und nun mit Kapazitiermedium überschichtet.

Nach der Resuspendierung des Pellets im Kapazitiermedium wurden die

Spermatozoen im Zentrifugenröhrchen für 60 Minuten bei 39°C inkubiert (CHENG et

al., 1986).

Nach Ablauf der Kapazitationszeit wurde das Sperma auf Motilität und Dichte

überprüft, um festzulegen, welches Volumen notwendig war, um in 400µl

Befruchtungsmedium eine Spermiendichte von 1x10 6 Spermien/ml zu erreichen.

3.11.3. Befruchtung der Oozyten

Nach 46-stündiger Maturation wurden die expandierten und muzifizierten Kumulus-

Oozyten-Komplexe (KOK`s) dreimal in 70µl Befruchtungsmedium (Vgl. Kap. 3.2.5.)

mit einer fein ausgezogenen Pasteurpipette (∅ ca. 200µm) gewaschen. Der

Waschvorgang dieser gereiften Kumulus-Oozyten-Komplexe fand auf einer

Wärmeplatte (Minitüb, Tiefenbach) unter der Stereolupe (M8,Wild, Herrbrugg,

Schweiz) bei 12facher Vergrößerung statt. Nach dem Waschen wurden jeweils 20

KOK`s in 4-Loch Schalen (Nunc, Nunclon GLW) in 400µl äquilibriertes und

mineralölüberschichtetes Befruchtungsmedium übertragen.

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