In-vitro-Maturation porciner Oozyten auf Feederlayer ... - Dragon IVF

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In-vitro-Maturation porciner Oozyten auf Feederlayer ... - Dragon IVF

3.14.1.2.Kombinierte FDA- Hoechst-Färbung zur Bestimmung der

Zytoplasmaaktivität

Die FDA (3`6`-Fluorescin Diacetate, Sigma, Deisenhofen ) - Färbung ist eine Methode,

zur Unterscheidung von toten und lebenden Embryonen. Lebende Embryonen zeigen

ein hell grün leuchtendes Signal (Abb. 9). Die zu untersuchenden Embryonen wurden

dreimal in 39°C warmen PBS gewaschen und dann in FDA-haltige PBS-Lösung

überführt. Dazu wurde eine FDA-Stammlösung von 5mg FDA/ml Aceton (Merck,

Darmstadt) in einer Konzentration von 2µl/2ml PBS verdünnt (DIDION et al., 1990).

Von dieser Verdünnung wurden 10µl abgenommen und jeweils in 50µl PBS verdünnt.

Die Embryonen verblieben jeweils für 1,5 Minuten bei 39°C auf der Wärmeplatte in

der FDA-Lösung und wurden anschließend dreimal in PBS gewaschen.

Danach erfolgte die zweite Inkubation der Embryonen im Hoechst-Farbstoff. A33342

(Sigma, Deisenhofen), um mitotisch aktive Kerne sichtbar zu machen (Abb. 10, 11).

Eine Stammlösung von 1mg Hoechst A33342/ml Aqua dest (PURSEL et al., 1985)

wurde zu je 10µl/50µl PBS verdünnt. Die Inkubationszeit im Hoechst-Farbstoff betrug

2 Minuten bei 39°C auf der Wärmeplatte.

Dann wurden die Embryonen auf einen Objektträger, auf den zuvor zwei

Vaseline/Paraffin (w/w 1:9) Streifen aufgetragen wurden, in die Mitte positioniert und

mit einem Deckgläschen abgedeckt, so daß die Zellen nur leicht gequetscht wurden.

Die FDA- Untersuchung fand mit einem Axioskop (Zeiss, Göttingen) Filtersatz 09

(Zeiss, Göttingen) bei einer Anregung von 450-490nm (BP Erregerfilter) und einer

Emission von 520nm (Sperrfilter LP 520, Interferenzfilter FT 510) statt.

Die Beurteilung der Hoechst-Färbung erfolgte ebenfalls auf dem

Fluoreszenzmikroskop (Axioskop, Zeiss, Göttingen) mit dem Filtersatz 02 (Zeiss,

Göttingen) bei einer Anregung von 365nm (Erregerfilter G 365) und einer Emission

von 420nm (Interferenzfilter FT 395, Sperrfilter LP 420).

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