In-vitro-Maturation porciner Oozyten auf Feederlayer ... - Dragon IVF
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Kumulusexpansion muß gewährleistet sein, daß die Reinitiierung der Meiose nicht<br />
überstürzt passiert. Das bedeutet, daß ein inniger Kontakt zwischen Kumulus und<br />
Oozyte bis zur Metaphase I erhalten bleiben muß (MOTLIK et al., 1986). Deshalb sollen<br />
die für die <strong>In</strong>-<strong>vitro</strong>-<strong>Maturation</strong> eingesetzten Medien zwar der Follikelflüssigkeit ähneln,<br />
aber eine vorzeitige Reinitiierung der Meiose verhindern (GÖTZE et al., 1990).<br />
Durch die 3x4 faktorielle Versuchsanstellung wurde erstmals der Effekt von<br />
<strong>Feederlayer</strong>n in Kombination mit verschiedenen Proteinzusätzen im Medium bei der <strong>In</strong><strong>vitro</strong>-<strong>Maturation</strong><br />
von Schweineoozyten überprüft.<br />
Es wurde ein deutlich positiver Effekt von beiden <strong>Feederlayer</strong>typen beobachtet.<br />
Weiterhin vermag der Einsatz eines <strong>Feederlayer</strong>s eine Serumkomponente vollständig zu<br />
ersetzten. Allerdings konnte kein fördernder Effekt von Anti-<strong>In</strong>hibin festgestellt werden<br />
und so kam es in weiteren Untersuchungen nicht mehr zum Einsatz.<br />
Zur Überprüfung der nuklearen Reifung von <strong>Oozyten</strong> wurden die Chromosomen mit<br />
Hilfe verschiedener Techniken dargestellt. Zum einen kam in dieser Arbeit die Giemsa -<br />
Färbung zur Anwendung. Mittels dieser ist es möglich, Metaphase II-Chromosomen<br />
deutlich darzustellen. Allerdings ist die Auswertungsrate sehr niedrig (TARKOWSKI,<br />
1966). Es handelt sich dabei um eine Chromosomenspreizung, bei der die durch<br />
Natriumcitrat <strong>auf</strong>geblähte Oozyte mit Hilfe von Essigsäure zum Platzen gebracht wird.<br />
Nach Ausschwemmung der Chromosomen und Trocknung werden diese durch den<br />
Giemsa-Farbstoff gefärbt. Es geschieht leider sehr häufig, daß sich der<br />
Chromosomensatz so weit von seiner zugehörigen Oozyte entfernt, daß er nicht mehr<br />
zugeordnet werden kann.<br />
Die Lacmoid-Färbung hat deshalb die Giemsa-Methode in dieser Arbeit abgelöst. Hier<br />
betrug die Wiederfindungsrate der gefärbten <strong>Oozyten</strong> 100%. Durch das Auftragen<br />
zweier etwa 3 mm breiter Paraffin - Vaseline (9:1) Streifen wurde das Deckglas fixiert,<br />
um während der langen Verweildauer im Essigsäure-Alkohol-Gemisch (1:3) nicht<br />
abgespült zu werden. MALENKO (1994) tritt diesem Problem durch die Konstruktion<br />
einer feuchten Färbekammer entgegen. Sowohl bei MALENKO (1994) als auch in dieser<br />
Arbeit konnten alle Stadien der Meiose vom germinalen Vesikel über „Germinal vesicle<br />
breakdown“(GVBD), Prometaphase I, Metaphase I, Anaphase I, Telophase I und<br />
Metaphase II genauestens dokumentiert werden. So konnte geklärt werden, ob<br />
innerhalb einer Kultur wenigstens die Meiose wieder <strong>auf</strong>genommen wurde, oder ob der<br />
Arrest im GV-Stadium erhalten blieb. Nachteil der Lacmoid-Methode war, daß ein<br />
Zeitraum von mindestens 24 Stunden Fixierung in Essigsäure-Alkohol eingehalten<br />
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