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Foto: © MWG Biotech AG

LABORWELT

III/2001

Das Themenheft von

Nanobead-

Markierung von

DNA

Qualität von

Oligonukleotid-

Chips

Functional Genomics

2D/3D-Chips

für Genomics

und Proteomics

Marktübersicht

& Schwerpunkt

SNP-Analyse

Hochdurchsatz

Chip-Printing

Neue

Klonbibliotheken

Sensor-Chips

Proteomics

mit SELDI

Programmierbare

DNA-

Prozessoren

BIOCOM AG


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I N T R O

Zum Thema

Genfunktionsanalyse: Herausforderung

für die Technologieentwicklung

Functional Genomics sind en vogue. Bundesministerien fördern die Aufklärung

der Genfunktionen seit kurzem massiv. Die großen Laborausstatter

bringen der Reihe nach komplett neue Geräteserien zur Proteomanalyse auf

den Markt. Und auf der BIO war nicht sehr viel zu hören von Genomforschung,

dafür aber viel von Proteomics. Doch bevor sich die Hoffnungen erfüllen

können, auf Basis der Informationen aus den sequenzierten Genomen

und zellulären Proteinmustern effektiver und gezielter Medikamente zu

entwerfen, ist noch viel zu tun. Vor allem geht es darum, die jungen zur

Verfügung stehenden Analyse-Techniken zu optimieren bzw. neue zu etablieren

– um dann die im „3-Milliarden-Buchstaben-Heuhaufen“ der DNA

versteckten Gene, ihre Transkripte und Proteine zu erkennen und zellulären

Prozessen zuordnen zu können. Diese große wissenschaftliche Herausforderung

wird weltweit aufgegriffen, und es gibt beachtenswerte Teilerfolge.

Erste wesentliche Erkenntnisse aus den wertvollen, aber noch mit einigen

Ungenauigkeiten behafteten „Draft“-Sequenzdaten des menschlichen Erbguts

erwarten Experten bei der Diagnostik genetischer Variationen. Die

kleinste Einheit dieser Varianten sind Punktmutationen (SNPs = single nucleotide

polymorphisms). Nach einer Mitte Juli publizierten Studie des US-

Unternehmens Genaissance Pharmaceuticals gibt es im Schnitt 12 pro Gen,

die sich unter anderem auf die Metabolisierung von Medikamenten auswirken.

Die Unwirksamkeit oder Nebenwirkungen von Medikamenten verursachen

jährliche Folgekosten von Milliarden US-$. Diese gewaltigen Ressourcen

ließen sich einsparen, wenn es gelänge, die zugrundeliegenden genetischen

Varianten zu identifizieren und in der Arzneimittelentwicklung zu berücksichtigen.

Diese Aussicht hat Firmen, die SNP-Analysesysteme vermarkten,

wie Pilze aus dem Boden schießen lassen. Einige der Techniken und

Leistungsfähigkeit der Analysesysteme finden Sie in unserer Marktübersicht

(S. 19) und in unserem Schwerpunkt SNP-Analyse (S. 17, 24, 27).

Doch auch bei den sogenannten Biochips, die heute am häufigsten zur Genexpressionsanalyse

eingesetzt werden, sind technologische Sprünge zu verzeichnen:

Die zunächst radioaktiven Markierungen zum Beispiel, mit denen

die Oligonukleotide oder cDNA-Stückchen gelabelt wurden, sind inzwischen

von Fluoreszenzfarbstoffen abgelöst worden. Die so erhaltenen Chips sind jedoch

nur bedingt lagerfähig und die erhaltenen Floureszenzsignale nur mühsam

reproduzierbar zu quantifizieren. Neue Wege der universellen Molekülmarkierung

auf der Basis von Nanobeads, die diese Probleme lösen, beschreibt

Michael Köhler vom IPTH in Jena ab Seite 4. Darüber beleuchten

wir für Sie einige technologische Neuerungen – darunter ein programmierbares

Arrayfertigungssystem (S. 36) und einen Hochdurchsatz-Arrayer (S.

37) –, die vor kurzem auf der Eurobiochips in München vorgestellt wurden.

Nachdem in jüngster Zeit auch kritische Stimmen laut wurden, die die Qualität

der Sequenzdaten hinterfragten, ist es noch wichtiger zu wissen, was

tatsächlich auf dem Chip ist. Lesen Sie dazu unsere Beiträge (S. 12, 29 und

39) zur Qualitätssicherung von Oligonukleotid-Arrays, die sich immer stärker

neben cDNA-Filtern und -Chips am Markt etablieren.

Prädestinieren die einheitlichen physikalischen Eigenschaften der Oligonukleotide

diese Molekülklasse geradezu für Chipuntersuchungen, bereitet die

Heterogenität der Proteine dagegen noch große Schwierigkeiten. Gesucht

wird nach einer universellen Chipoberfläche, auf der sich die Funktionsträger

des Lebens idealerweise funktionell im Hochdurchsatz analysieren lassen. Erste

kommerzielle Systeme (s. 47) und neue Ansätze, die in Kürze vermarktet

werden sollen (S. 31), erproben nun auch die Chips für die Proteinanalyse.

Ob beim Aufspüren neuer Proteintargets – vor allem den Membranrezeptoren

– intelligente Einzelansätze oder Hochdurchsatzmethoden den

Durchbruch bringen werden, darf mit Spannung erwartet werden.

Eine angenehme Lektüre wünscht Ihnen

Ihr LABORWELT-Team

Information ordern? Kennziffer 11 LW 03 / www.biocom.de

4 REPORT

Nanobead-Labeling

MICHAEL KÖHLER ET AL., JENA

Inhalt

BLITZLICHT

12 Qualitätskriterien bei der

Herstellung von DNA-Arrays

HUBERT PAUL, MWG-BIOTECH,

EBERSBERG

MARKTÜBERSICHT

SNP-Analyse: Kinetische 17

Messungen auf DNA-Chips

FRANK BIER ET AL., POTSDAM-REHBRÜCKE

MARKTÜBERSICHT

Geräteüberblick SNP-Analyse 19

MARKTÜBERSICHT

SNP-Nachweis mit d-HPLC 24

IRIS FROHWEIN, VARIAN, DARMSTADT

MARKTÜBERSICHT

Large-Scale-Genotypisierung 27

von SNPs

DÉSIRÉE MOSNER ET AL.,

GAG BIOSCIENCE, BREMEN

BLITZLICHT

29 Geprüfte Oligonukleotide auf Plastikarrays

JENS THIELMANN, BD CLONTECH, HEIDELBERG

BLITZLICHT 31

2D/3D-Chips

HOLGER EICKHOFF ET AL.,

SCIENION AG,BERLIN

BLITZLICHT

34 Neue cDNA-Klonkollektionen und Datenintegration

RALF LÖBBERT, LION BIOSCIENCE, HEIDELBERG

BLITZLICHT

36 DNA-Array-Herstellung mit hohem

Durchsatz

MANFRED REMER, PACKARD, DREIEICH

BLITZLICHT

37 Geniom ® – programmierbare Arrays

MARKUS BEIER ET AL., FEBIT, MANNHEIM

BLITZLICHT

39 Sequenzoptimierte Oligonukleotide

CHRIS SEIDEL ET AL., OPERON, ALAMEDA

BLITZLICHT

40 Expressionsanalyse mit Gewebe-Arrays

MICHAEL EHRET, BIOCAT, HEIDELBERG

BLITZLICHT

42 Lab-on-the-Chip: Neue Anwendungen

DR. MEIKE KUSCHEL, AGILENT, WALDBONN

BLITZLICHT

45 XNA-on-Gold: Sensor Chips

DEV KAMBHAMPATI, THERMOHYBAID, ULM

BLITZLICHT

47 SELDI: Proteinchips

ANDREAS WIESNER, CIPHERGEN, Surrey

50 Produktwelt/Impressum

|transkript LABORWELT Nr. III/2001 | 3


R E P O R T

Nanobiotechnologie

Fluoreszenz-freie Markierung

und Detektion von DNA-Biochips

durch Nanobead-Labeling

J. MICHAEL KÖHLER UND WOLFGANG FRITZSCHE,

INSTITUT FÜR PHYSIKALISCHE HOCHTECHNOLOGIE JENA

Biochips als

Informationsschnittstelle

Die Datenmenge, die heute in PCs, auf CDs

und auf Festplatten gespeichert wird, bewegt

sich in der gleichen Größenordnung

wie die Datenmenge, die komplexe Genome

enthalten (ca. 10 9 - 10 10 bits). In beiden Fällen

werden die einzelnen Informationselemente

vorzugsweise linear abgelegt oder adressiert.

Doch die Mechanismen der biologischen

und die Natur der technischen Informationsspeicherung

unterscheiden sich beträchtlich.

Im einen Fall sind die Daten als

optisch oder magnetisch auslesbare Spots

auf einer Festkörperoberfläche eingeschrieben,

im anderen Fall als Abfolge von Modulen

in einer molekularen Kette. Die technische

Lösung besitzt den Vorzug sehr hoher

Lese- und Schreibgeschwindigkeiten, die

biologische den Vorteil extrem kleinen

Raumbedarfs und der direkten Ankopplung

an synthesechemische Maschinerien. Die

Herstellungs-, aber auch die Auslese- und

Schreibperipherie beider Systeme unterscheidet

sich drastisch. Deshalb ist die Entwicklung

von Schnittstellen zwischen den

digital-elektronischen, magnetischen oder

optischen Speichersystemen und den biomolekularen

von höchstem Interesse.

Biochips dienen der schnellen Übertragung

biomolekularer in digital-elektronische Information.

Dazu verbinden sie eine primäre

Transduktion durch eine selektive stoffliche

Erkennung mit einer universellen sekundären

Transduktion mit Hilfe eines hochparallel

anwendbaren physikalischen Ausleseprinzips.

Eine parallele Auslesung gewährleistet

eine hohe Rate der Datenübertragung.

Die hohe Parallelität wird durch eine Vielzahl

von Oberflächenspots erreicht, von denen

jeder eine bestimmte chemische Spezies

trägt, so daß in der Summe aller auf einem

Chip enthaltenen Spots eine oberflächengekoppelte

Substanzbibliothek realisiert ist. In

dieser können die einzelnen chemischen

Spezies durch ihre Koordinaten eindeutig

bestimmten Spots zugeordnet werden. Die

primäre Transduktion besteht damit in einer

ortsspezifischen chemischen Erkennung 1,2 .

Dabei sind sehr große Parallelisierungsgrade

erreichbar. Bei Rastermaßen von 400 µm

können etwa 2.500 Spots auf einem 5 mm

breiten Chip untergebracht werden. Könnte

man die lithographische Auflösung der fortgeschrittensten

Fertigungsverfahren der Mikroelektronik

ausnutzen, so wären Spotraster

bis herab zu etwa 400 nm möglich. Damit

könnten 600 Millionen Spots auf einem

Chip von einem Quadratzentimeter Fläche

untergebracht werden.

Die Geschwindigkeit der Signalgewinnung

hängt zum einen vom Zeitbedarf für die spezifische

molekulare Wechselwirkung und die

damit verbundenen Stofftransportprozesse

in der Umgebung der Chipoberfläche ab. Zum

anderen ist sie Funktion der Geschwindigkeit

der sekundären Transduktion, also der

Ermittlung der Spots auf denen Bindeereignisse

stattgefunden haben. Erstes ist im wesentlichen

ein physikochemisches Problem,

das von der chemischen Natur der beteiligten

Moleküle, der Bindungskinetik sowie der

Diffusion und Konvektion in der mobilen

Abb. 1: Bindung von

oberflächenfunktionalisierten

Nanopartikeln an eine

Chipoberfläche mit

komplementärer

Bindungsfunktion

(schematisch)

Phase abhängt. Da die molekulare Wechselwirkung

an allen Spots gleichzeitig stattfinden

kann, ist die Geschwindigkeit nicht vom

Parallelisierungsgrad abhängig. Das zweite

Problem ist im wesentlichen meßtechnischer

Natur. Bei serieller Auslesung wächst der

Zeitbedarf mit dem Parallelisierungsgrad.

Für ein rasches Auslesen großer Arrays sind

seriell arbeitende Verfahren deshalb indiskutabel.

Es werden bildgebende Verfahren

favorisiert, bei denen viele Spots gleichzeitig

erfaßt werden können. Da heute sehr

empfindliche bildgebende Detektoren kostengünstig

verfügbar sind, bieten sich optische

Meßtechniken für das Auslesen an. Die

direkte Auslesung der Anlagerung von

Molekülen auf Oberflächen ist relativ zeitintensiv

und apparativ aufwendig. An einer

Verbesserung solcher Verfahren wird zwar

gearbeitet, eine bald in der Breite nutzbare

und kostengünstige Lösung ist jedoch nicht

abzusehen.

Für ein hochempfindliches und hochparalleles

Auslesen molekularer Bindeereignisse

haben sich Markierungstechniken bewährt.

Während anfangs wegen ihrer hohen Empfindlichkeit

Radionuklid-Markierungen zum

Einsatz kamen, werden inzwischen überwiegend

Fluoreszenzfarbstoffmarkierungen

eingesetzt. Diese besitzen den Vorteil einer

hohen Empfindlichkeit bei arbeits- und umweltschutztechnisch

einfacherer Handhabung.

Gegenüber einfachen photometrischen

Techniken zeichnen sie sich dadurch aus,

daß durch eine räumliche, spektrale und

gegebenenfalls zusätzlich noch durch eine

zeitliche Entkopplung von Fluoreszenzanregung

und Fluoreszenz-Emissions-Messung

kleine Signale praktisch hintergrundfrei

detektiert werden können.

Probleme der Markierung

mit Fluoreszenzfarbstoffen

Die Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen

bringt jedoch eine Reihe von Problemen mit

sich. Vom Standpunkt des Arbeits- und

Umweltschutzes sind Fluoreszenzfarbstoffe

nicht unbedenklich. Farbstoffe etwa, die

als Interkalatoren zur Messung der Konzentration

doppelsträngiger Nukleinsäuren eingesetzt

werden, lagern sich in die molekulare

Kette des Erbgutträgers ein und verursachen

Fehler bei dessen Replikation oder Transkription.

Diese können zu Mutationen oder

Störungen in der Proteinbiosynthese führen

und Krebs auslösen oder begünstigen. Auch

nicht-interkalierende Farbstoffe, die sich

chemisch an DNA oder RNA koppeln lassen,

können mutagen wirken.

Aber auch meßtechnisch bringt die Fluoreszenzfarbstoffmarkierung

Probleme mit sich.

Kennziffer 12 LW 03/www.biocom.de Info

4 | Nr. III/2001 |transkript LABORWELT


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R E P O R T

Abb. 2: Verfahrensablauf beim sekundären

Labeling mit Fluorophor-Markern oder Metall-

Nanopartikeln

Denn das Fluoreszenzsignal hängt nicht nur

von Intensität und Wellenlänge des Anregungslichtes

und der Dichte der gebundenen

Farbstoffmoleküle ab, sondern auch von

der chemischen Umgebung der Farbstoffmoleküle.

Umgebungsabhängige Quantenausbeuten

schränken die Übertragbarkeit

und Reproduzierbarkeit von Meßergebnissen

deutlich ein. Die elektronische Anregung

der Farbstoffmoleküle durch die absorbierten

Photonen führt zugleich zu Nebenprozessen.

Neben der strahlungslosen

thermischen Relaxation findet in einem gewissen

Umfang auch eine chemische Umwandlung

aus dem angeregten Zustand statt.

Dadurch werden Chromophore zerstört, so

daß während der Messung die Zahl der absorbierenden

und fluoreszierenden Moleküle

abnimmt. Diese Strahlungsdegradation

– auch Photobleichung genannt – ist ihrerseits

von der chemischen Umgebung abhängig.

Sie trägt zur Unsicherheit bei der

quantitativen Bewertung von Fluoreszenzsignalen

bei.

Die Farbstoffmoleküle sind auch bei längerfristiger

Lagerung nicht ohne weiteres stabil,

da sie neben dem raschen photochemischem

Abbau auch einem thermischen Abbau

unterliegen, der allerdings deutlich langsamer

verläuft. Farbstoffmarkierte Biochips

können deshalb nur bedingt archiviert werden.

Oberflächenfunktionalisierte

Metall-Nanoteilchen

Die Schwierigkeiten bei der Anwendung von

Fluoreszenzfarbstoffen für die Markierung

von Biochips können vermieden werden,

wenn an ihrer Stelle Nanopartikel zum Einsatz

kommen 3 . Nanopartikel vereinigen in

sich Eigenschaften von Festkörpern und von

Molekülen. Sie sind typische Vertreter sogenannter

mesoskopischer Systeme, deren

Verhalten im Grenzbereich zwischen Quantensystemen

und makroskopischen Systemen

angesiedelt ist.

Die Wechselwirkung größerer Partikel mit

Festkörperoberflächen wird zumeist von

unspezifischen Wechselwirkungen dominiert.

Dies erklärt sich dadurch, daß bei Kontaktflächen,

die nicht nur einzelne Atome

oder funktionelle Gruppen betreffen, sondern

ausgedehntere Ensembles einbeziehen,

die Summe vieler schwächerer unspezifischer

Wechselwirkungen, wie etwa van-der-

Waals-Bindungen und Dipol/Dipol-Effekte,

eine einzelne oder einige wenige spezifische

Bindungen dominiert. Reduziert man

den Durchmesser von Partikeln, so können

diese mit bestimmten chemischen Oberflächengruppen

spezifische Wechselwirkungen

mit komplementär bindenden Gruppen einer

Festkörperoberfläche eingehen, wobei

die stärkeren spezifischen Wechselwirkungen

die Summe der unspezifischen Wechselwirkungen

übertrifft.

Eine hochspezifische Wechselwirkung kann

durch die Hybridisierung zueinander komplementärer

Nukleinsäuresegmente (Oligonukleotide)

erreicht werden, von denen der

eine Typ eine an eine planare Festkörperoberfläche

gebunden ist, der komplementäre

an einen Nanopartikel (Abb. 1). Dazu werden

Oligonukleotide mit einer Thiolgruppe

versehen. So thiolierte Oligonukleotide bilden

auf Goldoberflächen selbstassemblierende

molekulare Filme aus, wobei die Thiolgruppe

eine feste Verbindung mit der Metalloberfläche

eingeht. Untersuchungen zum

Bindeverhalten von Gold-Nanopartikeln, die

mit Oligonukleotiden funktionalisiert waren,

zeigten, daß bei Partikeldurchmessern

zwischen 15 und 60 nm noch gut eine spezifische

Bindung an Chipoberflächen erreicht

werden konnte, die mit den komplementären

Oligonukleotiden bedeckt waren. Oberflächen,

die mit nicht-komplementären

DNA-Segmenten versehen waren, zeigten

keine oder zumindest eine signifikant schwächere

Affinität gegenüber den entsprechenden

Nanopartikeln. Damit werden Metallteilchen,

die immerhin noch einige Hunderttausend

bis Millionen Atome enthalten,

wie Moleküle chemisch selektiv gekuppelt 4,5 .

Die Kopplung funktioniert auch, wenn die

Dichte der komplementär bindenden Moleküle

auf der Festkörperoberfläche verringert

wird. Wahrscheinlich genügen einige

wenige, vielleicht sogar nur eine einzige Bindung,

um das Metallteilchen auf der Oberfläche

zu fixieren. Damit wird ein enorm

günstiges Verhältnis von gekoppelten Atomen

zu koppelnder Bindung erreicht. Wahr-

scheinlich liegt dieses Verhältnis im Bereich

zwischen 10 4 und 10 6 . Allein diese große

Zahl bedeutet einen signifikanten Verstärkungseffekt.

Neben der Zahl der Atome spielt

aber ihre Art eine noch viel bedeutsamere

Rolle. Metallische Nanopartikel sind elektronenleitfähig

und gehen mit elektromagnetischer

Strahlung intensive Wechselwirkungen

durch Streuung, Absorption oder

Reflexion ein. Besonders attraktiv sind sie

aufgrund ihrer starken, Partikelgrößen-abhängigen

Absorption von Licht im Bereich

der Plasmonenresonanzfrequenz.

Partikel aus Edelmetall können außerdem in

einfachen Redoxprozessen katalytisch wirken.

Dieser Effekt ist aus der Fotografie bekannt.

Dort werden metallische Primärkeime,

die im Extremfall aus nur vier Silberatomen

bestehen durch einen Redoxprozeß verstärkt,

in dem Elektronen aus einem Reduktionsmittel

(dem Entwickler) auf Silberkationen

übertragen werden. Während für einen

solchen Verstärkungsprozeß in der Fotografie

Silberhalogenidkristalle als Silberionenspender

fungieren, kann für die metallkatalysierte

Verstärkung an oberflächenimmobilisierten

Goldpartikeln das Silber

auch in Form von gelösten Silberionen zugeführt

werden. Mit einem solchen Prozeß ist

eine rasche chemische Verstärkung von einmal

fixierten Goldpartikeln möglich:

(Au

Ag + + Reduktionsmittel kat

)

Ag

Abb. 3: Ausbildung

einer scharfen Kante

der Nanopartikelbedeckung

auf einer

Chipoberfläche an

der Grenze zwischen

einem bindenden

und einem nichtbindenden

molekularen

Oberflächenfilm

(SFM-Aufnahme)

Will man ein solches Verstärkungsverfahren

einsetzen, so brauchen die spezifisch zu

bindenden Metallpartikel, also die eigentlichen

Markierungselemente, nicht maximiert

zu werden. Man kann ihre Größe den Erfordernissen

der selektiven Oberflächenreaktion

anpassen.

Der Einsatz von Metallpartikel für die Markierung

von molekularen Bindeereignissen

greift die bewährten Prinzipien der Radioisotopmarkierung

bzw. der Fluoreszenzmarkierung

auf. Es bleibt die Reihenfolge der

wesentlichen Prozeßschritte erhalten (Abb.

2):

Inkubation eines Testchips mit der Probenflüssigkeit

Spülprozeß

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R E P O R T

Abb. 4: Mikrospots von Oberflächenfilmen

(10 µm x 10 µm), die in eine nicht-bindende

Umgebung eingebettet sind. Abbildung der

erhöhten Partikeldichte durch Rasterkraftmikroskopie

(Spotbreite: 10 µm)

sekundäre Inkubation mit dem Markierungsmaterial

(funktionalisierter label)

Spülprozeß

Ausleseprozeß.

Die Edelmetall-Label besitzen eine Reihe von

Vorteilen gegenüber den konventionellen

Markierungsvarianten. So werden ihre optischen

Eigenschaften im wesentlichen durch

das Metall selbst, aber kaum durch die molekulare

Umgebung bestimmt, wie das etwa

bei der Fluoreszenzquantenausbeute bei

Fluoreszenz-Labeln der Fall ist. Die Teilchen

verändern sich auch bei längerer Bestrahlung

nicht, so daß man zeitlich konstante

optische Signale erwarten kann, während

organische Farbstoffe praktisch immer eine

Strahlungsdegradation erleiden. Die Testchips

können archiviert werden, weil sie

auch bei längerer Lagerung keiner thermischen

Zersetzung oder etwa einem oxidativen

Abbau unterliegen. Schließlich sind sie

auch arbeitschutztechnisch weniger bedenklich

als Fluoreszenzfarbstoffe, insbesondere

als Interkalatoren, und erst recht gegenüber

dem Einsatz von Radionukliden.

Die selektive Anbindung von Nanopartikeln

läßt sich sehr gut anhand der Rasterkraftmikroskopie

(SFM) nachweisen. Aufgrund

der hohen Auflösung dieses Abbildungsverfahrens

können die einzelnen Gold-

Teilchen gut sichtbar gemacht werden. Bei

optimalen Verhältnissen können lateral mikrostrukturierte,

aber weitgehend geschlossene

Monofilme von Metallnanopartikeln

erzeugt werden. Zwischen bindenden und

nicht-bindenden Oberflächenbereichen bilden

sich scharfe Kanten in der Partikelbedeckung

aus (Abb. 3). Oberflächenmikrospots

aus monomolekularen Schichten, die

in eine nicht-bindende Umgebung eingebettet

sind – beispielsweise komplementäre Oligonukleotide

in einer Alkylsilanumgebung

–, liefern Flächen, die im Rasterkraftmikroskop

anhand ihrer höheren Partikeldichte gut

nachgewiesen werden können (Abb. 4).

Die Rastersondenmikroskopie ist für die Methodenentwicklung

ein sehr leistungsstarkes

Verfahren. Sie ist jedoch für Routineanwendungen

und speziell für das Auslesen

höher integrierter Arrays ungeeignet, da die

Chipoberflächen abgerastert werden müssen,

und der Zeitaufwand dadurch bei größeren

Flächen extrem hoch ist. Für die schnelle

Auslesung von Biochips, die mit Edelmetall-Nanopartikeln

markiert werden, gibt es

unterschiedliche Strategien. Entweder nutzt

man die elektrische Leitfähigkeit eines Ensembles

von Partikeln, gegebenenfalls auch

eines leitfähigen Netzwerkes, das sich nach

der chemischen Verstärkung in Bereichen

höherer Partikeldichte ausbildet. Alternativ

kann man auch die elektrochemischen Eigenschaften

der Oberfläche, die Doppelschichtkapazität

oder Redoxpotentiale auslesen

und über Impedanzmessungen die

Dichte angelagerter Metallpartikel bestimmen.

Die Metallpartikel erlauben jedoch auch

eine optische Auslesung, da sich durch ihre

Anwesenheit auf einer dielektrischen Chipoberfläche

neben den elektrischen auch die

optischen Eigenschaften entscheidend verändern.

Konzept des elektrischen

Auslesens

Die einfachste Variante einer elektrischen

Auslesung besteht in der Bestimmung der

Abb. 5: Ausbildung eines elektrischen

Kontaktes durch Anlagerung von Nanopartikeln

in einem Elektrodenspalt; a) größere

Spaltweite, hoher Bedeckungsgrad; b) kleine

Spaltweite, niedriger Bedeckungsgrad;

c) größere Spaltweite und niedriger Bedekkungsgrad

(schematisch)

Gleichstromleitfähigkeit zwischen zwei Elektroden.

Liegen die Partikel so dicht beieinander

und gegenüber den kontaktierenden

Elektroden, daß die Distanzen bzw. die die

Oberfläche bedeckenden Molekülschichten

durch Elektronentunneln überwunden werden

können, so führt die Bedeckung eines

Elektrodenspalts bei der Anlagerung der

Nanopartikel zu einem sprunghaften Anstieg

der elektrischen Leitfähigkeit. Wenn

die Spaltweite zwischen den Elektroden den

Durchmesser der Nanopartikel deutlich

übertrifft, müssen diese sehr dicht gepackt

sein, um einen elektrischen Durchgang zu

erreichen (Abb. 5a).

Abb. 6: Ausbildung eines elektrischen Kontaktes

durch Anlagerung von Nanopartikeln in

einem Elektrodenspalt bei größerer Spaltweite

und niedrigem Bedeckungsgrad mit

chemischer Verstärkung (schematisch)

Ein Kontakt läßt sich auch erreichen, wenn

die Wahrscheinlichkeit der Anbindung der

Nanopartikel nicht so hoch ist, dafür der

Spalt aber so klein ist, daß ein oder maximal

zwei Partikel angelagert werden müssen,

um den Spalt zu überbrücken (Abb 5b). Bei

niedrigem Bedeckungsgrad und höherer

Spaltweite wird kein Kontakt mehr hergestellt

(Abb. 5c).

Ein elektrischer Kontakt kann jedoch auch

bei niedrigerem Bedeckungsgrad leicht erreicht

werden, wenn die in geringerer Dichte

angebundenen Metallpartikel als Katalysatoren

für eine lokale Metallabscheidung

genutzt werden. Die von den Elektrodenkanten

und den Partikeln aus wachsende

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8 | Nr. III/2001 |transkript LABORWELT


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R E P O R T

Metallschicht führt zuerst an den partikelbedeckten

Spaltabschnitten zur Ausbildung

elektrischer Kontakte (Abb. 6).

Konzept des optischen

Auslesens

Einzelne Nanopartikel mit Abmessungen in

der Größenordnung von 30 nm können nur

mit größerem Aufwand durch optische Techniken

direkt ausgelesen werden, etwa durch

Nahfeldsondentechniken oder Streusignalmessungen.

Diese sind aufwendig bzw. anfällig

gegenüber Störsignalen. Wenn jedoch

auf mikrostrukturierten Flächen nicht ein

einzelner Nanopartikel, sondern kleinere

Partikel-Ensembles gebunden sind, so wirken

die Nanopartikel in der Wechselwirkung

mit elektromagnetischer Strahlung kooperativ.

Immerhin sind bei einer rund

10%igen Bedeckung auf einer Fläche von 3 x

3 µm 2 etwa 1.000 Partikel von 30 nm Durchmesser

vorhanden. Eingermaßen dicht liegende

Partikel sind im Ensemble in der Lage,

einfallendes Licht zu einem gewissen Anteil

zu reflektieren bzw. in seiner Transmission

zu dämpfen (Abb. 7). Dadurch wird ein einfaches

optisches Auslesen möglich. Die Messung

eines Reflexions- oder eines Transmissionssignals

ist wesentlich einfacher als die

Messung der Fluoreszenz. Außerdem ist das

Signal nicht von Umgebungseinflüssen abhängig

und leidet nicht unter photochemischer

Zersetzung der signalgebenden Marker.

Schon relativ kleine Gesamtzahlen von Partikeln

liefern ausreichende Bedeckungsgrade

und damit deutliche optische Meßsignale,

so daß sowohl in Transmission als auch in

Reflexion gut gemessen werden kann (Abb.

Abb. 7: Optische Signalentstehung

an Nanopartikel-bedeckten

Chipoberflächen

(schematisch)

8). Der Verstärkungseffekt der einzelnen

Bindungen für die Signalentstehung ist durch

die Anlagerung der Partikel der Fluoreszenzmarkierung

vergleichbar. Es kann jedoch

mit viel größeren optischen Ausgangssignalen

gearbeitet werden. Mit entsprechend

empfindlichen Nachweiselementen,

kann die Auslesung bei moderaten Beleuchtungsintensitäten

sehr rasch erfolgen. So

können Microarray-Anordnungen mit Spotgrößen

bis zu wenigen Mikrometern mit

Abb. 8: Optisches Signal von mikrostrukturierten

Nanopartikel-bedeckten Chipoberflächen

bei Auslesung in Reflexion (links) und in

Transmission (rechts)

einer CCD-Kamera bei sehr gutem Signal/

Rausch-Verhältnissen innerhalb von einer

oder wenigen Millisekunden bei Beleuchtung

mit einer Halogenlampe ausgelesen

werden (Abb. 9). Es wird davon ausgegangen,

daß mit entsprechenden Laser-Anordnungen

eine Auslesung im Mikrosekundenbereich

und darunter möglich ist.

Im unverstärkten Zustand ist eine rasche

Auslesung durch Reflexion oder Transmission

darauf angewiesen, daß die Zahl der

pro Fläche immobilisierten Markerpartikel

Abb. 9: Abbildung von

Mikrospots mit einer

CCD-Kamera bei

Auslesezeiten von 1 bis 3

Millisekunden (Spotdurchmesser:

4 µm)

nicht zu klein ist. Die Technik der chemischen

Verstärkung erlaubt jedoch auch bei

kleinen Partikeldichten eine einfache und

schnelle optische Detektion. So können Spots

bei kleinen Dichten von Bindegruppen und

relativ kleinem Verhältnis der gebundenen

Nanoteilchen in den Spots zur Dichte unspezifisch

gebundener Nanoteilchen in der

Umgebung noch in Reflexion sichtbar gemacht

werden, wenn die Nanoteilchen durch

eine chemische Verstärkung so weit vergrößert

werden, daß sie als Einzelpartikel in

Reflexion mit sichtbarem Licht nachgewiesen

werden können (Abb. 10). Damit ist die

Technik der Metallteilchenmarkierung in

Verbindung mit schnellem optischen Auslesen

auch auf sehr kleine Bindegruppendichten

anwendbar. Wahrscheinlich hat diese

Technik sogar das Potential zu einem echten

Nachweis für molekulare Einzelbindungereignisse,

verbunden mit einer robusten und

schnellen optischen Auslesung.

Nanoteilchen-

Markierungstechnik:

Künftiges Potential

Die Nanoteilchenmarkierung verspricht eine

Reihe von wichtigen Vorteilen gegenüber

der Markierung mit Fluoreszenzmolekülen.

Diese reichen von der allgemeinen Leistungsfähigkeit,

den Nachweisgrenzen, der Quantifizierbarkeit

und Übertragbarkeit, der Arbeitsgeschwindigkeit

und Praktikabilität bis

hin zu umwelt- und arbeitsschutztechnischen

Aspekten (siehe Tabelle). Einige der

Vorzüge sind nicht auf metallische Nanopartikel

oder Gold allein beschränkt, sondern

gelten auch für andere Nanopartikel

als Marker, etwa fluoreszierende Nanobeads

oder Nanobeads mit hohen Dichten

stabiler synthetischer Farbstoffe.

In den Möglichkeit der einfachen elektrischen

Auslesung, vor allem aber der schnellen

optischen Auslesung einer Vielzahl von

Bindeflächen durch bildgebende oder sehr

schnell arbeitende serielle Leseverfahren

wird ein herausragender Vorteil der Nanoteilchenmarkierung

gesehen. Dieser reicht

in seinen Konsequenzen noch weit über die

quantitativen Vorteile gegenüber der Fluoreszenzmarkierung

hinaus. Arrayverfahren

werden heute fast ausschließlich in der Genom-

und mRNA-Diagnostik eingesetzt. Der

Einsatz in der Nukleinsäureanalytik ergibt

sich aus der hohen chemischen Homogenität

dieser Stoffklasse, die den Einstieg in die

Array-Technologien bei dieser Substanzklasse

entscheidend begünstigt hat.

Der analytische Nachweis oder die quantitative

Bestimmung vieler unterschiedlicher

stofflicher Spezies ist jedoch kein Problem,

das auf die Nukleinsäurediagnostik beschränkt

ist. In weiten Bereichen der

Pharma-Entwicklung, in der biomedizinischen

Diagnostik, in der Veterinärhygiene,

10 | Nr. III/2001 |transkript LABORWELT


R E P O R T

in der Umwelt- und Agrartechnik, aber auch

in anderen Wirtschafts- und Lebensbereichen

wie in der Ausbeutung von Bodenschätzen,

der Qualitätssicherung bei Rohstoffen,

Pflege- und Nahrungsmitteln und

in der Kontrolle von Luft und Medien wird

der Bedarf an preiswerten Vielparameterbestimmungen

wachsen. Leider stehen für andere

Stoffklassen nicht so einfache Erkennungssysteme

zur Verfügung wie in der Sequenzerkennung

durch selektive Hybridisierung

im Falle von DNA und RNA. Es hat

in den letzten Jahren jedoch eine erheblich

über das Gebiet der Nukleinsäuren hinausreichende

Entwicklung zu molekularen Erkennungssystemen

eingesetzt. Diese wird

in Zukunft wahrscheinlich in Lösungen

münden, in denen auch stofflich unterschiedlichere

Gruppen von chemischen Spezies in

gemeinsamen Verfahren nachgewiesen und

quantifiziert werden können. Die Nanoteilchen-Markierungstechnik

bietet sich als universelle

Markierungsmethode für diese zukünftigen

Entwicklungen an. Die gegenwärtig

forcierten Anstrengungen zur Proteomcharakterisierung

werden möglicherweise

das erste Beispiel einer solchen Entwicklung

werden.

Literatur

[1] Gallop, M.A.; Barrett, R.W.; Dower, W.J.; Fodor,

S.P.A.; Gordon, E.M.: J. Med. Chem. 37 (1994), 1233

[2] Schena, M.; Shalon, D.; Davis, R.W.; Brown, P.O.:

Science 270 (1995),467

[3] Elghanian, R.; Storhoff, J.J.; Mucic, R.C.; Letsinger,

R.L.; Mirkin, C.A.: Science 277 (1997), 1078

[4] Köhler, J. M.; Reichert, J.; Csaki, A.; Fritzsche, W.:

DECHEMA-Statusseminar „DNA- Chiptechnologie:

Anwendung und Nutzung“ (Frankfurt/M. 24.-

25.1.2000), 42

Abb. 10: Optischer Nachweis von Bindeereignissen

bei der bevorzugten Kopplung an kleinen

Bindeflächen unter Nutzung von Nanoteilchenmarkierung

und nachfolgender metallkatalysierter

chemischer Verstärkung: Die einzelnen gebundenen

Nanoteilchen werden durch die Metallverstärkung

optisch sichtbar gemacht, wodurch

auch bei extrem niedrigen Bindedichten eine rasche

optische Auslesung von Bio-chips mit sehr

kleinen Spotdurchmessern möglich wird (links:

Maskenstruktur, Mitte: optisches Bild von Spots

mit niedriger Bindungsdichte nach Silberverstärkung,

rechts: Spots durch schwarze Kreise markiert,

oben: Positivstruktur, unten: Negativstruktur,

Spotdurchmesser: 4 µm)

[5] Möller, R.; Csaki, A.; Köhler, J.M.; Fritzsche, W.:

Nucleic Acid Research 28 (2000), 20

Korrespondenzadresse

Dr. Michael Köhler

Inst. f. Physikal. Hochtechnologie Jena

Winzerlaer Straße 10, D-07745 Jena

Postfach 100239, D-07702 Jena

Tel.: 03641-206-303, Fax: -206-399

eMail: michael.koehler@ipht-jena.de

Dr. W. Fritzsche

Inst. f. Physikal. Hochtechnologie

Winzerlaer Straße 10, D-07745 Jena

Postfach 100239

D-07702 Jena

Tabelle: Absehbare Vorzüge der Nanoteilchenmarkierung gegenüber der Markierung mit

Fluoreszenzmolekülen für den Nachweis von Bindeereignissen an molekularen Oberflächenspots

Problem Fluoreszenz-Marker Nanoteilchen-Marker

Umgebungseinfluß erheblich (Quantenausbeute) unabhängig

Ausbleichverhalten stark kein Ausbleichen

elektrische Auslesung nicht möglich möglich

chemische Verstärkung nicht möglich möglich

Auslesung in Reflexion nicht möglich effizient

Auslesung in Transmission nicht möglich effizient

Auslesezeiten Sekunden bis Minuten 0,001 s; µs-Bereich möglich

quantitative Übertragbarkeit eingeschränkt unabhg. v. Substanzklassen

universelle Anwendbarkeit nur begrenzt anwendbar universell anwendbar

langfristige Archivierung nicht sinnvoll unbegrenzt lagerfähig

Umweltbelastung mutagene Farbstoffe kaum bedenklich

Mehr Information gewünscht? Kennziffer 15 LW 03 oder www.biocom.de

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|transkript LABORWELT Nr. III/2001 | 11


B L I T Z L I C H T

Oligonukleotid-Arrays

Qualitätskriterien bei der

Herstellung von DNA-Microarrays

HUBERT PAUL, MWG-BIOTECH AG, EBERSBERG

DNA-Microarrays halten immer mehr Einzug in den Laboralltag. Der Begriff Microarray oder Biochip

meint die miniaturisierte systematische Anordnung von biomolekularen Sonden, wie Nukleinsäuren,

Peptiden, Proteinen oder Polysacchariden, auf einer planaren Festkörperoberfläche. Technisch am

weitesten entwickelt ist zur Zeit die DNA-Microarray-Technologie. Zur DNA-Microarray-Herstellung

werden im wesentlichen zwei Verfahren angewendet (siehe LABORWELT 3/00, S. 12 ff.). Zum

einen die technisch sehr anspruchsvolle, von der Halbleitertechnik adaptierte in situ-Synthese der

Nukleinsäuren auf dem Trägermaterial 1 , die zwar eine sehr hohe Integrationsdichte der Sonden

ermöglicht, aber zum Teil nur eine sehr begrenzte Flexibilität des Array-Designs erlaubt. Dieser steht

die technologisch weniger aufwendige ex situ-Synthese gegenüber, bei der die bereits synthetisierte DNA

mittels robotergestützer Verfahren durch Absetzen auf eine Trägeroberfläche aufgebracht wird 2 . Dies

ermöglicht die sehr flexible Herstellung von nieder- bis mitteldichten DNA-Arrays. Trotz des technologischen

Fortschrittes bei den DNA-Microarrays darf jedoch nicht übersehen werden, daß es bislang

keine einheitlichen Standards gibt 3 , weder für die Microarray-Herstellung noch für die Auswertung der

mit den Microarrays erzielten experimentellen Daten. Daher erlangt die Qualitätskontrolle von

Microarrays einen immer höheren Stellenwert bei der Diskussion von Microarray-Ergebnissen.

Key Words: Microarray, Oligonukleotide, Expression Profiling, Qualitätskontrolle

Optimale Oligonukleotidlänge

für Microarrays

Bei Oligonukleotid-Microarrays besteht immer

noch die Gretchenfrage nach der optimalen

Länge der Oligonukleotide. Zentraler

Punkt dieser Frage ist die Sensitivität

und Spezifität der Oligonukleotide. Abbildung

1 zeigt die Abhängigkeit der Signalintensität

(Fluoreszenz) der hybridisierten

Probe von der Länge des verwendeten Oligonukleotids

sowie von der Linkerlänge

des 5‘-aminomodifizierten Oligonukleotids.

Es gilt: Je länger das Oligonukleotid, desto

höher die Signalintensität der hybridisierten

Probe. Die Signalintensität eines 50mer

Oligonukleotids ist im Durchschnitt um

Faktor 1,5 höher als bei einem 40mer. Dies

wurde in mehreren unterschiedlichen Experimenten

sowohl mit komplexen als auch

mit singulären cDNA-Proben nachgewiesen

6,7 . Auch die Zunahme der Linkerlänge

des immobilisierten Oligonukleotids bewirkt

eine Steigerung der Signalintensität.

Dieser Effekt ist jedoch von der chemischen

Art der Trägeroberfläche und der damit

verbundenen Immobilisierungs-Chemie

des Oligonukleotids abhängig. Nach dieser

Beobachtung müßte die Strategie bei Oligonukleotid-Microarrays

lauten: je länger das

Oligo, desto sensitiver der Array. Dem stehen

einerseits Einschränkungen bei der

Synthese von Oligonukleotiden länger als

50 Nukleotide entgegen, andererseits Einschränkungen

beim Design der Oligonukleotide

sowie die wachsende Gefahr von

Kreuzhybridisierungen. Der höhere Herstellungspreis

längerer Oligonukleotide soll

dabei außer acht gelassen werden.

Kopplungseffizienz

bei der Oligonukleotidsynthese

Die Kopplungseffizienz bei Oligonukleotiden

liegt bei der gebräuchlichen Phosphoramidit-Chemie

bei durchschnittlich 99%. Das

bedeutet, daß 99 von 100 Oligonukleotidsträngen

bei einem Synthesezyklus um ein

Nukleotid erfolgreich verlängert werden, bei

einem Oligonukleotidstrang mißlingt die

Elongation. Wird ein 50mer Oligonukleotid

synthetisiert, so sind bei einer Kopplungseffizienz

von 99% am Ende nur rund 61% der

Kennziffer 16 LW 03/www.biocom.de Info

synthetisierten Stränge von voller Länge. Die

Kopplungseffizienz nimmt zusätzlich bei

zunehmender Oligonukleotidlänge infolge

sterischer Faktoren und veränderter Reaktionskinetik

ab. Durch die zunehmende Länge

des Oligonukleotids müssen die Kopplungszeiten

erhöht werden, somit nehmen die Nebenreaktionen

sprunghaft zu, z.B. Depurinierungen,

Aminierungen von T zu C oder

von G zu Diamino-Purin-Derivaten sowie

Oxidationen der Nukleobasen. Wird das Oligonukleotid

in situ auf dem Chip synthetisiert,

so beträgt die Kopplungseffizienz – je

nach Synthesetechnologie – gerade noch zwischen

85% und 97% 4, 7, 9 . Hier haben ex situ-

Oligonukleotid-Arrays einen unbestrittenen

Vorteil. Verkürzte oder depurinierte Oligonukleotide

sowie sonstige Nebenprodukte

und Verunreinigungen können vor der Immobilisierung

auf dem Trägermaterial abgetrennt

werden, was bei der Direktsynthese

von Oligonukleotiden auf dem Chip nicht

möglich ist. Zudem besteht die Möglichkeit,

alle Oligonukleotide mittels MALDI-TOF-

Massenspektrometrie (matrix assisted laser

desorption ionization, time of flight) auf ihre

Qualität im Sinne von Anwesenheit von verkürzten

Ketten oder Depurinierungsprodukten

sowie auf ihre Identität hin zu überprüfen.

MWG-Biotech führt diese Untersuchung

standardmäßig für alle Oligonukleotide, bevor

diese auf dem Trägermaterial immobilisiert

werden.

Spezifität

Aus bioinformatischer Sicht ist die Verwendung

von 50mer Oligonukleotiden bei DNA-

Arrays am besten geeignet, da nachgewiesen

Abb. 1: Einfluß der Oligonukleotidlänge und der Länge des Linkers auf die Signalintensität. Mit

zunehmender Oligonukleotidlänge nimmt die Signalintensität der hybridisierten Probe zu. Für

die beiden Arabidopsis thaliana-Klone ara5 und ara7 wurden Oligonukleotide unterschiedlicher

Länge generiert. Dabei war die Sequenz des 30mers in der Sequenz des 40mers enthalten und

die Sequenz des 40mers in der Sequenz des 50mers. Alle Oligonukleotide wurden mit einem C6-

Amino-Linker am 5´-Ende modifiziert, das 50mer-Oligonukleotid wurde außerdem mit einem

C12-Amino-Linker (durch C12 gekennzeichnet) sowie mit einem aus C12- und C6-Linker zusammengesetzten

C18-Linker (gekennzeichnet durch C12+6) versehen. Ferner wurden alle Oligonukleotide

mit einer einzelnen Cy3-markierten cDNA hybridisiert, die aus der entsprechenden in

vitro transkribierten RNA durch reverse Transkription hergestellt wurde.

12 | Nr. III/2001 |transkript LABORWELT


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B L I T Z L I C H T

werden konnte, daß durch noch längere Oligonukleotide

die Spezifität nicht erhöht wird.

In einem theoretischen Versuch wurden für

90 zufällig aus Saccharomyces cerevisiae ausgewählte

Gene nicht sequenzüberlappende Oligonukleotide

verschiedener Länge berechnet.

Die Sequenzen der gefundenen Oligonukleotide

wurden dann mittels eines Smith-

Waterman-Alignments mit allen offenen Leserastern

(open reading frames, ORF) der

Hefe verglichen. Dabei wurde überprüft, wie

oft die Sequenz eines einzelnen Oligonukleotids

bestimmter Länge nochmals im Hefegenom

mit einer definierten Ähnlichkeit gefunden

werden kann. Die dabei ermittelte Anzahl

der Treffer wurde durch die Anzahl der

Oligonukleotide der gegebenen Länge dividiert,

um so der Tatsache Rechnung zu tragen,

daß für ein gegebenes Gen zahlenmäßig

mehr kürzere als längere Oligonukleotide

entworfen werden können und somit auch

eine größere Zahl von Treffern gelandet werden

kann. Dem Experiment wird die Beobachtung

zugrundegelegt, daß zwei Transkripte

mit einer Ähnlichkeit größer gleich 75%

über 50 bp nicht mehr durch Hybridisierung

auf einem Oligonukleotid- oder cDNA-Array

voneinander unterschieden werden können 5 .

Wie in Abbildung 2 zu erkennen ist, sind

50mer Oligonukleotide spezifisch, da die Anzahl

der Treffer bei 75% Ähnlichkeit und höher

durch noch längere Oligonukleotide nicht

stärker abnimmt als bei 50mer Oligonukleotiden.

Längere Oligonukleotide sind somit nicht

spezifischer als 50mer-Oligonukleotide. Diese

Annahme wurde in Experimenten in der

Praxis bestätigt, wobei eine optimale Oligonukleotidlänge

von 55 Basen ermittelt wurde

7 . Essentiell beim Design von Oligonukleotiden

ist, daß die Sequenz eines Oligonukleotids

keine 15 Nukleotide oder mehr am Stück

enthalten darf, die zu einem Nicht-Ziel-Transkript

exakt komplementär sind, da dies sonst

zu Kreuzhybridisierung führt 5, 6 .

Qualitätskontrolle bei Microarrays

Abb. 2: Anzahl der Übereinstimmungen,

mit der die Oligonukleotide

für 90 zufällig

ausgewählte Hefegene mit

entsprechender Ähnlichkeit im

Hefegenom nochmals gefunden

werden konnten. Erläuterungen

siehe Text. Die Spezifität

kann durch Oligonukleotide

länger als 50 Basen nicht

mehr erhöht werden, da die

Anzahl der Sequenzübereinstimmungen

75% von längeren

Oligonukleotiden im

Vergleich zu 50meren nicht

mehr reduziert werden kann.

Für die meisten potentiellen DNA-Microarray-Anwender

stellt sich die Frage, ob ein auf

PCR-Produkten basierender oder ein auf Oligonukleotiden

basierender Microarray das Instrument

der Wahl ist. Für eine Massenproduktion

eines DNA-Microarrays ist es essentiell,

daß alle dafür verwendeten Komponenten

eine gleichbleibende Qualität besitzen. Bei

Microarrays auf PCR-Produkt-Basis (auch

cDNA-Arrays genannt) werden die PCR-Produkte

oder deren zugrundeliegende Template-DNA

nur in wenigen Fällen durch Sequenzierung

auf ihre Identität überprüft. Meist

werden die erhaltenen PCR-Produkte auf einem

Agarose-Gel aufgetrennt und hinsichtlich

ihrer zu erwartenden Größe und deren Homogenität

kontrolliert. Dieser Gel-Check ist unabdingbar,

da nicht jede PCR-Reaktion erfolgreich

ist und die Ausbeute sowie die Uniformität

an Produkt von Reaktion zu Reaktion beträchtlich

variieren können. PCR-Produkte mit

unscharfen Banden oder Mehrfachbanden

müssen eliminiert werden. In manchen Fällen

stellt die Abtrennung von PCR-Primer-Multimeren

vom gewünschten Produkt ein nicht zu

unterschätzendes Problem dar, vor allem bei

der Aufreinigung durch Ultrafiltration.

Abb. 3: Überprüfung der Immobilisierung von

Oligonukleotiden auf der Chipoberfläche

durch unspezifische Hybridisierung mit fluoreszenzmarkierten

Zufallsoligonukleotiden.

Mit Pfeilen gekennzeichnet sind Oligonukleotide,

die nur unzureichend immobilisiert wurden.

Die unterschiedlichen Intensitäten der

Spots sind durch die unterschiedliche

Sequenzverteilung bei der Herstellung der

fluoreszenzmarkierten Zufallsoligonukleotide

bedingt. Zudem stehen nicht alle Zufallsoligonukleotide

infolge von Sekundärstrukuren und

Multimerbildung für eine Hybridisierung zur

Verfügung. Ist ein Punkt kaum noch oder gar

nicht mehr zu detektieren, so kann davon

ausgegangen werden, daß die Immobilisierung

der Nukleinsäure fehlerhaft erfolgte

(Pfeile).

Bei Oligonukleotiden müssen die verkürzten

Oligonukleotide und sonstigen Nebenprodukte

sowie die für die nachfolgende Oligonukleotid-Immobilisierung

störenden Salze

und aminogruppenhaltigen Komponenten

effizient von den gewünschten Vollängenprodukten

abgetrennt werden. Für eine Aufreinigung

im hohen Durchsatz ist das nicht

mehr mittels HPLC, sondern nur noch mit

geeigneten Methoden wie der MWG-eigenen

HPSF ® -Technik (highly purified, salt free) zu

bewerkstelligen.

Auch für die nachfolgende Qualitätskontrolle

der Oligonukleotide mittels MALDI-TOF-

Massenspektrometrie ist die Salzfreiheit von

Vorteil. Wie bereits erwähnt, ist die Abtrennung

von verkürzten Oligonukleotiden und

sonstigen Fehlsequenzen vom Vollängen-

Oligonukleotid bei der in situ-Synthese auf

dem Chip nicht möglich.

Sind alle zu immobilisierenden Nukleinsäuren

– ob cDNA oder Oligonukleotide – gereinigt

und liegen in der entsprechenden Konzentration

im jeweiligen Spottingpuffer vor, so

kann mit dem mechanischen Aufbringen (Spotten)

der Nukleinsäuren auf das Trägermaterial

begonnen werden. Um sicherzugehen, daß

beim Überführen der Nukleinsäuren in die

beim Spotten verwendeten Mikrotiterplatten

kein Vertauschen oder Auslassen von Kavitäten

unterlaufen ist, hat es sich als sinnvoll

erwiesen, an bestimmten Plätzen der zu spottenden

Mikrotiterplatte entsprechende Kontrollen

zu plazieren. Diese ergeben je nach

Anordnung auf dem Array ein charakteristisches

Muster, für gewöhnlich in der linken

oberen und der rechten unteren Ecke eines

jeden Subarrays sowie an bestimmten Plätzen

innerhalb des Subarrays. Fehlt dieses Muster

nach Hybridisierung des Arrays mit den markierten

und zu den Kontrollen komplementären

Gegenstrang-Oligonukleotiden, so ist während

des Befüllens der Kavitäten oder beim

Spotten ein Fehler unterlaufen und daher keine

einwandfreie Zuordnung der Sonden auf

dem Array zu den entsprechenden Genen mehr

möglich. Zudem können diese Punkte als Referenzpunkte

für die Justierung eines Gitters bei

der Arrayauswertung herangezogen werden.

Kontrollspots

Diese Kontrollspots werden auch zur Überprüfung

möglicher Probenverschleppungen

herangezogen. Leuchtet nach der Hybridisierung

der Kontrollspots mit deren markierten

Gegenstrang-Oligonukleotid auch derjenige

Spot auf, der im Anschluß an den Kontrollspot

auf den Array aufgebracht wurde – also

meist der benachbarte Spot –, so kann davon

ausgegangen werden, daß eine Verschleppung

der zuvor gespotteten Probe stattgefunden

hat. Zwei mögliche Fehlerquellen

Kennziffer 17 LW 03/www.biocom.de Info

14 | Nr. III/2001 |transkript LABORWELT


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B L I T Z L I C H T

dafür sind eine Kontamination der Probe beim

Befüllen der Microtiterplatten, die sich unter

ungünstigen Umständen selbst mit einem

Pipettierroboter ereignen kann, oder ein nicht

vollständiges Reinigen des Arrayers nach der

zuletzt gespotteten Probe.

Immobilisierungskontrolle

Einige Arrayer-Systeme sind mit einer CCD-

Kamera ausgerüstet und kontrollieren bereits

beim Spotten der Arrays das ordnungsgemäße

Absetzen der Proben, dagegen nicht

deren korrekte Immobilisierung auf der Trägeroberfläche.

Eine andere Möglichkeit, das

Aufbringen der Probe auf die Trägeroberfläche

zu überprüfen, beruht auf der Beobachtung,

daß unter bestimmten Bedingungen

DNA durch Streuung von Laserlicht beim

Einscannen mit einem Arrayscanner des noch

nicht prozessierten Arrays visualisiert werden

kann. Die Güte der Proben-Immobilisation

kann nach dem Prozessieren der Microarrays

durch unspezifisches Hybridisieren des

Arrays mit fluoreszenzmarkierter DNA getestet

werden (Abb. 3). Auch eine Visualisierung

der immobilisierten DNA durch Anfärben

des Arrays mit einem nukleinsäurebindenden

Fluoreszenzfarbstoffes 8 ist eine gängige

Methode bei der Qualitätskontrolle. Die

aufwendigste, aber auch eine der effektivsten

Methoden bei der Immobilisierungskontrolle

ist die Hybridisierung mit einer markierten

komplexen cDNA- oder cRNA-Probe. Bei diesem

Kontrollexperiment müssen dieselben

Expressionswerte für jede einzelne DNA-Sonde

wiedergefunden werden, wie sie bei der

Entwicklung und Validierung des Arrays ermittelt

worden sind. Voraussetzung dafür ist

aber die Verwendung eines „goldenen Standards“

als Hybridisierungsprobe. Diese doch

aufwendige und teure Qualitätskontrolle wird

meist dann eingesetzt, wenn eine neue Charge

von Oligonukleotiden oder PCR-Produkten

bei der Arrayherstellung verwendet wurde.

Auch die Hybridisierung von Arrays mit

fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden, die

zu den immobilisierten Sonden komplementär

sind, wird aus Kostengründen kaum

durchgeführt. Die Kosten für diese Art von

Qualitätskontrolle können allerdings drastisch

gesenkt werden, wenn der komplementäre

fluoreszenzmarkierten Gegenstrang

in einer enzymatischen Reaktion unter Verwendung

des Klenow-Fragmentes, dNTPs,

Random-Primer und von DNA (Oligonukleotide

oder PCR-Produkte) hergestellt wird,

die dieselbe Sequenz hat, wie die auf dem

Array immobilisierte DNA.

Alle Immobilisierungskontrollen werden aus

Zeit- und Kostengründen und nicht zuletzt

aufgrund der anfallenden riesigen Datenmengen

nur stichprobenartig durchgeführt.

Dabei hat es sich als sinnvoll erwiesen, Arrays

vom Anfang sowie von der Mitte und

dem Ende eines jeden Arrayverlaufs zu kontrollieren.

Ausblick

Trotz der hohen Herstellungsqualität gibt es

noch keine praktikable automatisierte Methode

zur Qualitätskontrolle von DNA-Arrays.

Die meisten QC-Methoden sind verläßlich,

doch mit einigem Arbeits- und Kostenaufwand

verbunden. Bedingt durch die unterschiedlichsten

Herstellungsverfahren von

DNA-Arrays ist auch in unmittelbarer Zukunft

nicht mit einem Standard-QC-Verfahren

zu rechnen. Bezüglich des Austausches

und Vergleiches experimenteller Microarray-

Daten ist trotz einiger Bemühungen in nächster

Zeit mit keinem Standard zu rechnen, da

ein Vergleich von Microarray-Daten sehr von

der Art und Qualität der Arrays abhängt.

Dagegen zeichnet sich ein Trend weg von

den cDNA-Arrays und hin zu den Oligonukleotid-Arrays

ab. Bedingt wird dies durch

die qualitativ hochwertige und im größeren

Maßstab durchführbare Oligonukleotidsynthese.

Selbst wenn die Meinungen um die

„optimale Oligonukleotidlänge“ noch etwas

auseinander gehen, so besteht eine Tendenz

bei Oligonukleotid-Microarrays zur Verwendung

von Oligonukleotiden größer als 40

Nukleotide.

Bioinformatik

Literatur

[1] Fodor, S.P.A. et al., Science 251 (1991), 767-773.

[2] Schena, M., Shalon, D., Davis, R.W., Brown, P.O.,

Science 270 (1995), 467-470.

[3] http://www.dnachip.org/mged3/

[4] McGall, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93 (1996),

13555-13560.

[5] Kane, M.D. et al., Nucleic Acids Res. 28 (2000),

4552-4557.

[6] eigene Beobachtungen, nicht publiziert.

[7] Huges, T.R. et al., Nature Biotechnology 19 (2001),

342-347.

[8] Battaglia, C, Salani, G, Consolandi, C, Rossi Bernardi,

L, De Bellis, G., Biotechniques 29 (2000) 78-81.

[9] McGall, G. et al., J. Am. Chem. Soc. 119 (1997),

508 1-5090.

Korrespondenzadresse

Dr. Hubert Paul

MWG-Biotech AG

Abteilung Biochip / Microarray-Entwicklung

Anzinger Str. 7

85570 Ebersberg

Tel.: 08092-8289170

Fax: 08092-8289310

eMail: hpaul@mwgdna.com

www.mwg-biotech.com

Bioinformatik-gestützte Auswahl von

Sonden für DNA-Arrays mit humanen Genen

Der Transkriptionsstatus einer eukaryotischen Zelle kann mit Hilfe von DNA-Microarray-Analysen

bestimmt werden. Dabei kann die Auswahl der Gene aber nur dem

jeweiligen Stand der Wissenschaft entsprechen. Die für das Humangenom seit vorigem

Jahr vorliegenden „Draft“-Daten werden daher kontinuierlich ergänzt: Die Gesamtzahl

der menschlichen Gene wird heute auf rund 35.000 geschätzt. Etwa 20% des Humangenoms

sind vollständig entziffert, für weitere 80% der Heterochromatinregion liegen nur

unvollständige Sequenzen vor. Für etwa 40% der Gene gibt es inzwischen vollständige

Sequenzen. Im menschlichen Genom werden etwa 9 Millionen polymorphe Basenaustausche

(SNPs) erwartet. Davon sind 20% als Kandidaten in öffentlichen Datenbanken

eingetragen. Nur etwa 1.000 Genmutationen von 6.000 in der OMIM-Datenbank eingetragenen

monogen vererbten Merkmalen sind bekannt. Die Aufdeckung von Sequenzvarianten

bei genetisch komplex vererbten Krankheiten gestaltet sich weit schwieriger.

Weiterhin kann man für etwa 1.800 Gene einen Bezug zum Krebsgeschehen ableiten.

Das Phänomen des alternativen Splicings spielt eine entscheidende Rolle in der Entwicklung

und für die Gesundheit vieler höherer Organismen. In komplexen Genen kann

alternatives Splicing zu Hunderten unterschiedlicher mRNA-Isoformen aus einem einfachen

Transkript führen. Ein weiterer Aspekt sind Mutationen an Splice-Stellen, da sie

einen Beitrag zu krankheitsverursachenden Exonsprüngen, Aktivierung kryptischer Splice-Stellen

sowie Entstehung von Pseudo-Exons innerhalb eines Introns oder Intron-

Unterdrückung darstellen.

Die DNA-Microarrays (10.000 und 2000 humane Gene) werden bei der MWG-BIOTECH AG

routinemäßig innerhalb des BioGIST-Managementsystems produziert. Dabei werden spezifische

Parameter für die Optimierung der Oligonukleotide gesetzt. Die Oligonukleotide

basieren auf der MWG-eigenen Datenbank der Protein-codierenden Sequenzen (CodeSeq).

Sie dimerisieren nicht, haben keine Ähnlichkeit zu polymorphen Regionen und können in

bezug auf Länge und GC-Gehalt angepaßt werden. Außerdem werden Oligonukleotide mit

einer Homologie von mehr als 75% und Abschnitten von 15 Basen innerhalb des Oligonukleotids

mit einer Homologie von 100% ausgeschlossen, um Kreuzhybridisierungen

mit anderen Genen zu vermeiden. Die Splicevarianten werden ebenfalls berücksichtigt.

Dr. Bernd Drescher, MWG-BIOTECH AG, Director for Life Sciences IT

16 | Nr. III/2001 |transkript LABORWELT


M A R K T Ü B E R S I C H T

Genetische Variation

Neue Wege der SNP-Analyse: Kinetische

Messungen auf einem DNA-Chip

FRANK F. BIER, EVA EHRENTREICH-FÖRSTER, NENAD GAJOVIC-EICHELMANN, ANDREA GRIEP, FRANK

KLEINJUNG*, JÖRG HENKEL; FRAUNHOFER INSTITUT FÜR BIOMEDIZINISCHE TECHNIK, ABT. MOLEKULARE

BIOANALYTIK UND BIOELEKTRONIK, BERGHOLZ-REHBRÜCKE. *JETZT: NOXXON PHARMA AG, BERLIN

Einzelbasenabweichungen (Single nucleotide

polymorphism, SNP) in wichtigen Genen der

am Metabolismus beteiligten Enzyme sind derzeit

intensiv diskutierte Kandidaten für die

individuellen Reaktionen von Patienten auf

Medikamente. Die Pharmakogenomik befaßt

sich mit der Aufklärung dieser Zusammenhänge.

So kommt eine US-Statistik 5 zu der Abschätzung,

daß Arzneimittel-Unverträglichkeiten

bei den Todesursachen an vierter Stelle

stehen. Das Ziel wird von vielen Forschern

darin gesehen, unter Kenntnis der Therapierelevanten

SNPs individuell angepaßte Therapien

zu entwickeln und damit eine bessere

Wirkung mit weniger Nebenwirkungen zu

erreichen. Aber bereits bei der alltäglichen

Nahrungsaufnahme können veränderte Enzyme,

die etwa durch einen SNP in nur einer

Aminosäure verändert sind, unterschiedliche

Verwertungen bis hin zu krankhaften Störungen

mit sich bringen. Mit dem komplexen

Zusammenwirken von genetischer Prädisposition

und Nahrungsaufnahme beschäftigt sich

die Nutrigenomik. Diese Zusammenhänge

aufzuklären ist das Anliegen des kürzlich

durch das Bundesforschungsministerium

(BMBF) geförderten BioProfile-Verbundvorhabens

unter Federführung des Deutschen

Instituts für Ernährungsforschung in Potsdam-

Rehbrücke gemeinsam mit den Max-Planckund

Fraunhofer-Instituten in Potsdam und

Berlin-Dahlem. Die Umsetzung der hier vorgestellten

Technik in Diagnostika und Produkte

der Bioanalytik ist ein Ziel des BioHy-

Tec-Verbundes, der gefördert durch die InnoRegio-Initiative

des BMBF mit 20 Firmen

und Forschungseinrichtungen unter Federführung

der Universität Potsdam eine Infrastruktur

für die Entwicklung und Produktion von

Biosensoren und Biochips aufbaut.

Damit ist das große Interesse an der Analyse

von SNPs als ein einfaches Beispiel genetischer

Variation verständlich. Jedoch müssen

wahrscheinlich zehn Millionen individuelle

DNA-Variationen untersucht werden, um den

Einfluß der SNPs beherrschbar zu machen,

meint Francis Collins, der Leiter des amerikanischen

Instituts für Humangenomforschung.

Die Notwendigkeit geeigneter Meßmethoden

ist damit evident. Die heute etablierte Chip-

Technologie 1,2 ist im allgemeinen nicht in der

Lage, SNPs eindeutig zu detektieren.

Dies wird an einem Beispiel mit zwei verschiedenen

PCR-Produkten verdeutlicht, einer

Wildtyp-DNA und einer SNP-DNA. Auf der

Oberfläche eines Chips ist eine 13mer-DNA-

Sonde immobilisiert, die komplementär zur

Wildtyp-DNA ist und die Abweichung der

SNP-DNA im Zentrum hat. Die Bindungsstärke

(K D

) der beiden DNA-Typen unterscheidet

sich in diesem Fall um den Faktor 4. Die Bindungskonstanten

ändern sich mit der Temperatur.

Man kann daher durch Temperaturerhöhung

den Unterschied in den Bindungsstärken

vergrößern, verschlechtert dabei aber die

untere Nachweisgrenze durch eine generelle

Verschlechterung der Bindungskonstante. Die

Veränderung der Bindungskonstante im obigen

Fall wird durch die Änderung der Dissoziationsgeschwindigkeit

hervorgerufen, die

Mehr Informationen ordern? Kennziffer 18 LW 03 oder www.biocom.de

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|transkript LABORWELT Nr. III/2001 | 17


M A R K T Ü B E R S I C H T

Abb. 1: Zeitlicher Verlauf

einer Hybridisierung

bei Raumtemperatur.

Fullmatch („Wildtype“)

und Missmatch

(SNP) unterscheiden

sich deutlich in der

Dissoziationsgeschwindigkeit.

Dieser

Unterschied ist auch

dann noch leicht erkennbar,

wenn beide

Spezies in unterschiedlichen

Konzentrationen

oder in verunreinigten

Proben

vorliegen.

Assoziationsgeschwindigkeit ist nahezu unverändert

3 . Die Menge gebundener DNA ist

dem Signal (hier: ein Fluoreszenzsignal) proportional.

Die maximale Menge, die erwartungsgemäß

an den Chip binden kann, ist

daher durch die Formel

S = S 0

/ (1 + K D

/c)

gegeben, wobei S das Signal, S 0

das Maximalsignal,

K D

die Bindungskonstante und c die Konzentration

des jeweiligen PCR-Produktes in der

Meßlösung ist 4 . Die Konzentration eines PCR-

Produktes hat also denselben Einfluß auf die

gesamte Menge und damit auf das Meßsignal

wie der Unterschied in der Bindungsstärke.

Ausgehend von der Chiptechnologie und Erkenntnissen

aus der Biosensorik haben wir

deshalb eine Methode entwickelt, die unabhängig

von der Konzentration SNPs nachweisen

kann, indem die Dissoziationsgeschwindigkeit

bestimmt wird. Das ist die Geschwindigkeit,

mit der sich hybridisierte DNA natürlicherweise

wieder löst, denn auch auf der

Oberfläche eines Sensor-Chips findet eine thermodynamische

Bindungsreaktion aus Assoziation

und Dissoziation statt. Wildtyp und

SNP unterscheiden sich ausreichend in dieser

Konstante, sofern die Variation zentral genug

liegt. Wir haben daher ein Gerät mit einer

Fließzelle auf dem Chip entwickelt, das es

erlaubt, Hybridisierung und Dissoziation online

zu betrachten. Abbildung 1 zeigt Bindungskurven

der beiden PCR-Produkte, an

die an einer invarianten Stelle fluoreszierende

Marker hybridisiert wurden (Abb. 1).

Bei einem Hybridisierungsexperiment bei

niedriger Temperatur (hier: 25 °C) werden die

PCR-Produkte in einen Pufferstrom injiziert,

der den Chip umspült. Die zuvor in Einzelstränge

zerlegten PCR-Produkte hybridisieren

nun an die auf dem Chip immobilisierten

DNA-Sonden (Bereich A in Abb. 1). Anschließend

wird die nicht hybridisierte DNA aus der

Meßzelle entfernt und der Chip nur von Puffer

umspült. Bereich B in Abbildung 1 charakterisiert

die Zeit, in der unspezifisch gebundene

DNA entfernt wird. Hybridisierte DNA löst

sich von der Oberfläche wieder ab, dieser Prozeß

wird über einen längeren Zeitraum (ca. 30

min) verfolgt (Abb. 1, Bereich C). Die Geschwindigkeit,

mit der DNA natürlicherweise

von der immobilisierten Sonde dissoziiert, ist

charakteristisch für die Paßfähigkeit. Die Geschwindigkeitskonstante

wird mit einer speziellen

Kurvenanpassung auf die Dissoziationsphase

bestimmt, die spezifische Oberflächeneigenschaften

berücksichtigen muß. In

Abbildung 1 ist die Wildtyp-DNA durch eine

geringe Abnahme des Fluoreszenz-Signals

bereits optisch von der deutlich instabileren

SNP-DNA zu unterscheiden. Die Dissoziationsgeschwindigkeiten

von Wildtyp- und SNP-

DNA unterscheiden sich deutlich. Aber auch

in unreinen Gemischen ist eine Identifizierung

verhältnismäßig leicht möglich, wenn die Kurvenanpassung

gelingt. Dies zeigen in Abbildung

1 die unteren beiden Kurven, bei denen

nur die mathematische Analyse zu einem sicheren

Ergebnis führt. Bei den Kurven der

angereicherten Proben kann man an dem höheren

Signal der SNP-DNA zu Beginn der

Dissoziationsphase (Pfeil) erkennen, daß die

Konzentration der SNP-DNA mehr als 20fach

größer ist als die der Wildtyp-DNA, obwohl

die Bindung der SNP-Sonde schwächer ist als

die des Wildtyps. Die Bestimmung über das

Gleichgewichtssignal, wie sie bei üblicher

DNA-Chip-Auswertung vorgenommen wird,

kann bei solchen Konzentrationsverhältnissen

leicht zu Fehlinterpretationen führen. Auf

einem DNA-Chip werden verschiedene Sonden

in einem Raster immobilisiert und PCR-

Produkte untersucht (Abb. 2).

In Abbildung 2 ist eine typische Messung dargestellt,

bei der unterschiedlichste Sonden (Länge,

Zusammensetzung) immobilisiert sind. Die

automatische Datenverarbeitung wird auf die

Felder von Interesse angewandt (im kleinen

Fenster unterlegt) und die Werte der Kurvenapassung

ausgegeben. Mit einer geeigneten

Datenanalyse-Software läßt sich in jedem einzelnen

Punkt die Menge an gebundener Wildtyp-DNA

sowie als Summenwert die Menge

an SNP-DNA bestimmen. Der Nachweis von

SNPs wird damit erheblich erleichtert.

Mit der Auswertung der Bindungskinetik wird

mehr Information aus einem Spot eines Arrays

gezogen. Die kinetische Auswertung erlaubt

daher auf die üblicherweise hohe Redundanz

von DNA-Chips zu verzichten und kann daher

zu erheblichen Kostensenkungen bei der Herstellung

von DNA-Chips beitragen.

Literatur

[1] Nature genetics Vol. 21 Suppl 1999

[2] Schena M., (Hrsg.) DNA-microarrays – a practical

approach, Oxford Universitiy Press, New York 1999

[3] Bier, F. F., Kleinjung, F., and Scheller, F. W. (1997).

Real-time measurement of nucleic acid hybridisation

using evanescent wave sensors: steps towards the

genosensor. Sensors and Actuators B, 38-39:78-82

[4] Karlsson, R. (1994). Real-time competitive kinetic

analysis of interactions between low-molecularweight

ligands in solution and surface-immobilized

receptors. Analytical Biochemistry, 221:142-151.

[5] Evans. W.E and Relling, M.V. (1999). Pharmacogenomics:

translating functional genomics into rational

therapeutics, Science 286: 487-491

Abb. 2: Auf einem DNA-

Chip können mehrere Hybridisierungsreaktionen

gleichzeitig in ihrem Verlauf

analysiert werden.

Nach Auswahl der Felder

des Arrays werden die

Meßkurven überlagert und

automatisch analysiert.

Korrespondenzadresse

Dr. Frank F. Bier

Fraunhofer-Institut f. Biomedizinische Technik

Abt. Molekulare Bioanalytik u.Bioelektronik

Arthur-Scheunert-Allee 114-116

D-14558 Bergholz-Rehbrücke

Tel.: 033200-88-378, Fax: 033200-88-452

eMail: frank.bier@ibmt.fhg.de

18 | Nr. III/2001 |transkript LABORWELT


T

S N P - A N A L Y S E

1 . Firmenanschrift/Ansprechpartner

Amersham Pharmacia Biotec h

Munzinger Str. 9

79111 Freiburg

eMail: cust.servde@apbiotech.com

Applied Biosystems

PE Deutschland GmbH

Brunnenweg 13

64331 Weiterstadt

Tel.: 06151-101-110

Dr. Thomas Schaefer

Applied Biosystems

PE Deutschland GmbH

Brunnenweg 13

64331 Weiterstadt

Tel.: 06151-101-110

Dr. Thomas Schaefer

Applied Biosystems

PE Deutschland GmbH

Brunnenweg 13

64331 Weiterstadt

Tel.: 06151-101-110

Dr. Thomas Schaefer

® ® ®

2 . Gerätebezeichnung/Serie

MegaBace

500, MegaBace 1000, MegaBace 400 0 A BI PRIS M 310

Genetic Analyze r

A BI PRIS M 3100

Genetic Analyze r

A BI PRIS M 3700 Genetic Analyze r

3. Abmessungen des Systems

(Breite x Tiefe x Höhe, cm)

102

x 89 x 82 cm

61cm x 87cm x 56c m

74cm x 81cm x 55c m

77cm x 77cm x 135c m

4 . Komplettsystem/Zusatzgeräte erforderlich? Komplettsyste

m

Komplettsyste

m

K omplettsyste m

Komplettsystem (Standgerät )

5 . Kurzbeschreibung des Funktionsprinzips DNA-Sequenzierung und single nucleotide prime r

extension

DNA-Fragmentanalyse mittels Kapillarelektrophorese;

5-Farb-SNP-Detektion nach Primerextension mit dem

® M

A BI PRISM S NaPsho t Multiplex-Ki

T

t

DNA-Fragmentanalyse mittels Kapillarelektrophorese;

5-Farb-SNP-Detektion nach Primerextension mit dem

® M

A BI PRISM S NaPsho t Multiplex-Ki

T

t

6.

Kurzbeschreibung des Produktes/Systems

und seiner Komponenten

DNA-Fragmentanalyse mittels Kapillarelektro-

phorese; 5-Farb-SNP-Detektion nach

® M

P rimerextension mit dem ABI PRISM S NaPsho t

Multiplex-Kit

Kapillarelektrophorese mit 16-, 32-, 48-, 64-, 80-,

96-, oder 384 Kapillaren parallel je nach Modell und

Ausführung. Auswertung mit spezieller SNP-

bzw.

Sequenziersoftware auf WIN NT, WIN 2000 PC

®

A BI PRISM S NaPsho t Multiplex-System: SNa P

shot Multiplex Ready Reaction Mix, fluoreszenz-

®

m arkierte ddNTPs, AmpliTaq DNA-Polymerase,FS ,

Primerextension um 1 Base am 3´-Ende

®

A BI PRISM 310 Genetic Analyzer :

Kapillarelektrophorese ( 1 Kapillare)

®

A BI PRISM S NaPsho t Multiplex-System: SNa P

shot Multiplex Ready Reaction Mix, fluoreszenz-

®

m arkierte ddNTPs, AmpliTaq DNA-Polymerase,FS ,

Primerextension um 1 Base am 3´-Ende

®

A BI PRISM 3100 Genetic Analyzer :

Kapillarelektrophorese (16 Kapillaren)

®

A BI PRISM S NaPsho t Multiplex-System: SNa P

shot Multiplex Ready Reaction Mix, fluoreszenz-

®

m arkierte ddNTPs, AmpliTaq DNA-Polymerase,FS ,

Primerextension um 1 Base am 3´-Ende

®

A BI PRISM 3700 Genetic Analyzer :

Kapillarelektrophorese ( 96 Kapillaren)

7 . mögliche Anwendungen

SNP-Validierung, Linkage Mapping un d

Assoziationsstudien

SNP-Validierung,

Assoziationsstudien

Linkage

Mapping

und

SNP-Validierung,

Assoziationsstudien

Linkage

Mapping

und

7 .1 Einsatzbereich

S NP-Validation, SNP-Screenin g

S NP-Validation, SNP-Screening (medium throughput ) SNP-Validation, SNP-Screening (high throughput )

7 .2 geeignet für Erstidentifizierung von SNPs Geeignet für Erstidentifizierung von SNPs durc h

Sequenzierung.

nein

nein

nein

7 .3 zur Routineanwendung bereits bekannter SNPs Zur Routineanwendung bereits bekannter SNP s

durch primer extension

ja

ja

ja

8 . Durchsatz/Stunde

Sequenzierung bis zu 384 Proben/Stunde, Screenin g

primer extension bis zu 2000 Proben/Stunde

(abhängig vom Modell und der Anzahl der

Kapillaren)

Multiplex-Analyse

Kombinationen in

in einer Kapillare;

Multiplex-Analyse

Kombinationen in

in einer Kapillare;

Multiplex-Analyse von bis zu 10 Primer-Template-

Kombinationen in einem Reaktionsgefäß/

Auftrennung in einer Kapillare; Durchsatz bis zu 480

SNPs/Tag

von bis zu 10 Primer-Templateeinem

Reaktionsgefäß/Auftrennung

Durchsatz bis zu 7.680 SNPs/Tag

von bis zu 10 Primer-Templateeinem

Reaktionsgefäß/Auftrennung

Durchsatz bis zu 23.040 SNPs/Tag

9.

Technische

Daten

®

9 .1 Hardware

CE,

WIN NT oder WIN 2000 P C

A BI PRIS M 310 Genetic Analyzer: eine Kapillare ,

Argon-Laser (10mW), CCD-Kamera (64 x 512

Pixel), Vollautomat für bis zu 96 Proben,

automatische Probenzuführung mittels Autosampler,

Mac G4 mit OS 9.1

®

9 .1 ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer: 1 6

Kapillaren, Argon-Laser ( 25mW), CCD-Kamera ( 256

x 512 Pixel), Vollautomat für bis zu 2 x 384 Proben,

automatische Probenzuführung mittels Autosampler,

PC mit Win NT 4.0

®

A BI PRISM 3700 Genetic Analyzer: 96 Kapillaren ,

Argon-Laser (40mW), CCD-Kamera (330 x 1100

Pixel), Vollautomat für bis zu 4 x 384 Proben,

automatische Probenzuführung mittels

Pipettierroboter, PC mit Win NT 4.0

®

9 .2 Software/Auswertung/Datenbanken

S equenzanalysesoftware, SNP-Profiler-Softwar e D ata Collection, GeneScan Analysis, Genotype r -

Software

®

D ata Collection, GeneScan Analysis, Genotyper -

Software

®

D ata Collection, GeneScan Analysis, Genotyper -

Software

1 0. Extras/Besonderheiten

Vollautomatische Probeninjektion und Datenanalyse ,

automatische Fragmentgrößenbestimmung mittels

G eneScan - 120 LI Z Size Standar d

Vollautomatische Probeninjektion und Datenanalyse,

automatische Fragmentgrößenbestimmung mittels

G eneScan - 120 LI Z S ize Standard, SeqScap e -

Software mit integrierter Funktion für Basecalling,

Assembling, Alignment, Sequenzvergleich,

Heterozygoten/Mutations-Detektion

Vollautomatische Probeninjektion und Datenanalyse,

automatische Fragmentgrößenbestimmung mittels

G eneScan - 120 LI Z Size Standard, SeqScape ‘

Software mit integrierter Funktion für Basecalling,

Assembling, Alignment, Sequenzvergleich,

Heterozygoten/Mutations-Detektion, 8

Reservekapillaren

1 1. Preis (für eine typische Konfiguration) v on 350.000 DM bis 1.100.000 D M

je nach Systemausstattung, Kitgröße und Durchsatz ,

auf Anfrage

je nach Systemausstattung, Kitgröße und Durchsatz,

auf Anfrage

je nach Systemausstattung, Kitgröße und Durchsatz,

auf Anfrage

|transkript LABORWELT Nr. III/2001 | 19


:

M A R K T Ü B E R S I C H T

1 . Firmenanschrift/Ansprechpartner

Applied Biosystem s

PE Deutschland GmbH

Brunnenweg 13

64331 Weiterstadt

Tel.: 06151-101-110

Dr. Thomas Schaefer

Bruker Saxonia Analytik

Permoserstr. 15

04318 Leipzig

Dr. Martina Macht

Tel.: 0341-2431-409

Fax: 0341-2431-404

eMail: sales@bsax.de

GmbH

GAG BioScience

Dr. Jörn Mosner

Hochschulring

28359 Bremen

40

GmbH

Tel.: 0421-22308-0

Fax: 0421-22308-30

contact@gag-bioscience.de

www.gag-bioscience.de

® ®

2 . Gerätebezeichnung/Serie

A BI PRIS M 7900

HT Sequence Detection Syste m

a utofle x M ALDI-TOF-Massenspektromete r


3. Abmessungen des Systems

(Breite x Tiefe x Höhe, cm)

Basiseinheit 72cm x 84cm x 64cm und mit Automatisierungszubehör

125cm x 84cm x 64cm

7 5 x 125 x 198 cm

365 x 120 x 199 cm (für Amplifikationsmodul)

4 . Komplettsystem/Zusatzgeräte erforderlich? K omplettsystem bestehend aus: ABI PRIS M ® 7900 HT Sequenc e

Detection System inkl. PC, Sequence Detectionsoftware und

PrimerExpress-Software, optional mit Automatisierungseinheit für

Übernachtbetrieb

T hermocycler/optional Pipettierroboter

Komplettsystem: Komplettsystem bestehend aus 5 Modulen: Barcod e

gestützte Probenerfassung, DNA-Extraktion (Beckman Coulter),

Amplifikation (Grohmann), Detektion (Bruker Daltonik) und Datenbank

(KAT)

5 . Kurzbeschreibung des Funktionsprinzips SNP-Detektion mittels zweier sequenzspezifische Sonden nach de m

®

T aqMan -Prinzip in einem homogenen Assayformat (simultan e

Herstellung von PCR-Produkt und Fluoreszenzsignal). Messung erfolgt

am Ende der PCR durch direktes Lesen der Platte

(Endpunktbestimmung), ohne weitere Aufreinigungs-

bzw.

Arbeitsschritte (< 2 min pro Platte) wahlweise im 384 well-

oder

96 well-Format

MALDI-TOF-Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS),

allelspezifischem Primer-Extension-Assay

nach

DNA-Isolierung, Amplifikation

Massenspektrometrie

und

Primer-Extension,

6.

Kurzbeschreibung des Produktes/Systems

und seiner Komponenten

alle

DNA-Amplifikation, allelspez.

Probenvorbereitung (z.B. mit

Good-Assay), MALDI-TOF-MS

Zuordnung der Genotypen

Primer-Extension-Reaktion und

genopure DNA-Aufreinigungskit od.

mit anschl. Software-unterstützter

7 . mögliche Anwendungen

S NP-Validierung sowie Quantitative Real-Time-PC R

Automatisierte Genotypisierun g

7 .1 Einsatzbereich

Medium bis High throughput SNP-Screening un d

-Validierung

Klinische

(Forensik,

Pharmakokinetik,

Pflanzenzucht)

Zuordnung

von

Individuen

und

Pflanzenforschung,

Pharmaforschung,

Lebensmittelkontrolle

7 .2 geeignet für Erstidentifizierung von SNPs nein

beding

t

Nein

7 .3 zur Routineanwendung bereits bekannter SNPs ja

ja

Ja: Large-scale Genotypisierung, Erstellung digitaler DNA-Signature n

8 . Durchsatz/Stunde

automatischer Betrieb 84 Platten in 2,5 h; entspricht ca 130.00 0

Proben im 384 well-Plattenformat pro Arbeitstag bzw. ca. 315.000

Proben in 24 Std.

b is zu 1536 (abh. vom Automatisierungsgrad der Probenvorbereitung) 60.000 SNPs pro Ta g

9.

Technische

Daten

MALDI-TOF-

RealTime PCR-System für SNP-Detektion im Plate Read-Modus und

die Quantifizierung im Real Time-Modus, wahlweise 384 well- oder

96 well-Format, flexible Reaktionsvolumina von 5 bis 100 ml •

automatische Beladung über Automatisierungszubehör (optional);

einfache Anwendung durch ein standardisiertes PCR-Protokoll für

zu testenden SNPs

Integrale vollautomatisierte Hochdurchsatzanlage im 384er MTP-Format

zur SNP-Genotypisierung mit vorgeschalteter automatischer DNA-

Extraktion und Hochdurchsatz-MALDI-TOF-Massenspektrometrie. Eine

Genotypendatenbank aktualisiert die Allelfrequenzen bei gleichzeitiger

Speicherung der Datensätze

Diagnostik,

Tier- und

Tier-

9 .1 Hardware

vollautomatisch und flexibel im Durchsatz (96er-

oder 384er-Format )

anpaßbares Peltier-basierendes Real-Time-PCR-System mit 488 nm

Argon-Ionenlaser zur Fluoreszenzanregung und gekühlter CCD-

Kamera zur Fluoreszenzdetektion. Computerausstattung: Pentium III

733 MHz-Prozessor, 256 MB RAM, 30 GB-Festplatte, CD-Brenner und

17-Zoll-Farbmonitor

MALDI-TOF-MS mit vollautomatischer

Proben ohne Benutzer-Interaktion

Messung

von

bis

zu

30.000

Datenserver Pentium III 933 MHz, 512 MB ECC SDRAM • Linien

Steuerrechner Pentium III 933 MHz, 512 MB ECC SDRAM • Backup

Rechner Pentium III 933 MHz, 512 MB ECC SDRAM, DAT

Bandlaufwerk DDS4 • alle Rechner verfügen über redundante Netzteile,

eine USV 2000 VA und sind im 19-Zoll-Gehäuse eingebaut, die Daten

werden auf einem externen SCSI RAID 5, mit einer Nettokapazität von

90 GB, gespeichert in einem Rackmount-Gehäuse • Die Kommunikation

mit den Modulen erfolgt über ein geswitchtes 100 Mb-Netz.

M

9 .2 Software/Auswertung/Datenbanken

S equence Detection Software 2.0 läuft auf Windows N T 4.0, enthäl

alle Funktionen zur Gerätesteuerung, Datensammlung und Auswertung

der Daten (graphisch und tabellarisch), Export der Daten möglich

(z.B. Anschluß an LIMS-System zur Datenverwaltung möglich) •

M

P rimerExpress-Software - Software zum schnellen und komfortable

®

D esign der TaqMan Assay s

T

t

T

n

Übersicht der bestimmten Genotypen inkl.

Graphik und/od. Datenbank-kompatibles

Datenexport z.B. in Datenbanken möglich

Qualitätskontrolle als

Tabellenformat, einfacher

mit

1 0. Extras/Besonderheiten

Wechselblocktechnik (384well und 96 well), optionale s

Automatisierungszubehör, PlateRead-Funktion

LIMS: Steuersystem für das Amplifikationsmodul, Betriebssystem

Windows NT 4.0 • Genotools (MALDI): Betriebssystem Windows NT

4.0 • Liniensteuerung: basierend auf Oracle 8i, alle prozessrelevanten

Daten werden zur Dokumentation in einer relationalen Datenbank

erfasst ( Oracle 8i) • Genotypendatenbank: mit Hilfe eines Hash-Algo-

rithmus indexierte Datenbank • Betriebssystem: alle Server arbeiten

Linux Kernel 2.4

Das MALDI-TOF-Massenspektrometer ist kompatibel mit alternativen erweiterungsfähiges System durch modulare Bauweise

Methoden zur SNP-Genotypisierung, ist aber auch ohne Hardware-

Änderung für weitere Einsatzgebiete (QA/QC, Proteomics,

Polymeranalytik) geeignet

1 1. Preis (für eine typische Konfiguration) je

nach Ausstattung und Durchsatz auf Anfrag e

a uf Anfrag e

auf Anfrag e

20 | Nr. III/2001 |transkript LABORWELT


/

S N P - A N A L Y S E

1 . Firmenanschrift/Ansprechpartner

Karsten Sprin g

ThermoHybaid

Berner Straße 45

60437 Frankfurt

Tel. 069-50919672

Karsten Spring

ThermoHybaid

Berner Straße 45

60437 Frankfurt

Tel. 069-50919672

Karsten Spring

ThermoHybaid

Berner Straße 45

60437 Frankfurt

Tel. 069-50919672

Dr. Martin Greber

MWG-Biotech AG

Anzingerstr. 7

85560 Ebersberg

2 . Gerätebezeichnung/Serie

C himer a

D ASH (Dynamic Allele Specific Hybridisation ) M cSNP (Melting Curve SNP Analysis )

RoboSNiP: Automated SNP Analysis Syste m

3.

Abmessungen

(Breite x Tiefe

x

des Systems

Höhe, cm)

40x40x51cm

42x42x34c

m

4 2x42x34c m

1300 x 700 x 700 mm(w/d/h )

5 . Kurzbeschreibung des Funktionsprinzips Schmelzpunktbestimmung ds-DNA :

Denaturierungspunkt unterschiedlicher Proben wird

über Fluoreszenz eines ds-interkalierenden Farbstoffes

in Echtzeit bestimmt. Quantitative PCR in Echtzeit als

weitere Funktion.

6.

Kurzbeschreibung des Produktes/Systems

und seiner Komponenten

Gelfreies System, 96er-Microtiterplatten-Format,

Roboter kompatibel, automatisches Scoring,

Kombination aus high end-Thermocycler und

-Fluorometer.

Schmelzpunktbestimmung ds-DNA:

Denaturierungspunkt unterschiedlicher Proben

über Fluoreszenz eines ds-interkalierenden

Farbstoffes bestimmt

Gelfreies System, 96er-Microtiterplatten-Format,

Roboter-kompatibel, automatisches Scoring

wird

PCR-RFLP/AFLP-basierend: Nach

Restriktionsenzymbehandlung werden die Größen

der Produkte fluorometrisch über Schmelzpunkte

bestimmt

Gelfreies System,

Roboterkompatibel,

96er-Microtiterplatten-Format,

automatisches Scoring

System to accurately distinguish single

changes in DNA fragments (SNP’s) with

spectrometry

T

d

base

mass

Fully automated (walk away) sample preparation

robot for PCR purification, primer extension,

extension product purification, target purification

and target spotting in 384 well format • High

performance, bench integrated mass spectrometer

system • Automated analysis and genotype calling

software

7 . mögliche Anwendungen

Automated genotyping in routin e

7 .1 Einsatzbereich

SNP-Scoring,

quantitative PC R

S NP-Scorin g

SNP-Scoring; Kunden mit PCR-RFLP/AFLP -

Erfahrung; kein Einfluß durch Sekundärstruktur

Probe

7 .2 geeignet für Erstidentifizierung von SNPs Nein

Nein

Nein

der

7 .3 zur Routineanwendung bereits bekannter SNPs Ja

Ja

J a

8 . Durchsatz/Stunde

1.920

Proben/Stunde (SNP-Modus )

384

Proben/Stund e

1 .152 Proben/Stund e

1,536 samples/day (singleplex) • 4,608 samples/da y

(triplex) • 7,680 samples/say (pentaplex)

9.

Technische

Daten

9 .1 Hardware

Peltierelement, Photomultiplier, Halogenlampe, 2x 8

Filter, CCD-Detektor, Rechner: PentiumIII oder höher.

Peltierelement, Photomultiplier,

Rechner: PentiumIII oder höher.

SNP-Scoring: Einfache

flexible Bearbeitung der

manuelle oder grafische

Parameter, Nachanalyse

möglich, automatische

Allel möglich, einfacher

Datenbanken, Windows

Halogenlampe,

Peltierelement, Photomultiplier,

Rechner: PentiumIII oder höher.

SNP-Scoring: Einfache

flexible Bearbeitung der

manuelle oder grafische

Parameter, Nachanalyse

möglich, automatische

Allel möglich, einfacher

Datenbanken, Windows

Halogenlampe,

B

M

T

n

4 . Komplettsystem/Zusatzgeräte erforderlich? Komplettsyste

m

Komplettsyste

m

K omplettsyste m

Complete system including RoboSNiP 1600 sample

M

p reparation robot and BIFLEX III Matrix-Assiste

LASER Desorption Mass Spectrometer Time-of-

Flight Mass Analzyer

RoboSNiP: 16 washable tip assemblies for sample

distribution • 2 integrated 384-well HTR Primus

thermocyclers with motorized lid • Plate handler for

positioning of microplates • Peltier cooled pipetting

positions for microplates (4x 96 1x 384 well) •

L oading position for SCOUT† MTP MALDI-TO F

target • Vacuum chamber with double column

carrier and vacuum unit • Stacker ( cooled noncooled)

for 20 microplates • Peltier cooled reagent

racks • Bar code reader and printer

IFLEX III: Matrix-Assisted LASER Desorptio

Mass Spectrometer TOF Mass Analzyer • 125 cm

linear TOF analyzer for both positive and negative

ions • High sensitivity fast MCP detector system •

Gridless MALDI source with Pulsed Ion Extraction

(PIETM) • SCOUT 384TM MALDI target

9 .2 Software/Auswertung/Datenbanken

SNP-Scoring: Einfache Probenparametereingabe ,

flexible Bearbeitung der kundenspezifischen Setups,

manuelle oder grafische Eingabe der Scoring-Para-

meter, Nachanalyse mit veränderten Parametern

möglich, automatische Qualitätskontrolle für jedes

Allel möglich, einfacher Import und Export in Daten-

banken, Windows 9x bis Millenium-Oberfläche.

Zusätzlich benutzerfreundliche Software zur Steue-

rung der Realtime-PCR Datenaufnahme und -Analyse

Probenparametereingabe,

kundenspezifischen Setups,

Eingabe der Scoring-

mit veränderten Parametern

Qualitätskontrolle für jedes

Import und Export in

9x bis Millenium-Oberfläche

Probenparametereingabe,

kundenspezifischen Setups,

Eingabe der Scoring-

mit veränderten Parametern

Qualitätskontrolle für jedes

Import und Export in

9x bis Millenium-Oberfläche

Genotools: Automated analysis and genotype calling

software • Data acquisition with fuzzy logic • Setup

of all parameters for genotyping by primer exten-

sion reactions • Automated genotype analysis •

Multiplex feature to support multiplex biallelic

genotype calling • Quality control of determined

masses for genotype calling • Graphical display of

results •

1 0. Extras/Besonderheiten

G radient über 1 5 °C kein

e

k ein e

Highly automated with minimum hands-on tim e

1 1. Preis (für eine typische Konfiguration) auf

Anfrag e

auf

Anfrag e

auf

Anfrag e

Euro 328 00 0

|transkript LABORWELT Nr. III/2001 | 21


:

:

:

:

t

t

M A R K T Ü B E R S I C H T

1 . Firmenanschrift/Ansprechpartner

Pyrosequencing Gmb H

Susanne Gläser (Salesmanagerin Deutschland)

Tel.: 040-81957566

Fax: 040-91957567

eMail: susanne.glaeser@pyrosequencing.com

www.pyrosequencing.com

SEQUENOM GmbH

Mendelssohnstrasse

22761 Hamburg

M

2 . Gerätebezeichnung/Serie

P S Q 96

– Preferred Technology Program (384 )

M assARRA Y

3.

Abmessungen

(Breite x Tiefe

x

des Systems

Höhe, cm)

15

D

Tel: +49 (0)40 899676 0

Fax: +49 (0)40 899676 10

eMail: dna@sequenom.de

Ansprechpartner: Edvin Munk

M

5 2 x 65 x 49 cm

S pectroREADE R

T

m

und

Rolf

Reist

Transgenomic Limited

The Quadrangle, Crewe Hall

Weston Road, Crewe, Cheshire, CW1 6UZ (United Kingdom)

Tel.: + 44 (0) 1270 507 123, Fax: +44 (0) 1270 507 111

eMail: sales@transgenomic.co.uk, www.transgenomic.com

Contact Person: Dr. Robert C. Hutton

Managing Director, European Operations

Syste

W AV E

® Nucleic Acid Fragment Analysis Systems: • WAVE 2100A •

T

m

M assenspektrometer: 175cm x 89cm x 150c 56” width x 25” depth x 27” heigh t

M

4 . Komplettsystem/Zusatzgeräte erforderlich? K omplettsyste m

Z usatzgeräte: SpectroDESIGNE R Assay Design-Software fü

automatisches multiplex-Assay-Design der Amplifikationsprimer

des Extensionsprimers. • SpectroTYPER RT-Workstation und

-Software für Echtzeit-Datenanalyse und verbesserte Datenqualität

multiplex-Assays

5 . Kurzbeschreibung des Funktionsprinzips P yrosequencin g Real Time-Sequenzierung in der Mikrotiterplatte .

Sequenzierung durch Synthese mittels Chemilumineszenz und

Enzymsystem (Luziferase, Apyrase, Sulfurylase, Polymerase). Jeder

Einbau eines Nukleotids erzeugt ein Lichtsignal (kostenlose CD über

das Funktionsprinzip unter www.pyroseuquencing.com erhältlich)

6.

7.

Kurzbeschreibung des Produktes/Systems

und seiner Komponenten

mögliche

Anwendungen

7 .1 Einsatzbereich

Schnelle, sehr zuverlässige HT-Sequenzierung kurzer Fragmente in de r

Mikrotiterplatte • SNP-Screening (bis 20 b) • Allelfrequenzen (AQ) •

Sequenzanalyse (SQA) (20-40 b) • Mutationsscreening • Bacterial

Typing (16s rRNA) • Virus Typing • mt-DNA Sequenzierung

T

r

und

S

M

d

M

T

r

T

n

pectroDESIGNER : Assay-Design-Software für automatisierte

ssay-Design • SpectroPREP Multikanal-Pipetierroboter für di

robenvorbereitung in Mikrotiterplatten • SpectroPOINT Multikanal

intool für den Probentransfer auf den SpectroCHIP

M M

S pectroREADER : MALDI-TOF-Massenspektrometer • SpectroTYPE R -

M

W orkstation: Datenbank und Datenanalyse • SpectroTYPER RT Rea l

Time-Dateninterpretation für Multiplex-Reaktionen

M

S

M

A

M

P

M

P

bei

T

s

T

e

T

-

T


7 .2 geeignet für Erstidentifizierung von SNPs n ein

Grundsätzlich ja, diese Erweiterung des MassARRAY-Systems wir d

zur Zeit entwickelt.

7 .3 zur Routineanwendung bereits bekannter SNPs ja

Ja, hierfür ist das System wegen des einfachen, automatisierte n

Assay-Designs von Multiplexreaktionen besonders geeignet

8 . Durchsatz/Stunde

P S Q 96: 480 Proben/h (5 x 96) • PTP System: 1.920 Proben/h (5 x

384)

9.

Technische

Daten

Fully

integrated

and

automated

instrument

®

T he WAVE System uses temperature modulated heteroduplex analysis

(TMHA) by denaturing high performance liquid chromatography

(dHPLC).

The WAVE Systems for mutation detection comprises of a: • DNASep

separation column • UV/VIS Detector • 2x 96 well-plate autosampler

high precision Peltier oven • quaternary gradient solvent delivery

s ystem • WAVEMAKER software (software prediction of DN A

fragments melt temperatures)

®

S NP-Analysen

D HPLC analysis on the Transgenomic WAV E System is suitable fo r

®

d etection of genetic mutations and polymorphisms. WAVE System s

provide the highest accuracy and sensitivity for discovery, screening

®

a nd scoring of SNPs, insertions and deletions. The WAVE system is a

powerful complement to technologies for characterization of genetic

variation • It can be used for analysis and purification of

®

O ligonucleotides with a custom configuration of the WAVE system .

Also analysis of RNA fractions is possible with the system this and

other nucleic acid assays have also been developed

c a. 5.000 Genotypen/Stunde

2x 96 well plates per 24 hour cycle. With 3500HT this can be increase d

to 360 samples per 24 hour cycle

9 .1 Hardware

P entium III 4 • Flatscreen Monitor • HP-Laser Jet120 0

contact Transgenomic

9 .2 Software/Auswertung/Datenbanken

Softwarepakete: SNP: SNP-Screening • AQ: Allelfrequenzbestimmung •

SQA: Sequenzanalyse • Primerdesign-Software

f)

WAVE 3500A: features an internal Accelerator • WAVE3500HT: high

throughput version featuring an internal Accelerator and a micro-

volume solvent mixer (optional 2x 384 well-plate autosampler)

Die Methode basiert auf der von SEQUENOM für die Massenspektro-

metrie optimierten und patentierten Primer Extension-Reaktion. Es

wird ein Primer vor die polymorphe Region „gelegt“ und um einige

Basen verlängert. Danach wird der verlängerte Primer auf den

pectroCHIP transferiert und im MALDI-TOF-Massenspektromete

analysiert. Die ermittelten Massen im Massenspektrum werden von

er SpectroTYPER -Software analysiert, und die resultierende

Genotypen werden in der Datenbank gespeichert.

P SQ 96: Dispensationseinheit zur automatischen Dispensation de s

Enzym- und Substratgemischs und der Nukleotide • Detektionseinheit

(CCD-Chip) zur Real Time-Detektion

1 0. Extras/Besonderheiten

Zuverlässige Unterscheidung von Homo-

und Heterozygoten durc h

quantifizierbare Peaks; automatische Allelfrequenzbestimmung mit

Statistik. Sequenzierung von bis zu 20 Basen (SNPs), bzw. 20-40

Basen (Sequenzanalyse); bis zu 96 (384) unterschiedliche Sequenzen

pro MT-Platte • Pooling und Multiplexing möglich

a) Automatisches Assay-Design, b) Geringe Kosten durch Multiplex-

fähigkeit auch bei geringen Mengen, c) Homogener Assay ohne Beads

etabliert, d) Hoher Durchsatz, e) Höchste Genauigkeit durch die

Bestimmung der molekularen Massen der DNA ohne Surrogatmarker,

Zum Kundenstamm zählen wir u.a. das Sanger Centre, das

Whitehead Institute, die GSF, das NIH

yes

yes

P roprietary WAVEMAKER software for system control and dat a

analysis. • MutationDiscovery.com (internet-accessed database of

sequence variants, including mutations and SNPs, found by using

WAVE System technology)

®

A dditional features include a: • WAVE Accelerator to improve hig h

®

t hroughput (model 2100A only) • WAVE Fragment collector (up o

92 samples can be collected in 2x 96 well-plates) • WAVE

Fluorescence Detector • System optimization for high throughput

®

a nalysis (HT accessory kit and DNASep HT cartridge) • Capability o

perform other Nucleic Acid Analysis assays • Alternate configuration

system for analysis and purification of Oligonucleotides • Alternate

protocols for analysis of RNA

1

®

1 1. Preis (für eine typische Konfiguration) P S Q 9 6: 102400 Euro • PTP-System: auf Anfrag e

c a. EUR 500.000 (je nach Systemkonfiguration )



of

22 | Nr. III/2001 |transkript LABORWELT


j

j

.

,

S N P - A N A L Y S E

Kennziffer 19 LW 03 oder www.biocom.de Info ordern?

1 . Firmenanschrift/Ansprechpartner

Varian Deutschland Gmb H

Alsfelder Str. 6, 64289 Darmstadt

Anton G. Mayer

Tel.: 06151-703221

AlphaCrom OHG - Büro Eggstätt

Frühlingstr. 5, 83125 Eggstät

Dr. Jörg Schülein, Tel.: 08056-902751

2 . Gerätebezeichnung/Serie

Varian Helix Syste m

Monitor)

und

Rechner

(ohne

cm

90

x

60

x

80

des Systems

Höhe, cm)

Abmessungen

(Breite x Tiefe

3.

x

4 . Komplettsystem/Zusatzgeräte erforderlich? Komplettsyste m

Pufferlösungen,

Helix-Trennsäulen-Set,

Monitor),

und

Rechner

(inkl.

Software

Säulenofen,

UV-Detektor,

Well-Plate-Probengeber,

Gradientenpumpen,

aus

HPLC-System bestehend

Degasser

Biokompatibles

Schaltventil und

Kurzbeschreibung des Produktes/Systems

und seiner Komponenten

6.

Anwendungen

mögliche

7.

7 .1 Einsatzbereich

SNP-Detektion und SNP-Screening, DNA-Fragmentanalytik und (optional) DNA-Fragment-Fraktionierun g

7 .2 geeignet für Erstidentifizierung von SNPs a

7 .3 zur Routineanwendung bereits bekannter SNPs a

8 . Durchsatz/Stunde

6 Proben pro Stunde, bei Verwendung entsprechender Poolingtechniken meh r

Daten

Technische

9.

5 . Kurzbeschreibung des Funktionsprinzips Hybridisierung von Wild-Type und Mutante; dadurch Bildung von Hetero-

und Homoduplexen, die mittels denaturierender HPLC und UV-Detektion nachgewiesen werden .

9 .1 Hardware

• Pumpen: Binäres Hochdruckmischsystem Flussbereich 0,01 – 5 mL/min • Probengeber: Kapazität bis zu sieben 96- oder 384-MTP’s; Injektion von 0,1 – 100 0 µ L Probentellerkühlung 4 – 1 5 ° C •

D etektor: UV-Detektor 190 –380 nm • Säulenofen: Selbstkalibrierbarer Ofen 10 ° C über Raumtemp. bis 9 9 ° C Temp.genauigkeit 0, 1 ° C mit Kalibrierung • Helix-Trennsäule: 3 mm ID-Säule mit „larg e

pore“- C18-Material

9 .2 Software/Auswertung/Datenbanken

Star Workstation Software (Win 2000 bzw. Win98/NT) zur System-Steuerung, Datenauswertung und Reporterstellung; Star Reviewer Software zur Erkennung und zum Daten-Managment vo n

Sequenzvarianten

1 0. Extras/Besonderheiten

Vollautomatisation; hohe Wahrscheinlichkeit der Neudetektion (>95 %) von SNP s

1 1. Preis (für eine typische Konfiguration)

konfigurationsabhängig – ab DM 105.000,0 0

Anzeige

|transkript LABORWELT Nr. III/2001 | 23


M A R K T Ü B E R S I C H T

SNP-Analyse

Varian Helix-System: Schnelles

Detektieren und vollautomatisches

Screenen von Punktmutationen

IRIS FROHWEIN, VARIAN DEUTSCHLAND GMBH, DARMSTADT

Mit dem Varian Helix TM -System können Punktmutationen (SNPs) detektiert und DNA-Fragmente

bequem und kostengünstig analysiert werden. Das Helix TM -System basiert auf der Technik der

denaturierenden HPLC (d-HPLC) und bietet entscheidende Vorteile: Durch Einsatz eines Autosamplers

für 96er- und 384er-Platten kann man vollautomatisch bis zu 140 Proben in 24 Stunden

analysieren. Es ist damit ein echtes „Walk Away-System“, das zudem reproduzierbare und quantitative

Ergebnisse liefert.

Hier setzt das Helix d-HPLC-System (siehe

Abb. 2) ein: Aus der so vorbereiteten Probe

werden 2,5 – 5 µL mit einem Autosampler auf

eine Säule injiziert, dies entspricht nur ca. 20-

50 ng des PCR-Produktes. Die Säule ist mit

festem Trägermaterial als Trennphase gefüllt

und wird über Gradientenpumpen mit einer

Puffersalzlösung in Wasser und Acetonitril

gespült. Die Puffersalzionen wirken hierbei

als Mittler zwischen den „Amplikonen“ und

der Trennphase. Die Heteroduplexe sind aufgrund

des Mismatches (T-C bzw. G-A liegen

sich gegenüber) etwas instabiler als die Homoduplexe

(T-G bzw. G-C). Über einen Säulenofen

wird nun die Temperatur eingestellt,

die zum Aufschmelzen der DNA-Helix der

Heteroduplexe führt. Die Folge ist, daß diese

schneller über die Säule laufen als die Homoduplexe.

Zum Auffinden neuer Mutationen

muß zuvor die Denaturierungs-Temperatur

für das zu untersuchende DNA-Fragment

ermittelt werden. Die Puffersalzsubstanz

TEAA (Triethylammoniumacetat) stabilisiert

hierbei die Schmelzbereiche, so daß die mutationstypische

Schmelztemperatur innerhalb

eines engen Bereiches liegt. Das Auffinden

der passenden Temperatur wird durch das

Melt-Programm (zu finden unter http://

insertion.stanford.edu/melt. html) erleich-

In der Genomforschung spielt das Detektieren

und Screenen von SNPs („Single Nucleotide

Polymorphisms“, Punktmutationen) in

pflanzlicher und tierischer DNA eine sehr

wichtige Rolle. In mehreren Forschungsfeldern

kommt den Punktmutationen eine enorme

Bedeutung zu, unter anderem:

In Populationsstudien, in denen SNPs

Rückschlüsse auf genetische Zuordnungen

erlauben

In der Erforschung der genetischen Ursachen

von Krankheiten

In pharmakogenetischen Untersuchungen

und bei der Targetvalidierung, also der

Frage, ob bestimmte Mutationen die Wirksamkeit

von Medikamenten bei entsprechenden

Personen beeinflussen.

Beim Neuauffinden von Detektionen und

dem Screenen von Mutationen, auch bei verschiedenen

Spezies, erweist sich die denaturierende

HPLC (d-HPLC) als eine hochempfindliche

und sehr leistungsfähige Methode.

Varian bietet hierzu ein ausgereiftes d-HPLC-

System an.

Das Prinzip dieser Technik ist recht einfach:

Das auf die Mutation zu untersuchende DNA-

Fragment wird amplifiziert und im Falle homozygoter

Proben anschließend mit Wild-

Typ-DNA versetzt. Heterozygote Proben können

ohne Zusatz von Wild-Typ-Standard eingesetzt

werden. Dann folgt ein Aufheiz- und

Abkühlschritt, der zur Hybrisierung der Probe

mit dem Wild-Typ-Standard führt. Im Falle

einer Mutation erfolgt hierbei die Bildung von

Homo- oder Heteroduplexen (siehe Abb. 1).

Abb. 1: Prinzip der d-HPLC

Abb. 2: Schema des

Varian Helix-Systems

tert. Nach der Auftrennung ergeben sich dann

für Mutationen charakteristische Mehrpeakprofile,

die mittels eines UV-Detektors gemessen

werden (siehe Abb. 3). Diese Peakprofile

werden als Chromatogramme abgespeichert,

hierbei handelt es sich um sogenannte

RUN-Files; diese können über die

mitgelieferte Varian Star-Software problemlos

ausgewertet werden.

Es können mit dem Helix-System Mutationen

in Amplikonen in der Größe 50 bis 700

Basenpaare detektiert werden. Die Wahrscheinlichkeit,

mit der d-HPLC neue Mutationen

zu finden, liegt bei 95% – bei entsprechendem

Primerdesign oder Einsatz anderer

DNA-Fragmente besteht sogar nahezu 100%

Detektionswahrscheinlichkeit. SNPs, die mittels

d-HPLC aufgefunden wurden und bei

denen die Denaturierungstemperatur bestimmt

wurde, lassen sich mit 100%iger Wahrscheinlichkeit

in Proben finden. Es können

bis zu 140 Proben pro Tag gescreent werden,

bei Einsatz entsprechender Poolingmethoden

sogar wesentlich mehr.

Die Firma Varian hat seit Anfang des Jahres

2001 eine neue Helix-Trennsäule auf den

Markt gebracht, mit der sich mindestens 3.000

Proben messen lassen. Diese Säule hat einen

Durchmesser von nur 3 mm. Die Peakprofile

sind dadurch erhöht, was zu einer verbesserten

Empfindlichkeit und einem geringeren

24 | Nr. III/2001 |transkript LABORWELT


S N P - A N A L Y S E

Probenverbrauch führt. Zusätzlich ist der Verbrauch

an Laufmittel im Vergleich zum Einsatz

von 4,6 mm-Säulen um ca. 50% verringert.

An laufenden Analysenkosten lassen

sich aufgrund des geringen Pufferverbrauchs

und der hohen Säulenlebensdauer etwa 0,8

bis 1 DM pro Probe veranschlagen.

Das Helix-System ist komplett biokompatibel,

daß heißt, alle Materialien, mit denen

Puffer und Probe in Kontakt kommen, sind

edelstahlfrei. Durch Korrosion (Puffersalze!)

wird zum einen durch ausgelöste Eisenionen

der chromatographische Trennprozeß gestört

und zum anderen nach mehreren Jahren die

Systemgüte stark verringert.

Aufgrund des Detektionsprinzips ist die Wiederfindung

und Übertragbarkeit von Muta-

tionsprofilen zwischen verschiedenen

d-HPLC-Systemen gegeben. Der eigens für

diese Applikation angepaßte, kalibrierbare

Säulenofen ermöglicht eine reproduzierbare

Einstellung der Denaturierungstemperatur

und eine Übertragbarkeit der Methode auf

verschiedene Helix-Systeme.

Neben SNP-Detektion und -Screening läßt

sich das Helix-System auch für DNA-Fragmentanalysen

einsetzen (Nukleobasenauflösung

3%). Peakhöhenanalysen ermöglichen

Quantifizierungen, womit zum Beispiel transgene

Anteile in Proben ermittelt werden können.

Auch das Aufreinigen von Proben mit

anschließendem Sammeln ist durch Ankoppeln

eines Fraktionssammlers möglich.

Innerhalb der Varian Star-Software läßt sich

mVolt

12,5

10

7,5

5

2,5

0

-2,5

-3,7

52 °C

53 °C

54 °C

55 °C

56 °C

57 °C

58 °C

1 2 3 4 Minuten

Abb. 3: Peakmuster bei der Detektion von

SNPs in Abhängigkeit von der Schmelztemperatur

mVolt

15,0

12,5

10,0

7,5

5,0

3,0

80 bp

102 bp

174 bp

257 bp

267 bp

298 bp

434 bp

458 bp

2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 Minuten

Abb. 4: DNA-Fragmentanalyse

587 bp

über das sogenannte Sampletracking eindeutig

zuordnen, in welchem Sammelgefäß oder

welcher Mikrotiterplatten-Kavität das isolierte

Fragment zu finden ist.

Das Helix d-HPLC-System nutzt die Vorteile

der HPLC-Technologie – wie ausgezeichnete

Reproduzierbarkeit, hohe Automatisierbarkeit

mit angebundener Datenverwaltung und

einfache Bedienung –, um auf unkomplizierte

Weise, Mutationen zu finden und anschließend

Proben auf entsprechende Polymorphismen

zu screenen.

Korrespondenzadresse

Iris Frohwein

VARIAN Deutschland GmbH

Alsfelder Straße 6

64289 Darmstadt

Tel.: 06151-703-233

Fax: 06151-703-330

eMail: iris.frohwein@varianinc.com

Mehr Infos benötigt? Kennziffer 20 LW 03 oder www.biocom.de

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|transkript LABORWELT Nr. III/2001 | 25


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S N P - A N A L Y S E

SNP-Diagnostik

Large-Scale-Genotypisierungen von SNPs

– ein neues Automationskonzept

DÉSIRÉE MOSNER UND DANIELA SEELIG, GAG BIOSCIENCE GMBH, BREMEN

GAG BioScience GmbH ist ein

im Technologiepark Bremen ansässiges

Biotechnologieunternehmen.

GAG steht dabei für

„Genomics and Genetagging“.

Genotypisierungen zum Zwekke

von Herkunftsanalysen sind

der Schwerpunkt von GAG

BioScience.

Abb. 1: Prinzip SNP-Genotyping

Im Sommer diesen Jahres wird

das Unternehmen eine Hochdurchsatz-Roboterstraße

vorstellen,

die auf die Analyse von

SNPs (single nucleotide polymorphisms)

mittels Massenspektrometrie

abgestimmt ist.

Diese kann in allen Kernbereichen

der „large-scale“-Genotypisierung

zum Einsatz kommen:

der Tier- und Pflanzenzucht, der

genetischen Diagnostik und der

Lebensmittelkontrolle. Die neue

Analysestraße arbeitet vollautomatisch,

von der DNA-Gewinnung

über die massenspektrometrische

Detektion bis hin

zur Erfassung der ermittelten

Daten in einer Datenbank und

wertet 60.000 Genotypen pro

Tag und Gerät aus. Aufgrund

der modularen Bauweise der

Anlage ist eine Erweiterung der

Kapazität auf bis zu 600.000 Genotypen

pro Tag realisierbar.

Anwendung wird die neue

Technologie zunächst im Bereich

der Genotypisierung von

Rindern finden. Mit dem von

GAG BioScience entwickelten

Genetagging, der Genotypisierung

zum Herkunftsnachweis

von Rindern auf der Grundlage

von DNA-Analysen, soll das bestehende

Rinderkennzeichnungssystem

ergänzt werden.

Jedes Tier hat eine individuelle

Abfolge von Bausteinen in seiner

DNA, die durch die DNA-

Analyse ermittelt und als digitalisierte

Signatur zum unverwechselbaren

und fälschungssicheren

Identifikationsmerkmal

wird. SNPs sind Sequenzvariationen,

die gegenüber den

bisher verwendeten DNA-

Markern, den Mikrosatelliten,

deutliche Vorteile aufweisen:

Sie lassen sich schnell und präzise

massenspektrometrisch detektieren

sowie automatisiert

und digital in einer Datenbank

darstellen. Dabei ist statistisch

gesichert, daß dieselbe DNA-

Signatur bei 100 Millionen getesteten

Tieren nicht noch einmal

auftreten kann.

Die Identifizierung der SNPs basiert

auf einer Primer-Extension-Reaktion

und der daraus resultierenden

Massenänderung

des Extensions-Primers. Die Änderung

der molekularen Masse

erfolgt allelspezifisch und wird

mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie

erfaßt. Jede SNP-

Position wird auf die Ab- und

Anwesenheit einer spezifischen

Base untersucht und resultiert

aufgrund nur drei möglicher alleler

Zustände eines SNP in einem

binären Datencode: 01 ho-

mozygot A, 10 homozygot B, 11

heterozygot AB.

Geplant ist die gezielte Individualtypisierung

des gesamten

deutschen Rinderbestandes.

Dafür hat GAG BioScience im

vergangenen Jahr ein Netzwerk

von Kooperationen aufgebaut,

das die Umsetzung des Systems

unterstützt. Dazu gehören: Für

die Validierung der SNPs das

Institut für Tierzucht der TU-

München (Prof. Ruedi Fries) sowie

Gerätehersteller, Softwareentwickler

und Tierkennzeichner.

Mit der Rinder-DNA-Datenbank

kann ein großer Fortschritt

für den Verbraucherschutz erreicht

werden, denn die DNA-

Signatur dient der lückenlosen

Rückverfolgbarkeit von Fleisch

und Fleischprodukten. Die Genotypen

stehen für spätere

Überprüfungen zum Herkunftsnachweis

von getesteten

Fleischprodukten zur Verfügung.

Das Datenbankkonzept bringt

für den Verbraucher mehr

Transparenz in der gesamten

Fleischproduktion und interaktive

Zugriffsmöglichkeiten für

Verbraucherschutz, Veterinärämter

und andere Institutionen.

Ein weiterer entscheidender

Vorteil ist, daß die Routineanalyse

von SNPs wird nur einen

Bruchteil der herkömmlichen

Analyse kosten wird.

Korrespondenzadresse

Dipl.-Ing. Daniela Seelig

GAG BioScience BioScience GmbH

Hochschulring 40

28359 Bremen

Tel.: 0421-22308-0

Fax: 0421-22308-30

eMail: seelig@gag-bioscience.de

Info ordern? Kennziffer 22 LW 03 oder www.biocom.de

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Information ordern? Kennziffer 21 LW 03

|transkript LABORWELT Nr. III/2001 | 27


B L I T Z L I C H T

Array-Oberflächen

Plastik-Arrays – geprüfte DNA-Oligos

auf einem neuartigen Trägermaterial

Kennziffer 23 LW 03/www.biocom.de Info

JENS THIELMANN, BD BIOSCIENCES CLONTECH, HEIDELBERG

Die Vorteile zweier verschiedener Trägermaterialien

für DNA-Array-Experimente kombiniert

jetzt ein neuer Plastik-Array der Firma

Clontech: High-Density-Spotting, niedriger

Hintergrund, einfache Handhabung wie

beim Glas-Array, die Sensitivität, Flexibilität

und universelle Anwendbarkeit ohne Spezialgeräte

wie beim Nylon-Array (Tab. 1).

Plastik als Trägermaterial

Das neue Trägermaterial erlaubt es, DNA

wesentlich dichter als bisher auf Nylonmembranen

zu spotten. Mit mehr als 8.300 Genen

lassen sich damit praktisch alle heute bekannten

humanen Gene – also rund ein Viertel des

humanen Genoms – in einem einzigen Experiment

untersuchen.

Plastik hat eine ganze Reihe von Vorzügen,

die Analysen einfach und präzise machen.

Plastik ist nicht porös. Dies minimiert die

unspezifische Bindung an das Trägermaterial

und maximiert so durch einen extrem niedrigen

Hintergrund das Signal/Rausch-Verhältnis.

Die Plastikfilme sind handlich

(8 x 12 2 cm ) und flexibel, und sie verziehen

sich nicht bei höheren Temperaturen, wie sie

zum „Strippen“ nötig sind. Dies gewährleistet

eine problemlose Auswertung der mehrfach

verwendbaren Arrays. Darüber hinaus

ergeben die Spots eine gleichmäßige Signalstärke

auf ihrer Fläche. Dies ist essentiell für

eine automatische Datenverarbeitung.

Lange Oligonukleotide als Targets

Jedes Gen wird auf dem Plastikarray durch

ein „langes Oligo“ repräsentiert, ein 80-Basen-Fragment,

das den besten Kompromiß

Tabelle 1: Vergleich von Atlas Plastik-, Glas- und Nylon-Arrays

zwischen der Hybridisierungseffizienz eines

cDNA-Fragments und der Unterscheidungsfähigkeit

kurzer Oligos zwischen homologen

Sequenzen darstellt. Mit einer Spezialsoftware

werden für jedes Gen die Regionen

bestimmt, die weniger als 70 % Homologie

zu allen Einträgen in GenBank besitzen. Diese

„Long-Oligo-Technology“ erlaubt es, Mitglieder

von Multigenfamilien oder Splice-

Varianten zu unterscheiden, was mit cDNAs

praktisch nicht möglich ist.

Qualitätssicherung

Die Problematik von Oligonukleotiden mit

unkorrekter Sequenz hat erst in jüngster Zeit

Zeit stärkere Beachtung gefunden 1 . Bei Clontech

wird jedes einzelne Oligo auf seine Identität

und seine Fähigkeit, ein starkes Hybridisierungssignal

zu produzieren, getestet, bevor

es für den Printprozeß freigegeben wird. Dazu

werden zwei verschiedene Antisense-Hybridisierungen

durchgeführt:

Zum einen werden mit dem Klenow-Enzym

die Antisense-Oligonukleotide einer bestimmten

Sektion des Arrays synthetisiert, markiert

und mit dem gesamten Array hybridisiert (siehe

als Beispiel ein Spezifitätstest des Atlas

Glass Human 1.0 Microarrays in Abb. 1). Oligonukleotide

mit schwachen Hybridisierungssignalen

oder sichtbarer Kreuzhybridisierung

mit anderen Fragmenten werden neu entworfen.

Ohne diesen Test, der sicherstellt, daß

jedes Oligo ein starkes und spezifisches Signal

produziert, gäbe es rund 25 % Ausfälle.

Zum anderen wird die gleiche Hybridisierung

mit synthetischen Oligos durchgeführt. Es

werden Antisense-Oligos zu den Genen einer

bestimmten Sektion des Arrays hergestellt,

Plastik Glas Nylon

Anzahl der Gene 8.300 3.800 1.176

Targets Lange Oligos Lange Oligos PCR-Fragmente

Markierung/Detektion

33

P

33

P Fluoreszenz

32

P

33

P

Rel. Sensitivität ++++ ++++ ++ ++++ +++

Rel. Auflösung +++ +++ ++++ + ++

Mehrfache Verwendbarkeit Ja Nein Ja

Handhabung/Auswertung Einfach – keine Einfach – keine Schwieriger –

Deformation des Films Deformation des Verziehen der

Objektträgers Membran möglich

Unterscheidbarkeit ++++ ++++ ++

homologer Gene

Genauigkeit des gespotteten 100% getestete Oligos 100% getestete Olig. 100 % sequenz-

Materials

verifizierte cDNA

Kalibrierungsstandards Ja In Kürze erhältlich Nein

Abb. 1: Spezifitätstest eines Atlas Glass-

Microarrays. Eine Cy3-markierte Probe wurde

aus einem Gemisch von 5‘-aminomodifizierten

Antisense-Oligonukleotiden hergestellt, die

dem Quadranten B4 des Atlas Human 1.0-

Microarrays entsprechen. Die Sonde wurde

mit dem Atlas Glass Fluorescent Labelling-Kit

unter Umgehung der reversen Transkription

hergestellt und ein Atlas Human 1.0-Microarray

damit hybridisiert. Die Signale wurden mit

einem GenePix TM -4000-1 Scanner (Axon Instruments)

eingelesen. Die Abbildung zeigt, wie

spezifisch die Hybridisierung mit den Genen

erfolgt, die mit der Antisense-Sonde korrespondierenden.

Nur eine geringe, unspezifische

Kreuzhybridisierung ist sichtbar. Die regelmäßigen

Signale stammen von den Orientierungsmarkern.

vereint und markiert und damit der gesamte

Array hybridisiert. Dieser Test bestätigt die

korrekte Synthese der gespotteten Oligos.

Vergleichbarkeit

Bisher war es nicht möglich, Arrays aus verschiedenen

Chargen direkt miteinander zu

vergleichen. Durch die Verwendung von Kalibrierungsstandards

bei den neuen Plastikarrays

lassen sich Daten verschiedener Experimente

jetzt auch miteinander vergleichen. Von

jeder Charge werden mehrere Arrays mit einem

Antisense-Oligomix hybridisiert und die

erhaltenen Werte gemittelt. Diese chargenspezifischen

Daten sind über Clontechs Homepage

zugänglich und in die Array-Analysesoftware

Atlas Image 2.01 importierbar. Das Programm

kalibriert dann automatisch die Werte

der erhaltenen Signale. Auf diese Weise kann

man sich eine wertvolle Datenbank aufbauen.

[1] Knight, J. Nature 410, 860-861 (2001).

Korrespondenzadresse

Jens Thielmann

BD Biosciences Clontech

69126 Heidelberg

Tullastraße 4

28 | Nr. III/2001 |transkript LABORWELT


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B L I T Z L I C H T

Chipoberflächen

2D/3D-BioChips –

Neue Werkzeuge für die funktionelle

Genom- und Proteomanalyse

HOLGER EICKHOFF 1 , MARTIN SCHÜRENBERG 2 UND ECKHARD NORDHOFF 3,4

1

SCIENION AG, BERLIN, 2 BRUKER DALTONIK AG, BREMEN, 3 PROTAGEN AG, BOCHUM, 4 MAX-PLANCK-

INSTITUT FÜR MOLEKULARE GENETIK, BERLIN

Chipbasierte Methoden sind weitverbreitete

Verfahren in der modernen Biotechnologie.

Zusätzlich zu den in den vergangenen

30 Jahren etablierten seriellen biotechnologischen

Methoden, wie der Klonierung und

Amplifikation einzelner Gene oder Genprodukte,

erlauben chipbasierte Verfahren die

parallele Analyse tausender Gene durch ein

einziges Experiment. Gerade im Forschungsfeld

der Gen-Expressionsanalyse haben sich

chipbasierte Methoden zu einem nicht mehr

wegzudenkenden Baustein in Forschungsund

Entwicklungslabors entwickelt.

Die Grundlagen für chipbasierte Methoden in

der Biotechnologie wurden bereits vor mehr

als 12 Jahren gelegt 1-4 . Nachdem in den frühen

neuziger Jahren mit den Biochips der ersten

Generation noch vorwiegend mit einer radioaktiven

Detektion auf polymeren Trägermaterialien

wie Nylonfiltern 5 oder Polyacrylamidbeschichteten

Gläsern 6 gearbeitet wurde,

brachte die Einführung der zweiten Generation

von Biochips auf planaren Probenträgern

aus Silizium oder Glas – verbunden mit der

Möglichkeit der Fluoreszenz-Detektion – den

Durchbruch für die Technologie 7 . In den vergangenen

fünf Jahren wurden in einer Vielzahl

von Publikationen Anwendungen von

Microarrays oder Biochips beschrieben, die

ihr diagnostisches Potential bzw. die Möglichkeiten

zur Identifikation bisher unbekannter

Gene bei komplexen Krankheiten aufzeigen –

zum Beispiel bei Krebs.

Obwohl die erfolgreiche Anwendung von

Biochips bereits in vielen Fachaufsätzen beschrieben

wurde, mehren sich auch Stimmen,

die die mit Biochips erzielten Ergebnisse

kritisch beleuchten 8 . Neben bioinformatischen

Problemen, wie der korrekten Annotation

der auf den Biochip aufgebrachten

Genfragmente, gibt es eine Reihe technischer

Hürden, welche die Reproduzierbarkeit

der Ergebnisse auf Biochips der zweiten

Generation wesentlich einschränken. Sind

bei den in situ-Syntheseverfahren von Oligonukleotidchips

die Qualitätskontrollen für

die tatsächlich auf einem Chip synthetisierten

Sequenzen sehr eingeschränkt bis unmöglich,

leiden die Spottingverfahren, bei

denen vorher synthetisierte PCR-Fragmente

oder Oligonukleotide auf einen planaren

Probenträger aufgebracht werden, unter den

variierenden Übertragungseigenschaften der

eingesetzten Drucktechniken und Oberflächen.

Für die unerläßliche Normierung der

mit Hilfe von cDNA-Microarrays generierten

Hybridisierungsdaten wurden wirksame

Strategien entwickelt und deren Leistungsfähigkeit

demonstriert 9,10 .

Obgleich von verschiedenen Chipanbietern

diverse Modifikationen der Glasoberfläche

angeboten werden, können auf diesen – verglichen

mit Nylonfiltern – nur geringe DNA-

Mengen immobilisiert werden. Dies limitiert

die Empfindlichkeit der Messung maßgeblich.

Hybridisierungen und Prozessierungen

finden direkt auf den Chipoberflächen

statt, was viele Reaktionen aufgrund

unspezifischer Interaktionen mit dem Glasträger

oder wegen elektrostatischer Abstoßungseffekte

in der Nähe der Oberfläche

erschwert. Zudem sind die Raster, in denen

die DNA-Klone angeordnet werden, wegen

technischer Grenzen in der Feinmechanik

der verwendeten Chipherstellungsgeräte

nicht perfekt regelmäßig. Auch einzelne

Arrayelemente können sich voneinander

unterscheiden, da die Übertragungswerkzeuge

nicht in jedem Fall eine identische

Menge Flüssigkeit übertragen. Dadurch entstehen

verschiedene Signalstrukturen (sogenannter

Doughnut-Effekt, innen leer und

Hybridisierungssignal in einem Kreis statt

Abb. 1: Vergleich von cDNA-Microarrays.

Links: unmodifizierter Glasträger. Rechts:

Glasträger mit vorstrukturierter Oberfläche. Im

Vergleich zur unmodifizierten Oberfläche werden

auf der vorstrukturierten Oberfläche die

transferierten Probenmoleküle in situ drastisch

aufkonzentriert, bevor sie auf vorbestimmten

Positionen immobilisiert werden.

einem runden Punkt vorhanden), die entweder

nicht oder aber nur unter extremem

Aufwand quantifiziert werden können. Diese

beiden Eigenschaften erschweren speziell

die Auswertung gespotteter Chips.

Eine Gemeinschaftsentwicklung von Forschern

des Berliner MPI für molekulare Genetik

in Berlin (MPI-MG) und der Bruker

Daltonik AG setzt an diesem Schwachpunkt

der Biochips der zweiten Generation an 11-14 .

Durch den Einsatz vorstrukturierter Oberflächen

gelingt es perfekte Raster aus Probenmolekülen

zu erzeugen, die mit identischen

Probenmengen beladen werden kön-

Abb. 2: 2D/3D-BioChip. (a) Das 2D-Format des neuen Biochips beschreibt

eine vorstrukturierte Oberfläche bestehend aus einer hydrophoben oder lyophoben

Deckschicht auf der sich ein perfektes Raster von kleinen hydrophilen

Inseln befindet, die als Anker für die Aufnahme und Analyse von flüssigen

Proben fungieren. (b) Im Einsatz expandiert diese Struktur in die dritte

Dimension um die Höhe eines auf den Ankern aufsitzenden Tröpfchens (3D-

Format). Diese Tröpfchen stellen dynamische, „nahezu“ wandfreie Rekationsräume

für die Durchführung von biochemischen oder biologischen Experimenten

bereit. (c) 50 µl einer Patientenprobe wurden durch kurzen Kontakt

auf einem 2D/3D-BioChip in 4 X 384 Fraktionen aufgeteilt. (d) Die Natur

als Vorbild – Wandminimierte Reaktionsräume, wie sie auf 2D/3D-BioChips

zum Einsatz kommen, finden sich auch in der Natur, z.B. nach einem Regenschauer

auf gewachsten Pflanzenblättern.

30 | Nr. III/2001 |transkript LABORWELT


B L I T Z L I C H T

nen (Abb. 1). Diese neuen Oberflächen sind selbstorganisierend und

fehlertolerant, das heißt, nur die Oberfläche, nicht aber das Übertragungswerkzeug

bestimmt die genaue Positionierung sowie die

Menge der übertragenen Probe. Diese Biochips der dritten Generation

werden als 2D/3D-Biochip bezeichnet (Abb. 2) und arbeiten auf

planaren Trägern. Im Gegensatz zu den bislang verwendeten hydrophilen

Oberflächen (z.B.: Glas) sind die neuen Trägeroberflächen der

2D/3D-Biochips stark hydrophob oder sogar lyophob, also weder

durch hydrophile noch durch olephile Flüssigkeiten benetzbar. Um

dies zu erreichen, wird die Chipoberfläche (Glas, Metall oder Kunststoff)

beschichtet. Die Oberfläche weist zusätzlich ein mit verschiedenen

Drucktechniken oder lithographischen Verfahren aufgebrachtes

perfektes Raster von kleinen hydrophilen Inseln – sogenannten

hydrophilen Ankern – auf.

Lyophobe Beschichtungen werden zum Beispiel aus teflonartigen

Nanokompositmaterialien aufgebaut und bevorzugt eingesetzt, wenn

neben wäßrigen Lösungen auch organische Lösungsmittel auf dem

Chip zum Einsatz kommen. Ultradünne hydrophobe Schichten bestehen

beispielsweise aus modifizierten Silikonen und werden bevorzugt

auf Glasträgern für Reaktionen in wäßriger Lösung (z.B.:

Hybridisierung von DNA- oder RNA-Proben auf cDNA-Microarrays)

verwendet. Die hydrophilen Anker können aus wenigen Lagen

aufgedampfter Goldatome bestehen oder sind einfach Aussparungen

(Löcher) in der lyophoben oder hydrophoben Schicht. Im letzteren

Fall bestimmt die Oberfläche des Trägermaterials die hydrophilen

Eigenschaften der Anker.

Werden auf so vorstrukturierte Oberflächen mit den etablierten

Spottingverfahren (Nadeldruck-, Piezodispensier- oder Solenoiddispensierköpfen)

Probenlösungen mit DNA oder Proteinen aufgebracht,

lokalisieren sich diese als kleine Tröpfchen ausschließlich

oberhalb der hydrophilen Anker. Kommen die kostengünstigen

Nadeldruckköpfe (Pin Transfer Tools) zum Einsatz, wird die übertragene

Probenmenge durch die Abmessungen der hydrophilen

Anker bestimmt – also nicht durch die Güte der Druckwerkzeuge,

wie bei Chips der 2. Generation (Abb. 3). Unabhängig von dem

verwendeten Spottingverfahren werden die Proben in einem perfekten,

durch die hydrophilen Anker festgelegten Raster positioniert.

Hierzu reicht es aus, wenn die aufgebrachten Probentröpfchen den

jeweils zuständigen hydrophilen Anker kontaktieren. Die „benetzungsfeindliche“

Chipoberfläche bedingt, daß die Probentröpfchen

ihre Kontaktfläche minimieren und sich anschließend eigenständig

oberhalb der benetzungsfreundlichen Anker positionieren. Nach

dem Abdampfen des Lösungsmittels werden alle darin zuvor gelösten

Substanzen exklusiv auf den hydrophilen Ankern deponiert.

Daraus folgt, daß die hydrophilen Anker neben der Positionierung

auch die Abmessung und Geometrie (z.B.: kreisrund) der aufgebrachten

Proben exakt determinieren und bezüglich des verwendeten

Übertragungswerkzeuges fehlertolerant sind (Abb. 3).

Die 2D/3D-BioChip-Technologie wurde am MPI-MG basierend auf

der von Bruker patentierten AnchorChip-Technologie entwikkelt

12,13 und ist Gegenstand einer gemeinsamen Patentanmeldung.

Deren Nutzungsrechte liegen ausschließlich bei der Scienion AG,

der Protagen AG und Bruker Daltonik AG. Das 2D-Format des Chips

beschreibt die vorstrukturierte Oberfläche des Chips inklusive aller

eventuell darauf immobilisierten Moleküle (Abb. 2a). Das 3D-Format

beschreibt den Chip im Einsatz, also wenn auf den hydrophilen

Ankern Tröpfchen mit Probenlösung aufsitzen (Abb. 2b). Diese

durch die lyophobe bzw. hydrophobe Chipoberfläche isolierten

Tröpfchen stellen individuelle, fast wandfreie Reaktionsräume bereit,

innerhalb welcher die Anbindung der Probenmoleküle an die

Oberfläche, die Nachweisreaktion oder andere Prozessierungsschritte

(z. B. enzymatisch katalysierte Synthesen oder Spaltungsreaktionen)

durchgeführt werden.

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|transkript LABORWELT Nr. III/2001 | 31


B L I T Z L I C H T

der Durchmesser der präparierten Probe

(Kontaktfläche) direkt miteinander verknüpft:

desto größer der Tropfen, desto größer

die benetzte Oberfläche. Auf 2D/3D-

Biochips ist diese Abhängigkeit als Folge

des neuen Oberflächendesigns über einen

weiten Bereich aufgehoben. Verglichen zu

konventionellen Reaktionsgefäßen stellen

2D/3D-BioChips dynamische Reaktionsräume

bereit, deren Volumen sich den Erfordernissen

anpaßt. Wird ihr Inhalt entfernt oder

das enthaltene Lösungsmittel abgedampft,

verbleibt eine planare Chipoberfläche für

die Detektion. Übertragen auf den Alltag

könnten diese Art von „Gefäßen“ viele Entsorgungsprobleme

lösen helfen: Sie entstehen

bei Bedarf, wachsen mit dem Inhalt und

verschwinden sobald der Inhalt verbraucht

ist. In der Natur lassen sich Reaktionsräume,

wie sie auf 2D/3D-BioChips zum Einsatz

kommen, vielerorts beobachten – insbesondere

während oder nach einem Regenschauer,

zum Beispiel auf einem gewachsten Pflanzenblatt

(Abb. 2d).

Die Durchführung von biochemischen oder

molekularbiologischen Experimenten in

immer kleineren Dimensionen – zum Beispiel

in auf Glas oder Siliziumplättchen eingelassenen,

nur wenige Nanoliter umfassenden

Kavitäten – wird in vielen Fällen

durch unerwünschte Wechselwirkungen mit

den Gefäßwänden eingeschränkt. Typische

Beispiele sind etwa die unspezifische Adsorption

von Probenmolekülen oder des für

ihre Umsetzung notwendigen Enzyms. Einfach

ausgedrückt besteht das Problem darin,

daß das Volumen bei Verkleinerung der Abmessungen

der Reaktionsgefäße mit der dritten

Potenz, die Oberfläche dagegen nur mit

der zweiten Potenz schrumpft. Daraus folgt,

daß mit der Miniaturisierung konventioneller

Reaktionsgefäße die genannten negativen

Einflüsse der Gefäßwände auf das Reaktionsgeschehen

drastisch zunehmen. Dieses

Problem wird durch die 2D/3D-BioChiptechnologie

überwunden.

Abb. 3: 2D/3D-BioChips sind fehlertolerant. Obwohl im gezeigten Fall das Zentrum der Probentransfernadel

(Transfer Pin) das Zentrum der gewünschten Position auf dem Chip um mehr als

100 µm verfehlt, wird die Probenlösung auf die exakte Position gelenkt. Die Aufnahme rechts außen

zeigt, daß das Transfervolumen ebenfalls durch den Chip (die Abmessungen des hydrophilen

Ankers) und nicht durch das verwendete Druckwerkzeug bestimmt wird.

Wird der trockene Chip (2D-Format) in eine

zu analysierende Lösung eingetaucht oder

wird ein Aliquot davon (z.B.: 50 µl) darüber

geführt, bindet jeder der hydrophilen Anker

ein durch seine Abmessungen exakt definiertes

kleines Volumen der Probenlösung

(z. B.: 5 nl), das anschließend für den Nachweis

möglicher Inhaltsstoffe (z. B. Antikörper

in Serum) oder die Bestimmung enzymatischer

Aktivitäten genutzt werden kann

(Abb. 2c). In einer speziellen, an die Abmessungen

des Chips angepaßten Feuchtigkeits-

/Hybridisierungskammer können die Volumina

dieser Tröpfchen (Reaktionsräume)

leicht über mehrere Stunden hinweg konstant

gehalten werden. Bei Bedarf kann durch

Flüssigkeitszugabe (z.B. durch einen modifizierten

Tintenstrahldrucker) oder Verdampfung

das Reaktionsvolumen den Erfordernissen

dynamisch angepaßt werden.

Weitere, etwa für den Nachweis erforderliche

Reagenzien werden ebenfalls bevorzugt

berührungslos zugeführt, zum Beispiel

durch den Einsatz einer Piezo- oder Solenoiddispensierstation.

Auf konventionellen Chipoberflächen (z. B.

Glas) sind das aufgebrachte Volumen und

Abb. 4: Proben können auf 2D/3D-Biochips

effektiv aufkonzentriert werden. Im gezeigten

Beispiel wurden 150 bzw. 200 Attomol einer

Peptidmischung gelöst in 1,5 (Mitte) bzw. 2,0

µl eines Isopropanol/Wassergemisches auf

den Chip transferiert (a) und auf wenige Nanoliter

aufkonzentriert (b,c). Die exakte Position,

Geometrie und Größe der aufkonzentrierten

Probe wird in diesem Experiment durch das

Design der Chipoberfläche vorab festgelegt

(c). Oberflächendesign: Teflonbeschichtung

ausgestattet mit einem 2,5 x 2,5 mm-Raster

von kreisrunden hydrophilen Ankern (Durchmesser:

100 µm). Diese bestehen aus jeweils

wenigen Lagen von Goldatomen.

Betrachtet man die 2D/3D-Chiprohlinge

analog zur Halbleitertechnologie als Hardware,

beispielsweise als Prozessor, kann man

sie mit verschiedenen DNA-Sequenzen, Proteinen

oder Proteinfragmenten für bestimmte

Fragestellungen ausstatten (programmieren)

und nach Durchführung eines Experimentes

– beispielsweise der Hybridisierung mit

mRNA oder cDNA – das Ergebnis als Punktmuster

darstellen. In dem Vergleich Computerchip

versus Biochip entsprechen in diesem

Fall kleine, als flexible Reaktionsräume

fungierende Tröpfchen den winzigen Transistoren,

von denen in modernen Mikroprozessoren

viele Millionen integriert sind und

logische Schaltungen ermöglichen.

Probenmoleküle können auf 2D/3D-Biochips

in situ, zum Beispiel vor ihrer Immobilisierung,

effektiv und verlustfrei aufkonzentriert

werden. In diesem Fall kann der

Durchmesser der aufgebrachten Probentropfen

die Abmessungen der hydrophilen Anker

um ein Vielfaches überschreiten (Abb.

4a). Nach dem Überführen der Probe wird

diese dann einfach durch Abdampfen von

Lösungsmittel aufkonzentriert, wobei die in

allen drei Raumrichtungen schrumpfenden

Tröpfchen sich auf die hydrophilen Anker

zurückziehen (Abb. 4b). Erst wenn der

Durchmesser der Tröpfchen auf die Abmessungen

der hydrophilen Anker geschrumpft

ist, reduziert sich der weitere Schrumpfvorgang

auf die dritte Dimension und der Aufstellwinkel

der Tröpfchen ändert sich dramatisch

(zuvor > 90 °, danach


B L I T Z L I C H T

philen Anker auszukristallisieren (Abb. 5b).

Letztere haben einen Durchmesser von wahlweise

200, 400, 600 oder 800 µm (Abb. 5c).

Das Aufkonzentrieren der Analytmoleküle

unmittelbar auf dem Probenträger verbessert,

verglichen mit konventionellen Präparationstechniken,

die Nachweisempfindlichkeit

erheblich. Komplexe Peptidgemische

und Nukleinsäuren können dadurch auch

im Attomolbereich mit einem guten Signalzu-Rauschverhältnis

nachgewiesen werden

11,14

. Die Vorstrukturierung der Probenträger

erlaubt höhere Probendichten als konventionelle

Probenträger zulassen, bestimmt

vorab die exakten Koordinaten und Abmessungen

der präparierten Proben und erleichtert

und beschleunigt damit deren vollautomatische

Analyse erheblich. Zum Beispiel

können 384 verschiedene Peptidgemische

so in weniger als einer Stunde massenanalysiert

werden.

Abbildung 6 zeigt, daß in Tropfen, die den

2D/3D-BioChips aufsitzen oder daran

hängen, Probenmoleküle im Mikromaßstab

hochparallel aufgereinigt werden können

und darin auch schwierige Reaktionen effizient

durchgeführt werden können. Ein Beispiel

ist die in situ-Proteolyse von Proteinen,

die mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese

isoliert wurden. Die Ausformung

von Reaktionsgefäßen mit einem minimalen

Wandkontakt auf 2D/3D-BioChips bietet

noch weitere Vorteile: zum Beispiel ist das

Signal-zu-Rauschverhältnis auf 2D/3D-

DNA-Chips nach der Hybridisierung im

Vergleich zu BioChips der zweiten Generation

wesentlich erhöht. Neben der bereits

beschriebenen Aufkonzentrierung der Probenmoleküle

vor oder während deren Anbindung,

beschränkt sich die Hybridisierungsreaktion

ausschließlich auf die hydrophilen

Anker und damit das Hintergrundsignal

zwischen den einzelnen Ankern auf die

bekannte und konstante Eigenfluoreszenz

des Trägermaterials (Chiprohling). Diese ist

bei dem von der Scienion AG verwendeten

Herstellungsprozeß minimal und unter anderem

dafür verantwortlich, daß die Nachweisempfindlichkeit

auf 2D/3D-DNA-Chips

gegenüber DNA-Chips der zweiten Generation

erhöht ist. Die bekannten Doughnut-

Effekte – also Spots mit einem in der Spotmitte

schwachen, aber am Spotrand wesentlich

erhöhten Intensitätsprofil –, welche die

Bildanalyse erschweren, sind auf 2D/3D-

BioChips noch nicht beobachtet worden –

ebenso wie Ghost-Spots, also Signale, die eine

geringere Intensität als das Hintergrundsignal

aufweisen.

Weitere Vorteile von 2D/3D-BioChips sind,

daß in jedem Reaktionsraum (Tröpfchen)

die für ein bestimmtes Biomolekül idealen

Bedingungen (Ionenstärke, pH) hergestellt

werden können, um beispielsweise möglichst

viele verschiedene Proteine in einer

möglichst nativen Umgebung vorzuhalten.

Verbunden mit den vielfältigen Detektions-

Abb. 5 (a) Die Probenpräparation

für die MALDI-

MS wurde durch die Einführung

der Anchor-

Chips-Technologie, auf

der die 2D/3B-BioChiptechnologie

basiert, entscheidend

verbessert.

(b) Die aufgetragene Probenlösung

wird aufkonzentriert

und in ihrer Position

korrigiert. Die in

der Lösung enthaltenen

Analyt- und Matrixmoleküle

kokristallisieren anschließend

ausschließlich

auf dem hydrophilen Anker.

(c) Die hydrophilen

Anker – Durchmesser:

200, 400, 600 oder 800 µm

möglichkeiten wie MALDI-TOF-MS, MAL-

DI-FT-ICR-MS oder dem Nachweis von Fluoreszenz,

Lumineszenz oder der Oberflächen-

Plasmonenresonanz und den nur minimal

vorhandenen Oberflächen, welche auf

Biochips der ersten zwei Generationen gerade

das Studium von Protein-Protein-Wechselwirkungen

limitieren, bieten 2D/3D-

BioChips eine interessante Alternative für

neue funktionale und native Assays und das

Hochdurchsatz-Screening.

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VL, Mirzabekov AD. An oligonucleotide hybridization

Abb. 6: Auf 2D/3D-BioChips können auch

komplexe Prozesse wie die magnetische Aufreinigung

von Biomolekülen oder die enzymatische

(in situ) Spaltung von Proteinen effizient

und hochparallel durchgeführt werden. Je

nach Bedarf und Ausrichtung des Chip fungieren

dabei kleine aufsitzende oder hängende

Tröpfchen als Reaktionsräume mit minimaler

Wandfläche.

approach to DNA sequencing. FEBS Lett. 1989 Oct

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Korrespondenzadresse

Dr. Holger Eickhoff

Scienion AG

Volmerstr. 7a, D-12489 Berlin

eMail: eickhoff@scienion.de

Dr. Eckhard Nordhoff

MPI für molekulare Genetik, Berlin

eMail: nordhoff@molgen.mpg.de

Dr. Martin Schürenberg

Bruker Daltonik AG, Bremen

eMail: msch@bdal.de

|transkript LABORWELT Nr. III/2001 | 33


B L I T Z L I C H T

Microarray-Genexpressionsanalyse

Neue cDNA-Klonkollektionen und ein

innovatives Datenintegrationssystem

RALF LÖBBERT, LION BIOSCIENCE AG, HEIDELBERG

Die Verwendung von DNA-Chips, besser

bekannt als „Microarrays“, zur Untersuchung

der Genexpression haben in den letzten

Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen

– sowohl für die biologische Grundlagenforschung

als auch für die Entwicklung

und Prüfung neuer Wirkstoffe in der

pharmazeutischen Industrie. Entscheidend

für die erfolgreiche Anwendung dieser neuen

Methodik ist die Auswahl der richtigen

Technologie. Die Wissenschaftler der Abteilung

für Arzneimittelentwicklung von LION

bioscience haben bereits früh ein sehr breites

Spektrum an Methoden und Technologien

zur Untersuchung differentieller Genaktivitäten

etabliert. In diesem Zusammenhang

wurden auch einschlägige Erfahrungen mit

verschiedenen cDNA-Klonkollektionen gemacht,

die als Ausgangspunkt für die Generierung

von Probenmaterial zur Herstellung

von Microarrays dienten.

Diese zumeist öffentlich zugänglichen cDNA-

Kollektionen wurden ursprünglich für die

Transkriptomanalyse im Rahmen von „expressed

sequence tag“ (EST)-Projekten hergestellt.

Der Verwendung dieser Klone für

die Herstellung von Microarrays erwies sich

dagegen als problematisch. Bereits bevor mit

dem Auftragen der Proben (spotting) auf die

Glasträger begonnen werden konnte, stellte

die Amplifikation der cDNAs mittels „Polymerase-Ketten-Reaktion“

(PCR) den Experimentator

auf eine harte Geduldsprobe. Den

Sammlungen liegen verschiedene Plasmid-

Vektorsysteme zugrunde und machten die

Verwendung verschiedener PCR-Bedingungen

erforderlich. Uneinheitliche Insertlängen

und lange homopolymere „A“-Sequenzen an

den 3‘- Enden der cDNA führten zu niedrigen,

sehr inhomogenen Ausbeuten an Probenmaterial.

Obwohl schließlich mit größerem

Aufwand gleiche, hinreichend stark konzentrierte

Lösungen zum Bedrucken der Glasträger

bereitstanden, konnten aufgrund der

sehr heterogenen Fragmentläge der cDNAs

nur sehr unterschiedliche molare Mengen

aufgebracht werden. Häufig entsprach die

Identität der Klone nicht den Erwartungen.

cDNA-Proben waren in vielen Fällen falsch

annotiert, sehr wahrscheinlich aufgrund der

quantitativ und qualitativ begrenzten Sequenzinformation.

Die proteinkodierenden

Sequenzbereiche enthielten teilweise evolutionär

konservierte Abschnitte, die – besonders

zwischen Mitgliedern einer Genfamilie

– zu Kreuzhybridisierungen und somit zu

falsch-positiven Ergebnissen führte. Falschpositive

Ergebnisse wurden auch aufgrund

von repetitiven Sequenzelementen beobachtet,

die in den nicht translatierten Bereichen

der cDNAs gefunden wurden. Nicht selten

ist mit der Verwendung solcher EST-cDNA-

Sammlungen auch die Verpflichtung verbunden,

die gewonnenen Ergebnisse zu publizieren,

was für den industriellen Anwender

meist nicht akzeptabel ist.

Abb. 2: Jedem

arrayTAG cDNA-

Klon liegen umfassende

Informationen

in der Annotationsdatenbank

arrayBASE

zugrunde.

Abb. 1: Homogene Größenverteilung von

arrayTAG cDNA-Fragmenten. Gelelektrophoretische

Auftrennung der cDNAs nach

Amplifikation mittels PCR.

Aufgrund der praktischen Erfahrungen mit

den bis dahin verfügbaren Klonsammlungen

entschloß sich LION bioscience zur Entwicklung

neuer cDNA-Klonkollektionen

speziell für die Microarray-Anwendung.

Dafür wurde ein proprietäres Verfahren zur

cDNA-Klonierung entwickelt, das in Verbindung

mit einem automatisierten Hochdurchsatz-Laborprozeß

zur Herstellung von

nicht-redundanten cDNA-Sammlungen

führt. Diese cDNAs haben eine sehr homogene

Größe (Abb. 1) von 200 bis 600 bp und

sind in ein einheitliches Vektorsystem kloniert.

Die für die PCR-Amplifikation notwendigen

Primerbindungsstellen befinden

sich unmittelbar neben dem cDNA-Insert,

so daß nur der spezifische cDNA-Anteil amplifiziert

und auf den Glasträger aufgebracht

werden kann. Im Rahmen der cDNA-Synthese

werden die poly-(A)-Enden der cDNAs

entfernt, so daß die damit verbundenen Probleme

– wie schlechte PCR-Eigenschaften

und unspezifische Hintergrundhybridisierungen

– eliminiert werden können. Das

Gesamtdesign erlaubt eine sehr effiziente und

homogene Amplifikation der cDNAs. Die homogene

Größe gewährleistet, daß annähernd

äquimolare Mengen auf die Microarrays aufgebracht

werden können.

Im Zuge dieses neuen Klonierungsverfahrens

werden cDNA-Moleküle hergestellt, die

auf das 3‘-Ende der mRNA zurückgehen.

Der 3‘-gelegene, nicht proteinkodierende Bereich

eines Transkripts weist die größten

Sequenzunterschiede zwischen Mitgliedern

einer Genfamilie auf, so daß diese Region für

die Differenzierung von nahe verwandten

Transkripten durch Hybridisierungstechniken

besonders gut geeignet ist.

Vor der endgültigen Sequenzierung aller

cDNAs wird die noch vorhandene Redundanz

an häufigen Transkripten aus der Bibliothek

entfernt. Zu diesem Zweck wird

34 | Nr. III/2001 |transkript LABORWELT


aus der Primärbibliothek eine Stichprobe von cDNA-Klonen sequenziert,

um häufig vorkommende Klone zu identifizieren. Diese

Klone werden dann für die Hybridisierung von hochdichten Koloniefiltern

der gleichen Klonbibliothek eingesetzt. cDNA-Klone, die

nicht mit Sequenzen der häufigen Klone hybridisieren, bilden die

Grundlage für die erneute Auswahl einer Sequenzierungsstichprobe

und einer weiteren Filterhybridisierung. Erst nach mehreren

Runden dieser Redundanzminimierung wird der Sequenzierungsprozeß

aller noch verbleibenden cDNA-Klone angestoßen.

Die erhaltenen Sequenzen werden mit bioinformatischen Methoden

nach repetitiven Sequenzelementen oder Elementen mit geringer

Sequenzkomplexizität durchsucht. Solche cDNAs würden in

Microarray-Experimenten falsch-positive Ergebnisse liefern und

sind daher nicht Teil der endgültigen cDNA-Sammlung. Durch

direkte Sequenzvergleiche mit bereits bekannten cDNA-Sequenzen

wird die Qualität in bezug auf Integrität und Lage des kurzen 3`cDNA-Fragmentes

überprüft. Schließlich werden redundante cD-

NAs auf Ebene der Nukleotidsequenz eliminiert, so daß letztlich

jede cDNA nur einmal in der endgültigen cDNA-Sammlung vertreten

ist.

Schon bald nach dem Start dieses unter dem Namen arrayTAG

bekannten cDNA-Projekts erkannten die Wissenschaftler bei LION

bioscience, daß eine spezialisierte cDNA-Kollektion für die Anwendung

im Microarray-Experiment nur von sehr begrenztem Wert ist,

wenn nicht gleichzeitig auch ein umfassendes System der cDNA-

Annotation aufgebaut wird. Die ausführliche Beschreibung der

cDNAs und die Einordnung der zugrundeliegenden Gene in bereits

bekannte biologische Zusammenhänge ist eine grundlegende Voraussetzung

für die korrekte Analyse der Flut der Microarray-Daten.

Aus diesem Grund wurde eine interaktive Datenbank aufgebaut,

die alle relevanten Daten zu einem gegebenen Transkript enthält.

Die als arrayBASE bezeichnete Datenbank basiert auf LIONs

bewährter Datenintegrations-Plattform SRS, die eine einfache und

schnelle Möglichkeit der Datenabfrage und -verknüpfung ermöglicht.

arrayBASE integriert sowohl Daten aus öffentlichen Quellen

als auch solche, die mit LIONs Sequenzanalyse- und Annotationssystem

bioSCOUT ® hergestellt wurden. Neben der gesamten

Sequenzinformation werden ausgewählte Treffer in öffentlichen

Datenbanken wie GenBank, SWISS-PROT oder RefSeq sowie umfangreiche

Informationen aus dem NCBI-UniGene-Transkript-Cluster

dargestellt (Abb. 2). Eigene, tiefergehende Annotationsdaten

werden klar und prägnant in dem bioSCOUT ® -„Feature Report“

dargestellt, der integraler Bestandteil der Datenbank ist und eine

weite Spanne an Hyperlinks zu Hintergrundinformationen und

Quelldaten bereitstellt.

Das arrayTAG/arrayBASE-Programm wurde bisher für die in

der Life Science-Forschung wichtigen Modellorganismen Maus,

Ratte und Hund aufgelegt. Die Sammlungen mit den entsprechenden

Datenbanken sind zum Teil bereits erhältlich und werden von

der Firma BIOCAT im deutschsprachigen Raum vertrieben. Die

überaus positiven Erfahrungen mit diesen neuen Ressourcen in

LIONs eigener Arzneimittelentwicklung und bei Kunden aus der

Life Science-Industrie und der -Forschung bestätigen das Gesamtkonzept.

Anzeige

Korrespondenzadresse

Dr. Ralf Löbbert

LION bioscience AG

Im Neuenheimer Feld 515

D-69120 Heidelberg

eMail: ralf.loebbert@lionbioscience.com

Kennziffer 25 LW 03 oder www.biocom.de Info ordern?

|transkript LABORWELT Nr. I/2001 | 35


B L I T Z L I C H T

Arraying

Microarray-Herstellung im

High Throughput

MANFRED REMER, PACKARD BIOSCIENCE GMBH, DREIEICH

Eine der wesentlichsten Problemstellungen

bei der Herstellung von BioChips oder

Micro-Arrays war bisher das Erreichen eines

hohen Durchsatzes, um sinnvolle Produktionsgrößen

zu erreichen. Neben den

physikalischen Parametern mußten auch

technische Faktoren beachtet werden, um

speziell im Bereich der Verarbeitung von

DNA- und Proteinproben einen Hochdurchsatz

zu realisieren. Dies war meist nur durch

den Einsatz mehrerer Systeme mit unterschiedlichen

Eigenschaften möglich. Jetzt

stellt Packard BioScience den SpotArray

Enterprise vor, der speziell für diesen Bereich

entwickelt wurde und mit höchster

Flexibilität eingesetzt werden kann.

Abb. 1: Makroaufnahmen Dispense Tips,

Kapillaren

Als ideal hat sich bei den notwendigen Dosierungen

von minimal 325 pl pro Spot die

Piezo-Technik bewährt. Diese garantiert

nicht nur das kontaktfreie Dosieren von flüssigen

Materialien auf unterschiedliche Trägeroberflächen,

sondern arbeitet zudem zuverlässig

mit höchster Präzision und Richtigkeit.

Das „Non Contact“-Verfahren schont

die Oberfläche der Trägersysteme und vermeidet

gleichzeitig eine Kontamination. So

können mit dieser Methode neben Standard-

Glastrays auch dreidimensionale Systeme

oder Träger mit Membranen problemlos bearbeitet

werden. Ein weiterer Vorteil der

Piezo-Technik ist die geringe mechanische

Belastung der zu verarbeitenden Flüssigkeiten

– unter anderem entwickeln sich

wegen der geringen kinetischen Energie keine

erhöhten Temperaturen, was besonders

bei proteinhaltigen Materialien die Denaturierung

vermindert bzw. verhindert und

sogar die Verarbeitung von zellhaltigen Materialien

ermöglicht.

Daraus ergibt sich eine Vielzahl von Einsatzmöglichkeiten

mit verschiedensten biologischen

Materialien und Proben in Forschung

und Produktion wie etwa Oligonukleotide,

cDNA, genomische DNA, Nukleinsäurederivate,

Proteine, Antikörper, Antigene

bis hin zu ganzen Zellen oder nichtsedimentierenden

Suspensionen.

Gerade bei vollautomatischen Systemen mit

derart hoher Flexibilität in der Anwendung

ist es unabdingbar, die flüssigkeitsführenden

Systeme rückstandsfrei waschen zu können.

Der SpotArrray Enterprise ist deshalb

mit speziellen Waschgefäßen ausgestattet.

Die Kapillaren werden mit einer Kombination

aus interner Systemflüssigkeit von innen

und weiteren wählbaren Flüssigkeiten

gleichzeitig von außen gereinigt. Zusätzlich

kann eine Ultraschallreinigung oder

sogar die Kombination aus beiden Verfahren

eingesetzt werden. Hierbei ist selbstverständlich

die Nutzung unterschiedlicher

Waschmaterialien möglich. Besonders bei

Verwendung von proteinhaltigen Lösungen

zeigt sich die Effektivität dieses Waschverfahrens.

Auch bei der Dosierung mit Piezo-Technik

ist ein automatisches Kontrollsystem notwendig,

speziell wenn es sich um ein HT-

Gerät handelt und höchster Durchsatz gefordert

ist. Der SpotArray Enterprise ist

deshalb mit einem besonders effektiven Kamerasystem

ausgerüstet, das jede Dosierung

kontrolliert und dokumentiert. Sollten Fehldosierungen

bei den Spots auftreten, so kann

dieser Fehler nachbearbeitet und somit eliminiert

werden.

Dieses sichere Verfahren verhindert daher

weitgehend „Ausschuß“-Produktionen und

vermindert dadurch Produktionskosten.

Weiterhin sind alle aufgenommenen Materialien

in die Ausgangsgefäße „rückführbar“.

Der Dosierkopf des SpotArray Enterprise

verwendet 8 Kanäle parallel. Jeder Kanal

ist individuell steuerbar und erreicht einen

CV von < 2,5 %. Abhängig von den verwendeten

Materialien kann die Varianz zwischen

allen 8 Kanälen < 6,5 % erreichen.

Diese Präzision ist gerade bei Verwendung

von Protein-Materialien und Tests wesentlich,

da hier immer häufiger anstatt eines

Ja/Nein-Resultates das „quantitative dose/

response“-Verfahren benötigt wird.

Abb. 2: Array Trax mit Dosierkopf und Kamera

Da alle 8 Kanäle individuell Materialien

aufnehmen können, hat der SpotArray

Enterprise nicht nur eine sehr hohe Prozeßgeschwindigkeit,

sondern kann so auch bis

zu 278 unterschiedliche Biomoleküle pro

Stunde verarbeiten.

Die mechanische x-y-z-Einheit des Dosierkopfes

ist nach industriellen Halbleiter-

Standards hergestellt und ermöglicht somit

höchste Positionierungsgenauigkeit.

Speziell für ein HT-System ist eine schnelle

und effektive „Beladung“ mit Trägern notwendig.

Das System ist daher mit einem

leicht wechselbaren „Tablett“ ausgerüstet,

das extern bestückt werden kann. Dieses

Tablett nimmt bis zu 108 Standard-Träger

auf. Diese Flexibilität ermöglicht ein „On

Going“-Bestücken des Systems und reduziert

so die Beladungszeit zwischen den

einzelnen „Runs“.

Weitere Informationen

Packard BioScience GmbH

Robert-Bosch-Str. 32

63303 Dreieich

Tel.: 06103 -385-151

www.packardbioscience.com

Abb. 3: Spot Array Enterprise-System

36 | Nr. III/2001 |transkript LABORWELT


B L I T Z L I C H T

Biochip-Herstellung

Geniom ® -Technologie: Der erste

frei programmierbare DNA-Array

MARKUS BEIER, MARCUS HAUSCH, MANFRED MÜLLER, CORD STÄHLER, PEER STÄHLER, FRITZ STÄHLER,

FEBIT GMBH, MANNHEIM

Die Geniom-Technologie der febit gmbh stellt einen neuartigen integrierten Ansatz für die Untersuchung

von Genexpressionsmustern und die Mutationsanalyse mit Hilfe von DNA-Arrays dar. Die

Arbeitsweise der Geniom-Technologie ermöglicht ein Arbeiten vergleichbar dem eines gewöhnlichen

Personal Computers. Ausgehend von digitalen Gensequenzdaten wird innerhalb weniger Stunden ein

spezifischer individueller DNA-Array aufgebaut, danach im Gerät hybridisiert und die Hybridisierungsereignisse

erneut als digitale Daten ausgelesen. Biologische Prozesse können somit in digitale

Daten übersetzt und durch intelligente Bioinformatiksoftware abgebildet werden.

Key Words: Oligonucleotide Array, DNA-Array, DNA-Chip, Custom Array, light-directed synthesis,

Expression Profiling, Genotyping

A

B

Die DNA-Chip-Technologie 1 besitzt eine

zentrale Bedeutung für die Erforschung der

Funktion und Regulation von Genen sowie

für die Untersuchung von SNPs (single nucleotide

polymorphisms, Punktmutationen)

zu Diagnostikzwecken. Neben durch Auftragen

(Spotten) von cDNAs hergestellten

Microarrays 2 besitzen vor allem in situ hergestellte

Oligonukleotid-Arrays 3,4 eine gro-

Abb. 1: Geniom One – die erste vollintegrierte

DNA-Array-Plattform. Herstellung, Hybridisierung

und Analyse eines Array-Experimentes

finden vollautomatisiert in einem einzigen Gerät

statt.

ße Marktbedeutung. Die Oligonukleotid-

Arrays lassen sich sowohl für die Bestimmung

von Genexpressionsmustern 5 , die Sequenzierung

als auch für die Detektion von

SNPs oder anderen Mutationen verwenden

6 . Ein limitierender Faktor in der Anwendung

von DNA-Arrays ist bislang, daß

sich diese nur unter extrem hohem Aufwand

für ein individuelles Experiment optimieren

lassen. Hier stellt die Geniom-Technologie

einen wesentlichen Fortschritt dar,

da ohne Vorlaufzeiten individuelle DNA-

Arrays direkt beim Kunden vor Ort konzipiert

und hergestellt werden können. Da

das Design eines DNA-Arrays in digitaler

Form vorliegt, können alle einmal erstellten

DNA-Arrays jederzeit modifiziert, op-

timiert, ganz oder teilweise mit anderen

DNA-Arrays kombiniert werden. Ein weiterer

Vorteil der Geniom-Technologie liegt

darin, daß der Gesamtprozeß – ausgehend

von der Synthese der Oligonukleotid-Sonden

über die Hybridisierung bis hin zur

Detektion – in einem einzigen Gerät erfolgt.

Durch diesen integrierten Ansatz können

viele Fehlerquellen durch falsche Handhabung

oder andere Einflüsse vermieden

werden. Dieser integrierte und flexible

Ansatz erlaubt es, auf spezifische Fragestellungen

zugeschnittene DNA-Arrays innerhalb

eines Tages herzustellen und in

einem No-Hands-On-Prozeß zu hybridisieren

und auszulesen.

Array-Design und -Synthese

Abb. 2: DNA-Prozessor. (a) Das Array-Format

der Geniom-Technologie ist eine daumengroße

dreidimensionale Mikrostruktur; durch

die Trennung in vier Subräume kann der DNA-

Prozessor wahlweise als ein großer Array mit

hohem Informationsgehalt (40.000 Features)

oder als vier voneinander unabhängige Arrays

mit jeweils 10.000 Positionen verwendet werden.

(b) Sowohl der Aufbau der Oligonukleotid-Sonden

als auch die Hybridisierung mit

den markierten Proben findet in den Kanälen

des DNA-Prozessors statt.

Im ersten Schritt des Gesamtprozesses wird

die Berechnung der für den geplanten DNA-

Array spezifischen Oligonukleotid-Sonden

durchgeführt. Danach wird auf Basis der

Sequenz-Datei der berechneten DNA-Sonden

ein Syntheseprotokoll erstellt, nach dem

die Oligonukleotid-Sonden in situ an einer

festen Phase synthetisiert werden. Die Festphasensynthese

der Sonden erfolgt lichtgesteuert

unter Verwendung moderner

Schutzgruppenchemie in einer dreidimensionalen

Mikrostruktur – dem sogenannten

DNA-Prozessor. Der zyklische Syntheseprozeß

– bestehend aus einer Abfolge von

Belichtungen und Kondensationen mit den

DNA-Bausteinen (A,C,G,T) – wird so lange

durchlaufen, bis an jeder Position des Arrays

in der Mikrostruktur die gewünschte

DNA-Sequenz aufgebaut wurde. Auf diese

Weise können in einem etwa 2 x 2 cm großen

DNA-Prozessor bis zu 40.000 Oligonukleotid-Sonden

mit einer Länge bis zu 60

Nukleotiden aufgebaut werden.

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|transkript LABORWELT Nr. III/2001 | 37


B L I T Z L I C H T

Der DNA-Prozessor ist in vier voneinander

unabhängige Subräume untergliedert, die

zwar alle parallel synthetisiert werden, aber

später jeder für sich als individuelle Arrays

oder wahlweise alle vier zusammen als ein

großer Array verwendet werden können.

Ein wesentlicher Vorteil der Geniom-Technologie

besteht darin, daß sich das Array-

Design den Anwender-Bedürfnissen individuell

anpassen läßt. Durch die Flexibilität

beim Aufbau des Arrays, können unter

anderem die Länge der Oligonukleotid-Sonden,

die Zahl der pro Gen verwendeten

Sonden, interne Kontrollsonden sowie Perfect

Match/Mismatch-Strategien auf das jeweilige

Experiment optimal abgestimmt

werden.

Array-Hybridisierung

und -Analyse

Nach der Array-Synthese wird die zu untersuchende

markierte Probe über ein Probenzugabeventil

zugegeben. Hierbei können

vom Anwender softwaregesteuert Hybridisierungparameter

wie Zeit, Temperatur,

Puffer und Durchmischung sehr genau

kontrolliert werden. Peltiergesteuert steht

dem Anwender ein breiter Temperaturbereich

von 10 bis 95 °C zur Verfügung. Hervorzuheben

ist auch das für die Hybridisierung

benötigte Probenvolumen, das durch

das verschwindend geringe Innenvolumen

des DNA-Prozessors gegeben ist. Pro Hybridisierungs-Assay

werden 15-20 µl Probenvolumen

benötigt, das durch eine kontrollierte

Bewegung während des Hybridisierungsvorganges

immer wieder an den

Oligonukleotid-Sonden aktiv vorbeigeführt

wird und so zu einer Verbesserung der

Hybridisierungskinetik führt.

Die durch die Hybridisierung erzeugten

Fluoreszenzsignale werden mit einer CCD-

Kamera detektiert. Der Anwender ist durch

Verwendung eines Filterrades nicht an einen

bestimmten Farbstoff gebunden. Es

können sowohl Einfarben- als auch Mehrfarben-Experimente

durchgeführt werden,

Abb. 3: Anwendungsbeispiele.

(a) Expression-

Profiling (Hefe, 30.000

Sonden, 25mere). (b) Genotypisierung

von HPV-

Stämmen. (c) Mutations-

Analyse (20 Sonden pro

SNP; auch bei einem geringen

Abstand von 7 bp

zwischen zwei SNPs ist

die Mutation eindeutig zu

bestimmen)

bei denen zum Beispiel zwei Transkriptionszustände

direkt auf dem gleichen Array

vergleichbar sin.

Da für die Experimente mit der Geniom-

Technologie nur digitale Daten als Input

benötigt bzw. digitale Daten als Output

erzeugt werden, ist es durch intelligente

Bioinformatiksoftware möglich, das im vorangegangenen

Experiment erlangte Wissen

am nächsten Tag sofort für ein verbessertes

Chipdesign umzusetzen.

Applikationen

Die hohe Flexibilität der in situ-Synthese,

jedes mögliche Muster von DNA-Sonden,

das in digitaler Form als Sonden-Sequenzdatei

definiert wird, auf dem Array herzustellen,

wirkt sich besonders auf die Anzahl

verfügbarer Applikationen aus. Die Palette

reicht von Expressions-Studien und Resequenzierungen

bis hin zu Genotypisierungs-Anwendungen

wie der SNP-Detektion

und Mutationsanalysen. Abbildung 3

zeigt eine Auswahl von Anwendungen, die

auf der Geniom-Plattform durchgeführt

wurden. Momentan umfaßt der Informationsgehalt

eines DNA-Prozessors 40.000 Oligonukleotid-Sonden,

wobei durch die Unterteilung

in Subräume wahlweise vier unterschiedliche

Proben mit jeweils 10.000

Sonden oder eine Probe gegen alle 40.000

Sonden untersucht werden kann.

Bei Expressionsstudien kann der Anwender

zwischen einem Setup unter Verwendung

langer (typischerweise 50 bis 60mere)

oder einem mit kurzen Oligonukleotid-Sonden

wählen. Die erste Variante erlaubt die

Simulation gespotteter cDNA-Arrays, wobei

ein Gen typischerweise durch einige

wenige lange Oligonukleotid-Sonden repräsentiert

wird 7 . Bei Verwendung kurzer

Sonden werden für ein Gen klassischerweise

16 bis 20 Oligonukleotide (20-25mere)

benutzt und durch einen ebenso großen

Satz von Mismatch-Oligonukleotiden ergänzt.

Das Design spezieller Assays zum

Aufspüren von Splice-Varianten von Genen

ist auf der Geniom-Plattform sowohl

mit langen und mit kurzen Oligomeren-

Arrays möglich. Abbildung 3a zeigt eine

Expressionsstudie, die mit 30.000 Hefe-spezischen

Oligonukleotid-Sonden realisiert

wurde. Hierbei wurden jeweils 16 Oligonukleotid-Sonden

mit den jeweils zugehörigen

Mismatch-Sonden für die Repräsentation

eines Gens benutzt.

Weiterhin lassen sich auf der Geniom-Plattform

alle Assays durchführen, die Mutationen

mit einer Sensitivität bis hin zu einem

Einezlbasenpaaraustausch detektieren. Sollen

bislang unbekannte Mutationen gefunden

werden, wird die zu untersuchende

Sequenz klassischerweise als Tiling-Array

auf den Array aufgebracht und per Hybridisierung

Base für Base resequenziert. So

wurden hohe Ausbeuten (>97%) bei der

Resequenzierung von Fragmenten bislang

bis zu einer Länge von 2 kb erzielt. Bekannte

Mutationen können durch mutationsspezifische

Oligonukleotid-Sonden effektiv

nachgewiesen werden. Auf der Geniom-

Plattform hat sich ein Assay-Format, das

bis zu 20 spezifische Oligonukleotid-Sonden

zur Detektion einer Mutation verwendet,

als äußerst effektiv erwiesen, selbst

wenn zwei Mutationen sehr eng zueinander

positioniert sind (Abb. 3c). Im Hinblick

auf Genotypisierungs-Assays konnten beispielsweise

unterschiedliche Stämme des

Humanen Papillom-Virus (HPV) eindeutig

charakterisiert werden. Hierbei fanden spezifische

Oligonukleotid-Sonden Verwendung,

die es ermöglichen, gezielt zum Beispiel

HPV2b neben anderen HPV-Stämmen

nachzuweisen (Abb. 3b).

Literatur

1. Lemieux B., Aharoni A., Schena M., Mol. Breeding,

4, 277-289, (1998)

2. Schena M., Shallon D., Davis R., Brown P., Science,

270, 467-470, (1995)

3. Southern E., Maskos U., Elder R., Genomics, 13,

1008-1017, (1992)

4. Pease A.C., et.al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91,

5022-5026, (1994)

5. Lockhart D. et.al., Nat. Biotechnol., 14, 1675-1680,

(1996)

6. Cronin M.T., et.al., Human Mutation, 7, 244-255,

(1996)

7. Hughes T.R. et.al., Nat. Biotechnol, 19, 342-347,

(2001)

Kontaktadresse

febit gmbh

Käfertalerstr. 190

68167 Mannheim

Tel.: 0621-3804-0

Fax: 0621-3804-400

Wissenschaftliche Korrespondenz:

Peer Stähler, Chief Scientific Officer

eMail: peer.staehler@febit.de

38 | Nr. III/2001 |transkript LABORWELT


B L I T Z L I C H T

Oligonukleotid-Arrays

Sequenzoptimierte Longmer-

Oligonukleotide für DNA-Microarrays

CHRIS SEIDEL 1 , SAJEEV BATRA 1 , DR. RALF HUCH 2 UND DR. PETER SCHÜSSLER 3 ,

1

OPERON INC., ALAMEDA (CA), USA, 2 QIAGEN GMBH, HILDEN, 3 OPERON EUROPE, KÖLN

DNA-Microarrays ermöglichen

die parallele Expressionsanalyse

einer großen Anzahl von

Genen in einem Experiment. Dabei

können die zu untersuchenden

Gene durch Oligonukleotide

oder PCR-Fragmente auf

dem DNA-Microarray repräsentiert

werden.

Bei der Genexpressionsanalyse

mit Hilfe von PCR-Fragment-

Microarrays (cDNA-Arrays)

kommt es aufgrund von Kreuzhybridisierungen

zwischen homologen

DNA-Sequenzen häufig

zu Schwierigkeiten, die Expressionsmuster

verwandter

Gene zu unterscheiden. Ebenso

titativ erfaßt werden kann.

In der hier beschriebenen Untersuchung

werden 70mer-

Microarrays mit PCR-Fragment-Microarrays

hinsichtlich

ihrer Fähigkeit verglichen, die

durch Hitzeschock induzierte

differentielle Genexpression zu

analysieren.

Experimentelles

Vorgehen

Die DNA-Microarrays zur Untersuchung

des Hitzeschock-

Effekts auf die Genexpression

bei der Bäckerhefe (Saccharomyces

cerevisiae, Stamm S288C)

Abb. 1: Untersuchungen zur Hitzeschock-Genexpression mit 70merund

PCR-Fragment-Arrays. Der Einfluss einer Hitzeschock-Behandlung

auf die Expression von Hefegenen wurde insgesamt vier Microarrays

untersucht: zwei waren mit 70mer-Oligonukleotiden des Yeast Genome

Oligo Set „gespottet“ (70mer) und zwei mit PCR-Fragmenten (PCR).

Zum Vergleich sind veröffentlichte Daten mit aufgenommen (Publ; Daten

aus Referenz 2). Die Expressionsverhältnisse für drei bestimmte

Genfamilien sind dargestellt.

schwierig ist es, auf diese Weise

Gene zu untersuchen, die über

differentielles Splicing für verschiedene

Transkripte codieren.

Darüber hinaus ist die PCR eine

aufwendige Methode, um einen

vollständigen Satz von DNA-

Sonden für die Microarray-Produktion

herzustellen. Die chemische

DNA-Synthese von

70mer-Oligonukleotiden (auch

Longmere genannt) ist demgegenüber

ein effizientes Verfahren,

DNA-Sondenmoleküle für

Microarrays herzustellen, mit

denen die Genexpression quanwurden

entweder mit synthetischen

70mer-Oligonukleotiden

des Yeast Genome Oligo Sets

(Operon) oder mit PCR-Fragmenten

hergestellt, die vollständige

offene Leserahmen (open

reading frames, ORFs) spezifischer

Hefegene repräsentieren.

Als feste Phase dienten Poly-L-

Lysin-beschichtete Glasobjektträger,

auf denen die Nukleinsäure-Sonden

nach Standardmethoden

1 immobilisiert wurden.

Die Hefezellen wurden in YPD-

Medium bei 25 °C bis zu einer

optischen Dichte (OD) von 0,8

kultiviert. Die Kultur wurde

dann in zwei gleiche Volumina

geteilt und die eine Hälfte einer

Hitzeschock-Behandlung von

30 min bei 40 °C ausgesetzt. Anschließend

wurden die mRNAs

aus behandelten und unbehandelten

Zellen isoliert (RNeasy ®

und Oligotex ® Kits, QIAGEN)

und durch reverse Transkription

(Omniscript Reverse

Transcriptase, QIAGEN) in

cDNA umgeschrieben. Während

der reversen Transkription,

die für beide mRNA-Populationen

getrennt verlief, wurden

die cDNA-Moleküle unter

Einbau Cy3- oder Cy5-gekoppelter

Nukleotide markiert. Diese

unterschiedlich markierten

Target-cDNAs wurden gleichzeitig

für die Hybridisierung

der Microarrays eingesetzt.

Ergebnisse und

Diskussion

Der Yeast Genome Oligo Set

(Operon) besteht aus insgesamt

6.307 sequenzoptimierten, für

Hefe-ORFs spezifischen 70mer-

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online unter www.biocom.de:

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|transkript LABORWELT Nr. III/2001 | 39


B L I T Z L I C H T

Tabelle 1: Korrelationskoeffizienten (r-Werte) für die Vergleiche der Daten aus 70mer-Arrayund

PCR-Fragment-Array-Analysen sowie mit veröffentlichten Daten. *Daten aus Referenz 2.

70mer 1 70mer 2 PCR 1 PCR 2

70mer 2 0,93

PCR 1 0,86 0,84

PCR 2 0,82 0,83 0,86

Publ* 0,89 0,89 0,80 0,76

Oligonukleotiden, die direkt auf Glasobjektträger

gespottet werden können (Array-

Ready Oligo Sets). Mit Hilfe einer speziellen

Oligodesign-Software wurden genspezifische

70mer-Sequenzen ausgesucht, deren

Identität zu anderen Gensequenzen minimal

ist. Dabei wurden Sequenzen nahe

am 3'-Ende bevorzugt ausgewählt. Alle

70mer-Oligonukleotide sind außerdem

hinsichtlich ihrer Sekundärstruktur und

Schmelztemperatur (T m

= 74 ± 3 °C) überprüft.

Für den Vergleich der 70mer-Microarrays

mit PCR-Fragment-Microarrays wurden

zwei Microarrays mit 70meren des Yeast

Genome Oligo Sets hergestellt und zwei

mit PCR-Fragmenten. Die differentielle

Genexpression wurde in Hybridisierungsexperimenten

mit den fluoreszenzmarkierten

Target-cDNAs aus den Kontroll-

Hefezellen und Hitzeschock-behandelten

Hefezellen analysiert. Die mit den

Microarrays gewonnenen Daten zur Expression

einzelner Gene aus drei Genfamilien

sind im Vergleich zu publizierten

Daten dargestellt (siehe Abb. 1).

Der Vergleich der Korrelationskoeffizienten

zeigt, daß die Analyse mit den

70mer-Microarrays zu deutlich besser reproduzierbaren

Ergebnissen führte. Darüber

hinaus stimmten die Ergebnisse der

70mer-Microarray-Analyse besser mit

den veröffentlichten Daten überein (siehe

Tab. 1).

Zur Validierung wurde der Effekt der Hitzeschock-Behandlung

auf die Expression

von acht verschiedenen Genen mittels

Real-Time-RT-PCR mit TaqMan ® -Sonden

auf einem ABI PRISM ® 7700 Sequenzdetektionssystem

(Applied Biosystems)

quantifiziert und mit den Werten aus den

Microarray-Analysen verglichen. Die Korrelationen

lagen bei 0,82 (PCR-Fragment-

Array) bzw. 0,98 (70mer-Array). Dies belegt

die hohe Genauigkeit der Microarray-Analysedaten,

die mit den 70mer-Oligonukleotiden

erhalten wurden.

Fazit

Targetverifizierung

In situ-Targetanalyse mit

Gewebearrays

DR. MICHAEL EHRET, BIOCAT GMBH, HEIDELBERG

Mit der nahezu täglich steigenden Anzahl neu identifizierter Targetgen-Kandidaten gewinnt die in

situ-Genexpressionsanalyse in möglichst vielen unterschiedlichen Gewebeproben zunehmend an

Bedeutung. Das Screening mit den bei BioCat erhältlichen Gewebearrays ermöglicht die parallele

Genexpressionsanalyse in bis zu 60 verschiedenen Gewebeproben.

Targetgen-Screening

Abb. 1: Makroskopische Ansicht eines HEgefärbten

Gewebe-Arrays (HE=Hämatoxylin-

Eosin)

ten Gene und ihre Genprodukte sind potentielle

Angriffspunkte (Targets) für diagnostische,

prognostische oder auch therapeutische

Interventionen.

Eine häufig zur Identifizierung differentiell

exprimierter Gene eingesetzte Methode sind

sogenannte cDNA-Expression-Arrays: Auf

Glas oder auf Nylon immobilisierte Nukleinsäuresequenzen

werden dabei mit jeweils

Beim Vergleich von PCR-Fragment-Microarrays

mit 70mer-Oligonukleotid-

Microarrays ergaben die 70mer-Microarrays

durchgehend höhere Reproduzierbarkeiten

und eine bessere Übereinstimmung

mit veröffentlichten Ergebnissen.

Die hohe Reproduzierbarkeit der Genexpressionsdaten,

die aus den Untersuchungen

mit den 70mer-Microarrays gewonnen

wurden, konnte durch Vergleich mit

Daten aus einer quantitativen Real-Time-

RT-PCR bestätigt werden. Die sequenzoptimierten

70mer-Oligonukleotide der

Operon ® Array-Ready Oligo Sets sind somit

effiziente und hochspezifische Sondenmoleküle

für Microarray-Analysen.

Sie reduzieren Fehler durch Kreuzhybridisierungen

auf ein Minimum und können

damit zuverlässige Expressionsdaten

liefern.

Literatur

1. DeRisi, J., Iyer, V., and Brown, P.O. (1999) The

Mguide, version 2.0. (cmgm.stanford.edu/

pbrown/mguide/).

2. Lashkari, D.A. et al. (1997) Yeast microarrays

for genome wide parallel genetic and gene expression

analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94,

13,057.

Korrespondenzadresse

Dr. Peter Schüßler

Operon Europe

Nattermannallee 1

50829 Köln

Zahlreiche molekularbiologisch forschende

Labors sind auf der Suche nach Genen, deren

Expression in verändertem Gewebe signifikant

von jener in gesunden Zellen abweicht.

Diese als differentiell exprimiert bezeichnezwei

cDNA-Proben hybridisiert. Eine der

beiden cDNA-Proben wird aus RNA hergestellt,

die aus gesundem Gewebe stammt. Die

andere wird aus RNA des krankhaften Gewebes

generiert. Als Ergebnis solcher Experimente

werden oft zahlreiche differentiell exprimierte

Gene gefunden, die als Targetkandidaten

in Frage kommen.

Eine wesentliche Beschränkung dieser cDNA-

Expression-Array-Versuche besteht darin,

daß aus Kostengründen und aus Materialmangel

meist nur eine begrenzte Zahl an

Untersuchungen durchgeführt wird. Es ist

jedoch wesentlich, die Expression jedes einzelnen

Kandidatengens möglichst vieler verschiedener

Patienten zu analysieren, um statistisch

signifikante Rückschlüsse auf die diagnostische,

prognostische oder therapeutische

Relevanz des Gens oder Genproduktes

ziehen zu können 1 . Die bei BioCat erhältlichen

vorgefertigten Gewebearrays erleichtern

diese Forschungsanalysen.

Gewebearrays

Auf Objektträgern befinden sich bis zu 60

Gewebeproben verschiedener Probanden

40 | Nr. III/2001 |transkript LABORWELT


B L I T Z L I C H T

Abb. 2: Immunhistochemische

Anfärbung

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(Abb. 1). Die chirurgisch entnommenen Gewebeproben werden für 12

bis 24 Stunden in vierprozentigem, neutralem Formalin fixiert, in

Ethanol dehydriert und nach Xylenbehandlung in Paraffin eingebettet.

DNA, RNA und Proteine bleiben bei diesem Verfahren intakt 2 . Den

Donorparaffinblöcken werden Gewebestücke mit 2 Millimeter Durchmesser

entnommen. Diese werden in einem Rezipientenblock vereinigt

und als Dünnschnitte auf einem Objektträger definiert positioniert.

Die bis zu 60 verschiedenen Gewebeproben enthalten jeweils

rund 100.000 Zellen, was sensitive und reproduzierbare Ergebnisse bei

der in situ-Detektion von Proteinen oder Nukleinsäuren ermöglicht.

Mit Standard-in situ-Hybridisierungs- oder Immunohistochemie-

Methoden können parallel in allen auf dem Gewebe-Array befindlichen

Proben mRNA, DNA oder das exprimierte Protein jeweils eines

Kandidatengens nachgewiesen und analysiert werden. Auf Proteinebene

erfolgt die Detektion und Lokalisation mittels immunohistochemischer

Standardmethoden (IHC): Nach Entparaffinisieren, Hydrieren

und Freisetzen der Antigene wird der Objektträger zunächst

mit einem sogenannten Blocking-Serum und danach mit dem primären

Antikörper gegen das zu detektierende Protein inkubiert. Die

Anfärbung wird nach Inkubation mit einem biotinylierten sekundären

Antikörper sowie einem Avidin-Enzym-Komplex durch Zugabe

eines Peroxidasesubstrates durchgeführt (siehe Abb. 2). Der mRNAoder

DNA-Nachweis bzw. die Lokalisation erfolgt durch in situ-

Hybridisierung (ISH): Nach Entparaffinisierung, Hydrierung und

Proteinasebehandlung wird der Objektträger zunächst in verschiedenen

Puffern präinkubiert und anschließend mit einer Digoxigeninmarkierten

Sonde hybridisiert. Nach einigen Waschschritten wird mit

einem Anti-Digoxigenin-Antikörper inkubiert und beispielsweise mit

NBT/BCIP angefärbt (siehe Abb. 3).

Da die Gewebe-Arrays standardisiert hergestellt werden, kann eine

ganze Serie in Betracht kommender Targetgen-Kandidaten auf diese

Weise gescreent werden. Hierbei sind Aussagen über die jeweilige

Expressionsstärke möglich. Darüber hinaus können RNA, DNA- oder

Proteinmoleküle in den Geweben durch mikroskopische Betrachtung

lokalisiert werden, was zur Aufklärung der Genfunktion entscheidende

Hinweise geben kann. Da das Gewebematerial von Patienten unterschiedlichen

Alters und unter Umständen verschiedenen Geschlechts

stammt und bei Krebsgewebe Material aus unterschiedlichen Tumorarten

und Tumorstadien verwendet wird, können pharmakogenetische

Rückschlüsse gezogen werden. Zur Analyse von Targetgen-Kandidaten

für bestimmte Krebstypen sind Gewebe-Arrays mit Schnitten

unterschiedlicher Patientengewebe mit etwa Magen-, Darm-, Lungen-

, Brust, Prostatakrebs (u.v.a.) erhältlich. Des weiteren gibt es zur Validierung

allgemeiner Krebstargets Arrays mit verschiedenen Tumorarten

oder Krebszell-Linien auf einem Objektträger.

Arrays mit menschlichen nicht-neoplastischen Gewebeproben sind

ebenfalls erhältlich. Sie können für die vergleichende Analyse von

Krebs- und Normalgewebe oder auch für die in situ-Genexpressionsanalyse

nicht krebsrelevanter Gene in verschiedenen Gewebetypen

eingesetzt werden. Weiterhin sind Gewebearrays mit Organschnitten

der Ratte oder der Maus lieferbar, die zum Beispiel für gentoxikologische

Fragestellungen verwendet werden können.

Fazit

Der Einsatz von Gewebe-Arrays ist eine standardisierbare Methode

zur Verifizierung und funktionellen Untersuchung von Target-Genen

oder Target-Proteinen in situ.

Literatur

[1] Moch et al., American Journal of Pathology, Vol. 154, No. 4, April 1999.

[2] Kononen et al., Nature Medicine Vol. 4, Nr. 7, 1998.

Abb. 3: In situ-

Hybridisierung

Korrespondenzadresse

Dr. Michael Ehret

BioCat GmbH

Im Neuenheimer Feld 581, Im Technologiepark, D-69120 Heidelberg

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Mikrofluidik

Lab-on-a-Chip-Technologie –

Anwendungen im Bereich der

Biochemie und Molekularbiologie

DR. MEIKE KUSCHEL, DR. ODILO MÜLLER, AGILENT TECHNOLOGIES DEUTSCHLAND GMBH, WALDBRONN

Die Bestimmung der Größe, Qualität und Konzentration von Biomolekülen wie etwa DNA, RNA und

Proteinen ist eine grundlegende Anwendung in der Life Sciences-Forschung. Traditionellere Methoden

zur Analyse von Biomolekülen, wie Gelelektrophorese oder Kapillarelektrophorese, werden jetzt

durch eine neue analytische Methode ergänzt, die auf der Lab-on-a-Chip-Technologie basiert. Diese

Technologie ermöglicht die Miniaturisierung und Integration verschiedenster experimenteller Arbeitsschritte

in einem einzigen Prozeß sowie die Kombination mit einer automatisierten Datenanalyse.

Vorteile der Lab-on-a-Chip-Technologie, verglichen mit den traditionelleren Methoden, sind ein

minimaler Probenverbrauch, sehr kurze Analysezeiten, eine leichte Handhabung, der geringe Kontakt

mit schädlichen Substanzen und die Produktion kleinerer Abfallmengen.

Der Bedarf an analytischen Methoden, die

eine immer schnellere und automatisierte

Analyse von Biomolekülen ermöglichen, ist –

nicht zuletzt durch die erfolgreiche Entzifferung

des menschlichen Genoms sowie die

Absicht spezifischere und zielgerichtetere Medikamente

zu entwickeln – erheblich gestiegen.

Bisher sind die meisten analytischen Methoden

noch sehr zeitaufwendig, arbeitsintensiv

und benötigen große Probenmengen.

Die Gelelektrophorese ist die am häufigsten

verwendete und seit 50 Jahren bewährte Methode

zur Größenbestimmung, Qualitätsund

Reinheitsanalyse von DNA, RNA oder

Proteinen. Die neuentwickelte Lab-on-a-

Chip-Technologie 1-6 ermöglicht die Kontrolle

und Manipulation sehr kleiner Flüssigkeitsvolumina

in Mikrokanälen, die in Glasoder

Plastikchips eingeätzt werden (Abb. 1).

Diese Technologie schafft die Voraussetzung

dazu, verschiedene, bisher sequentielle, experimentelle

Arbeitsschritte in einen einzigen

Prozeß zu integrieren und zu automatisieren,

zum Beispiel die Probenhandhabung,

elektrophoretische Auftrennung, Färbung

und Entfärbung sowie Detektion. Die Kombination

mit Software ermöglicht außerdem

die Automatisierung von Datenanalyse und

Archivierung. So profitiert ein solches Labon-a-Chip-Analysesystem

von einem Minimum

an manuellen Arbeitsschritten, deutlich

kürzeren Analysezeiten, erhöhter Datengenauigkeit,

signifikanter Kostenreduktion

und minimalem Kontakt zu schädlichen

Substanzen.

Wichtige Entwicklungen auf dem Gebiet der

Lab-on-a-Chip-Technologie wurden von Caliper

Technologies Corp. (Mountain View, CA,

USA) geleistet. In Zusammenarbeit mit Caliper

Technologies hat Agilent Technologies

Deutschland GmbH (Waldbronn, Deutschland)

den Agilent 2100 Bioanalyzer entwickelt,

das erste auf der Lab-on-a-Chip-Technologie

basierende, kommerziell erhältliche Gerät.

Abb. 2: Vergleich der Gelähnlichen

Darstellung der

Agilent 2100 Bioanalyzer-

Software mit einem Agarosegel.

Verschiedene DNA-

Fragmente wurden aus Adenovirus

2-DNA mit Hilfe der

PCR amplifiziert und mit dem

DNA 7500 LabChip ® -Kit analysiert.

Die Konzentrationsbestimmung

der DNA-Fragmente

eines Größenstandards

(Low Mass Ladder) mit

Hilfe des Lab-on-a-Chip-Systems

im Vergleich zu der

vom Hersteller angegebener

Konzentration ist in der Tabelle

gezeigt.

Spur 1: 300 bp-Fragment;

Spur 2: 300 bp-Fragment (1:4

Verdünnung); Spur 3:

2966 bp-Fragment; Spur 4

2966 bp-Fragment (1:4

Verd.); Spur 5: Low Mass

Ladder (Gibco BRL); Grün:

oberer und unterer Marker

Abb. 1: Glaschip im Größenvergleich. Kleine,

miteinander verbundene Kanäle werden in

das Glasmaterial eingeätzt. Dieses Kanalnetzwerk

enthält Strukturen, welche die Analyse

von DNA, RNA oder Proteinen einschließlich

Probenhandhabung, elektrophoretische Trennung,

Färbung und Entfärbung sowie Detektion

ermöglichen.

Lab-on-a-Chip-Analysesystem

Der Agilent 2100 Bioanalyzer besteht aus

einem kleinen, mit einem Computer kommunizierendem

Gerät. Dieses Gerät enthält

programmierbare Hochspannungsquellen,

die jeweils mit einer Platinelektrode verbunden

sind. Die Proben werden mit Hilfe einer

Pipette auf den Glaschip aufgetragen, und

der Chip wird dann in das Gerät eingelegt

(Abb. 1). Durch das Schließen der Klappe

kommen die Platinelektroden in Kontakt mit

den Proben. Nun können die Proben durch

Anlegen einer Spannung über die Elektroden

in den Kanälen bewegt und manipuliert

werden. Die Injektion einer Probe in einen

Trennkanal sowie die elektrophoretische

Trennung, Detektion des Fluoreszenzsignals

und Datenanalyse laufen komplett automatisch

ab und werden durch eine Software

kontrolliert. Jede Probe wird in weniger als

zwei Minuten (z.B. 90 Sekunden für DNA-

Proben) aufgetrennt, so daß die Analyse eines

vollständig beladenen Chips mit 10 bis

12 Proben nach etwa 25 bis 30 Minuten abgeschlossen

ist – inklusive Vorwärmzeit sowie

Kalibrierung des Gerätes. Die Software bietet

Datenaufnahme, Präsentations- und Interpretationsfunktionen.

Die Daten werden

als Elektropherogramm für jede Probe und

in einer gelähnlichen Darstellung gezeigt.

Zusätzlich liegen die Ergebnisse auch in einem

Tabellenformat vor und können in andere

Programme exportiert werden.

Anwendungen für die

Lab-on-a-Chip-Technologie

Die Lab-on-a-Chip-Technologie ermöglicht

eine Reihe verschiedener experimenteller

Aufgaben, wie Größenbestimmung und

Quantifizierung von DNA-Fragmenten (z.B.

von PCR-Reaktionen oder Restriktionsverdaus),

Qualitäts- und Integritätskontrolle

Caliper ® , LabChip ® und das LabChip Logo ® sind US

registrierte Warenzeichen von Caliper Technologies

Corp., Mountain View, CA

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von Gesamt- oder Boten-RNA sowie die Analyse einer Vielzahl

verschiedener Proteinproben, wie etwa Zellysate oder Säulenfraktionen.

Verschiedene Anwendungsbeispiele für die Lab-on-a-Chip-

Technologie werden im folgenden beschrieben und mit konventionellen

Analysemethoden verglichen. Alle nachfolgend beschriebenen

Versuche wurde mit Hilfe der anwendungsspezifischen Lab-

Chip ® -Kits und dem Agilent 2100 Bioanalyzer durchgeführt.

Größenanalyse und Quantifizierung von

PCR-Produkten

Zwei verschiedene PCR-Produkte mit 300 bp und 2.966 bp, amplifiziert

aus Adenovirus 2-DNA, wurden mit dem Lab-on-a-Chip-System

analysiert und zum Vergleich mit Agarosegelelektrophorese

analysiert (Abb. 2). In der gelähnlichen Darstellung des Lab-on-a-

Chip-Systems, sind die PCR-Produktbanden deutlich schärfer als im

Agarosegel. Die Größenauflösung über 1.500 bp ist vergleichbar zum

Agarosegel, doch unter 1.500 bp deutlich besser als im Agarosegel.

Aufgrund der hohen Empfindlichkeit und der Bandenschärfe können

mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer DNA-Produkte detektiert

werden, die nicht auf dem Agarosegel zu erkennen sind. Beispiele

protein hsp72 kodieren. Das Ziel dieses Versuches war eine Co-

Amplifizierung von GAPDH und hsp 72. Die Expression von hsp 72

kann durch viele Faktoren beeinflußt werden. Für diesen Versuch

wurde RNA von HepG2-Zellen isoliert und in cDNA umgewandelt.

Die cDNA wurde mit einem spezifischen Primerpaar für GAPDH

(PCR Produkt: 442 bp) und hsp72 (PCR Produkt: 384 bp) amplifiziert.

Dafür wurde eine sogenannte „Primer dropping“-Methode

verwendet, da bei den Genen auf sehr unterschiedlichem Niveau in

den Zellen exprimiert wurde. Hasp72 wird über den Bereich von

sieben Zyklen fast unverändert amplifiziert, während die GAPDH-

Menge exponentiell steigt. Anhand der Ergebnisse (Abb. 3) konnte

eine optimale PCR-Zyklenzahl für hsp72 und für GPDH bestimmt

werden. Diese ermöglicht es jetzt, die Regulation des hsp 72-Gens in

Folgeversuchen zu untersuchen.

Qualitätskontrolle von Gesamt-RNA

Die Analyse intakter Gesamt-RNA aus kultivierten Jurkatzellen ist

in Abbildung 4 gezeigt. Die 18S- und 28S-ribosomalen RNA-Banden

werden automatisch durch die Software identifiziert und dominieren

das Elektropherogramm. Die Menge der niedermolekularen

RNA (Bande 1), der aus 5S-, 5.8S- oder Transfer-RNA besteht, hängt

stark von der Methode ab, die ausgewählt wurde, um die RNA zu

isolieren. Der Gesamt-RNA-Abbau durch RNase-Kontamination

verursacht einen Shift in der Größenverteilung zu kleineren Fragmenten

und eine geringere Signalintensität. Die18S- und 28S-RNA-

Banden können nicht mit absoluter Sicherheit identifiziert werden.

Mit weiterer Degradation werden nur noch kleiner Fragmente detektiert,

und die Signalintensität nimmt weiter ab.


Info ordern? Kennziffer 29 LW 03 oder www.biocom.de

Abb. 3: Die Analyse der GAPDH- und hsp72-PCR-Produkte wurde mit

dem Lab-on-a-Chip-System durchgeführt und ist als gelähnliche Darstellung

gezeigt. Außerdem wurden die mit dem Lab-on-a-Chip-System

bestimmten Konzentrationen der PCR-Produkte gegen die Zahl der

PCR-Zyklen aufgetragen.

sind etwa Nebenprodukte von PCR-Amplifikationen oder sehr verdünnte

DNA-Fragmente (Vergleiche Spur 3+4 in Abb. 2). Die Konzentrationsbestimmung

erfolgt automatisch durch die Software. Die

Genauigkeit der Quantifizierung wird hier am Beispiel der Analyse

der DNA-Fragmente der „Low Mass Ladder“ demonstriert (siehe

Grafik in Abb. 2). Um die DNA-Fragmentgröße und deren Konzentration

genau zu bestimmen, wird als erste Probe auf dem Chip ein

Größenstandard analysiert. Außerdem werden mit jeder Probe interne

Standards (der obere und untere Marker) analysiert. Die Verwendung

dieser internen Standards, die die Probe einrahmen, ermöglicht

die Korrektur kleiner Drifts und damit eine genaue Größen-

und Konzentrationsbestimmung.

Anzeige

Hochauflösende Analyse kleiner DNA-Fragmente

Abbildung 3 zeigt die Verwendung des DNA 1000 LabChip ® -Kits

zur Optimierung von PCR-Bedingungen für RT-PCR-Reaktionen

zweier verschiedener Gene, die für GAPDH und das Hitzeschock-

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B L I T Z L I C H T

Größenbestimmung und

Analyse von Proteinen

Ein besonderes Chipdesign ermöglicht außerdem

die Analyse von bis zu 10 Proteinproben

im Größenbereich von 14 bis 200 kD in

weniger als 30 Minuten 7 . Um vergleichbare

Daten mit SDS-PAGE zu erzielen, werden

etwa drei Stunden benötigt. Das bedeutet,

daß mit der neuen Technologie ein signifikanter

Zeitgewinn gegenüber der konventionellen

Methode möglich ist. Die Lab-on-a-

Chip-Technologie ermöglicht die Integration

Abb. 4: Gesamt-RNA isoliert

von kultivierten Jurkatzellen

(100 ng/µl). Die Ergebnisse

der Analyse mit dem Labon-a-Chip-System

(RNA

6000 LabChip ® -Kit) sind als

gelähnliche Darstellung

(rechts) und Elektropherogramm

(links) gezeigt. Das

erste Elektropherogramm

zeigt intakte Gesamt-RNA,

die beiden folgenden zeigen

die fortschreitende RNA-

Degradation durch RNase-

Kontamination.

und Automatisierung verschiedener manueller

und zeitaufwendiger Arbeitsschritte, wie

die Färbung und Entfärbung von Proteinen.

Eine Vielzahl verschiedener Proben, wie

Zellysate, Säulenfraktionen, Antikörper oder

aufgereinigte Proteine können analysiert werden.

Die Sensitivität, die mit einem auf laserinduzierter

Fluoreszenz basierten Lab-on-a-

Chip-System erreicht werden kann, ist vergleichbar

zu einer normalen Coomassie-Färbung

von Polyacrylamidgelen. Abbildung 5

zeigt die Analyse einer Proteinmischung mit

dem Agilent 2100 Bioanalyzer und einem 4-

Abb. 5: Analyse einer Proteinmischung

mit dem

Lab-on-a-Chip-System

(Protein 200 LabChip ® -Kit)

im Vergleich zur Analyse

derselben Probe mit einem

4-20% Polyacrylamidgel.

Das Elektropherogramm,

zusammen mit

der gelähnlichen Darstellung

vom Lab-on-a-Chip-

System, ist im oberen Teil

der Abbildung gezeigt. Die

untere Abbildung zeigt ein

Polyacrylamidgel zusammen

mit der densitometrischen

Auswertung.

20% SDS-PAGE Gel. Die Auflösung, die mit

dem Lab-on-a-Chip-System erreicht werden

kann, ist besser oder vergleichbar zu der

Auflösung der konventionellen Methode.

Zum Beispiel werden Carbonanhydrase I und

II, die sich um weniger als 10% im Molekulargewicht

unterscheiden (31 und 29 kD) mit

dem Lab-on-a-Chip-System deutlich getrennt.

Zusammenfassung

Die Lab-on-a-Chip-Technologie wird die analytischen

Methoden im Bereich der Biochemie

und der Molekularbiologie deutlich beeinflussen.

Zur Zeit ermöglicht diese Technologie

die schnelle, verlässliche und reproduzierbare

Größenbestimmung und Quantifizierung

von Nukleinsäuren und Proteinen.

Die einfache und sichere Handhabung dieser

Chips wird die meisten analytischen Gele,

die gefärbt, entfärbt, digitalisiert und analysiert

werden, ersetzen. Die digitalisierten

Daten ermöglichen eine einfache und bequeme

Archivierung in einer Datenbank oder

den einfachen Datenaustausch mit Kollegen.

In der Zukunft werden Mikrochips einen noch

weitaus größeren Teil vieler biochemischer

und molekularbiologischer Methoden in Laboratorien

ersetzen. Sie bieten die Möglichkeit

äußerst komplexe experimentelle Schritte

durchzuführen, wie etwa Probenaufreinigung,

Extraktion oder biochemische Reaktionen

auf einem Chip. Zusätzlich beinhaltet die

Lab-on-a-Chip-Technologie das Potential,

einen weitaus höheren Probendurchsatz als

bisher zu ermöglichen.

Literatur

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M. Anal. Chem. 66, 2949-2953 (1994)

[2] Woolley, A. T.; Mathies, R. A. Proc. Natl. Acad.

Sci. U.S.A. 91, 11348-11352 (1994)

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[6] Müller, O., Hahnenberger, K., Dittmann, M., Yee,

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21(1), 128-34 (2000)

[7] Bousse, L., Mouradian, S., Minalla, A., Yee, H.,

Williams, K., and Dubrow, R. Analytical Chemistry,

(2001) 73(6), 1207-1212 (2001)

Korrespondenzadresse

Dr. Meike Kuschel

Agilent Technologies Deutschland GmbH

Chemische Analysentechnik

Hewlett-Packard-Straße 8, 76337 Waldbronn

Tel.: 07243-602858, Fax: 07243-602149

eMail: meike_kuschel@agilent.com

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Sensorchips

XNA on Gold TM Microarrays:

Sensor Platform for Genomic,

Proteomic and Glycomic Research

DEV KAMBHAMPATI*, WEIDONG DU, MICHAEL SCHÄFERLING, MARGIT KRUSCHINA,MICHAEL CIEPLIK

& FLAVIO ORTIGAO, THERMO HYBAID, ULM

One of the outcomes of the colossal Human Genome Project was the widespread use of microarrays in

biological research. Microarrays have revolutionized the way biotech and pharmaceutical research is

conducted today. Large-scale gene expression and genotyping experiments can be conducted on a

single chip, thus reducing the overall time and cost of the entire research study. Now that the euphoria

over the sequencing of the Human Genome has finally settled, researchers are increasingly finding it

challenging how to extract useful information from the raw code of massive data that was generated

during the sequencing process. In addition, understanding the genome is only the first step in the long

process of comprehending how the various aspects of cellular machinery function. The greatest

challenge at the moment is to understand gene expression, polymorphisms and the functioning of

proteins within the human body. Besides the genes and proteins, it is also important to realize the

function and contribution of some of the most important, and often neglected, molecules which are of

the carbohydrate family (saccharide, glycans, etc.). These molecules constitute the structural components

of cells and are very critical in regulating inter-cellular molecular traffic across the cell membrane.

Key Words: DNA Chips, Protein Chips, Glycochips, Microarrays

To understand the genetic causation of

diseases and how preventive steps on that

basis can be taken, it is important to solve

the mysteries of the above genomic, proteomic

and glycomic challenges. Almost all of

the microarrays that are currently available

in the market are primarily designed to

address only genomic problems and are

highly inflexible when they are applied for

addressing proteomic and glycomic issues.

The biggest bottleneck for the currently

available microarrays is their immobilization

chemistries which are designed only for

a limited range of applications. In addition,

these microarrays suffer from a lot of nonspecific

binding problems which greatly

hampers the overall quality of the microarray

data.

The XNA on Gold TM microarray is a sensor

platform that can currently address (Table 1)

all aspects of genomic, proteomic and glycomic

research. This sensor platform is universal

in nature and can be used directly without

changing the immobilization procedures

for the various biomolecules (DNA, PNA,

proteins, peptides, glycans, saccharides, lectins,

etc.). Data with high signal-to-noise

ratios can be achieved on this sensor platform,

and since this is an universal microarray,

it provides enormous flexibility for researchers

to conducts a wide range of experiments

that can have profound significance

in the area of therapeutics, drug discovery

and diagnostics.

In the following sub-sections, the sensor strategy

along with selected examples from the

genomic (Single Nucleotide Polymor-

phisms), proteomic (immunostatus), and

glycomic (blood serology) applications will

be provided. Finally, the various aspects of

the proteomic research landscape will also

be briefly addressed.

Universal Sensor Platform

The XNA on Gold TM sensor platform is based

on a streptavidin monolayer. This constitutes

the biological interface (Fig. 1), which is

suitable for immobilizing a wide range of

biotinylated biomolecules. The biotin-streptavidin

interaction is one of the strongest in

nature and thus, serves as a robust platform

for conducting biomolecular interaction studies

on microarrays. A chemical interface

employing self-assembly techniques on gold

is used to anchor the streptavidin layer. The

well-characterized self-assembled monolayer

of biotin ensures a highly specific coupling

with streptavidin, resulting in a sensor

Fig. 2: (A) SNP Scoring on XNA on

Gold TM Microarrays. The above

melting curves for the various DNA

duplexes were monitored on the

microarrays by using the commercially

available DASH instrument

(ThermoHybaid). The lower curve

indicates the background response

while the upper two curves correspond

to different DNA duplexes.

Various such melting curves can be

generated on the two sets of 96

and 384 spot XNA on Gold TM

Microarrays. (B) Mini-sequencing

of the probes was also carried out

for SNP result corroboration.

NH

O O O- NH

Fig. 1: XNA on Gold TM Microarrays. Self assembly

techniques employing biotin was used

to construct a well defined streptavidin surface

that is amenable to a wide range of genomic,

proteomic and glycomic applications.

surface that exhibits negligible non-specific

binding interactions. Steric hindrance effects

are also minimized by the optimal design of

the chemical interface. The self assembled

monolayer also acts as a passivating layer

during the immobilization of delicate biological

molecules like proteins and various

glyco-conjugated compounds. Protein immobilization

on solid interfaces is one of the

most demanding tasks for surface scientists

since these molecules denature easily. Protein

function is governed by the amino acid

sequences and their conformations, and it is

vital that their pristine structure is maintained

while they are immobilized on microarrays.

Microarrays constructed directly on

glass can easily denature proteins and also

leads to a lot of background signal due to the

electrostatic nature of the silanol surface

groups on glass. The streptavidin surface

ensures that proteins are efficiently coupled

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to the sensor interface without compromising

their biological activity. Since the interactions

are highly specific and free from

background effects, highly reproducible results

can be obtained with uniform spot

morphologies and intensities.

Single Nucleotide Polymorphism

(SNP) Analysis

SNP analysis is becoming increasingly crucial

for addressing the diversity issues in humans

and cattle. Using the XNA on Gold TM microarrays,

SNP analysis can be conducted readily for

a wide range of applications. To address the

issue of cattle provenance, SNP analysis was

conducted on our chips using a dynamic allele

specific hybridization (DASH, ThermoHybaid)

instrument that can monitor fluorescent intensity

changes during the heating cycles. Using

this instrument, real-time DNA melting curves

can be generated (Fig. 2) on our microarrays.

Mini-sequencing was also formed on the chip to

corroborate the SNP results. The melting curves

corresponding to the various duplexes were

monitored by using an intercalating fluorescent

labeled SYBR Green dye. Such real-time SNP

and melting analysis on microarrays can greatly

accelerate the field of customized drug dis-

Fig. 4: Interaction of anti-A tri

mAbs with A- and

B-type of surface immobilized tri-saccharides.

The highly specific interaction of the mABs

with only A-type of tri-saccharides is evident

from the above curve. The interaction of these

molecules with the B-type of trisaccharides is

virtually negligible. Similar results were obtained

when anti-B tri

mAbs were used (data not

shown). These results clearly validate the application

of these microarrays for blood serology

applications.

Fig. 3: Interaction of

mAb9E10 antibodies with

surface immobilized biotinylated

c-myc peptides. The

concentration of the antibodies

and the peptides was

varied over a wide range,

and the signal responses

corresponding to these interactions

was monitored

by using chemiluminescence.

The numbers in the

inset indicate the dilution

ratios of the antibody molecules

(with their corresponding

buffer).

covery and provenance studies. SNP detection

by MALDI-TOF Mass Spectroscopy is also

possible on our microarrays.

Immunostatus Chip (Peptide Chip)

In this specific application, biotinylated

c-myc peptides were immobilized on to the

microarray and their interaction with monoclonal

antibodies of varying concentrations

was monitored. Chemiluminescent ELISA

was performed on these peptide microarrays

to detect these interactions. The following

histograms (Fig. 3) clearly indicate the

general trends in the peptide-antibody interaction

behavior at varying peptide and

antibody concentrations. Such a chip strategy

can be readily applied in the area of

clinical diagnostics where different peptides

and antibodies can be immobilized on to a

microarray and can be used for screening

various antigens or related marker molecules.

The XNA on Gold TM microarrays can be

used readily with various detection modes:

chemiluminescence, radioactivity and fluorescence;

and thus offers wide flexibility in

tagging the various target molecules.

Blood Serology Chip (Glycochip)

This is a challenging area of microarray research

where the structure and function of

these highly complex molecules is hard to

comprehend. To further test the versatility

of ThermoHybaid‘s microarrays, we immobilized

different trisaccharides on the chip

for blood serology applications. Various

spots corresponding to different concentrations

of the A- and B- type of trisaccharides

were immobilized on the chip and their interaction

with the corresponding anti-A tri

or

B tri

mAbs was monitored. The interaction of

these antibodies with the surface immobilized

A- and B- type of trisaccharides is shown

in Figure 4. Highly specific binding is observed

for the interaction of both types of these

antibodies. Besides the above application in

serology, investigating glyco-conjugated

molecules is crucial since they often serve as

good target molecules for the development

of various types of cancer vaccines and also

serve as good diagnostic markers.

Current Challenges

Microarrays have displayed their value in

conducting various gene expression and

genotyping experiments. In spite of the rapid

strides that have taken place in this field,

the issues of non-specific binding, steric hindrance

effects and low signal-to-noise ratios

that greatly hamper the quality of the data,

are yet to be fully resolved. The same issues

plague the area of protein and glycochips.

Proteins are highly complicated and delicate

molecules, whose functions are correlated to

their structural conformations. Thus, it is

very important to maintain their pristine structure

in place when they are immobilized on to

the microarrays, and this in our opinion, is

currently one of the greatest challenges. Since

Table 1: Application fields of XNA on

Gold Microarrays

Proteomics

Protein arrays

Biochemical activity

Gene distribution phenotype

Protein-protein interactions

Protein-DNA interactions

Epitope mapping

Chemical/functional proteomics

Genomics

Nucleotide arrays

Expression profiling

SNP detection

Re-sequencing

Dignostics/prognostics

Glycomics

Glycan, Saccharide, Lectin interactions

Saccaride/glycan interactions

Membrane/signaling studies

Glycoprotein interactions

Therapeutics/Diagnostics/Vaccines

nearly 60 % of all proteins are yet to be fully

characterized, significant technological hurdles

have to be overcome before the promises

of drug discovery and diagnostics can be

fulfilled. The XNA on Gold TM microarray

system is one of those important technological

tools that can greatly help researchers in

attaining their complex and highly demanding

research objectives.

Acknowledgments

The authors would like to thank Mathias

Pfeiffer, Sven Klingel and researchers at Syntesome

(Russia) for technical support.

Author for Correspondence

Dr. Dev Kambhampati

Product Manager

Phone: 0731-93579267

Fax: 0731-93579291

eMail: dev@thermohybaid.de

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Proteomics

Das ProteinChip ® -System

von Ciphergen Biosystems Inc.

PD DR. ANDREAS WIESNER, CIPHERGEN BIOSYSTEMS, DEUTSCHLAND.

Seit seiner Markteinführung vor vier Jahren

wird das von Ciphergen Biosystems Inc. entwickelte

und produzierte ProteinChip ® -System

in einer stetig steigenden Zahl von

Laboratorien eingesetzt. Es ermöglicht seinen

Nutzern, sich mit geringstmöglichem

Aufwand eine breite Palette proteinanalytischer

Themenfelder zu erschließen.

Die Anwendungsgebiete des Systems umfassen:

Vergleichendes Protein Profiling

Entdeckung und Validierung von Biomarkern

für Diagnose und Therapie

Proteinreinigung und Proteinidentifizierung

Bindungsstudien (Antikörper-Antigen,

Rezeptor-Ligand, DNA/RNA-Protein)

Funktionsprinzip

Das zentrale Element des ProteinChip ® -Systems

sind die ProteinChip ® -Arrays. Dabei

handelt es sich um schmale Metallstreifen, die

auf ihrer Oberfläche 8, 16 oder 24 Spots besitzen

und auf die die zu analysierenden Proben

direkt aufgetragen werden. Man arbeitet entweder

„im stehenden Tropfen“ oder verwendet

Mikrowellaufsätze („Bioprozessoren“), die

die Inkubation von maximal 500 µl pro Spot

ermöglichen. Die Bioprozessoren gibt es im 8

well-, 96 well- und 192 well-Format. Sie werden

für den Versuch auf die entsprechende

Anzahl von Arrays aufgesetzt und danach

wieder entfernt.

Die verschiedenen ProteinChip ® -Arrays lassen

sich in zwei Haupttypen unterteilen. Eine

Serie ist mit chromatographischen Oberflächen

versehen. Die Spots weisen hier hydrophobe,

hydrophile, Kationen-, Anionen-austauschende

oder Metallionen-bindende Oberflächeneigenschaften

auf. Die andere Serie

besitzt voraktivierte Oberflächen zur Kopplung

von Proteinen oder Nukleinsäuren. Für

das vergleichende Protein Profiling werden

die chromatographischen Arrays eingesetzt,

die voraktivierten Arrays dienen zur Durchführung

von Antikörper-Antigen-, Rezeptor-

Ligand- oder DNA/RNA-Protein-Bindungsstudien.

Die Analyse der auf den Arrays vorhandenen

Moleküle erfolgt im ProteinChip ® -Reader, einem

Flugzeitmassenspektrometer (TOF(time-

of-flight)-Analysator). Die Proteine werden

nach Zugabe einer energieabsorbierenden

Matrix mit Hilfe eines Laserstrahls ionisiert

und anschließend in einem elektrischen Feld

beschleunigt. Aus den Flugzeiten der Proteine

vom Probenträger bis zu einem Detektor

am Ende des „Flugtunnels“ errechnet das

ProteinChip ® -System deren Molekulargewichte.

Das System besteht also aus ProteinChip ® -

Arrays, ProteinChip ® -Reader und Protein-

Chip ® -Software (Abb. 1).

Versuchsschritte

Die zu analysierenden Lösungen müssen nicht

vorbehandelt werden (Abb. 2). Körperflüssigkeiten

wie Serum, Plasma oder Urin werden

lediglich verdünnt und dann direkt auf die

chromatographischen ProteinChip ® -Arrays

aufgetragen. Die Kopplung von Proteinen oder

DNA und RNA auf den voraktivierten Arrays

ist ebenso unkompliziert (1). Nach der Inkubation

der Proben folgen einige kurze Waschschritte

zur Entfernung der nicht auf den Arrays

gebundenen Moleküle (2). Anschließend

Abb. 1: Die drei Komponenten des Protein-

Chip ® -Systems

wird eine energieabsorbierende Matrix auf

die Spots aufgetragen (3). Diese Matrix kristallisiert

innerhalb weniger Minuten gemeinsam

mit den auf den Arrays vorhandenen Biomolekülen,

anschließend kann sofort die Analyse

(4, 5) erfolgen. Jeder Peak des Spektrums repräsentiert

ein Protein mit dem auf der Abzisse

angegebenen Molekulargewicht. Die Peak-

Profile (trace-view) können zur besseren Übersicht

auch als Striche (map-view) oder als Bandenmuster

(gel-view) dargestellt werden. Ein

kompletter Versuch dauert nicht länger als

sechs Stunden, eine Person kann pro Arbeitstag

ca. 100 Proben analysieren.

Abb. 2: Versuchsschritte

einer Probenanalyse.

Auftragen der

Probe (1), Waschen (2),

Auftragen der Matrix

(3), Einführen des ProteinChip

® -Arrays in

den -Reader (4), Analyse

mit Hilfe der ProteinChip

® -Software

Besonderheiten des

SELDI-Verfahrens

Da die ProteinChip ® -Arrays hier nicht nur als

Probenträger dienen, sondern durch ihre definierten

Oberflächeneigenschaften mit der Probe

interagieren und deshalb ganz maßgeblich

die Zusammensetzung der zu analysierenden

Proteine bestimmen, bezeichnet man das im

ProteinChip ® -System eingesetzte Verfahren als

SELDI (surface enhanced laser desorption/

ionization), im Unterschied zu schon länger

|transkript LABORWELT Nr. III/2001 | 47


B L I T Z L I C H T

Abb. 3: Entdeckung und Validierung von Biomarkern. Die ProteinChip ® -Software ermöglicht die

vergleichende Analyse vieler verschiedener Spektren. Zur Verdeutlichung sind hier nur vier

Spektren eines ausgewählten Molekulargewichtsbereiches gezeigt, jeweils zwei Spektren gehören

einer Gruppe („H“ oder „D“) an. Der Gel-view hilft dabei, Unterschiede in den Spektren schon

mit bloßem Auge schnell zu erkennen. Die Spektren können nahzu beliebig miteinander kombiniert

werden, Mittelwertbildungen, Subtraktionen etc. sind einfach durchzuführen. Hier ist als

Beispiel das Ergebnis einer Analyse gezeigt, in der Intensitätsunterschiede von peaks gleicher

Molekulargewichte zwischen unterschiedlichen Spektren berechnet wurden. Das Ergebnis dieser

Clusteranalyse weist auf drei Peaks mit deutlich unterschiedlichen Signalintensitäten hin.

Rechts ist ein Overlay-view dieses Bereiches wiedergegeben. Diese drei Proteine sind also in

der Gruppe „D“ wesentlich höher konzentriert als in der Gruppe „H“ und können somit als potentielle

Marker für das entsprechende Krankheitsbild der „D“-Gruppe angesehen werden.

amyloiden Peptide nachgewiesen 13,14 . In dem

letztgenannten Beispiel werden auf dem Array

Antikörper gekoppelt, die am N-terminalen

Bereich der β-amyloiden Peptide binden.

Anschließend lassen sich alle C-terminal verkürzten

Peptide in biologischen Proben (Cerebrospinalflüssigkeit,

Serum, Zellkulturen)

nachweisen. Dieser Test kann jetzt auch mit

einem ready to use-Kit durchgeführt werden.

Man erhält also nicht nur ein Positiv/Negativ-

Ergebnis, sondern die Analyse zeigt auch,

welche Fragmente vorhanden sind, da alle an

den Antikörpern gebundenen Peptide mit ihren

Molekulargewichten dargestellt werden.

Neben dem vergleichenden Protein Profiling

und den Bindungsstudien ist noch ein drittes

Feld zu nennen, in dem sich das ProteinChip ® -

System bereits bewährt hat: der Nachweis

kovalenter Proteinmodifikationen, wie sie beispielsweise

durch Glykosylierungen 15 oder

Phosphorylierungen verursacht werden. Da

sich diese Veränderungen auf das Molekulargewicht

der Proteine auswirken, sind sie ebenfalls

im ProteinChip ® -Reader nachweisbar.

bekannten MALDI (matrix assisted laser desorption/ionization)-Verfahren.

Ein Vorteil des

SELDI-Verfahrens besteht in der gleichmäßigen

Verteilung der Proteine auf der Spot-

Oberfläche und der homogenen Kristallisation

nach Zugabe der energieabsorbierenden

Matrix. Der die Ionisierung der Proteine auslösende

Laserstrahl trifft beim Abrastern der

Spot-Oberfläche immer auf einen repräsentativen

Querschnitt der vorhandenen Moleküle,

was eine Quantifizierung der in der Probe

vorhandenen Proteinmengen ermöglicht.

Nach Eichung mit Verdünnungsreihen kann

die Konzentrationsangabe in absoluten Zahlen

erfolgen.

Die Steuerung des ProteinChip ® -Readers und

die Auswertung der von ihm generierten Daten

erfolgt durch die ProteinChip ® -Software,

die eine einfache Bedienbarkeit des Gerätes

gewährleistet und sowohl die Einzelanalyse

als auch die vergleichende und kombinatorische

Auswertung sehr vieler Spektren ermöglicht.

Das schnelle Auffinden von Biomarkern

und Biomarker-Mustern – also gruppenspezifischen

Veränderungen im Proteinmuster mit

diagnostischem oder therapeutischem Wert –

wird dadurch ermöglicht (Abb. 3).

Notwendige Vorkenntnisse

Zum Erlernen einer profesionellen Handhabung

des Systems bietet Ciphergen seinen

Kunden ein fünftägiges Einführungstraining

an. Darüber hinaus können, zur Vertiefung

der Kenntnisse oder für neue Mitarbeiter, Fortbildungsveranstaltungen

in der sogenannten

ProteinChip ® -University in Fremont, Kalifornien,

gebucht werden. Die mehrtägigen Kurse

werden von erfahrenen Wissenschaftlern des

Unternehmens geleitet und betreut.

Anwendungsbeispiele

Die genannten Vorzüge des ProteinChip ® -Systems

bei der schnellen und reproduzierbaren

Durchführung vergleichender Protein Profiling-Studien

sind der Grund dafür, daß es

schon besonders häufig zur Entdeckung neuer

diagnostischer Marker oder potentieller therapeutischer

Targets eingesetzt wurde 1,2 .

Das Spektrum reicht dabei von der Tumordiagnostik

3,4 , der Diagnose von physiologischen

Funktionsstörungen 5 , dem Nachweis von Faktoren,

die an Wundheilung und Regeneration

beteiligt sind 6 , bis hin zur Identifizierung bakterieller

Virulenzfaktoren 7 . In allen eben genannten

Fällen wurden die chromatographischen

Arrays eingesetzt. Meist wurde Probenmaterial

benutzt, das nicht (Urin) oder wenig

(Blut) invasiv entnommen wurde. Ist eine Gewebeentnahme

unumgänglich, so reichen geringste

Mengen an Zellmaterial aus 8,9 .

Spezifische Bindungsereignisse können mit

den voraktivierten Arrays untersucht werden.

Bindungsproteine, Antikörper oder Nukleinsäuren

werden auf den Spots gekoppelt. Anschließend

werden Proteinlösungen, die die

potentiellen Bindungspartner (Rezeptoren,

Liganden, Antigene, DNA/RNA-Bindungsproteine)

enthalten, auf den Spots inkubiert.

Nachfolgende Waschschritte gewährleisten die

Entfernung nicht gebundener Moleküle, direkt

anschließend werden die Bindungspartner

im ProteinChip ® -Reader nachgewiesen

(Abb. 4). Mit dieser Vorgehensweise wurden

Rezeptoren für Wachstumsfaktoren 10 , Bindungsdomänen

bakterieller Oberflächenproteine

für humanes Plasminogen 11 , bakterielle

Bindungsproteine für extrazelluläre Matrixproteine

12 oder auch die im Verlauf der Alzheimerkrankheit

verstärkt auftretenden β-

Reinigung und Identifizierung

von Proteinen

In allen genannten Anwendungsbeispielen ist

das vorläufige Ergebnis der Analyse das genaue

Molekulargewicht des Biomarkers, Bindungsmoleküls

oder der kovalent veränderten

Proteinvariante. Die Identifizierung der

jeweiligen Proteine ist meist das sich anschließende

Ziel der Untersuchung.

Dazu wird das interessierende Protein zunächst

so weit wie möglich gereinigt. Falls es

unter stringenten Waschbedingungen auf dem

Spot verbleibt, während die anderen Moleküle

dabei entfernt werden, erfolgt dies direkt

auf dem Array. Gelingt das nicht, so kann man

eine Reinigung über Mini-Säulen (werden

ebenfalls von Ciphergen angeboten) oder über

präparative Säulenchromatographie vornehmen.

In beiden Fällen profitiert man von den

aus der Analyse mit dem ProteinChip ® -System

gewonnenen Erkenntnissen: Da man das

genaue Molekulargewicht und die Bindungseigenschaften

des Proteins bereits kennt, können

geeignete Separationsmethoden schnell

entwickelt werden. Den Erfolg der Reinigung

kann man zudem mit dem ProteinChip ® -System

laufend verfolgen. Eine weitere Möglichkeit

besteht darin, das Protein zumindest soweit

in der Probe anzureichern, daß es in einer

Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach Coomassie-Färbung

darstellbar ist. Man schneidet

dann die entsprechende Bande aus und benutzt

das Gelstück für die weitere Analyse.

Nachdem das Protein gereinigt vorliegt, wird

es enzymatisch gespalten. Meist verwendet

man dazu Trypsin, eine Protease, die sich für

diesen Zweck vielfach bewährt hat. Das Protein

wird dadurch in Fragmente zerlegt. Die

einzelnen Teilstücke weisen eine charakteristische

Molekulargewichtsverteilung auf, da

48 | Nr. III/2001 |transkript LABORWELT


B L I T Z L I C H T

das Enzym an bestimmten Aminosäurepositionen

bevorzugt schneidet. Mit diesem „Fingerabdruck“

kann man dann in online-Datenbanken

recherchieren und erhält als Ergebnis

die Identität des Proteins zusammen mit dem

Wahrscheinlichkeitsgrad der Richtigkeit dieser

Zuordnung. Die ProteinChip ® -Software

bietet vorgefertigte Internet-Verbindungen an,

die den Nutzer sofort nach der Analyse in die

Recherche-Datenbanken weiterleiten.

Tritt der (zumindest bei humanen Proteinen)

seltene Fall ein, daß das Protein in der Datenbank

nicht vorhanden ist, oder ist der Anwender

aus anderen Gründen an einer weitergehenden

Charakterisierung interessiert, so besteht

auch die Möglichkeit, die Peptide zu

sequenzieren. Dazu werden die ProteinChip ® -

Arrays über ein Interface an ein QQ-

TOF(Quadrupol/Quadrupol-time of flight)-

Massenspektrometer angeschlossen. Hier

werden einzelne Peptide aus dem Fragmentgemisch

selektiert, in weitere Fragmente zerlegt

und aus den Flugzeiten der Teilstücke

dann die Sequenz des Peptids ermittelt. Diese

Arbeiten können für Ciphergen-Kunden in

einem der drei biomarker discovery center – in

den USA oder Dänemark – durchgeführt werden.

Ciphergen bietet zudem ein Interface für

das PE-Sciex QStar-MS an. Bei Zugang zu

einem solchen Gerät, können die Sequenzanalysen

dann auch vom Kunden selbst vorgenommen

werden.

Vergleich zur

2D(zweidimensionalen)

Gelelektrophorese

Jeder, der sich für die Analyse komplexer Proteingemische

interessiert, kennt die 2D-Gelelektrophorese

als wichtige Methode zur möglichst

umfassenden Auftrennung aller in einer

Probe enthaltenen Proteine. In den meisten

Fällen werden die Moleküle zunächst nach

ihrem isolelektrischen Punkt (1. Dimension)

und anschließend nach ihrer elektrophoretischen

Beweglichkeit (2. Dimension) in einem

Polyacrylamidgel getrennt und angefärbt. Die

dadurch sichtbar gewordenen Proteine können

direkt aus dem Gel entnommen und weiter

analysiert werden.

Im Gegensatz zum Nutzer der 2D-Gelelektrophorese,

verfolgt der Anwender des Protein-

Chip ® -Systems fast nie das Ziel, alle Proteine

in der Probe gleichzeitig darstellen zu wollen.

Vielmehr nutzt er den Vorteil aus, daß jeder

Array-Typ in Kombination mit definierten

Waschbedingungen auf reproduzierbare Weise

bestimmte Protein-Subpopulationen aus der

Probe trennt, der Analyseprozeß also gleichzeitig

mit einer chromatographischen Separation

verknüpft ist. Neben der Tatsache, daß

eine weniger komplexe Probe natürlich leichter

analysiert werden kann, ist dabei eine andere

Konsequenz noch wichtiger: Viele Proteine,

die zuvor aufgrund ihrer geringen Konzentration

bei klassischen Analyseverfahren

nicht detektiert wurden, treten dadurch überhaupt

erst in Erscheinung. Gerade beim vergleichenden

Protein Profiling zur Entdeckung

von Biomarkern erlangt dieses Phänomen eine

hohe Bedeutung. Andere Unterschiede zwischen

der 2D-Gelelektrophorese und dem ProteinChip

® -System liegen in der Analysetechnik

begründet. So sind Peptide, hydrophobe

Proteine oder solche mit extremen isolelektrischen

Punkten in der 2D-Gelelektrophorese

nur schlecht oder gar nicht darstellbar. Insbesondere

regulatorisch und inflammatorisch

bedeutsame Proteine weisen aber häufig zumindest

eine dieser Eigenschaften auf. Das

ProteinChip ® -System dagegen kann Peptide

besonders gut darstellen und ist von den chemischen

Eigenschaften der Proteine weitgehend

unabhängig.

Die gute Auftrennung größerer Proteine und

das Arbeiten im präparativen Maßstab ist ein

unbestreitbarer Vorteil der 2D-Technik. Die

dort benötigten Proteinmengen sind allerdings

dann ein Hindernis, wenn man möglichst viele

Proben in kurzer Zeit vergleichend analysieren

möchte. Hier ist der geringe Proteinbedarf,

die gute Reproduzierbarkeit und der um

Größenordnungen höhere Probendurchsatz

des ProteinChip ® -Systems von besonderem

Wert. Das ProteinChip®-System kann also

als eigenständige Einheit oder als Ergänzung

zur 2D-Technik eingesetzt werden.

Literatur

[1] Davies, H.A., Journal of Molecular Medicine 78 (2000),

B29.

[2] Fung, E.T., Thulasiraman, V., Weinberger, S., Dalmasso,

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F.I., Gong, L., Nasim, S., Wright, G.L. Jr., American Journal

of Pathology (2001), 1491-1501.

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Adam, B., Yip, T., Schellhammer, P.F., Gong, L. and Vlahou,

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276.

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Biochimica Biophysica Acta 1524 (2000), 102-109.

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Science 6 (2000), 459-469.

[15] Chernyak, A., Karavanov, A., Ogawa, Y., Ková, P., Carbohydrate

Research 330 (2001), 479-486.

Korrespondenzadresse

PD Dr. Andreas Wiesner

Field Scientist Germany

Ciphergen Biosystems, Ltd.

Surrey Technology Centre

The Surrey Research Park

Guildford, Surrey, GU2 7YG, UK

Tel: ++49-30-84719442

Fax: ++49-30-84719443

eMail: awiesner@ciphergen.com

www.ciphergen.com

Abb. 4: Schematische Darstellung der möglichen Proteinbindungsstudien. Der Nachweis der

Bindungspartner erfolgt im ProteinChip ® -Reader (unteres Bild).

|transkript LABORWELT Nr. III/2001 | 49


P R O D U K T W E L T

Kennziffer 32 LW03

Incyte-Microarrays von BioCat

Incyte Genomics macht seine

komplette Palette an Microarrays

verfügbar. Bisher wurden

die Incyte-Gene Expression-

Microarrays nur im Rahmen

von Dienstleistungen angeboten.

Seit kurzem werden die

DNA-Chips von Incyte vom

Vertriebspartner BioCat in Heidelberg

für den Einsatz im eigenen

Labor verkauft. Die Incyte

DNA-Chips („LifeArrays“) werden

mit einem kompletten System

angeboten, das optimale

Hybridisierungsergebnisse ermöglicht.

Das System enthält

bis auf den Scanner alle Software-

und Hardware-Komponenten

sowie Reagenzien für

Kennziffer 34 LW03

Arrayauswertung:

Präzise und automatisiert

Die Anforderungen an die Qualität

der Arrays und der daraus

resultierenden Daten ist in den

letzten Monaten erheblich gestiegen.

Dies ist auch in Hinblick

auf die Aussagekraft eines

Experiments unabdingbar, und

nur durch eine exakte Quantifizierung

können Änderungen in

der Genexpression statistisch signifikant

gesichert werden.

Imaging Research Inc. hat dem

mit seiner neuen Version 6.0

der Software ArrayVision Rechnung

getragen.

ArrayVision 6.0 wertet fluoreszente

und radioaktiv markierte

Arrays aus. Dabei bietet das

Programm eine Vielzahl unterschiedlicher

Parameterr zur Bestimmung

der Spots, des Hintergrunds

sowie zur Normierung

an. Neu sind Berechnungsverfahren,

mit denen Störungen

in einzelnen Spots eliminiert

werden können (z.B. Hot

das cDNA-Fluoreszenz-Labeling,

die Hybridisierung sowie

die quantitative Auswertung

von Expressionsprofilen. Darüber

hinaus wird die Palette der

Dienstleistungen erweitert:

Neu angeboten werden nun

auch Expression Profiling Services

mit Incyte Arrays, auf

die Incyte-eigene Gene und

ESTs gespottet sind.

Nach Zusendung von polyAmRNA-Proben

an BioCat Heidelberg

erhält der Kunde nach

wenigen Wochen eine Auswertung

der differentiellen

Expression von annähernd

10.000 Genen.

Die käuflichen Chips und die

Expression Profiling-Dienstleistungen

werden für folgende Organismen

angeboten: Mensch

(sechs verschiedene Arrays mit

insgesamt mehr als 50.000 verschiedenen

ESTs), Maus, Ratte

(drei verschiedene Arrays, geordnet

nach Interessengebieten),

Arabidopsis thaliana, Candida albicans

sowie Staphylococcus aureus.

Spots, Überstrahlungen). Dies

führt zusammmen mit der kürzlich

eingeführten Software ArrayStat

zu einer erheblichen Verbesserung

der gesamten Auswertung.

MicroChip-Scanner können vermehrt

Serien von MicroChips in

einem Arbeitsgang scannen. Um

die so erzeugten großen Datenmengen

zeitsparend auszuwerten,

hat Imaging Research automatisierte

Berechnungsverfahren

in ArrayVision eingeführt.

Dadurch werden mit einem Protokoll

Serien von Arrays automatisiert

ausgewertet.

Kennziffer 33 LW03

DNA-Extraktion

vollautomatisch

AGOWA ® Maxisep 7200 ist ein

neuer Magnetseparator für die

Bearbeitung von Ausgangsmaterialien

bis zu 1 ml. 72 Proben

können gleichzeitig prozessiert

werden. Für höhere Probenaufkommen

können mehrere Separatoren

parallel betrieben werden.

Das kompakte Gerät ist

mit einer Heiz- und Kühlfunktion

ausgestattet und auf Pipettierautomaten

verschiedener

Hersteller appliziert. Je nach

Anzahl der täglich zu bearbeitenden

Proben können optimale

Lösungen für jedes Labor angeboten

werden. Auf der Basis

der AGOWA ® mag Maxi DNA-

Isolation-Kits wird im Ergebnis

eines einfachen und zuverlässigen

Protokolls bis zu 30 µg Gesamt-DNA

aus unterschiedlichstem

Probenmaterial in hoher

Qualität extrahiert.

Kennziffer 35 LW03

Fluoreszenzreader

mit Laseranregung

Als jüngstes Mitglied der Laserfluoroskop-Baureihe

brachte die

IOM GmbH den neuen Fluoreszenzreader

LF 401-MTP- R auf

den Markt. Der LF 401 MTP-R

ist ein Multiwellplatten-Reader,

der die Vorteile der laser-induzierten

Fluoreszenzdetektion für

die Erfordernisse moderner

High-Throughput-Probenanalysemethoden

erschließt. Durch

die scharfe Fokussierung des

Anregungslichts können Multiwellplatten

bis 1.536 Wells/Platte

sowie Spots auf low- und medium-density-Biochips

detektiert

werden.


Impressum

Die Themenhefte |transkript

LABORWELT erscheinen vierteljährlich

als Supplement des Nachrichtenmagazins

BioTechnologie

|transkript im Verlag der

BIOCOM AG

Stralsunder Str. 58-59

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Redaktion:

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Alle Beiträge sind urheberrechtlich

geschützt. Ohne schriftliche Genehmigung

der BIOCOM AG darf kein

Teil in irgendeiner Form reproduziert

oder mit elektronischen Systemen

verarbeitet, vervielfältigt oder

verbreitet werden.

© BIOCOM AG, Berlin

Bildnachweis: Titelbild mit

freundlicher Genehmigung der

MWG Biotech AG, Ebersberg

Eine neuartige Lasertechnologie

erlaubt die Fluoreszenzanregung

vom ultravioletten bis

in den NIR-Bereich und damit

die Anpassung des Readers an

nahezu jeden Fluoreszenzmarker.

Hervorzuheben sind höchste

Nachweisempfindlichkeit in

kleinsten Volumina (1536-Platte,

Biochip) und die Minimierung

des Übersprechproblems. Aufgrund

der Nanosekunden-Zeitauflösung

bei der Detektion eröffnet

sich die Möglichkeit, spezifische

Fluoreszenzlebensdauern

zu bestimmen. Dieser neue

Parameter ermöglicht die Entwicklung

neuartiger Fluoreszenzassays.

Kennziffer 30 LW 03 oder www.biocom.de Information ordern?

50 | Nr. III/2001 |transkript LABORWELT


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