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laborwelt Nr. 1 / 2012 – 13. Jahrgang Krebszellanalyse Farbcode identifiziert Krebszell-Klone DNA Enrichment Anreicherung von Zielgenen mit Mikrofluidik-Chips Zellbiologie Neue Anwendungen für die Durchflusszytometrie Jetzt neu: www.laborwelt.de


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Inhalt Laborwelt 1 / 2012 4 Nachrichten aus der Wissenschaft Eingefrorene Pesterreger; Leuchtturm für Berlin; Biostrom aus der Stratosphäre; Lehrgang in Kommunikation; Fortgeschrittenes Tumorimaging; Forscher bauen Hefemagnete; Evolution: DNA springt mit; Auf den Spuren der Urmenschen 36 Labormarkt im Umbruch Qiagen schrumpft sich gesund Krebszellanalyse TITEL: Krebszellenanalyse Brustkrebszellen, die bei der Operation übersehen werden, sind der Hauptgrund für eine schlechte Prognose. Deutsche und holländische Experten entwickeln derzeit ein Verfahren, das die Krebszellen schon bei der OP sichtbar macht (S. 19) I Wissenschaft Technologie 17 Auffinden einer Mutation für erblichen Hörverlust mit Capture Arrays Burkhard Ziebolz, Roche Applied Science, Penzberg Blitzlicht Fertigung 20 Kunststoff-Know how: Basis für Lab-on-Chips zur Zielgenanreicherung Manfred Konrada, Sony DADC Austria AG, Salzburg Blitzlicht Automation 22 Automation der Zielgenanreicherung für den GS FLX Darren Birr, 454 Life Science, Branford, USA Expertenpanel Diagnostik 24 Sequenzierungs-basierte Diagnostik Kerstin Stangier, Dr. Saskia Biskup, Daniela Steinberger, Hanns-Georg Klein Paperwelt Highlight des Monats 26 Chromothripsis – wenn das Genom explodiert Jan Korbel, EMBL, Heidelberg Zellbiologie III Wissenschaft Einzelzell-Analyse 6 RGB marking: Klonale Analyse von Krebszellen Boris Fehse et al., Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf Expertenpanel Imaging 9 Krebs sehen während der Operation Dr. Werner Scheuer, Roche Pharma, Penzberg; Prof. Dr. Go van Dam, Universitätsklinik Groningen, Niederlande Paperwelt Highlight des Monats 10 DNA-Methylierung als Marker für die Chemotherapie-Resistenz Matthias Ebert, Universität Heidelberg Blitzlicht Mikrofluidik 12 Isolierung zirkulierender Tumorzellen Markus Gusenbauer und Thomas Schrefl, Fachhochschule St. Pölten, Österreich Blitzlicht Proteomics 14 Validierung neuer Protein-Biomarker im Kampf gegen Prostatakrebs Ralf Schiess et al., Proteomedix AG, Schlieren, Schweiz Zellbiologie Spätestens seit EU-Politiker das Thema Tierversuche entdeckt haben, wird immer mehr Geld in zellbasierte Toxizitätstests investiert. Was die Tests können und nicht können, diskutieren Thomas Hartung, Jürgen Hescheler und Dirk Dressler im Expertenpanel auf Seite 35. Blitzlicht Zellkultur 28 Schneller Erregernachweis mit Nanomembranen Bret Barnhizer, Nanologix Inc, Hubbard, USA Blitzlicht Durchflusszytometrie 30 ReadyFlow – lange Leuchtdauern für Flow Cytometry-Analysen Dr. Martin Gründkemeyer et al., Technologieförderung Münster GmbH Paperwelt Impfstoffe 32 Ein Baukasten für Impfstoffverstärker Carlos Guzman, Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung, Braunschweig DNA Enrichment II Zielgen-Anreicherung Bis auf das PacBio RS-System sind alle Next-Generation-Sequenzer auf einen PCR-Schritt vor der eigentlichen Sequenzierungsarbeit angewiesen, der Zielsequenzen anreichert. Eine mit dem GS FLX kompatible Plattform hat jetzt die Firma Hamilton Robotics vorgestellt (S. 22). Blitzlicht Imaging 33 Zellteilungsdauer im High-Content-Screening bestimmen Andreas Pippow et al., Fraunhofer FIT, St. Augustin; Bayer Healthcare, Berlin 37 Stellenmarkt Aktuelle Jobangebote 38 Verbände Kontakt zu den LABORWELT-Partnerverbänden 39 Produktwelt Neu auf dem Labormarkt 41 Termine Aktuelle Ankündigungen 42 Ausblick/Impressum LABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 | 3


Nachrichten Aktuelles Forschung Den Pesterreger einfrieren Braunschweiger Forscher haben eine trickreiche Strategie zur Bekämpfung der Pest entwickelt. Angriffspunkt des Teams um Katja Böhme vom Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung in Braunschweig ist ein Regulatorprotein, das den Erreger bei Temperaturen unter 37°C ruhen lässt. Inaktivierten sie das molekulare Thermometer durch genetische Manipulation, konnte ein naher Verwandter des Pesterregers – das Durchfallbakterium Yersinia pseudotuberculosis – nicht mehr sein krankmachendes Programm im menschlichen Körper starten. Dieses wird durch das Schlüsselprotein LcrF aktiviert. Damit LcrF das bakterielle Verteidigungsprogramm scharfstellen kann, muss jedoch erst der Transkriptionsrepressor YmoA von der DNA gelöst werden. Dies geschieht in intakten Krankheitserregern, sobald sie in den Körper gelangen und die Temperatur auf 37 °C steigt. Auch die LcrF-mRNA kann nur bei Körpertemperatur abgelesen werden; vorher bildet sie ein nicht ablesbares Knäuel. „Wir konnten die Temperaturkontrolle von LcrF gleich auf zwei Ebenen beeinflussen“, so Böhme. „Zunächst haben wir die Menge von YmoA künstlich gesteigert und so das Gen für den Regulator LcrF inaktiviert.“ Zusätzlich tauschten die Forscher einzelne mRNA-Bausteine aus, so dass sich YmoA auch bei Körpertemperatur nicht mehr in seine Funktionsform entfalten konnte. Daraufhin war das Immunsystem in der Lage, die Erreger zu beseitigen. Ihre Forschungsergebnisse sehen die Forscher als Grundlage für die Entwicklung eines neuen Medikamentes. „Ein Molekül, das die mRNA von LcrF wie eine Klammer zusammenhält, würde die Yersinien inaktivieren und sie so dem Immunsystem ausliefern“, so Abteilungsleiterin Petra Dersch. Außerdem würde ein solcher Wirkstoff ausschließlich die krankmachenden Yersinien treffen, da nur sie dieses molekulare Thermometer besitzen. Kommunikation Nachhilfe in Medienkompetenz Keine Geheimbünde, kein Elfenbeinturm und kein Fachkauderwelsch – Wissenschaftler sollen ihre gewonnenen Erkenntnisse publik machen. Ein neugegründetes Institut wird den gewillten Forschern künftig beibringen, wie man gut mit der Öffentlichkeit kommuniziert: Wie Ende Februar bekannt wurde, soll das von der Klaus-Tschira-Stiftung gegründete Nationale Institut für Wissenschaftkommunikation (NaWik) im Oktober 2012 mit dem Lehrbetrieb beginnen. Es ist am Karlsruher Institut für Technologie (KIT) angesiedelt und wird zunächst für fünf Jahre mit insgesamt bis zu 10 Mio. Euro gefördert. Das NaWik kooperiert mit der Nature Publishing Group, zu der unter anderem auch Spektrum der Wissenschaft, Nature und Scientific American gehört. Zunächst ist geplant, Module zu entwickeln, die in die naturwissenschaftliche Ausbildung von Doktoranden und Master-Studenten am KIT integriert werden. Später sollen dann die besten Modelle deutschlandweit an Universitäten und Forschungsinstituten angeboten sowie Weiterbildungsmöglichkeiten auch für Postdocs und Gruppenleiter geschaffen werden. Forschung Leuchtturm für die Hauptstadt Ende Februar fiel die Grundsatzentscheidung: Teile des Max-Delbrück-Centrums für Molekulare Medizin und der Charité Universitätsmedizin Berlin werden zusammengeführt. Die Erwartungen, die Bundesforschungsministerin Annette Schavan an das neue Berlin Institute of Health stellt, sind groß: „Mit diesem Projekt können wir eine Einrichtung von Weltrang für die Gesundheitsforschung schaffen“ – und zwar in Sachen Spitzenforschung, wie auch die Nachwuchsförderung. Die Entscheidung hat Signalwirkung für ganz Deutschland. Wenn mit der Exzellenzinitiative 2017 bedeutende Geldmittel vom Bund wegfallen, dürfte an einigen Unis der Ruf nach alternativen Finanzierungskonzepten laut werden. Einrichtungen wie das Karlsruhe Institute of Technology (KIT) oder das Berlin Institute of Health könnten dann als Vorbild dienen. Von 2013 an sollen die beiden Einrichtungen verstärkt miteinander kooperieren, in einer zweiten Phase soll dann die strukturelle Weiterentwicklung hin zum Berlin Institute of Health erfolgen. Ob und wieviel Geld es dafür gibt, wurde indes nicht bekannt. Brennstoffzelle Biostrom aus der Stratosphäre Biologen der Universität Newcastle haben aus einer Flusswasserprobe sieben exoelektrogene Bakterien isoliert und zur Stromproduktion in einer mikrobiellen Brennstoffzelle eingesetzt. Die Ergebnisse des Teams um Jinwei Zhang und Grant Burgess wurden in Environmental Science and Technology veröffentlicht. Ließen die Briten die Mikroben als Biofilm auf den Kohlenstoffeletroden wachsen, produzierten sie soviel Strom, dass eine Lampe aufleuchtete. Als besonders effektiv erwiesen sich dabei zwei „Außerirdische“, auf die die Wissenschaftler überraschenderweise in ihrer Probe gestoßen waren: Bacillus stratosphericus und Bacillus altitudinis kommen in den oberen Schichten der Atmosphäre vor. In den mikrobiellen Brennstoffzellen (microbial fuel cells, MFC) der Forscher besiedeln die exoelektrogenen Mikroorganismen als Biofilm die Kohlenstoffelektroden. Über den Prozess der katalytischen Oxidation setzen sie dort organische Verbindungen in Elektrizität um. Jinwei und Burgess fanden heraus, dass auch die Zusammensetzung des Biofilms Einfluss auf die Stromproduktion hat: Biofilme aus einer einzigen Art waren denen aus mehreren Arten unterlegen. Mit einem Mix aus den 25 besten (bereits bekannten und neu entdeckten) exoelektrogenen Bakterienarten erreichten die Forscher eine Leistung von 200 mW pro Quadratmeter. Allerdings ist der Weg von der Labor-MCF zur Stromproduktion noch weit. Vom Labormaßstab bis in die großtechnische Produktion veranschlagen Experten rund 10 bis 20 Jahre. 4 | 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 LABORWELT


Aktuelles Nachrichten Forschung Echtzeit-Imaging verrät Tumorgewebe Irische Forscher haben ein neues Verfahren entwickelt, mit dessen Hilfe man in Echtzeit genau beobachten kann, wo sich im Körper Tumorgewebe befindet. Ziel der Gruppe um Erstautorin Michelle Cronin vom Universitäts- College Cork (UCC) ist es, Bakterien zur Bekämpfung von Krebs einzusetzen. Weil die Mikroben sich mit Vorliebe in Tumorgewebe aufhalten, versprechen sie ein exaktes Tumortargeting. Um das Fernziel zu erreichen, mussten die Mikrobiologen jedoch zuerst sicherstellen, dass die Bakterien das Krebsgewebe verlässlich erkennen und besiedeln. Ende Januar gelang der Nachweis: die Iren präsentierten ein Bildgebungsverfahren, mit dem sie den Weg der Bakterien dreidimensional in vivo verfolgen können. Dazu injizierten sie mit einem Biolumineszenz-Gen ausgestattete Bakterien ins Blut von Mäusen. Dank neuer optischer 3D- Tomographen konnten sie den Aufenthaltsort und die Anzahl der leuchtenden Einzeller so genau wie nie zuvor bestimmen. Bereits seit 15 Jahren wird am Tumortargeting mit Bakterien geforscht – am intensivsten an Salmonella typhimurium. Erste klinische Studien mit Salmonellen ergaben indes, dass der therapeutische Nutzen die Gefahr, eine Immunantwort oder Krankheiten auszulösen, nicht aufwiegt. Die irischen Onkologen testeten daher auch nicht-pathogene Bakterien. Das Fazit der Forscher: Sie finden Krebs ebenso effektiv wie Salmonellen. Diese wollen die Iren nutzen, um Chemotherapeutika gezielt in den Tumor zu schleusen. Genetik Evolution: DNA springt mit Wiener Tiermediziner haben bei der Taufliege Drosophila malanogaster erstmals alle springenden Gene und deren Einbauorte komplett kartographiert. Die Transposons beeinflussen die Evolution offenbar viel stärker als gedacht, so das Fazit der Wiener Forschergruppe um Christian Schlötterer. Nach Durchzählen aller mobilen DNA-Elemente in einer Drosophila-Population mit einem eigens für diesen Zweck entwickelten Verfahren stellten die Forscher überraschenderweise fest, dass es im Genom viel mehr Stellen gibt, in die die Transposons potentiell springen können, als bisher gedacht (PLoS Genetics (2012): 8(1):e1002487.). An insgesamt 13 Einbaustellen – bisher waren nur zwei bekannt – fanden die Forscher stabil eingebaute springende Gene, die sich sich offenbar positiv auf die Tiere auswirken. Für Schlötterer ein Beweis für die Bedeutung der Transposons in der Evolution: „Wir sollten sie überhaupt nicht als Parasiten sehen. Sie gehören möglicherweise zu den Mechanismen, mit denen Organismen ihr genetisches Repertoire vergrößern, um besser auf zukünftige Herausforderungen vorbereitet zu sein.“ Mikrobiologie Forscher bauen Hefe-Magneten Forscher der Universität Harvard (Boston, USA) haben Hefezellen magnetisch gemacht. Dafür bedarf es nur überraschend weniger molekularer Tricks: Wie sie im Fachmagazin PLoS Biology berichten, orientiert sich die aufgerüstete Bäckerhefe in der Petrischale entlang magnetischer Feldlinien. Um Saccharomyces cerevisiae den Sinn für Magnetismus einzuimpfen, mussten die Forscher um Pamela Silver und Keiji Nishida zunächst das Gen für ein Eisentransportprotein zerstören, das das Eisen in die Vakuolen der Zelle entsorgt. Da das so im Zytosol angereicherte Eisen auch toxisch wirken kann, ließen die Forscher die Hefen daraufhin das menschliche Eisenspeicherprotein Ferritin herstellen. Ferritin umhüllt die Eisenionen. Damit kann eine größere Menge Eisen in der Zelle toleriert werden. Diese beiden Veränderungen reichten schon aus, um die Zelle für einen Magneten zu sensibilisieren. Doch Nishida und Silver war das nicht genug: Sie identifizierten ein Hefe-Gen, das die magnetische Sensibilität beeinflusst. Nachdem sie Extrakopien dieses Gens in die Hefezellen eingeschleust hatten, wurden die Zellen nochmals magnetischer. Neben dem wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn versprechen magnetisch gemachte Zellen eine Reihe künftiger Anwendungen: die gezielte Verabreichung von Medikamenten, die Aufreinigung von Zellpopulationen oder die Detektion von Krebszellen. Allerdings sei es bis zu möglichen Anwendungen laut den Forschern noch ein weiter Weg. Mit Magneten in Form gebrachte Hefezellen Paläogenomik Auf den Spuren der Ur-Menschen Vor zwei Jahren überraschten die Leipziger Paläogenetiker um Svante Pääbo vom Max- Planck-Institut für Evolutionäre Anthropologie mit der Entdeckung einer neuen fossilen Menschenform. Jetzt haben sie im Internet die komplette DNA-Sequenz des Genoms des Denissova-Menschens in 30-facher Abdeckung offengelegt. In der Denissova-Höhle im Altai-Gebirge fanden russische Forscher 2008 das Fragment eines Fingerknochens. Die Analyse der daraus extrahierten DNA in Leipzig ergab, dass es sich weder um einen modernen Menschen (Homo sapiens) noch um einen Neanderthaler (Homo neanderthalensis) handelte. Der „Homo denisova“ war entdeckt. Er gilt als einer der Vorfahren polynesischer und australischer Ureinwohner. 2010 wurde die vorläufige Sequenz des Denissova-Genoms mit 2-facher Coverage veröffentlicht. Die Wissenschaftler hoffen, dass mit den neuen, viel genaueren Daten , die auch repetitive genomische Bereiche gut abdecken, genetische Veränderungen aufgespürt werden können, die für die Entwicklung des modernen Menschen wichtig waren. LABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 | 5


Krebszellanalyse Einzelzell-Analyse I Krebszellanalyse RGB marking : Vielfarbige Zellmarkierung zur klonalen Analyse Dr. Kristoffer Weber, Michael Thomaschewski, Michael Warlich, Dr. Kerstin Cornils, PD Dr. Daniel Benten, Prof. Dr. Boris Fehse; Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf Biomarker sind ein Hauptprodukt der 7.000 Publikationen über Krebs, die jeden Tag erscheinen, und von Großprojekten wie dem internationalen Krebsgenom-Projekt. Die Kunst besteht darin, aus der Fülle Kandidatengene, -RNAs, Proteine und Metabolite die biologisch relevanten herauszufiltern und auf dieser Basis Frühererkennungstests zu entwickeln. Denn noch immer gilt: je früher der Krebs erkannt wird, desto besser die Aussichten für den Patienten. Biomarker gesucht Über einen DNA-Methylierungsmarker, der anzeigt, ob Darmkrebspatienten auf eine Chemotherapie ansprechen, berichtet hier eine Gruppe um Matthias Ebert (Paper of the month). Die Forscher haben per DNA-Sequenzierung nicht nur den Transkriptionsfaktor, sondern auch den betroffenen Signalweg ausgemacht, der die Therapieresistenz bedingt. Mittels massenspektrometrischer Proteomanalyse haben dagegen Forscher der Universitätsausgründung Proteomedix vier Biomarker- Proteine identifiziert, die die Spezifität der Prostatakrebsdiagnose um mehr als 40% verbessert. Ihren Test sieht die Gruppe um Dr. Ralph Schiess als Ergänzung zum PSA-Test. Noch im Forschungsstadium ist dagegen eine von Thomas Schrefl und Kollegen (Technische Hochschule St. Pölten, Österreich) entwickelte Simulationssoftware, die die Optimierung mikrofluidischer Chips ermöglichen soll, die wie ein Molekularsieb zirkulierende Tumorzellen aus dem Blut filtern und so eine Früherkennung der Metastasierung erkennen. Über eine Technik, die es erstmals gestattet, die Entwicklung einzelner Tumorstammzellzellen zu verfolgen, hat jetzt ein Team vom Universitätskrankenhaus Hamburg-Eppendorf entwickelt. Zwar ist der methodische Fortschritt bei der Analyse von Krebs und Tumoren langsam. Die Integration der Daten über Biomarker verspricht für die Zukunft aber ein besseres Verständnis dieses komplexen Krankheitsbildes. Lentivirale Vektoren integrieren in das Zielzellgenom und erlauben so die permanente Markierung genetisch modifizierter Zellen und ihrer Nachkommen. Kodieren die eingebrachten Vektoren für Fluoreszenzproteine, lassen sich markierte Zellen anhand der emittierten Fluoreszenz im Mikroskop oder mit Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) identifizieren. Wir konnten kürzlich zeigen, dass die simultane lentivirale Expression dreier Fluoreszenzproteine (Rot, Grün, Blau = RGB marking) im Einklang mit dem additiven Farbmodell zur Generierung spezifischer Mischfarben führt, welche an die Tochterzellen vererbt und so zu einer klonalen Eigenschaft werden. Darauf aufbauend eignet sich das RGB marking mit lentiviralen LeGO-Vektoren für die Verfolgung von Zellklonen sowohl im Rahmen der normalen Regeneration als auch der Kanzerogenese. Von Retroviren abgeleitete Vektoren haben sich als vielseitige Werkzeuge für die zellbiologische Forschung und die Gentherapie erwiesen. Ihre stabile Integration in das Zielzellgenom erlaubt die in vitro- und in vivo-Untersuchung langfristiger Effekte der Expression eingebrachter Transgene 1 . Auch für viele Anwendungen in der Gentherapie ist eine stabile Langzeitexpression des eingebrachten, therapeutischen Gens essentiell 2 . Umgekehrt können retrovirale Vektoren auch benutzt werden, um interessierende Gene über lange Zeiträume mit Hilfe der RNA-Interferenz abzuschalten oder herunterzuregulieren 3 . Allerdings ist die weitgehend ungerichtete Integration retroviraler Vektoren in das Zielzellgenom mit dem Risiko der unbeabsichtigten Aktivierung oder Zerstörung betroffener Genloci durch Insertionsmutagenese verbunden, welche im ungünstigsten Fall zur malignen Transformation der Zelle führen kann 4 . Um das Risiko der Insertionsmutagenese zu minimieren, wurde die Architektur retroviraler Vektoren dahingehend optimiert, dass die starken viralen Promotoren und Enhancer aus den long terminal repeats (LTRs) entfernt wurden. Die Entwicklung solcher selbst-inaktivierenden (SIN-)Vektoren mit nicht-viralen Promotoren hat zu einer signifikanten Verringerung des Risikos der Insertionsmutagenese im Tiermodell geführt 5,6 . LeGO-Vektoren und Fluoreszenzproteine zur Zellmarkierung Eine weitere Möglichkeit der Risikoverringerung ist die Entwicklung von Vektoren auf Basis von Retroviren, die ein anderes Integrationsmuster aufweisen. So hat sich gezeigt, dass die als Ausgangsbasis für retrovirale Vektoren der ersten Generation benutzten γ-Retroviren vom MLV-Typ (MLV = Murines Leukämievirus) eine Tendenz zur verstärkten Integration in Promotor- und Enhancerregionen von Genen aufweisen, die als besonders anfällig für die Insertionsmutagenese gelten 7 . Dagegen integrieren vom Humanen Immundefizienzvirus (HIV) abgeleitete, lentivirale Vektoren 1 bevorzugt in transkribierte Sequenzbereiche außerhalb der Promotor- und Enhancerregionen 8 . Andere, wie die α-Retroviren, scheinen sogar ein völlig neutrales Integrationsbild zu zeigen, was sie zu vielversprechenden Kandidaten für die Vektorentwicklung macht 9 . Lentivirale (SIN-) Vektoren werden aufgrund ihrer sehr hohen Effizienz in den unterschiedlichsten Zellsystemen und des angesprochenen geringeren Risikos einer Insertionsmutagenese derzeit in vielen Labors für die Transgenese benutzt. Wir haben kürzlich ein modulares Vektorsystem entwickelt, welches dem Baukastenprinzip folgt. Diese „lentiviralen Gen-Ontologie“(LeGO)-Vektoren erlauben die permanente Überexpression sowie die Herunterregulation von zu untersuchenden Genen 10, 11 . Eine weitere, sehr interessante Anwendung der LeGO-Vektoren ist die permanente Zellmarkierung. Die Markierung und die damit verbundene Wiedererkennbarkeit von Zellen und deren Tochterzellen hat wesentlich zu einem besseren Verständnis normaler Regenerationsprozesse sowie der Entstehung und Entwicklung maligner Krankheiten beigetragen 12 . Einen dauerhaften Entwicklungsschub für Markierungsansätze brachte in diesem Kontext die 2008 mit dem Nobelpreis für Chemie ausgezeichnete Entdeckung fluoreszierender Proteine und ihre Entwicklung als Markergene 13, 14 . Allerdings ist trotz einer Vielzahl neu beschriebener Fluoreszenzproteine die Zahl unterschiedlicher und tatsächlich unterscheidbarer Marker auf eine Handvoll beschränkt 15 . Praktisch bedeutet dies zum Beispiel, 6 | 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 LABORWELT


Einzelzell-Analyse Krebszellanalyse Abb. 1: (a) Nach dem additiven Farbmodell entstehen durch die Mischung der drei Grundfarben Rot, Grün und Blau die drei Farben Gelb, Cyan und Magenta sowie Weiß, wenn alle drei Grundfarben überlagern. (b) Erfolgt die Mischung stufenlos, können theoretisch unendlich viele Farbtöne generiert werden. (c) Drei lentivirale Vektoren, die jeweils ein Fluoreszenzprotein in einer der drei Grundfarben exprimieren, werden gleichzeitig zur Transduktion von Zellen in vitro verwendet. Je nachdem, durch welche Vektoren eine Zelle transduziert wurde, wird sie verschiedene Kombinationen der Fluoreszenzproteine exprimieren. (d) RGB-markierte Zelllinien HEK-293T, BON und FH-hTERT. Durch die klonale Markierung der Zellen ist das unterschiedliche Wachstumsverhalten der verschiedenen Zelllinien in vitro erkennbar. [Modifiziert, nach Nat. Med. 17 (2011), 504-509] dass auf der Basis einer permanenten Zellmarkierung mit den vorhandenen Fluoreszenzproteinen zwar die Organregeneration als ganzes, nicht jedoch der tatsächliche Beitrag einzelner Zellklone visuell nachvollziehbar ist 16 . Genau der Beitrag distinkter Zellklone zur normalen Gewebsregeneration und zur überschießenden Regeneration und dem Auswachsen maligner Tumoren war es, der uns interessierte – vor allem im Rahmen eines Projektes des SFB841 „Leberentzündung: Infektion, Immunregulation und Konsequenzen“. Daher standen wir vor der Aufgabe, mit der vorhandenen, begrenzten Zahl unterscheidbarer Fluoreszenzproteine eine möglichst unbegrenzte Zahl unterschiedlicher Zellklone definitiv identifizierbar zu machen. Eine Lösung dieses Paradoxons ergab sich aus der additiven Farbenlehre. Danach lässt sich in einem dreidimensionalen Farbraum aus den drei Grundfarben (Rot, Grün und Blau, RGB) jede beliebige Mischfarbe generieren (Abb. 1a, b). Dieses Verfahren der Farbmischung aus den Grundfarben wird zum Beispiel auch in Fernsehern und Computerbildschirmen verwendet. Die Frage war, ob sich das RGB­Prinzip auch auf die LeGO­Vektor vermittelte Expression dreier Fluoreszenzproteine in lebenden Zellen anwenden lässt (Abb. 1c). Um dies zu testen, benutzten wir drei LeGO­ Vektoren, die für jeweils ein Fluoreszenzprotein kodierten: LeGO­C2 für mCherry (Rot), LeGO­V2 für Venus (Gelbgrün) und LeGO­Cer2 für Cerulean (Blau). Die Transduktion der Zielzellen erfolgte gleichzeitig mit allen drei Vektoren mit zuvor berechneten identischen Mengen infektiöser Partikel (sog. MOI = Multiplizität der Infektion). Die MOI war dabei so eingestellt, dass mit jedem einzelnen der drei Vektoren ca. 50% WORKING WITH NANO-GOLD TRY: PARTICULAR ® GOLD NANOPARTICLES! made by physical laser ablation: Î Î Î pure, ligand-free gold without citrate or other residues available in water and other solvents direct conjugation to your biomolecules in our labs: Î Î Î high conjugation efficiency high surface coverage particle sizes between 5 and 50 nm Particular GmbH Hannover, Germany info@particular.eu particular.eu


Krebszellanalyse Einzelzell-Analyse Abb. 2: (a) Zahlreiche RGB-markierte Lebertumoren sind nach der Transplantation RGBmarkierter BON-Zellen im Leberschnitt sichtbar. Die meisten Tumoren sind einfarbig, einige mehrfarbig. (b) Einfarbige Tumoren wurden explantiert und in vitro kultiviert. (c) Sekundäre Tumoren nach Retransplantation der Zellen aus den primären Tumoren. Alle sekundären Tumoren sind einfarbig. (d) Sekundäre Tumoren nach Retransplantation gemischter Zellen beider primärer Tumoren. Hier sind sowohl einfarbige als auch gemischte, zweifarbige Tumoren sichtbar. (e) Molekulare Analyse der sekundären Tumoren (aus c und d) durch Insertionsstellen-spezifische PCR, zum Nachweis der klonalen Identität. [Modifiziert, nach Nat. Med. 17 (2011), 504-509]. aller Zellen transduziert wurden. Somit waren aus kombinatorischer Sicht acht verschiedene Gruppen transduzierter Zellen zu erwarten, die jeweils 12,5% aller Zellen umfassen sollten (Tab. 1) 17 . Vier dieser Gruppen waren durch die Expression mindestens zweier unterschiedlicher Fluoreszenzproteine charakterisiert und ließen mithin die für das RGB marking notwendige Entstehung von Mischfarben erwarten (Tab. 1). Eine grundlegende Voraussetzung für die Vielfalt der generierten Mischfarben bestand darin, dass die zu mischenden Grundfarben in unterschiedlichen Intensitäten vorliegen. Beim RGB marking mit LeGO-Vektoren sollte dies durch zwei wichtige Parameter des Gentransfers gewährleistet werden: Erstens, kann bei Gentransferraten von mehr als 50% pro Vektor davon ausgegangen werden, dass in einzelnen Zellen die Zahl der Vektorinsertionen für jede Farbe zwischen eins und drei variiert 18, 19 . Zweitens ist bekannt, Tab. 1: Bei einer Transduktionsrate von 50% je Farbe, sind die dargestellten Gruppengrößen zu erwarten. Vektoren pro Zelle Gruppengröße rot 12,5 % grün 12,5 % blau 12,5 % rot + grün 12,5 % rot + blau 12,5 % grün + blau 12,5 % rot + grün + blau 12,5 % nicht transduziert 12,5 % dass die Integrationsstelle eines Vektors einen signifikanten Einfluss auf die Expression des eingebrachten Transgens hat 19 .Die entscheidende Frage war, ob diese beiden Parameter zusammengenommen nicht nur hochspezifisch für eine gegebene Zelle sind, sondern auch an alle Tochterzellen weitergegeben werden und somit einen klonalen Marker darstellen. Wie erste Analysen in vitro mit HEK293T- Zellen zeigten, erlaubte das RGB marking tatsächlich die Identifikation von Zellklonen anhand der spezifischen Farbe, die allen Zellen des Klons gemein war (Abb. 1d) 17 . Dabei werden die verschiedenen Zellklone anhand ihrer individuellen Farbe im Fluoreszenzmikroskop direkt sichtbar gemacht, ohne dass die Zellintegrität zerstört werden muss (Abb. 1d). Damit ist eine Klonalitätsanalyse in sehr kurzer Zeit möglich. Im nächsten Schritt war die für die Anwendbarkeit des RGB marking entscheidende Frage der Farbkonstanz in vivo zu klären. Eines der von uns dazu benutzten Modelle basierte auf der seriellen Transplantation von RGB-markierten karzinogenen BON-Zellen. Wie erwartet hatten die RGB-markierten BON-Zellen in primären Rezipienten Lebertumoren gebildet, die in der Mehrzahl aus Zellen ein- und derselben Farbe bestanden (Abb. 2a) 17 . Allerdings waren auch einige „Mischtumoren“ nachweisbar (Abb. 2a) 17 . Wir explantierten einige der monochromen Tumoren, vereinzelten die Zellen und nahmen diese in Kultur. Wie wir zeigen konnten, wiesen alle aus einem Tumor isolierten Zellen über den gesamten Beobachtungszeitraum hinweg dieselbe Farbe wie der Ursprungstumor auf (Abb. 2b) 17 . Wurden diese Zellen in sekundäre Rezipienten transplantiert, entstanden erneut Tumoren, die durch die gleiche RGB-Farbe wie der Ausgangstumor charakterisiert waren (Abb. 2c) 17 . Mischten wir für die Transplantation RGB-markierte Zellen, die von zwei unterschiedlichen Tumoren abstammten, entstanden in den Sekundärrezipienten sowohl monochrome Tumoren, die den beiden Ausgangstumoren entsprachen, als auch zweifarbige Tumoren, die aus Zellen beider Ausgangstumoren bestanden (Abb. 2d) 17 . Folglich haben nicht die Zellen innerhalb eines Tumors in vivo ihre Farbe geändert, sondern mehrfarbige Tumoren sind aus mehreren Zellen verschiedener Farbe entstanden. Mit diesen sowie damit einhergehenden molekularbiologischen Untersuchungen (Abb. 2e) konnten wir nachweisen, dass das RGB marking eine klonale, langfristige und eindeutige Zellmarkierung in vivo ermöglicht 17 . Insgesamt ist es uns gelungen, mit dem RGB marking eine neue Methode der klonalen Zellmarkierung zu entwickeln, die für unterschiedlichste Anwendungen sowohl in Modellen der regenerativen Medizin als auch der Kanzerogenese von großem Interesse sein dürfte. Literatur [1] Naldini, L. et al., Science 272 (1996), 263-267 [2] Alexander, B.L. et al., Gene Ther. 14 (2007),1439-1447 [3] Singer, O., Verma, I.M., Curr Gene Ther. 8 (2008), 483-488 [4] Baum, C. et al., Hum Gene Ther. 17 (2006), 253-263 [5] Cornils, K. et al., Mol Ther. 17 (2009), 131-143 [6] Zychlinski, D. et al., Mol Ther. 16 (2008), 718-725 [7] Wu, X. et al., Science 300 (2003),1749-1751 [8] Wang, G.P. et al., Genome Res. 17 (2007), 1186-1194 [9] Suerth, J.D. et al., J Virol. 84 (2010), 6626-6635 [10] Weber, K. et al., Mol Ther. 16 (2008), 698-706 [11] Weber, K. et al., Gene Ther. 17 (2010), 511-520 [12] Barese, C.N., Dunbar, C.E., Hum Gene Ther. 22 (2011), 659-668 [13] Giepmans, B.N. et al., Science 312 (2006), 217-224 [14] Chalfie, M., PNAS USA, 106 (2009), 10073-10080 [15] Shaner, N.C. et al., Nat Methods 2 (2005), 905-909 [16] Vafaizadeh, V. et al., Stem Cells 28 (2010), 928-938 [17] Weber, K. et al., Nat Med. 17 (2011), 504-509 [18] Fehse, B. et al., Gene Ther. 11 (2004), 879-881 [19] Kustikova, O.S. et al., Blood 102 (2003), 3934-9397 Wir möchten uns bei vielen Kollegen bedanken, die uns mit Zellen und Konstrukten unterstützt haben: H. Wege (Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf) für FH-hTERT Zellen, R.Y. Tsien (Howard Hughes Medical Institute) mCherry cDNA, A. Miyawaki (RIKEN) und T. Schroeder (Institute for Stem Cell Research) Venus cDNA und D.W. Piston (Vanderbilt-Ingram Cancer Center) für Cerulean cDNA. Durchflusszytometrie wurde in der FACS Sorting Core Unit des Universitätsklinikums Hamburg- Eppendorf durchgeführt. Konfokale Mikroskopie wurde mit Hilfe von O. Bruns (Heinrich-Pette-Institut Hamburg) in Zusammenarbeit mit dem Nikon Application Center Norddeutschland durchgeführt. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB841 an B.F. und D.B.) und die Nachwuchsförderung des Forschungsförderungsfonds der Medizinischen Fakultät Hamburg (NWF-12/09 an K.W.). Korrespondenzadresse Prof. Dr. Boris Fehse Forschungsabteilung Zell- und Gentherapie Klinik für Stammzelltransplantation Onkologisches Zentrum – UCCH UK Hamburg-Eppendorf Martinistr. 52, 20246 Hamburg Tel./Fax: +49-40-7410-55518/-55468 8 | 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 LABORWELT


Expertenpanel Krebszellanalyse Real-time Tumor-Imaging Bereits seit 60 Jahren träumen Krebschirurgen davon, Tumore spezifisch anzufärben und diese dann während der Operation besser sichtbar machen zu können. Denn ein verbessertes Erkennen und Entfernen des Tumorgewebes verspricht bessere Aussichten für die Patienten. Bisherige krebsspezifische Farbstoffe blieben indes meist im Tierversuchsstadium, weil ihre Eigenschaften nicht ohne weiteres auf den Menschen übertragen werden können und daher die Kosten klinischer Studien von mehr als 1 Mio. Euro als zu risikoreich galten. Zusätzlich erfassten Fluoreszenzkameras nicht nur die Fluoreszenz, die von den markierten Zellen ausging, sondern auch die Eigenfluoreszenz, Reflexion, Streuung etc. Angesichts der Zulassung der ersten klinischen Studien zum intraoperativen Tumor-Imaging befragte LABORWELT einen Farbstoff- und einen Kamera-Experten, was sich geändert hat und wohin die Entwicklung geht. Werner Scheuer Dr. Werner Scheuer, ist Forschungsleiter in der Abteilung pRED, Discovery Oncology, bei Roche Diagnostics GmbH in Penzberg. LABORWELT Welche Methoden gibt es, Tumorzellen spezifisch zur Fluoreszenz anzuregen, und wo liegen ihre jeweiligen Stärken und Schwächen Scheuer Die beste Methode, um spezifisch Tumorzellen zu identifizieren, ist der gezielte Einsatz von mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Antikörpern, die gegen ein Tumor-assoziiertes Zelloberflächen-Antigen gerichtet sind. Entsprechende Antikörper-Fluorophor-Konstrukte bilden die Grundlage des FACS-Verfahrens, das bereits seit Jahren eingesetzt wird, um Tumorzellen ex situ zu identifizieren. Zusätzlich werden diese Antikörper zur immunhistochemischen Untersuchung von Krebs in Gewebebiopsien eingesetzt. Das „Krebsantigen“ sollte dabei funktionell am Wachstum des Primärtumors beteiligt sein und mit dem Schweregrad der Erkrankung korrelieren. Sogenannte Quantum dots weisen zwar exzellente (Fluoreszenz-) Eigenschaften auf, aber sie können sich in der Leber anreichern oder von Makrophagen aufgenommen werden und sind oft toxisch. Auch wurden Antikörper eingesetzt, die mit radioaktiven Isotopen markiert waren. Diese zeigten aber Nachteile wie eine geringe Auflösung und eine kurze Lebensdauer beziehungsweise Halbwertszeit. Um für den intraoperativen Einsatz geeignet zu sein, muss ein krebsspezifischer Marker besondere Anforderungen erfüllen. Physikochemisch sind insbesondere eine hohe Quantenausbeute, eine Emission im fernen Infrarotbereich, hohe Fluoreszenzstabilität und Lagerfähigkeit, Nichttoxizität sowie eine einfache und wirtschaftliche Produktion gefordert. Das Ankoppeln des Fluoreszenzlabels an den Antikörper sollte in einer Ein-Schritt- Reaktion erfolgen und nicht die Bindungskinetik an das Zielantigen stören. Zahlreiche Fluorophore müssen zudem optimiert werden, um Fluoreszenzbleaching zu vermeiden. Das Fluorophor-Antikörper-Konstrukt muss nach intravenöser Applikation eine optimale Serumstabilität aufweisen. Zudem ist seine Sicherheit in Cynomolgus-Makaken nachzuweisen. All dies erfüllen zwei an den Fluoreszenzfarbstoff IRDye800CW gekoppelte neue Antikörperkonstrukte, von denen einer unlängst die Zulassung für klinische Tests erhalten hat: der gegen das teils membrangebundene Antigen VEGF gerichtete Antikörper Avastin-IRDye800CW wird bereits ab diesem Herbst klinisch getestet. Danach sind auch Studien mit einem gegen den Her2/ neu-Rezeptor gerichteten Antikörper Herceptin- IRDye800CW geplant. Sie sollen mikrodosiert (Faktor 100 unter minimaler Wirkkonzentration des therapeutischen Antikörpers) verabreicht werden. Gegenüber Labeling-Ansätzen, die auf die Spaltung fluoreszenzgelöschter Peptide durch Krebszellproteasen setzen, weisen die zugelassenen Label den Vorteil auf, nicht in die Zelle aufgenommen und dort möglicherweise abgebaut zu werden. Go van Dam Prof. Dr. Gooitzen van Dam, Principal Investigator, Forschungsgruppe „Intraoperatives Optisches Imaging“, Abt. Chirurgie, Univ. Groningen. LABORWELT: Wo liegen die Stärken und Schwächen der derzeitigen NIR-Fluoreszenz-Kamerasysteme, die zum intraoperativen Tumorimaging genutzt werden sollen van Dam: Momentan gibt es nur ein einziges tatsächlich klinisch angewandtes Infrarot-Fluoreszenzkamerasystem, das Chirurgen in Kombination mit krebsspezifischen Fluoreszenzfarbstoffen hilft, zwischen Tumorgewebe und gesundem Gewebe zu unterscheiden. Es wurde von Vasilis Ntziachristos entwickelt, der am Helmholtz-Zentrum München und der Technischen Universität München forscht, und von unserer Gruppe im vergangenen Jahr erstmals an Patientinnen mit Eierstockkrebs getestet. Alle anderen Imaging-Systeme, die bisher mit demselben Ziel entwickelt wurden, sind videographische Systeme. Das Photodynamic Eye von Hamamatsu Photonics, das Fluobeam-System von Fluooptics aus Grenoble, das von der kanadischen Novadaq entwickelte Spy Imaging System oder das Artemis-System von O2view haben eines gemeinsam – sie machen Videos, indem sie lediglich ein Bild aufnehmen, ohne das physikalische Verhalten des Lichtes im Gewebe zu berücksichtigen. Sie korrigieren nicht die Signalabschwächung, weder durch Streuung oder Absorption noch durch die Gewebeeigenschaften. Das waren genau die Herausforderungen, denen sich Vasilis gegenübersah, als er 2001/2002 mit der Entwicklung seines Systems begann: Lediglich eine Epifluoreszenzkamera zu montieren, war nicht genug. Denn ein Großteil der Signale ging infolge der Absorption des Blutes verloren, oder bedingt durch die Lichtstreuung an Fettgewebe. Von der physikalischen Seite her, also der In strumentation, unterscheiden sich die Kamerasysteme nicht wesentlich. Der maßgebliche Unterschied besteht in der Daten akquisition und -analyse. Das Fluoreszenzsignal wird beim multispektralen Imagingsystem mit Hilfe eines patentierten Algorithmus korrigiert, der die Gewebeeigenschaften berücksichtigt. In Maus-Modellen konnten wir mit dieser Imagingtechnik die Rate falsch-positiver und falsch-negativer Ergebnisse bereits erheblich verringern. Das aktuelle System erreicht dies durch die simultane Detektion multipler Wellenlängen, verbesserte Algorithmen und fortschrittene Graphic Processing Units (GPU). Eine gut durch den Chirurgen zu bedienende Software ermöglicht es, für jeden Patienten und seinen individuellen Tumor eine Kalibrierung durchzuführen und anschließend real-time-Bilder aufzunehmen. Das System schafft damit die Grundlage dafür, Tumore schon während der Operation besser zu erkennen, besser zu entfernen und damit die Prognose der Patienten maßgeblich zu verbessern. In Pilotstudien im vergangenen Jahr haben wir bereits zeigen können, dass das System Eierstocktumore mit siebenmal höherer Auflösung erkennt als das menschliche Auge allein. In klinischen Studien, die in diesem Jahr an der Majo-Klinik in Rochester beginnen, soll dies an einer größeren Anzahl von Patienten statistisch untermauert werden. www.laborwelt.de LABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 | 9


Krebszellanalyse Paperwelt DNA-Methylierung als Marker für die Chemotherapie-Resistenz Matthias P.A. Ebert, Marc Tänzer, M.A., Benjamin Balluff, M.Sc., Elke Burgermeister, Antje Karen Kretzschmar, David J. Hughes, Reimo Tetzner, Catherine Lofton-Day, Robert Rosenberg, Anke C. Reinacher-Schick, Karsten Schulmann, Andrea Tannapfel, Ralf Hofheinz, Christoph Röcken, Gisela Keller, Rupert Langer, Katja Specht, Rainer Porschen, Jan Stöhlmacher-Williams, Tibor Schuster, Philipp Ströbel, and Roland M. Schmid: TFAP2E- DKK4 and chemoresistance in colorectal cancer, N Engl J Med. 2012 Jan 5;366(1):44-53 Dass die Inaktivierung von Transkriptionsfaktoren durch DNA-Methylierung einen Hinweis auf das Ansprechen auf eine Chemotherapie geben könnte, haben Ebert et al in einer retrospektiven Studie mit initial 78 Patienten mit fortgeschrittenem kolorektalen Karzinom gefunden. Wurde der Transkriptionsfaktor TFAP2-e infolge einer Hypermethylierung weniger exprimiert, nahmen zugleich die Expression des DKK4-Gens sowie die Therapieresistenz gegenüber dem Chemotherapeutikum 5-Fluoruracil (5-FU) zu. In vier weiteren Kohorten mit insgesamt 220 radio- oder chemotherapiebehandelten Patienten ließ sich der Zusammenhang erhärten. Es zeigte sich ein signifikanter Zusammenhang zwischen der TFAP2-e-Hypermethylierung und 5-FU-Therapieresistenz. Umgekehrt sprachen Patienten mit TFAP2-e-Hypomethylierung mit sechsfach erhöhter Wahrscheinlichkeit auf die Chemotherapie an. Prospektive Studien und die Untersuchung der funktionellen Rolle von Dkk4 im Wnt-Signalweg sollen nun helfen zu klären, ob sich die DNA-Methylierung zur Vorhersage des Therapieansprechens eignet. LABORWELT: Was sind Ihre wichtigsten Ergebnisse Ebert: Wir konnten mit unserer Arbeit zeigen, dass das epigenetisch regulierte Gen TFAP2-e in einer Vielzahl von kolorektalen Karzinomen methyliert und damit inaktiviert vorliegt. Wir haben zudem Hinweise gefunden, dass diese Hypermethylierung Einfluss auf das Ansprechen dieser Tumore auf eine Chemotherapie mit 5-Fluoruracil nimmt. Mechanistisch scheint es die TFAP2-e-Methylierung zu einer stärkeren Expression des DKK4-Gens zu führen, das zum Wnt-Signalweg gehört. Diese Ergebnisse sind retrospektiv erhoben worden. Deshalb der Konjunktiv. Ich möchte ich keine falschen Hoffnungen wecken, bevor die Resultate nicht in einer prospektiven Studie bestätigt wurden. LABORWELT: Wie sind Sie experimentell vorgegangen Ebert: Nachdem wir gesehen hatten, dass bei TFAP2-e bei etwa 50% der Patienten methyliert vorlag, haben wir uns mit dessen Funktion beschäftigt. Wir haben festgestellt, dass es keinen besonderen Einfluss auf Zellwachstum- und -teilung hat. Aber wenn wir die Zellen mit 5-Fluoruracil behandelt haben, konnten wir sehen, dass sie unterschiedlich reagiert haben, je nachdem ob das TFAP-Gen methyliert vorlag oder nicht. Wir haben dann einen Screen gemacht, indem wir das TFAP in Zellen überexprimiert haben und mittels Microarrays die Auswirkung auf verschiedene Kandidatengene untersucht haben. Dabei fiel das DKK4-Gen auf. Aus anderen Publikationen war von DKK4 bereits bekannt, dass das Gen möglicherweise eine Rolle bei der Chemotherapieresistenz spielt. In einem weiteren Schritt haben wir dann gezeigt, dass es einen engen Zusammenhang zwischen der TFAP2-e-Methylierung und der dadurch induzierten DKK4-Überexpression gibt. LABORWELT: Wissen Sie schon, wie häufig der Marker bei kolorektalem Karzinom und bei anderen Krebsarten vorkommt Ebert: Die Häufigkeit der Methylierung in kolorektalen Karzinomen liegt nach unseren Ergebnissen bei etwa 50% . Wir sind dabei, dies auch in anderen Krebsarten zu untersuchen. LABORWELT: Was ist ihr Ziel dabei Ebert: Wir beschäftigen uns ja primär mit der Frage, warum die Chemotherapie bei einem Patienten wirkt und bei dem anderen nicht. Man würde gerne bei der Vielzahl von Substanzen, die zur Verfügung stehen, für jeden Patienten die ideale Zusammensetzung von Wirkstoffen Prof. Dr. Matthias Ebert Prof. Dr. Matthias Ebert Jahrgang 1968, ist seit 2011 Direktor der II. Medizinischen Klinik des Universitätsklinikums Mannheim der Universität Heidelberg. Der gebürtige Münchener wurde 1995 an der Universität Ulm promoviert und habilitierte sich 2002 als Facharzt für Innere Medizin. Nach Spezialisierung auf das Gebiet Gastro enterologie erhielt der Heisenberg- Stipendiat (2002-2004) einen Ruf auf eine Professur für Klinische und Molekulare Gastroenterologie an die TU München (2006). Drei Jahre später wurde er zum Direktor des Roman-Herzog-Krebszentrums München bestellt. Eberts wissenschaftliches Interesse gilt der Pathogenese und Progression des Magenkarzinoms sowie der klinischen und translationalen Onkologie, insbesondere der Biomarkeranalyse. Der Inhaber mehrerer Patente hat mehr als 100 wissenschaftliche Arbeiten veröffentlicht. finden, auf die dessen Tumor gut anspricht. Wir und viele andere Gruppen denken, dass Biomarker dabei hilfreich sein können. Unser Marker zeigt, dass epigenetisch regulierte Gene ein möglicher Ansatzpunkt für die Vorhersage des Therapieansprechens sind. Die Befunde müssen aber, wie gesagt, durch prospektive Studie, also an noch nicht behandelten Patienten, zunächst abgesichert werden. Wir sind dabei, eine entsprechende Forschungsförderung zu beantragen. Erst danach werden wir soweit sein, einen entsprechenden Test zu etablieren, der die Wahrscheinlichkeit auf 5-FU anzusprechen, vorhersagt. LABORWELT: Wie gehen Ihre Arbeiten jetzt weiter Ebert: Wir untersuchen die Rolle der TFAP-Methylierung auch in anderen Tumoren, und wir schauen uns auch andere Chemotherapeutika an. Drittens planen wir mit verschiedenen Partnern die angesprochene prospektive Studie, und viertens, wollen wir weiter aufklären, welche funktionelle Rolle Dkk4 tatsächlich bei der Chemotherapieresistenz spielt. 10 | 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 LABORWELT


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Krebszellanalyse Mikrofluidik Isolierung zirkulierender Tumorzellen DI (FH) Markus Gusenbauer, Dr. Thomas Schrefl, Fachhochschule St. Pölten Die Analyse der Menge zirkulierender Tumorzellen im Blut ermöglicht die Kontrolle des Erfolges einer Krebstherapie sowie die Überwachung des Tumorwachstums. Doch die Konzentration der Zellen im Blut ist niedrig, so dass ihre Anreicherung oder Isolierung erforderlich ist. Mikrofluidik-Chips zur Isolierung zirkulierender Tumorzellen werden in naher Zukunft eine wichtige Rolle beim Therapiemonitoring von Krebserkrankungen spielen. In miniaturisierten Fluid-Kanälen bilden magnetische Partikel Ketten, deren Abstand sich durch gezielte magnetische Quellenfelder manipulieren lässt. Die so entstandene Struktur eignet sich als Filter zur Isolierung der zirkulierenden Tumorzellen. Der hier vorgeschlagene Chip kombiniert die mechanische und die biomagnetische Filterung. Mit Hilfe von Computersimulation kann der Chip entwickelt und optimiert werden. Im Blut zirkulierende Tumorzellen (circulating tumor cells, CTCs) können für eine effektive und zielgerichtete Behandlung von Krebserkrankungen von Nutzen sein. Sie lösen sich vom Primärtumor und gelangen in den Blutkreislauf. Von dort können sie auch weitentfernte Organe erreichen. Aus diesem Grund entstehen oft tödliche Metastasen auch nach erfolgreicher Beseitigung eines Krebsgeschwürs. Durch die erstmalige Beobachtung (1869) dieser den Tumorzellen ähnelnden Zellen ergab sich ein neues diagnostisches Potential 1 . Lange war es jedoch nicht möglich, zirkulierende Tumorzellen erfolgreich aus dem Blutstrom zu extrahieren. Allein durch die Abschätzung der Zahl der im Blut zirkulierenden Tumorzellen können Rückschlüsse auf den Status der Tumorerkrankung gezogen werden. Eine genauere Analyse einzelner Zellen führt zusätzlich zu einem verbesserten Verständnis der Biologie der verschiedenen Krebsarten und Metastasen. Der geringe Anteil an erkrankten Zellen im Blut erschwert aber die erfolgreiche Filterung. Es befindet sich nur etwa eine zirkulierende Tumorzelle unter mehreren hundert Millionen Blutzellen. Exitierendende Extraktionsmethoden für zirkulierende Tumorzellen In den letzten Jahren hat die Krebszellforschung erhebliche Fortschritte gemacht, auch bei der Analyse zirkulierender Tumorzellen. Es ist bereits möglich, einzelne Zellen aus dem Blut zu filtern und zu analysieren. Der Aufwand – sei es an Zeit oder an Geldmitteln – ist aber meist noch enorm. Es werden verschiedenste Technologien ineinander geschachtelt, um mit einzelnen Zellen arbeiten zu können. Im Fall der zirkulierenden Tumorzellen heißt das, dass durch mehrere Filtervorgänge die Zahl der nicht gesuchten Blutzellen stetig verringert wird. Der einfachste Ansatz der Filterung ist physikalischer Natur. Dazu wird der Größen- und Elastizitätsunterschied zwischen entarteten und gesunden Zellen genutzt. Zirkulierende Tumorzellen sind normalerweise etwas größer und lassen sich weniger deformieren als zum Beispiel rote Blutkörperchen. Dieses Wissen führte unter anderem zu mechanischen Membranfiltern 2 . Einige weiße Blutkörperchen überschneiden sich aber in der Größenbandbreite mit den CTCs. Das führt zu nicht-eindeutigen Ergebnissen in der Filterausbeute – das Verhältnis zirkulierender Tumorzellen zu den restlichen Blutzellen wird also zwar minimiert, aber sie werden nicht vollständig voneinander getrennt. Eine weitere Möglichkeit zur CTC-Aufreinigung ist der Einsatz von Antikörper-beschichteten Oberflächen, an denen das Blut vorbeigeführt wird. EpCAM-Proteine (epithelial cell adhesion molecule) können Tumorzellen epithelialen Ursprungs gezielt einfangen, während Blutzellen nicht an den Faktor binden. Tumorzellen anderen Ursprungs können durch spezielle Bindungsfaktor-Cocktails 3 angereichert werden. Die Wahrscheinlichkeit, dass eine zirkulierende Tumorzelle die spezielle Oberfläche berührt, ist dabei entscheidend für die erfolgreiche Extraktion. Eine Lösung ist die Generierung von Mikrosäulen in den Kanälen des CTC-Chips. Durch sie wird ein großes Oberflächen- zu Volumenverhältnis 4 erzielt. Eine unregelmäßige Anordnung solcher Säulen erhöht die Kontaktwahrscheinlichkeit 3 . Ein zweiter Ansatz, die Wahrscheinlichkeit des Aufeinandertreffens des Fängermoleküls mit einer CTC zu erhöhen, kommt ohne Mikrosäulen aus. Fischgrätenförmige Muster an Wänden der Kanäle des CTC-Chips führen zu genügend Turbulenzen, um Kolli sionen der „Fängermoleküle“ mit den zirkulierenden Tumorzellen herbeizuführen 5 . Um neuartige Antikörper für alle bekannten und noch unbekannten Tumorzellen zu finden, werden allerdings eine große Zahl an einzelnen zirkulierenden Tumorzellen benötigt. Erst nach erfolgreicher Charakterisierung aller Zellen kann eine optimale Ausbeute erfolgen. Das heißt aber, eine Affinitätsfilterung allein führt derzeit noch nicht zum gewünschten Resultat. Kombination von Vorteilen Abb. 1: Dynamischer Mikrofluidik-Chip. (a) Magnetische Partikel, (b) Kettenbildung und Erzeugen der Filterstruktur, (c) Mechanische und biomagnetische Filterung, (d) Ausspülen der Blutzellen und Isolation der Krebszellen. Durch unterschiedliche Abstände von funktionalisierten Mikrosäulen können die mechanische und Affinitäts-Filterung kombiniert werden 6 . Dadurch wird eine hohe Filter- 12 | 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 LABORWELT


Mikrofluidik Krebszellanalyse effizienz erreicht. Unsere Forschungsgruppe an der Fachhochschule St.Pölten beschäftigt sich derzeit mit der Entwicklung eines Simulationstools für Microfluidik-Chips im Rahmen des Projekts „Tunable microfluidic chips for isolating circulating cancer cells“ der Life Science Krems GmbH. In dieser Arbeit werden magnetische Teilchen mit Antikörpern funktionalisiert. Mit Hilfe eines externen Magnetfeldes können dann gezielt Filterstrukturen, zum Beispiel in CTC-Chips, erzeugt werden. Durch die Kombination von mechanischen Filterketten und den affinen Partikeln lässt sich eine besonders gute Filtereffizienz erzielen. Abbildung 1 zeigt den Ablauf einer Filterung von zirkulierenden Tumorzellen: a. Zu Beginn werden die oben erwähnten weichmagnetischen Partikel in einen Microfluid-Chip beliefert. Diese Teilchen sind mit speziellen Antikörpern beschichtet, an die die Tumorzellen sich anheften. b. Durch Anlegen eines magnetischen Gradientenfeldes bilden diese magnetischen Beads Ketten in genau definierten Positionen. Deren Abstände können durch Veränderung des Magnetfeldes gesteuert werden. c. Sobald diese Partikelketten in Position sind, beginnt die Zuleitung der Blutprobe. Durch die Kombination von Größenfilterung und Affinitätsbindung mit speziellen Antikörpern bleiben nur die zirkulierenden Tumorzellen haften. d. Diese können dann mit einem Mikroskop analysiert und für weitere Tests verwendet werden. Optimierung der Filtereffizienz durch Simulationen Abb. 2: (a) Computermodell eines roten Blutkörperchens. (b) Simulation der Deformation einer Brustkrebszelle an der Filterstruktur Wie auch in vielen anderen Bereichen können Computersimulationen das Verständnis von teuren, komplizierten oder schlecht erkennbaren Vorgängen verbessern. Alle derzeit verfügbaren Filtermethoden konnten bisher nur durch „trial-and-error“-Experimente entwickelt werden. Das führte zwar zu teilweise ansprechenden Resultaten, aber eine vollständige Trennung der Zellen konnte noch nicht erreicht werden. An der Fachhochschule arbeiten wir derzeit mit Hochdruck an einer Simulationsumgebung für einen vollständigen Filtervorgang zirkulierender Tumorzellen. Die Problemstellung verbindet Mikromagnetismus, Strömungs- und Zellularmechanik. EpCAM-behaftete weichmagnetische Partikel bewegen sich in einem magnetischen Gradientenfeld. Im Zusammenspiel mit Kräften der Blutströmung kann die genaue Position der magnetischen Partikel im Mikrofluid-Chip berechnet werden. Dadurch können, wie in Abbildung 1 gezeigt, Kettenstrukturen erzeugt werden. Das Zusammenspiel eines homogenen und des Gradientenfeldes emöglicht zudem die Variation der Filterabstände zwischen diesen Ketten 7 . Das Modell der Blutzelle wird als eine Oberflächenmembran mit interagierenden Teilchen beschrieben 8 . Ein spezielles Masse- Feder-System ermöglicht die genaue Nachbildung realer Strömungsbewegungen. Ein rotes Blutkörperchen besteht aus einem Zytoskelett und einer umschließenden Membran. Für die Computermodellierung wird nur die Membran zu Rate gezogen (Abb. 2a). 400 Oberflächenteilchen sind funktionell miteinander verbunden. Es wirken eine konstante Oberflächen- bzw. Volumenkraft, eine Federkraft und eine winkelabhängige Kraft. Mit einer optimalen Einstellung dieser vier Parameter kann ein nahezu reales Verhalten gesunder und kranker Blutzellen nachgestellt werden. Hauptaugenmerk werden auf das konstante Oberflächen und Volumen von Blutzellen gelegt. Den Rest erledigen Federkräfte zwischen den Teilchen und winkelabhängige Belastungen der Membranoberfläche. Zur Validierung werden die Modelle real durchgeführten Belastungsproben gegenübergestellt. Beispielsweise werden Blutzellen mit einer optischen Laserpinzette in die Länge gezogen 9 . Das Verhältnis von Längen- zu Breitendurchmesser bei konstanter Kraft ist ein wichtiger Faktor für ein korrektes Modell. In ähnlicher Weise lassen sich Krebzellen simulieren. Abbildung 2b zeigt die Deformation einer Brustkrebszelle beim Durchgang zwischen zwei Ketten aus magnetischen Partikeln. Zusammenfassung und Ausblick Die Zahl der Technologien zur Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen hat in den letzten Jahren stark zugenommen. Jede einzelne dieser Methoden scheitert aber derzeit noch an einer kompletten Trennung von den restlichen Blutzellen. Die Kombination von mechanischer und Affinitäts-basierter Filterung ermöglicht es, die Effizienz zu erhöhen. Für eine eindeutige Diagnose fehlt es aber an der Genauigkeit der erwähnten Mechanismen. Aufgrund der methodenabhängigen Ausbeute ist ein Vergleich verschiedener Technologien schwer möglich. Unser Team entwickelt derzeit eine Simulationsumgebung, um die Isolaterung zirkulierender Tumorzellen zu optimieren. Diese Resultate werden wichtige Erkenntnisse für den Bau zukünftiger „lab-on-a-chip“-Methoden liefern. Es werden dringend große Mengen an einzelnen Tumorzellen benötigt, um molekularbiologische Untersuchungen durchführen zu können. Der Bildung von Metastasen kann nur durch ausreichendes Wissen über die zirkulierenden Tumorzellen entgegengewirkt werden. Danksagung Die Autoren bedanken sich für aufschlussreiche Diskussionen mit Dr. Martin Pecherstorfer, Dr. Martin Brandl, Dr. Hubert Brückl und Dr. Ivan Cimrak und für die finanzielle Unterstützung der Life Science Krems GmbH. Literatur [1] Ashworth, T. R (1869). „A case of cancer in which cells similar to those in the tumours were seen in the blood after death“. Australian Medical Journal 14: 146–7. [2] Lu B, Xu T, Zheng S et al. (2010) Parylene membrane slot filter for the capture, analysis and culture of viable circulating tumor cells. Proceedings of the IEEE 23rd International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS):935–938 [3] Dickson MN, Tsinberg P, Tang Z et al. (2011) Efficient capture of circulating tumor cells with a novel immunocytochemical microfluidic device. Biomicrofluidics 5:034119-1–034119-15 [4] Nagrath S, Sequist LV, Maheswaran S et al. (2007) Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature 450:1235–1239 [5] Stott SL, Hsu CH, Tsukrov DI et al. (2010) Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proc Natl Acad Sci USA 107:18392– 18397 [6] Maimonis PJ, Merdek K, Dietenhofer K et al. (2010) Affinity and size capture of circulating tumor cells: a platform for increased sensitivity. Fourth AACR International Conference on Molecular Diagnostics in Cancer Therapeutic Development, Sep 27–30:B5 [7] Gusenbauer, Markus, Kovacs, Alexander, Reichel, Franz, Exl, Lukas, Bance, Simon, Özelt, Harald, and Schrefl, Thomas: Self-organizing magnetic beads for biomedical applications, Journal of Magnetism and Magnetic Materials 324(6), volume 324, 977–982, 2012 [8] M. Dupin, I. Halliday, C. Care, L. Alboul, Modeling the flow of dense suspensions of deformable particles in three dimensions, Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 75 (2007) [9] S. Henon, G. Lenormand,A. Richert,F. Gallet,A new determination of the shear modulus of the human erythrocyte membrane using optical tweezers (1999).doi:16/ S0006-3495(99)77279-6 Korrespondenzadresse Dr. Thomas Schrefl Fachhochschule St. Pölten Matthias-Corvinus-Straße 15 3100 St. Pölten, Österreich Tel.: +43-2742-313228-313 Fax: +43-2742-313228-609 thomas.schrefl@fhstp.ac.at www.laborwelt.de LABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 | 13


Krebszellanalyse Krebsmarker Validierung neuer Protein- Biomarker im Kampf gegen Prostatakrebs Dr. Kathrin Endt, Dr. Ralph Schiess, ProteoMediX AG, Schlieren, Schweiz Prostatakrebs zählt zu den am häufigsten diagnostizierten Krebsarten bei Männern und ist bei diesen nach Lungen- und Darmkrebs die dritthäufigste Todesursache. Im Jahr 2008 wurde weltweit bei circa 900.000 Männern Prostatakrebs diagnostiziert, und 258.000 erlagen dieser Erkrankung. Dabei waren rund 30% der Betroffenen älter als 50 Jahre. Für eine erfolgreiche Behandlung von Prostatakrebs sollte die Erkrankung in einem möglichst frühen Stadium detektiert werden. Daher bemühen sich Forscher mit großer Anstrengung, bereits existierende Diagnosemöglichkeiten qualitativ zu verbessern und neue prognostische oder diagnostische Biomarker zu entdecken sowie zu validieren. Heute gängige Untersuchungsmethoden zum Nachweis des Prostatakarzinoms beinhalten die Bestimmung des PSA-Wertes im Patientenblut und eine Tastuntersuchung der Prostata. Der PSA-Wert bezieht sich dabei auf das sogenannte prostataspezifische Antigen – ein Protein, welches bei Prostatakrebs, aber auch bei Entzündungen oder einer Vergrößerung der Prostata vermehrt im Blut gemessen werden kann. Liefern sowohl die Tastuntersuchung als auch ein erhöhter PSA-Wert Hinweise für einen Verdacht auf Prostatakrebs, wird oft ein invasiver Eingriff – eine Biopsie –durchgeführt. Allerdings birgt der PSA-Test den großen Nachteil einer sehr hohen Rate an falsch-positiven Prostatakrebs- Diagnosen (bis zu 75%), was häufig eine unnötige Biopsie mit Nebenwirkungen wie Blutungen und Inkontinenz zur Folge hat. Bis heute wurde zudem kein optimaler PSA-Schwellenwert definiert. Eine Senkung dieses Wertes birgt die Gefahr, dass insignifikanter Krebs behandelt wird, welcher im natürlichen Lebensverlauf nur mit sehr geringer Wahrscheinlichkeit lebensbedrohlich würde. Überbehandlung ist somit eines der größten Risiken bei der Prostatakrebs- Diagnose 1, 2 . Aus diesem Grund ist die Suche und Validierung von weiteren Markern, welche die Spezifität der Prostatakrebs-Diagnose verbessern und eine Aussage über die Aggressivität ermöglichen, unabdingbar. Mit Hilfe der quantitativen Massenspektrometrie konnten wir nun neue, sehr spezifische Biomarker im Serum von Prostatakrebspatienten ermitteln. Quantitative Massenspektrometrie als Biomarker-Screening-Strategie Molekulare und genetische Biomarker spielen eine entscheidende Rolle in der klinischen Onkologie. Sie erlauben Prognosen darüber, ob eine Person Krebs entwickeln wird, oder geben Hinweise auf das jeweils vorliegende Krebsstadium. Zudem helfen diagnostische Biomarker dem Mediziner bei der Entscheidung über Behandlungsoptionen und bei der Identifizierung von Subpopulationen, die auf eine bestimmte Therapie ansprechen 3, 4 . Eine der größten Herausforderungen ist dabei das Auffinden von Biomarkern im Blut oder anderen Körperflüssigkeiten mittels nicht-invasiver Detektionsmethoden, um eine patientenspezifische medizinische Vorsorge und Behandlung für Krebserkrankungen anbieten zu können. Um neue prognostische und diagnostische Proteinbiomarker im Serum von Krebspatienten zu identifizieren, nutzen Wissenschaftler das mittlerweile enorme Wissen über genetische Veränderungen (Mutationen), die oft Veränderungen in Signalwegen zur Folge haben, welche die Entstehung von Krebs begünstigen. Mittels Proteomanalysen, die auf quantitativer Massenspektrometrie basieren, konnte kürzlich gezeigt werden, dass Prostatakrebsspezifische Mutationen zu einem gesteigerten Vorkommen von Proteinbiomarken im Serum führen 5 . Eine Inaktivierung des PTEN (Phosphatase und Tensin-Homolog)-Gens führt dabei zu einem veränderten Phosphatidylinositol-3-Kinase- (PI3K)-Signalweg 6 , welcher eine veränderte Produktion von Oberflächenproteinen und sekretorischen Proteinen des Prostatagewebes nach sich zieht 7 . Mit Hilfe eines Mausmodells, das durch den Verlust des Tumorsuppressor- Gens PTEN im Prostataepithelium charakterisiert ist, konnten unter Anwendung massenspektrometrischer Screening-Strategien 8 Proteine mit unterschiedlichen Expressionsmustern in gesundem und krankem Gewebe von Mäusen identifiziert werden 6 . Diese in der Maus identifizierten potentiellen Biomarkerkandidaten wurden anschließend im Serum von 77 Patienten mit lokalem Prostatakrebs sowie einer Kontrollgruppe (66 Personen mit einer gutartigen Prostatavergrößerung) gemessen. Eine Untersuchung des Prostatagewebes von Prostatakrebspatienten ergab, dass PTEN- Defekte in mehr als 70% aller Fälle eine Rolle spielen. Somit konnte auch die Relevanz des Mausmodells bestätigt werden. Neue prognostische und diagnostische Biomarker Abb. 1: Sechs charakteristische Kennzeichen für Krebs 10 . Die vier Serumbiomarker HYOU1, ASPN, CTSD und OLFM4 decken vier Bereiche der sechs Hauptmerkmale verschiedener Tumorstadien ab (abgeänderte Zeichnung von Hanahan et al., 2011). Der Datensatz an gemessenen Proteinen im menschlichen Blut konnte nun genutzt werden, um geeignete Biomarkerkandidaten zu selektieren und somit Vorhersagemodelle aufzubauen, welche beispielsweise eine Unterscheidung zwischen einem normalen oder anomalen PTEN-Status erlauben. Mit Hilfe von histologischen Gewebeuntersuchungen konnten die biologischen Eigenschaften des Tumors und seine Bösartigkeit genauer bestimmt werden. Dadurch konnte bei einem 14 | 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 LABORWELT


Tab. 1: Vergleich der testspezifischen Eigenschaften des PSA-Tests mit einer kombinierten Messung von PSA und den vier Serumproteinmarkern (HYOU1, ASPN, CTSD, OLFM4). Ein kombinierter Test von PSA und den vier diagnostischen Biomarkern liefert eine deutlich erhöhte Spezifität von 79% und führt somit zu einer Reduktion von falsch-positiven Diagnosen. PSA Test (Goldstandard) Proteinmarker Genauigkeit 70 % 84 % Sensitivität 87 % 85 % Spezifität 45 % 79 % ist somit eine ideale nicht-invasive Methode, um die Anzahl an falsch-positiven Prostatakrebs-Diagnosen und somit unnötigen Biopsien zu verringern. Zudem bieten diese neuen diagnostischen Biomarker die Möglichkeit mit hoher Präzision, Stabilität und Reproduzierbarkeit Prostatakrebs detektieren zu können. Prospektive Validierungsstudien Eine momentane Limitierung der Anwendbarkeit und Aussagekraft des beschriebenen Diagnostik-Tests ist die Anzahl der analysierten humanen Proben und die ausschließlich retrospektiv durchgeführten Messungen. Daher soll zukünftig die Aussagekraft des auf der Messung des PSA-Wertes und der vier Proteinbiomarker basierenden Diagnostik-Tests in einer größeren Patientenstudie prospektiv getestet werden. Da Messungen, die auf der Technik von Massenspektrometern beruhen, nur bedingt für das Screenen einer großen Anzahl von Patientenseren geeignet sind, sollen die Proteinmessungen mit einer einfacheren Methode, dem sogenannten ELISA-Test, durchgeführt werden. Das schweizerische Start-Up Unternehmen ProteoMediX AG ist mit der Entwicklung eines solchen Tests beschäftigt und hofft, möglichst bald ein entsprechendes Produkt auf den Markt zu bringen. Bewahrheitet sich die Aussagekraft des neuen Diagnostik-Tests in den geplanten klinischen Studien, können unzähligen Männern unnötige Gewebeentnahmen und damit verbundene Komplikationen erspart werden sowie Unsicherheit und Angst, die mit einem erhöhten PSA-Wert einhergehen. Ferner kann dieser Test auch zu einer bedeutenden Senkung der Gesundheitskosten beitragen, da die Zahl falsch-positiver Diagnosen verringert wird. European Biotechnology Network PTEN-Gendefekt festgestellt werden, dass der Verlust des PTEN-Gens im Prostatagewebe mit einer beschleunigten Prostatakrebs- Progression und -Aggressivität einhergeht 9 . Es besteht demnach eine kausale Verbindung zwischen der Bewertung der Aggressivität eines Tumorgewebes und der Funktionalität des PTEN-Gens. In diesem Kontext konnten mittels bioinformatischer Methoden eine Handvoll Proteinbiomarker im Serum von Prostatakrebspatienten aufgefunden werden, welche die beschriebene Korrelation zwischen PTEN- Verlust und Krebsprogression verdeutlichten und sich somit für die nicht-invasive Abklärung von Prostatakrebsstadien eignen. Unter den ermittelten krebsspezifischen Biomarkerkandidaten konnten neben den prognostischen Biomarkern auch vier Proteine im Blutserum identifiziert werden, die Biotechnology Network! Join the European eine zuverlässige Prostatakrebsdiagnose ermöglichen, wenn sie mit dem PSA-Test The European Biotechnology Network kombiniert werden. Mit Hilfe von bioinformatischen Filtern wurden folgende vier Proteine is dedicated to facilitating co-operation between professionals in biotech- identifiziert: Hypoxia up-regulated protein 1 Literatur (HYOU1), Asporin (ASPN), Cathepsin D (CTSD) nology and the life sciences all over und Olfactomedin-4 (OLFM4). Dabei decken [1] Schröder, F.H., et al., ERSPC Investigators, N Engl J Med 360 Europe. The network is run by the European Biotechnology Foundation, a die vier Proteine zwei Drittel der biologischen (2009), 1320-1328 [2] Andriole, G.L., et al., PLCO Project Team, N Engl J Med 360 Hauptmerkmale in der Krebsentwicklung (2009), 1310-1319 ab non-profit organisation based in Brussels. Do you want to know more about 10 . CTSD ist zum Beispiel involviert in die [3] Tainsky, M.A. Biochim Biophys Acta (1796), 176-193 Tumorinvasion und Metastasierung, OLFM4 [4] Ludwig, J.A., Weinstein, J.N., Nat Rev Cancer 5 (2005), 845- 856 verhindert den Zelltod, ASPN hilft einer Zelle, [5] Cima, I., Schiess, R., et al., Proc Natl Acad Sci USA 108 (2011), the advantages of a (free) membership Just have a look at our website: Wachstumssuppressoren zu entgehen, und 3342-3347 [6] Maehama, T., Dixon, J.E., J Biol Chem 273 (1998), 13375- HYOU1 induziert die Angiogenese (Abb. 1). 13378 www.european-biotechnology.net Das Messen dieser vier Proteinmarker in [7] Mehrian-Shai, R., et al., Proc Natl Acad Sci USA 104 (2007), Kombination mit dem PSA-Test lieferte bei 5563-5568 [8] Schiess, R., Wollscheid, B., Aebersold, R., Mol Oncol 3 (2009), ersten Messungen bereits eine sehr hohe Spezifität von 79%, das heißt, in fast 80% der Fälle [9] McMenamin, M.E., et al., Cancer Res 59 (1999), 4291-4296 33-44 traf eine positive Vorhersage auch wirklich zu. [10] Hanahan, D., Weinberg, R.A., Cell 144 (2011), 646-674 Verglichen mit der PSA-Messung allein, die im gemessenen Kollektiv eine Spezifität von 45% aufwies, bedeutet dieser Wert eine Steigerung Korrespondenzadresse European Biotechnology Foundation von rund 43% (Tab. 1). Dieses Ergebnis konnte in Rue d‘Egmont 15 einer weiteren unabhängigen Messung für 37 Ralph Schiess, CEO B-1000 Bruxelles, Belgique Probanden (14 Personen mit lokalem Prostatakrebs; 23 mit gutartiger Prostatavergrößerung) Wagistr. 23 ProteoMediX AG Tel: +32 2 50 08 531 bestätigt werden. Ein auf dem PSA-Wert und CH-8952 Schlieren Fax +32 2 64 92 989 dem Messen der vier Proteine basierender Test ralph.schiess@proteomedix.com info@european-biotechnology.org www.european-biotechnology.net LABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 | 15


European Biotechnology Network builDing transatlantic PartnershiPs in biotechnology 30 th March | Brussels Join the European Biotechnology Network to explore how European biotechnology research can build US partnerships through the key funding mechanisms open on both sides of the Atlantic. Framework Programme Seven and Horizon 2020 from Europe combine with National Institutes of Health (NIH), Department of Defense (DOD) and the Bill and Melinda Gates Foundation from the US. Academia and industry from the US and Europe can fund partnerships through these programmes and accelerate technology and clinical/market application. The day brings together the European Commission and organisations active in European- US partnerships, from academia, SMEs and pharma, to showcase partnerships and the mechanisms behind them. In the memory of last year’s inspirational keynote speaker, Ian Bathurst, the meeting supports Medicines for Malaria Venture (MMV) a Swiss-based publicprivate initiative whose donor, stakeholder and grantee network across the US and Europe is exemplary of the kind of partnership we hope toshowcase. Doing the business! 29 th March 2012 Building Transatlantic Partnerships is supported by ‘Doing the business’, an intensive 1 day workshop on the logistics of biotechnology business in the US. With just 15 places available, the day focuses beyond the technology, with factors for success, corporate partnering, investment and grants and effective integration into different market and biotech culture. Visit www.european-biotechnology.net and click on our events to find out more and book your place! Please register now at www.european-biotechnology.net through the event pages. Meeting supported by: Grünecker Patent- und Rechtsanwälte European Biotechnology Foundation | Rue d’Egmont 15 | B-1000 Bruxelles, Belgique Tel: +32 2 50 08 531 | Fax +32 2 64 92 989 | info@european-biotechnology.org | www.european-biotechnology.net


Sequence Capture Zielgen-Anreicherung Auffinden einer Mutation für erblichen Gehörverlust mit Capture Arrays Genanreicherung II Dr. Burkhard Ziebolz, Roche Applied Science, Penzberg Erblicher Gehörverlust ist mit einer Häufigkeit von mindestens zwei Fällen auf 1.000 Neugeborene die häufigste sensorische Funktionsstörung beim Menschen. Rund 70% der Erkrankungen sind nicht-syndromisch (NSHL), das heißt, es treten keine zusätzlichen Symptome auf. Zwischen 1% und 5% der NSHL-Fälle sind durch X-chromosomale Mutationen bedingt, die bislang vier NSHL-Genloci (DFNX) zugeordnet werden konnten. Im Zuge einer Familienstudie konnten Hübner et al. 1 eine X-chromosomal-dominant vererbte Form des fortschreitenden Hörverlustes der chromosomalen Region Xp22 (DFNX4) zuordnen. Mit Hilfe der gezielten Sequenz-Anreicherung durch Hybridisierung genomischer DNA der Mitglieder einer deutschen Familie auf NimbleGen Capture Arrays (Roche NimbleGen Inc., Madison), die die genomische Zielregion repräsentierten, identifizierten Hübner und Kollegen nun eine nonsense-Mutationen im Gen für SMPX (small muscle protein, X-linked). Xp22 war bereits zuvor bei einer spanischen Familie als krankheitsrelevant angenommen worden, ohne dass aber eine ursächliche Mutation identifiziert werden konnte. Von Hübner et al. durchgeführte Sequenzanalysen bestätigten nun, dass auch hier eine Nonsense-Mutation in SMPX krankheitsrelevant ist. Weitere Studien ergaben, dass das mechanosensitive, Zytoskelett-assoziierte SMPX-Protein in den Stereocilien der Haarzellen und der Cochlea des Innenohrs von Mäusen exprimiert wird, die zur mechanosensorischen Transduktion beim Hörvorgang beitragen. Das Auftreten von Stopp-Codons in SMPX-Transkripten deutet darauf hin, dass es über einen nonsense-vermittelten mRNA-Abbau zum Funktionsverlust des SMPX-Proteins kommt. Die Forscher vermuten, dass SMPX zur Erhaltung der ständig unter mechanischem Stress stehenden Haarzellen des Innenohrs beiträgt. Zahlreiche Anwendungen des Next- Generation-Sequencings zielen auf die Untersuchung ganz bestimmter interessierender genomischer Regionen ab. Damit der Einsatz der Ultrahochdurchsatz- Instrumente wirtschaftlich wird, müssen deshalb die interessierenden Loci mittels PCR vervielfältigt werden, zumindest bei den Sequenzern der 2. Generation am Markt, die mittels Fluoreszenz-Readout die Sequenz bestimmen. Nicht amplifiziert wäre das Signal viel zu schwach, um detektiert zu werden. Die Amplifikation ist indes nicht trivial: Gilt es doch, alle zu sequenzierenden Abschnitte um genau denselben Faktor zu vervielfältigen. Diese aufwändige Probenvorbereitung – die Targetgenanreicherung –, die bei Single Molecule Sequenzieransätzen wegfällt, ist der eigentliche Flaschenhals bei der Next-Generation-Sequenzierung. Elution & PCR Hochparallele Sequenzierung auf Next Generation-Sequenzern Fragmentierung und Hybridisierung genomischer DNA an SeqCap TM -Microarrays, die Zielsequenzen enthalten Analyse der angereicherten Sequenzen Abb. 1: Ablauf der Targetsequenz-Anreicherung mit NimbleGen SeqCap TM -Arrays Suche nach der besten Automation Ein möglicher Ansatz, genomische Regionen anzureichern, ist die Hybridisierung gegen eine Bibliothek von DNA-Sonden auf einem Array. Wie leistungsfähig das zum Beispiel das von der NimbleGen Inc. entwickelte Verfahren ist, haben Hübner und Kollegen unlängst gezeigt. In einer Familienstudie konnten sie mittels sogenannter SeqCap-Microarrays ein Gen für die erbliche Innenohrschwerhörigkeit identifizieren und erste Hinweise auf dessen Funktionsweise finden (vgl Seite 17). Zur Serienreife entwickelt haben der US- Mikrofluidik-Experte Raindance und der Kunststoff-Spezialist Sony DADC Austria einen Mikrofluidikchip, der es ermöglicht, Millionen von Mikrotröpfchen herzustellen, in denen jeweils eine getrennte PCR-Reaktion abläuft (vgl. Seite 20). Eine Automation der PCR-Probenvorbereitung für Next-Generation-Sequencing-Anwendungen für den Genome Sequencer FLX (Roche Applied Science) bietet seit kurzem die Firma Hamilton Robotics an (siehe Seite 22). LABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 | 17


Zielgen-Anreicherung Sequence Capture Laborwelt Hintergrund Prinzip der Schallübertragung im Innenohr Schall wird vom Trommelfell über die Gehörknöchelchen des Mittelohrs im sogenannten ovalen Fenster auf die Cochlea (Schnecke, im Bild blau) übertragen. Die Cochlea ist im Querschnitt in drei Röhren unterteilt: Die Scala vestibuli (oberer Gang) ist mit dem ovalen Fenster verbunden. Sie nimmt den Schalldruck auf und führt ihn bis zur Spitze der Cochlea, dem Helicotrema. Dort führt eine scharfe Kehre in die zurücklaufende Röhre, die Scala tympani (untere Röhre), die am runden Fenster des Innenohrs endet. Zwischen den beiden Röhren liegt die Scala media, die den sensorischen Apparat, das Corti-Organ (große Abbildung), enthält. Trifft Schall über das ovale Fenster ein, bildet sich eine Wanderwelle, deren Maximum bei hohen Frequenzen den vorderen Abschnitt, bei tiefen Tönen den dünneren, hinteren Abschnitt der Basilarmembran zum Schwingen anregt. Die Frequenzinformation wird so in eine Ortsinformation umgewandelt. Basilar- und Tektorialmembran werden nun gegeneinander verschoben. Dies stimuliert die äußeren Haarzellen (OHC), ihre Länge zu ändern, was die lokalen Bewegungen im Cortiorgan etwa 1000-fach verstärkt. Die so verstärkte Wanderwelle erregt nun lokal die inneren Haarzellen (IHC), die das sensorische Signal erzeugen. BC RC Derzeit sind vier X-chromosomale vererbte Loci (DFNX) kartiert, die mit dem Auftreten des nicht-syndromischen Gehörverlustes (NSHL) in Zusammenhang stehen. DFNX1 ist durch eine fortschreitende Beeinträchtigung des Hörvermögens gekennzeichnet und tritt typischerweise im Alter zwischen 5 und 15 Jahren bei Männern sowie bei Frauen um die 50 auf. Welche Rolle das bei DFNX1 mutierte PRPS1-Gen, das ein Enzym der Nukleotidbiosynthese kodiert, im Innenohr spielt, ist unklar 2 . Ebenso fanden sich Mutationen 3 im Transkriptionsfaktor Pou3F4 bei Patienten mit DFNX2. Hierbei kommen die Kinder bereits mit stark eingeschränktem Hörvermögen (prälingualer Hörverlust) zur Welt, weil die Schallübertragung zwischen Mittel- und Innenohr gestört ist. Hübner et al. untersuchten einen dritten, postlingualen NSHL in einer großen deutschen Familie. Die Krankheit beginnt bei Jungen im Alter von 3 bis 7 Jahren, mit Hördefekten im oberen Frequenzband, schreitet aber progressiv bis zur Taubheit fort. Bei Frauen beginnt der Hörverlust zwischen dem 20. und 30. Lebensjahr und führt nach 10 bis 15 Jahren zu schweren Hörschädigungen, ohne dass zuvor Störungen der Schallweiterleitung aus dem Mittelohr oder eine Beeinträchtigung des Gleichgewichtssinnes zu bemerken wäre. Genomweite Kopplungsanalyse Eine genomweite Kopplungsanalyse (Gene Chip Human Mapping 10K Array, Affymetrix) deutete bei 11 der Familienmitglieder mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit (LOD-Score 2.23) darauf hin, dass der Defekt sich in einer 17,5 Mb-Region auf dem Chromosomenabschnitt Xp22.12 befindet. Die Berechnung der LOD-Scores erfolgte mit dem Programm ALLE GRO 4 unter der Annahme einer dominanten Vererbung mit vollständiger Penetranz. Die Allelfrequenz der pathogenen Variante wurde auf 0,0001 gesetzt. Die mit MERLIN 5 konstruierten Haplotypen für SNP-Marker auf dem Chromosomenabschnitt Xp22.12 engten den Krankheits-Locus auf die Region zwischen rs1482816 und rs1557901 ein. Identifikation des ursächlichen Gens mit NimbleGen SeqCap TM Arrays Um die dem Hörverlust zugrundeliegende Genmutation zu identifizieren, wurden alle Exons und je 1KB der Promotoren der 88 proteincodierenden Regionen der Zielregion zweier betroffener Männer sowie bekannte miRNAs mit dem Roche NimbleGen 385K Custom Sequence Capture Array angereichert (Dienstleister: ATLAS Biolabs GmbH) und sequenziert (Dienstleister: Cologne Center for Genomics). Der Chip repräsentierte dabei 96,3% der Zielsequenzen des Krankheitslocus. Insgesamt wurden die Targetgensequenzen um den Faktor 280 bzw. 284 angereichert, wie qPCR-Kontrollen ergaben. Nach Elution der hybridisierten Sequenzen vom Array und Amplifikation wurden diese sequenziert (Illumina GA IIx) und lieferten 2,8286 Gb bzw. 2,6060 Gb Rohsequenz. Die Reads wurden mit der MAQ short read-Alignment-Software 5 gegen das humane Referenzgenom (Version hg19) kartiert. Einzelbasen-Variationen (SNPs) wurden mittels MAQ, Indels mittels dem BWA-Aligner 6 und SAM-Tool 7 analysiert. Auf diese Weise identifizierten Hübner und Kollegen 3.858 bzw. 3.443 X-chromosomale Varianten in den beiden Personen. Zugleich wurden DNA-Proben weiterer betroffener Männer dieser Familie hinsichtlich hochpolymorpher Mikrosatelliten- Marker genotypisiert. Die Kopplungsregion konnte so auf eine 8,5 Mb-Region eingeengt werden, die nur noch 398 bzw. 347 single nucleotide-Varianten (SNVs) enthielt. Diese wurden hinsichtlich ihrer evolutionären Konserviertheit und ihrer Auswirkungen auf die Proteinbiosynthese weiter analysiert. Nach Sanger-Sequenzierung des aussichtsreichsten Kandidaten – einer nonsense-Mutation des small muscle protein, X-linked (SMPX) – zeigte sich, dass das Sequenzintervall den DFNX4-Locus enthielt. Dieser X-chromosomale Locus war 1996 bereits von Forschungspartnern von Hübner et al. in einer spanischen Familie kartiert worden 8 und steht in Zusammenhang mit dem Auftreten eines fortschreitenden, postlingualen Hörverlust. Bei Männern tritt die Erkrankung allerdings erst zwischen dem 5. und 7. Lebensjahr, bei Frauen erst im vierten Lebensjahrzehnt auf. Die retrospektive Analyse von SMPX in dieser Familie lieferte gleichfalls eine nonsense-Mutation (c175 G>T) in der proteinkodierenden Sequenz. Ebenso wie die in der deutschen Familie identifizierte Mutation (c.109G>T) scheint diese über vorzeitige Stopp-Codons einen 18 | 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 LABORWELT


Sequence Capture Zielgen-Anreicherung Porvair hairdryer Laborwelt DE 116.5x90_Layout 1 07/03/2012 17:25 Page 1 ACHEMA Halle 4.2 E44 ANALYTICA Halle B2 215 mRNA-Abbau und damit Funktionsausfall des SMPX-Proteins zu verursachen. Gestützt wird diese Hypothese durch zwei weitere, unabhängige Familienstudien 9 , die ebenfalls zeitgleich zeigen, dass SMPX das mutierte Gen bei der DFNX4-vermittelten Taubheit ist. Immunlokalisation von SMPX Immunlokalisationsstudien mit SMPX-Antikörpern ergaben, dass SMPX in verschiedenen Zellen des Innenohrs von Mäusen exprimiert wird (vgl. Hintergrund): Neben der Expression in nichtsensorischen Zellen wie Deiters- (DC), Böttcher- (BC) oder Pillar-Zellen (PC) zeigte sich auch eine schwache Expression in Haarzellen (iHC, oHC). Hübner et al. vermuten, dass SMPX zur Erhaltung der mechano-sensitiven Stereocilien auf den sensorischen Haarzellen der Cochlea erforderlich ist. Sie sehen gewisse Parallelen zur Funktion von SMPX in Muskelgewebe des Menschen 10-12 . Dort ist das 88 Aminsäuren-Protein in sogenannten Costameren lokalisiert – mechano-sensitiven Proteinkomplexen die die Sarcolemmamembran vor Schäden durch mechanischen Stress bei der Muskelkontraktion schützen. Literatur [1] Huebner AK, Gandia M, Frommolt P, Maak A, Wicklein EM, Thiele H, Altmüller J, Wagner F, Viñuela A, Aguirre LA, Moreno F, Maier H, Rau I, Giesselmann S, Nürnberg G, Gal A, Nürnberg P, Hübner CA, del Castillo I, Kurth I. (2011): Nonsense mutations in SMPX, encoding a protein responsive to physical force, result in X-chromosomal hearing loss. Am J Hum Genet. 88(5):621-7 [2] Liu X, Han D, Li J, Han B, Ouyang X, Cheng J, Li X, Jin Z, Wang Y, Bitner-Glindzicz M, Kong X, Xu H, Kantardzhieva A, Eavey RD, Seidman CE, Seidman JG, Du LL, Chen ZY, Dai P, Teng M, Yan D, Yuan H. (2010): Loss-of-function mutations in the PRPS1 gene cause a type of nonsyndromic X-linked sensorineural deafness, DFN2. Am J Hum Genet. 86(1):65-71. [3] De Brouwer AP, van Bokhoven H, Nabuurs SB, Arts WF, Christodoulou J, Duley J. (2010): PRPS1 mutations: four distinct syndromes and potential treatment. Am J Hum Genet. 86(4):506-18. Review. [4] Gudbjartsson DF, Jonasson K, Frigge ML, Kong A. (2000): Allegro, a new computer program for multipoint linkage analysis. Nat Genet. 25(1):12-3. [5] Li, H., Ruan, J., and Durbin, R. (2008). Mapping short DNA sequencing reads and calling variants using mapping quality scores. Genome Res. 18, 1851–1858. [6] Li, H., and Durbin, R. (2009). Fast and accurate short read alignment with Burrows- Wheeler transform. Bioinformatics 25, 1754–1760. [7] Li, H., Handsaker, B., Wysoker, A., Fennell, T., Ruan, J., Homer, N., Marth, G., Abecasis, G., and Durbin, R.; 1000 Genome Project Data Processing Subgroup. (2009). The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics 25, 2078–2079. [8] Del Castillo I, Villamar M, Sarduy M, Romero L, Herraiz C, Hernández FJ, Rodríguez M, Borrás I, Montero A, Bellón J, Tapia MC, Moreno F. (1996): A novel locus for nonsyndromic sensorineural deafness (DFN6) maps to chromosome Xp22. Hum Mol Genet. 5(9):1383-7. [9] Schraders M, Haas SA, Weegerink NJ, Oostrik J, Hu H, Hoefsloot LH, Kannan S, Huygen PL, Pennings RJ, Admiraal RJ, Kalscheuer VM, Kunst HP, Kremer H. (2011): Next-generation sequencing identifies mutations of SMPX, which encodes the small muscle protein, X-linked, as a cause of progressive hearing impairment. Am J Hum Genet. 88(5):628-34. [10] Patzak D, Zhuchenko O, Lee CC, Wehnert M. (1999): Identification, mapping, and genomic structure of a novel X-chromosomal human gene (SMPX) encoding a small muscular protein. Hum Genet. (5):506-12. [11] Kemp TJ, Sadusky TJ, Simon M, Brown R, Eastwood M, Sassoon DA, Coulton GR. (2001): Identification of a novel stretch-responsive skeletal muscle gene (Smpx). Genomics. 72(3):260-71 [12] Geiger B, Bershadsky A. (2002): Exploring the neighborhood: adhesion-coupled cell mechanosensors. Cell. 2002 Jul 26;110(2):139-42. Review. Korrespondenzadresse Dr. Burkhard Ziebolz Roche Diagnostics GmbH Nonnenwald 2 82377 Penzberg Tel.: +49-8856-604830 Fax: +49-8856-6079 4830 burkhard.ziebolz@roche.com www.roche.com austria wirtschaftsservice Wir mixen die optimale Finanzierung. 50.000 Euro Management auf Zeit: Finanzierung von temporärer externer Beratung awsg.at/maz Die Vorzüge eines MiniVap Selbstverständlich würden Sie keinen Haartrockner verwenden, um chromatographische Proben in einer einzelnen Mikrotestplatte zu verdampfen. Sie haben wahrscheinlich aber auch keine Lust Schlange zu stehen, um einen großen Evaporator in Ihrer Abteilung für denselben Zweck zu benutzen. In diesem Fall brauchen Sie einen Porvair MiniVap. Das Gerät ist klein, schnell, flexibel und beeinträchtigt Ihre Proben nicht. 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Zielgen-Anreicherung Mikrofluidik Kunststoff-Know how: Basis für Lab-on-Chips zur Zielgen-Anreicherung Dr. Manfred Koranda, Sony DADC Austria AG, Salzburg Bereits vor zwei Jahren berichtete RainDance Technologies Inc. von einem skalierbaren Multiplex- PCR-Verfahren auf Basis seiner Mikrotröpfchen-Technologie, mit dem sich interessierende genomische Regionen vor Sequenzierung gezielt anreichern lassen (vgl. LABORWELT 3/2009). Dank dem Fertigungs-Know-how von Sony DADC steht nach zweijähriger Kooperation jetzt ein hochdurchsatzfähiger Chip zur Verfügung, der einen wirtschaftlichen Einsatz der Next Generation-Sequenzierung zur Untersuchung von krankheitsassoziierten Genen, SNPs, chromosomaler Hot Spots etc, ermöglicht. Neben der Targetgen-Anreicherung soll der Chip künftig auch zur Zellsortierung eingesetzt werden. RainDance nimmt durch die von Sony DADC produzierten „Smart Consumables” erfolgreich am Wettbewerb um den Hochdurchsatz-Markt für Life Sciences-Instrumente teil. Die auf Mikro-Tröpfchen basierende, „highthroughput“-fähige Kerntechnologie von Rain Dance, RainStorm TM , erzeugt Millionen aufeinanderfolgender Tröpfchen, die als distinkte Reaktionsräume fungieren und ein einzelnes Molekül, eine Zelle oder eine Reaktion umschließen können (Abb. 1). Bei der Targetgen-Anreicherung fungiert jedes Tröpfchen als Reaktionsraum, in dem genomische DNA auf ein Primerpaar trifft und mittels PCR amplifiziert wird. Dazu werden auf einem Mikrofluid-Chip zunächst Tröpfchen erzeugt, je Abb. 2: Das Herzstück der gezielten Genanreicherung durch Mikrotröpfchen- PCR: der HeatWave TM -Chip ein Tröpfchen mit genomischer DNA und mit Primer zusammengeführt, fusioniert und die Tröpfchen in PCR-Röhrchen gesammelt. Nach hochparalleler PCR in den Millionen Tropfen können die gezielt angereicherten DNA-Abschnitte sequenziert werden (vgl. Abb. 1). Das Flagschiff von RainDance ist das RDT ThunderStorm System – eine vollautomatisierte Instrumenten-Plattform für das gezielte Next-Generation-Sequenzierung, die kompatibel mit allen marktgängigen Sequenzern ist und eine genaue Klassifizierung potentiell aller Abb. 1: Um interessierende genomische Loci hochparallel anzureichen, werden beim Rainstorm TM -Verfahren zunächst mit einem Netzmittel stabilisierte Tröpfchen von je 8 pl Volumen erzeugt, die PCR-Primerpaare (a) und genomische Template-DNA (b) enthalten. Je ein Tropfen der Bibliothek mit bis zu 4.000 Primerpaaren und je ein Tropfen mit der genomischen DNA werden in separate Kanäle eines Mikrofluidikchips geladen, paaren sich dort und werden in einer Kammer (c) durch ein elektrisches Feld (schwarze Dreiecke = Elektroden) fusioniert. Die PCR-Tröpchen werden außerhalb des Chips in Standard-PCR Tubes gesammelt. Die enthaltene DNA wird anschließend in handelsüblichen Thermocyclern im Tropfen amplifiziert. Dies ermöglicht ein Multiplexing in einem PCR-Röhrchen, das mehreren hundert bis tausend Amplifikation unter den Bedingungen einer Singleplex-Reaktion entspricht. 20 | 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 LABORWELT


Mikrofluidik Zielgen-Anreicherung Varianten in jeder Regionen eines Genoms ermöglicht. Dies ist zum Beispiel bei der Erkennung von krebsassoziierter Mutationen hilfreich. Herzstück des ThunderStorm ist der HeatWave TM TS-Probenchip (Abb. 2). Entwickelt und produziert von Sony DADC ermöglicht dieses „Smart Consumable“ die äußerst präzisen Mikro-Tröpfchen-Manipulationen, die für Hochdurchsatz-Analyse benötigt werden. Der Chip kommt dabei ohne bewegliche Teile oder Ventile aus. Kombination von Fertigungsund Assay-Know how RainDance trat erstmals 2009 an Sony DADC heran, als das Unternehmen mit der Herausforderung konfrontiert war, einen funktionierenden Prototypen aus PDMS in ein robustes „high-throughput“-Einwegprodukt für die Massenfertigung zu transformieren. Der nur einmalige Gebrauch des Chips war eine essentielle Voraussetzung, um eventuelle Probenkontaminationen – eine große Gefahr bei Genanalysen – auszuschließen. Besonders attraktiv für RainDance war dabei Sony DADCs anerkannte Fähigkeit, mikrofluidische Kanäle in kostengünstigem Kunststoff anstatt in teuren metallischen oder keramischen Chips fertigen zu können – Schlüsselaspekt für die tatsächliche Kosteneffizienz bei der Produktion und damit für die Massentauglichkeit des Systems. Das Produkt sollte den gesamten biochemischen Workflow (Abb. 1) abdecken: Einbringen der gereinigten genomischen DNA, Verpackung in Tröpfchen und anschließende Fusion mit „Master-Mix“-Tröpfchen einer Primer-Bibliothek, um diese für anschließende PCR-Reaktionen einzusetzen (vgl. Abb. 1). Dies war eine nicht zu unterschätzende Herausforderung, denn schon der Prototyp des Chips war komplex: mit Filterstruktur, Kanälen und Elektroden. Zuerst lösten stellten die Designer von Sony DADC sicher, dass die mikrofluidischen Kanäle während des Bonding-Prozesses nicht zerstört werden und ihr Durchmesser präzise innerhalb des engen Toleranzbereiches liegt, der ein reproduzierbares Tröpfchenvolumen garantiert (± 1%). Des Weiteren war es notwendig, die Elektroden genau positioniert zu drucken, um exakt definierte Tröpfchenfusionen zu induzieren. Mitentscheidend für die Fertigung eines massentauglichen Chip war, dass Sony DADC die gesamte Wertschöpfungskette abdecken kann – von Mastering zu Spritzguss, inklusive Elektrodendruck, Verklebung und Assemblierung sowie Etikettierung, Verpackung und Logistik. Ein weiterer Faktor war es, eine langfristige Zusammenarbeit sicherstellen zu können, wie für Sony DADC als weltweit führenden Produzenten möglich. Abb. 3: Stapelbar: der HeatWave TM TS-Chip Die von Sony DADC produzierte Version des HeatWave TM -Chips erhielt bei seiner Markteinführung im Herbst 2011 das Lob der Kritiker und unterstützt alle kommerziellen Anwendungen des RDT ThunderStorm-Systems. Dies schließt sowohl die „targeted ultra-deep cancer mutation detection” als auch die firmeneigenen Screening-Panels für Genanalysen mit ein: ADMESeq, ASDSeq, XSeq und HLASeq. Aufgrund des rapiden Fortschritts der Genomforschung war RainDance von Beginn an interessiert, einen Chip anzubieten, der gleichzeitig zwei Proben analysieren kann. Sony DADC hat dies ermöglicht: Der Heat- Wave TM TS Chip wird im zweiten Quartal 2012 in die Massenproduktion gehen. Dank seiner Stapelbarkeit (Abb. 3) und der Möglichkeit der vollautomatisierten Probenbeladung verspricht der neue Chip, die Produktivität auf ein bis dato unbekanntes Niveau zu heben und ermöglicht es Wissenschaftlern so, die Analysenkosten pro Probe zu senken und den Personalaufwand – verglichen mit anderen Methoden – deutlich zu reduzieren. Roch Kelly, Senior Vice President Operations bei RainDance, zeigt sich mit der Zusammenarbeit hochzufrieden: „Dank den zahlreichen Vorteilen des von Sony DADC produzierten neuen HeatWave TS Chips können unsere Kunden ihre Proben schneller, einfacher und weitaus kostengünstiger als jemals zuvor analysieren. Sony DADC ist ein erstklassiger Zulieferer, der auf jahrzehntelange Erfahrung in den Bereichen der Fertigung optischer Disks und regulierte Märkte zurückgreifen kann und somit eine wertvolle Quelle für zukünftige Produkte im Bereich „Smart Consumables“ darstellt. Laut Christoph Mauracher, Senior Vice President bei Sony DADC BioSciences, belegt die Zusammenarbeit mit RainDance, dass Sony DADC ein Schlüsselpartner für führende Life Sciences-Unternehmen weltweit sein kann. „Wir glauben, dass unsere Fähigkeit, hochentwickelte Mikrostrukturen in Polymeren herstellen zu können, kombiniert mit flexibler Produktion und Logistik exakt die Kombination liefert, wie sie von aufstrebenden und etablierten Unternehmen in diesem aufregendem Markt benötigt werden.“ Korrespondenzadresse Manfred Koranda, Sony DADC Austria AG Sonystrasse 20 A-5081 Anif, Salzburg Manfred.Koranda@sonydadc.com www.sonydadc.com Andy Noble, RainDance Technologies, Inc. 44 Hartwell Avenue Lexington, MA 02421 noblea@raindancetech.com Kultursysteme Isolieren Kultivieren Produzieren Dunn Labortechnik GmbH · Thelenberg 6 · 53567 Asbach Tel. +49 26 83 / 4 30 94 · Fax +49 26 83 / 4 27 76 · e-mail: info@dunnlab.de · Internet: www.dunnlab.de LABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 | 21


Zielgen-Anreicherung Automation Automation der Zielgenanreicherung für den Genome Sequencer FLX Darren Birr, 454 Life Science, Branford, USA Die Standardisierung und Automatisierung der Probenvorbereitung für das Next Generation Sequencing ist die Voraussetzung für die Erhebung in sich konsistenter Daten im Rahmen genomweiter Sequenzierungsstudien. Eine Kombination der Microlab® Starlet Liquid Handling Workstation (Hamilton Robotics) mit Roches REM e Liquid Handling-System reduziert die „hands-on“-Zeit der Probenvorbereitung für die Sequenzierung auf dem Genome Sequencer FLX (454 Life Sciences/ Roche Applied Science) von 5 Stunden auf 15 Minuten. Zusätzlich vermindert die walk away- Automatisierung des Emulsions-PCR-Schrittes sowie des Primer-Hybridisierungsschrittes bei der Zielgenanreicherung die Variabilität der Sequenzierungsergebnisse im Vergleich zur manuellen Probenvorbereitung. Die Genome Sequencer FLX (GS FLX)-Plattform (Roche Applied Science, Penzberg) bietet Vorteile bei der de novo-Sequenzierung und -Assemblierung genomischer DNA, beim Transkriptom- und Amplicon-Sequencing sowie bei der Analyse kleiner RNAs. Der Arbeitsablauf auf dem GS FLX System besteht aus vier Schritten: Dem Erzeugen der Sequenzbibliothek, der klonalen Sequenz- Amplifikation mittels Emulsions-PCR, der Sequenzierung selbst und der bioinformatischen Datenauswertung. Roches REM e System ermöglicht eine vollständige Automatisierung der Sequenzamplifikation und des Annealings der Sequenzprimer im Rahmen der Emulsions-PCR mit GS FLX Titanium-Reagenzien (vgl. Abb. 2). Gegenüber der manuellen Probenvorbereitung vereinfacht die Kombination einer Liquid Handling-Plattform mit dem REM e System die Durchführung der Emulsions-PCR signifikant: Fünf Stunden manuelle Laborarbeit werden durch einen reproduzierbaren, vollautomatischen Prozess ersetzt. Insgesamt stehen nach Positionierung des REM e Moduls auf der Arbeitsfläche des Microlab® STARlet Liquid Handling-Systems fünf verschiedene, vollautomatisierte REM e-Protokolle zur Verfügung, mit denen bis zu acht Proben parallel bearbeitet werden können. Das REM e Modul übernimmt dabei das Vortexen, die Vakuumfiltration, den Sequenz- Capture-Schritt mit Magnetbeads und das Erhitzen. Das Microlab® STARlet System führt alle Flüssigkeitstransfer mit Hilfe seiner voneinander unabhängigen 1.000 µl- Pipettierkanäle durch. In einer Testserie wurde ermittelt, ob die Integration des REM e Systems in die Microlab® STARlet Liquid Handling Workstation zu vergleichbaren Anreicherungsergebnissen führt wie die für Pipettierfehler anfälligere und wesentlich langsamere manuelle Probenvorbereitung. Jetzt noch schneller informiert mit www. .de Neu und tagesaktuell | Nachrichten | Börse | Presseschau | Mediathek | und vieles mehr 22 transkript_Web_EA_185x120.indd | 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 1 06.03.2012 LABORWELT 12:27:50 Uhr


Automation Zielgen-Anreicherung www.laborwelt.de Das REM e System wurde gemäß Herstellervorgaben installiert und die „Large Volume 4 Emulsion Cups per Run“-Methode mit Hilfe der Hamilton-Software Vector 4.2.0.6425 programmiert. Emulsions-PCR-Amplifikationsansätze wurden für vier zuvor generierte GS FLX Titanium Rapid Libraries gemäß Herstellerangaben angesetzt. Nach Amplifikation mit der emPCR-Methode für große Volumina (LV) wurde die Wasser-Öl- Emulsion aufgebrochen (gemäß Manual: bis Schritt 13/Abschnitt 3.5.3.), die Beads jeder LV-Probe in einem konischen 50 ml-Röhrchen vereint und mit Enhancing Fluid XT des emPCR Kits auf 5 ml aufgefüllt. Die Proben wurden dann gemäß REM e System anleitung auf dem Hamilton Microlab® STARlet plaziert und vier Emulsions-Cups prozessiert, wie im REM e System-Protokoll beschrieben. Abb. 1: Das REM e System für den Next Generation Sequencer GS FLX (454/Roche Applied Science), hier integriert in Hamiltons Liquid handling-Plattform Microlab® STARlet Abb. 2: Arbeitsablauf der 454-Sequenzierung auf dem GS FLX System. Zunächst wird eine Bibliothek einzelsträngiger Template-DNA erzeugt. Im zweiten Schritt erfolgt die Bindung der Template-DNA an magnetische Beads, deren anschließende, „klonale“ Amplifikation via Emulsions-PCR, das „Aufbrechen“ der Wasser-Öl-Emulsion, die Anreicherung DNA-positiver Beads und Auftrennung in die Kavitäten einer Picotiterplatte, in der das Pyrosequencing stattfindet. Methoden Das hier eingesetzte Microlab® STARlet Liquid Handling System war mit folgenden Komponenten ausgestattet: l autonome 1000 µl Pipettierkanäle (Hamilton) l REM e System (454 Life Sciences) l REM e System Tube Rack Carrier (Hamilton) l REM e System Deck Module Carrier (Hamilton) l 3 x 120 ml Reagent Carrier (Hamilton) l 120 ml Reagent Trough (Hamilton) l Tip Carrier (Hamilton) l 1000 µl CO-RE-Einmalpipettenspitzen (Hamilton). Tab. 1: Ergebnisse der Sequenzanreicherung von vier Proben auf dem REM e System. Zur Erzeugung aller vier Bibliotheken wurden 35 Mio. Beads eingesetzt. LV = large volume Bibliothek Emulsions-PCR Protokoll Endvolumen [µl] Bead Count Wiedergewinnung [%] Beadausbeute 1 LV 696 3.898 8 2.713.008 2 LV 746 3.952 8 2.948.192 3 LV 820 3.048 7 2.499.360 4 LV 800 3.960 9 3.168.000 Ergebnisse Nach Anreicherung mittels des REM e Systems wurden die Beads durchflusszytometrisch gemäß Herstellerangaben gezählt. Dabei wurde bei allen vier Proben die gewünschte Anreicherung um 5 % bis 20 % erzielt (vgl. Tab. 1). Die Beads wurden unter Einsatz einer in vier Bereiche unterteilten Picotiterplatte sequenziert. Sowohl die Sequenzanreicherung (Tab. 1) als auch die mittleren Leselängen (mit rund 400 Basen) lagen im Zielbereich. Damit liefert die Automation der Probenvorbereitung mit Hilfe der Microlab® Starlet Liquid Handling Workstation qualitativ hochwertige Sequenzierergebnisse bei signifikanter Reduktion der Hands-on-Zeit und des Risikos für Pipettierfehler. Das hier vorgestellte System ist geeignet für alle Typen von GS FLX- Titanium-Bibliotheken – wie Shotgun-, Paired End-, cDNA- und Amplicon-Libraries mit oder ohne Multiplex Identifiern (MIDs) – sowie für Emulsions-PCR-Formate mit kleinen, mittleren und großen Volumina. Korrespondenzadresse Bobby Chavli Hamilton Robotics 4970 Energy Way Reno, NV 89502 USA bobby.chavli@hamiltoncompany.com Marieke Mäder Hamilton Robotics Fraunhoferstraße 17 82152 Martinsried MMaeder@hamiltonrobotics.com LABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 | 23


Zielgen-Anreicherung Expertenpanel NGS-basierte Diagnostik Sequenzierungs-basierte Diagnose-Assays spielen vor allem eine Rolle Diagnostik monogener Erkrankungen. Mit zunehmender Genauigkeit, aber auch durch den rapiden Kostenverfall beim Next-Generation Sequencing werden neben der klassischen Sanger-Methode die ultraschnellen Sequenzer zunehmend interessant für die Diagnostik. Als großer Vorteil erscheint dabei, dass die bisherige Stufendiagnostik durch die Erfassung multipler Mutationen in einem einzigen Test eingesetzt werden kann. Da die Maschinen aber bislang alles andere als einfach bedienbar sind, wie sonstige Diagnostiktest, werden die meisten Tests bislang von hochspezialisierten Dienstleistern angeboten. Bis die zum Einsatz standardisierter Assays in der klinischen Diagnostik scheint es indes noch ein weiter Weg. Saskia Biskup Dr. Dr. med Saskia Biskup ist die Gründerin und Geschäftsführerin der CeGaT GmbH in Tübingen LABORWELT: Welche Vorteile bieten Diagnostikpanels auf Basis des Next-Generation Sequencings und wie genau müssen sie mindestens sein Biskup: Unter einem Diagnostik-Panel versteht man die gleichzeitige Sequenzierung aller für eine bestimmte Erkrankung relevanten Gene. Dies ist deutlich schneller und kostengünstiger als die herkömmliche Gen-für- Gen-Sequenzierung. Zudem – und das ist das Entscheidende – führt die Panel-Diagnostik aufgrund der parallelen Sequenzierung von bis zu mehreren hundert Genen signifikant häufiger zum Auffinden der genetischen Ursache. Ziel der genetischen Diagnostik ist die Diagnosesicherung und damit die eindeutige Zuordnung des Krankheitsbildes. Dadurch erhalten Patienten Gewissheit, eine Prognoseabschätzung kann getroffen werden, und Familienangehörige können beraten und gegebenenfalls präventiv behandelt werden. Zudem können Therapien angepasst und wirkungslose Therapien vermieden werden. Die Panel-Diagnostik ist eine neu verfügbare Methode, mit der Veränderungen in den untersuchten Genen mit hoher Genauigkeit ausgeschlossen oder identifiziert werden können. Diese hohe Genauigkeit ist der wichtigste Vorteil gegenüber der Gesamtgenom- Sequenzierung. Zudem wird das Auffinden von Zufallsbefunden, die nicht im Zusammenhang mit der untersuchten Erkrankung stehen, praktisch ausgeschlossen. Insgesamt führen die Diagnostik-Panels zu deutlich höheren Aufklärungsquoten und stehen * Dr. Klein arbeitet am Zentrum für Humangenetik und Laboratoriumsmedizin Dr. Klein, Dr. Rost und Kollegen in Martinsried als schnelle, effiziente und kostengünstige Methode für Ratsuchende, Betroffene, Ärzte und Wissenschaftler weltweit zur Verfügung. Hans-Georg Klein Dr. med. Hanns- Georg Klein, Facharzt für Laboratoriumsmedizin, Medizinische Genetik, Martinsried* LABORWELT: Welchen Nutzen verspricht eine NGS-basierte DNA-Analytik in der molekularen Onkologie und der HLA-Typisierung Klein: Das Verständnis der molekularen Mechanismen, die zur Tumorentstehung und -progression oder Therapieresistenz führen, sind wichtig für die Entwicklung neuer Krebsmedikamente. Mit Beginn der systematischen Genomforschung vor etwa 20 Jahren konnten neue Zielstrukturen identifiziert werden, die individuellere und nebenwirkungsärmere Therapien möglich machten. Die Charakterisierung von Mutations- und Aktivierungsmustern bestimmter Gene identifizierte „oncogene targets“ und wurde damit zur Grundlage einer stratifizierten Therapie mit monoklonalen Antikörpern (mAB) oder „small molecules“ (z.B. Tyrosinkinaseinhibitoren TKI). Dieser Ansatz wird unter dem Begriff „personalisierte Medizin“ zusammengefasst und heute durch den Einsatz von Hochdurchsatz- NGS-Geräten nochmals erheblich beflügelt. Für die Diagnostik relevant ist die Tatsache, dass bei hämatopoetischen Neoplasien und soliden Tumoren meist eine Mischung von Tumorzellen und normalen Zellen vorliegt, so dass bereits kleinste DNA-Veränderungen sehr sensitiv erfasst werden müssen. Während bei der DNA-Sequenzanalyse nach Sanger die Nachweisgrenze von Minoritäten bei etwa 20% liegt, können mittels NGS bei einer entsprechenden Abdeckung bereits 1-5% mutierte Zellen gegen einen Hintergrund von 95-99% detektiert werden. Bei Leukämien können beispielsweise Therapieverläufe und minimale Resterkrankung beobachtet oder prognostisch ungünstige Mutationen frühzeitig detektiert werden. Die Sensitivität von NGS steigert bei soliden Tumoren die Detektionsrate, insbesondere bei limitiertem Biopsiematerial, wie es häufig bei der Untersuchung von Lungentumoren der Fall ist. Ein weiterer Vorteil von NGS ist, dass in einem gezielten Amplikon-basierten Ansatz verschiedene onkogene Targets unterschiedlicher Patienten parallel, zeitnah und kostengünstig analysiert werden können. Die allogene Blutstammzelltransplantation ist bei Erkrankungen der blutbildenden Organe oft die einzige kurative Therapiemöglichkeit. Die Beurteilung der Kompatibilität zwischen Spender und Empfänger beruht auf der Bestimmung von HLA-Merkmalen. Diese liegen im hochvariablen Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC), der über 400 Gene mit vorwiegend immunologischer Funktion beinhaltet. Aufgrund der hohen Variabilität der HLA-Merkmale ist eine eindeutige Bestimmung der Allele mit herkömmlicher Sequenzierung nicht immer möglich. Beim NGS-Verfahren wird eine klonale Sequenzierung des amplifizierten DNA-Materials durchgeführt, wodurch eine deutlich bessere Auflösung der HLA-Allele möglich ist. Gleichzeitig kann der Probendurchsatz mit sogenannten DNA- Barcodes (Multiplex Identifiers) auf mehrere hundert Proben pro Sequenzierlauf erhöht werden. Bei der Suche nach einem geeigneten Spender werden derzeit nur einzelne Exons von vier bis sechs HLA-Genen untersucht. Trotz vollständiger Übereinstimmung der untersuchten Merkmale kommt es nach der Transplantation häufig zu den schweren Komplikationen Transplantat-gegen-Wirt- Erkrankung oder Transplantatabstoßung. Das NGS-Verfahren ermöglicht mit angemessenem Zeit- und Kostenaufwand die Untersuchung genetischer Unterschiede auf weitere potentiell relevante Gene auszuweiten. Somit können die Spenderauswahl optimiert und letztendlich bessere Transplantationsergebnisse erzielt werden. 24 | 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 LABORWELT


Expertenpanel Zielgen-Anreicherung Wera Hofmann Dr. Wera Hofmann, ist Medical Director der LifeCodexx AG, eines Tochterunternehmens der Konstanzer GATC Biotech AG LABORWELT: Welche Vorteile und Limitierungen bieten sequenzierungsbasierte Bluttests im Vergleich zu invasiven vorgeburtlichen Untersuchungsmethoden Hoffmann: Ausgangspunkt des Bluttests ist die Feststellung, dass die im mütterlichen Blut zirkulierende zellfreie fetale DNA mittels NGS-Technologien analysiert werden kann. Im Unterschied zu invasiven, vorgeburtlichen Untersuchungsmethoden birgt der Bluttest kein eingriffsbedingtes Fehlgeburtsrisiko. Bei negativem Testergebnis bleibt einer großen Mehrheit schwangerer Frauen mit einem Risiko für Chromosomenstörungen eine belastende invasive Untersuchung erspart. In Deutschland könnten daher jährlich etwa 600 ungeborene Kinder vor den tödlichen Folgen eines invasiven Eingriffs bewahrt werden. Während der Bluttest ab der 12. Schwangerschaftswoche (SSW) erfolgt, wird eine Fruchtwasseruntersuchung nicht vor der 14. SSW durchgeführt. Allerdings ist der Bluttest derzeit auf die Bestimmung von autosomalen numerischen Chromosomenstörungen wie der Trisomie 21 begrenzt. Auch gibt er keinen Aufschluss über die Form der Trisomie, ob es sich zum Beispiel um eine freie Trisomie oder eine erblich bedingte Translokations-Trisomie handelt. Dies kann nur eine invasive vorgeburtliche Untersuchung klären. Daher ist schwangeren Frauen mit einem auffälligen Ergebnis des Bluttests eine invasive vorgeburtliche Abklärung der genetischen Ursachen zu empfehlen. Daniela Steinberger Prof. Dr. Daniela Steinberger, Medizinische Leitung & Geschäftsführerin, bio.logis GmbH, Frankfurt am Main LABORWELT: Wie werden sich durch den Einzug der Next- Generation-Sequenziergeräte der Markt und die Erstattung sequenzbasierter Tests auf Erbkrankheiten verändern Steinberger: Ein Ende der rasanten Entwicklung rund um die DNA-Analysetechnologien ist derzeit überhaupt noch nicht abzusehen. Wie wir die anwendbaren Techniken bezeichnen, ob „next-“ oder „next-next-generation-sequencing“ ist dabei einerlei. Hinter diesen Begriffen, verbergen sich ohnehin viele verschiedene Methoden. Die Methoden, die sich auf dem Markt der Diagnostik von erblichen Merkmalen und Erkrankungen durchsetzen werden, sind vermutlich durch mehrere Attribute gekennzeichnet: Die Ergebnisse sind günstig zu generieren und stabil sowie einfach in der Anwendung bei größtmöglicher Präzision. Allein das macht allerdings noch keine markt- und erstattungsfähige Diagnostik daraus. Das Management zur Nutzbarmachung der vielen günstig und akkurat produzierten Sequenzen wird dann das „next-generation“-Ding der Zukunft werden. Erst damit wird sich der Nutzen individueller Genome oder Genomteile erschließen und eine klinische Anwendung möglich. Letzteres wäre schließlich eine Voraussetzung für die Erstattung. Nach „NGS“ lauten die Akronyme und Schlagworte der Zukunft dann „GIM“ –„genetic information management“- für den mit IT-Tools strukturierten Zugang zum „Interpretom“, zur Gesamtheit der interpretierbaren DNA-Varianten. Letztlich wird die Gemeinschaft der Versicherten es sich nicht leisten können, auf Erkenntnisse genetischer Diagnostik zu verzichten. Die Einbindung des Interpretoms in die elektronische Gesundheitsakte wird dann ein Punkt im Katalog der zu erstattenden Leistungen werden. Forschung Neuronen mit Licht abschalten Biophysiker aus Bochum und Berlin haben den Schaltmechanismus des durch Licht aktivierbaren Ionenkanals Kanalrhodopsin-2 (ChR2) 3 aufgeklärt. Ihre Ergebnisse präsentieren die Forscher um Prof. Dr. Klaus Gerwert im Journal of Biological Chemistry (2012, Bd. 287, S. 6904). Weil der Ionenkanal die Manipulation von Nervenzellen allein durch Licht ermöglicht, hat er sich bereits zum Standardwerkzeug der Optogenetiker entwickelt. Über die genaue Funktionsweise des Kanalrhodopsins war allerdings bislang wenig bekannt. Dies haben die Bochumer Biophysiker und ihre Partner von der Humboldt-Universität und der Charité Berlin jetzt geändert. Ende Februar berichteten sie über den genauen Schaltmechanismus des Ionenkanals. Danach löst eine durch Licht induzierte Veränderung der Aminosäure Glutaminsäure 90 (E90) ein verstärktes Eindringen von Wassermolekülen in die Zelle aus, so dass das Protein nun gezielt Ionen durch die Zellmembran leiten kann. Mittels zeitaufgelöster Infrarot-Spektroskopie zeigten sie r, dass sich der Kanal dann öffnet, wenn E90 ein Wasser- Original und Modell der (ChR2) 3 -Struktur stoff-Ion abgibt (Deprotonierung). Ergänzend bestätigten elektrophysiologische Experimente, dass eine Mutation der Aminosäure zu einer veränderten Ionendurchlässigkeit des Membrankanals führt. Am Computer gelang es den Forschern, zu simulieren, wie die Deprotonierung den Kanal öffnet und Wassermoleküle eindringen lässt. Forschungspolitik Mehr Geld vom Bund für Unis So schnell kann Politik gehen: Am 1. März empfahlen die sechs Forschungsweisen der Expertenkommission für Forschung und Innovation (EFI) Bundesforschungsministerin Annette Schavan in ihrem Jahresgutachten, die Unis zu fördern. Fünf Tage später kündigte die Ministerin an, das Grundgesetz ändern zu wollen. Bereits Anfang 2013 soll die Änderung des §91b, die die Finanzierung von universitären Einrichtungen durch den Bund erlaubt, mit Zweidrittel-Mehrheit beschlossen sein. Seit der Föderalismusreform 2006 sind die Kooperationsmöglichkeiten zwischen Bund und Ländern stark eingeschränkt. Das Geld des Bundes fließt fast ausschließlich in außeruniversitäre Einrichtungen. Die ländereigenen Universitäten können derzeit nur zeitlich befristet über sogenannte Vorhaben, Geld vom Bund bekommen, zum Beispiel den Hochschulpakt und die 2017 auslaufende Exzellenzinitiative. LABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 | 25


Zielgen-Anreicherung Paperwelt p53 als Trigger der Chromothripsis bei Krebs Rausch T, Jones DT, Zapatka M, Stütz AM, Zichner T, Weischenfeldt J, Jäger N, Remke M, Shih D, Northcott PA, Pfaff E, Tica J, Wang Q, Massimi L, Witt H, Bender S, Pleier S, Cin H, Hawkins C, Beck C, von Deimling A, Hans V, Brors B, Eils R, Scheurlen W, Blake J, Benes V, Kulozik AE, Witt O, Martin D, Zhang C, Porat R, Merino DM, Wasserman J, Jabado N, Fontebasso A, Bullinger L, Rücker FG, Döhner K, Döhner H, Koster J, Molenaar JJ, Versteeg R, Kool M, Tabori U, Malkin D, Korshunov A, Taylor MD, Lichter P, Pfister SM, Korbel JO. (2012): Genome Sequencing of Pediatric Medulloblastoma Links Catastrophic DNA Rearrangements with TP53 Mutations. Cell, doi: 10.1016/j.cell.2011.12.013 Erst seit Kurzem ist bekannt, dass Krebs durch explosionsartig in einem einzigen Schritt auftretende chromosomale Umlagerungen entstehen kann. Was allerdings hinter dem Chromothripsis genannten Phänomen steckt, lag bislang im Dunkeln. Korbel und Kollegen haben bei der Sequenzanalyse des Genoms von Patienten mit Sonic Hedgehog-Medulloblastom nun erstmals zeigen können, dass eine Mutation im Tumorsuppressorprotein p53 stark mit der Chromothripsis korreliert. In dieser Tumorart tritt der neue Krebsmechanismus bei 30% der Patienten auf. Nun soll untersucht werden, ob und in welchen Tumorarten der neuentdeckte Mechanismus eine Rolle spielt. LABORWELT: Was sind Ihre wichtigsten Ergebnisse Korbel: Vor rund einem Jahr beschrieb die Arbeitsgruppe um Peter Campbell im britischen Cambridge einen neuartigen Mechanismus der Krebsentstehung namens „Chromothripsis“. Dabei kommt es zu einer geradezu explosionsartigen Umlagerung großer Teile des Erbguts einer zuvor gesunden Zelle – Ergebnis ist die Entwicklung von Krebs. Nach Erscheinen der Studie von Campbell blieb jedoch unklar, welche zellulären Mechanismen Chromothripsis bewirken, oder ob es genetische Prädispositionen für sie gibt. Unsere Forschung hat in diesem Zusammenhang zu sehr interessanten, neuen Erkenntnissen geführt. Bei kindlichen Hirntumoren fanden wir, dass eine Mutation im Gen für das Protein p53 Chromothripsis auslöst. p53 wird auch „Wächter des Genoms“ genannt, denn das Protein sorgt normalerweise dafür, dass gesunde Zellen bei Erbgutschäden die Zellteilung einstellen – Krebs kann nicht mehr entstehen. Wir vermuten, dass p53-Mutationen diesen Schutzmechanismus ausschalten, so dass es zur Chromothripsis und Krebsentstehung kommen kann. Allerdings ist auch denkbar, dass p53-Mutationen die explosionsartigen Umlagerungen direkt auslösen. LABORWELT: Was war der Ausgangspunkt Ihrer Forschung Korbel: Vor einigen Jahren stellte ein Kollege von uns – Andreas Kulozik, leitender Arzt an der Heidelberger Universitäts-Kinderklinik – bei einem kleinen Mädchen, dass an einem Sonic Hedgehog- (SHH) Medullo blastom erkrankt war, eine erbliche Veränderung im p53-Gen fest. Im Rahmen des Internationalen Krebsgenom-Konsortiums (ICGC, www.icgc.org) ist meine Arbeitsgruppe an der molekularen Aufklärung der Entstehung von Medulloblastomen beteiligt. Als wir, gemeinsam mit Wissenschaftlern um Peter Lichter und Stefan Pfister vom Deutschen Krebsforschungszentrum, begannen, am EMBL die weltweit ersten vollständigen Genomsequenzen von kindlichen Tumoren zu erzeugen, erschien uns der Fall des Heidelberger Mädchens als ein vielversprechender Ansatzpunkt. Bei der Analyse ihres Genoms trauten wir zuerst unseren Augen nicht: Wir sahen Muster im Genom, die auf explosionsartige Umlagerungen hindeuteten, wie sie vorher noch nicht in Hirntumoren beschrieben worden waren. Schnell wurde uns klar, dass wir neue Einblicke in die Krebsentstehung durch Chromothripsis gewonnen hatten. LABORWELT: Wie sind Sie experimentell vorgegangen Korbel: Im Anschluss an die Analyse des Erbguts des Mädchens unterzogen wir Tumorproben von 98 Medulloblastomen einer Erbgutanalyse. In 13 der 98 Proben entdeckten wir das für Chromothripsis typische Chromosomen-Chaos. In allen 13 Tumoren fand sich ein verändertes p53 Gen, während wir bei Patienten mit normalem p53 nicht explosionsartige Veränderungen festgestellt haben. LABORWELT: Wo liegen die biologische Relevanz Ihrer Ergebnisse oder mögliche Anwendungen Korbel: Wir prüfen derzeit, ob wir künftig bei allen Patienten mit SHH-Medulloblastomen nach erblichen p53-Mutationen suchen sollen. Liegt Dr. Jan Korbel Dr. Jan Korbel ist als Gruppenleiter innerhalb der Abteilung Genome Biology des EMBL in Heidelberg tätig. Der Spezialist für genomische Strukturvariationen promovierte 2005 – nach Studium der Biotechnologie an der TU Berlin – an der HU Berlin und am EMBL in Heidelberg. Als Post-Doc forschte Korbel in Dr. Mark Gersteins Labor an der Yale University in New Haven. 2008 kehrte er zurück ans EMBL. Der Genomicsund Bioinformatikexperte arbeitet in internationalen Großprojekten mit, wie dem 1000 Genomes-Projekt oder dem Internationalen Cancer Genome Consortium. eine solche Mutation vor, so haben die Betroffenen ein erheblich erhöhtes Krebsrisiko – ohne davon zu wissen. Entdecken wir einen erblichen p53-Defekt, so können wir engmaschige Früherkennungsuntersuchungen empfehlen, um mögliche Tumoren in einem besser behandelbaren Stadium zu entdecken und so die Heilungschancen signifikant zu verbessern. Ein weiterer Grund spricht dafür, bei Patienten mit SHH-Medulloblastomen nach erblichen p53-Mutationen zu fahnden: Liegt eine solche Mutation vor, so ist besondere Vorsicht bei der Wahl der Behandlungsmethoden geboten, denn Strahlentherapie und auch einige Zyto statika wirken, indem sie das Erbgut schädigen. Bei Menschen mit vererbtem p53-Defekt ist die DNA-Reparatur jedoch in allen Körperzellen beeinträchtigt, so dass therapiebedingte DNA- Schädigungen leicht zu weiteren Tumoren führen könnten. LABORWELT: Wie gehen Ihre Arbeiten jetzt weiter Korbel: Wir werden auch in anderen Krebsarten nach Merkmalen von Chromothripsis suchen, mit dem Ziel, weitere genetische Faktoren zu erkennen, die bei diesem Phänomen eine Rolle spielen. Chromothripsis führt zu ausgesprochen aggressiven Tumoren, deshalb halten wir es für sehr wichtig, den molekularen Mechanismus vollständig aufzuklären. Wir erhoffen, dadurch den Weg für bessere diagnostische Verfahren oder neue Krebstherapieformen frei zu machen. 26 | 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 LABORWELT


Neu: www.laborwelt.de Die nächste Generation digitaler Labor-Nachrichten: Komplett neues Design, viele zusätzliche Funktionen – die ideale Kombination aus Spaß und Information für die kurzen Pausen im Laboralltag! Nachrichten, Journal Club und Presseschau. Dazu Themendossiers zu neuesten Methoden, Techniken und Geräten. Erweitern Sie Schritt für Schritt das eigene Knowhow und lernen Sie die Szene von Ihrer unterhaltsamen Seite kennen – mit Videos und Fundstücken aus dem Netz. www.laborwelt.de Kostenloser eNewsletter Regelmäßig alle Neuigkeiten im Überblick Aktuelle Nachrichten Neuigkeiten aus dem Labor und der Welt Top Produktvideos Innovative Firmen und neueste Produkte Presseschau Unterhaltsame Lesetipps zum Stöbern im Netz Journal-Club Internationale Fachartikel im Überblick Themendossiers Die informativen Themenschwerpunkte aus unserer Fachzeitschrift Mehrere Videokanäle Etwas für jeden - unterhaltsam und informativ Jobangebote Topaktuelle Stellenanzeigen aus den Bereichen Biotechnologie und Forschung Firmen im Focus Die wichtigsten Player, ihre Strategien und Geschäfte im Labormarkt Blogs Einblick in die Welt der Wissenschaftsblogger - mit Ranking Terminkalender Aktuelle Veranstaltungen und Konferenzen zum Thema Life Sciences


III Zellbiologie Zellkultur Zellbiologie Schnelle Kulturtechnik zur Detektion mikrobieller Kontaminationen Bret Barnhizer, CEO, NanoLogix Inc., Hubbard, USA Zellbasierte Verfahren haben einen wahren Aufschwung sowohl beim Drug Screening, der Toxizitätstestung von Chemikalien als auch dem Nachweis von Keimen erlebt. Zwar ist die Aussagekraft der zellbiologischen in vitro-Tests naturgemäß begrenzt. Doch durch zunehmende Datenintegration und Simulation soll langfristig die Modellierung auch komplexer Vorgänge möglich werden. Von Tierersatz bis Zellkultivierung Die Fortschritte die die in vitro-Assays bei der Substanztestung gemacht haben, beleuchten Jürgen Hescheler, Thomas Hartung und Dirk Dressler in einem Expertenpanel „Toxizitätstestung“ (vgl. Seite 35). Die Fortschritte bei einfachen Endpunkten wie der akuten Toxizität dürfen indes nicht darüber hinwegtäuschen, dass die Zahl der Tierversuche in den nächsten Jahre weiter drastisch steigen wird, weil sich systemische und Langzeitwirkungen bis auf absehbare Zeit eben nur in Modelltieren untersuchen lassen. Über deutliche Fortschritte im Bereich der Qualitätssicherung können sich indes biopharmazeutische Firmen und Lohnhersteller freuen. Die US-Firma Nanologix (vgl. S. 28) hat nämlich ein Verfahren zum Kulturnachweis von mikrobiellen Kontaminanten entwickelt, das die Kultivierungszeit dank einer Nanoporenmembran um Faktor 1o verkürzt. Die Technik, die sich im FDA-Zulassungsverfahren befindet, könnte auch den Milliardenmarkt der klinischen Diagnostik aufmischen. Auf einen verbesserten Nachweis von Erregern zielt auch ein neues durchflusszytometrisches Verfahren ab (vgl. S. 30), das derzeit von einem Forschungsverbund aus Münster entwickelt wird. Wie Impfstoffentwickler mit neuen intranasalen Impfstoffverstärkern die gewünschte Immun antwort künftig auswählen können, haben Forscher des Helmholtz-Zentrums für Infektionsforschung herausgefunden (vgl. S. 32). Im Sommer 2001 hat die US-Gesundheitsbehörde FDA ihren strategischen Plan „Advancement of Regulatory Science“veröffentlicht 1 . In diesem unterstreicht die Agentur vier Gebiete, in denen das Risiko für mikrobielle Kontamination in diversen produzierenden Industrien reduziert werden soll; eines davon ist die Reduktion des Risikos mikrobieller Verunreinigungen durch die Entwicklung „sensitiver, schneller Hochdurchsatz-Verfahren, um mikrobielle Kontaminationen zu detektieren, identifizieren und beziffern sowie ihren Nutzen bei der Einschätzung der Produktsterilität zu validieren“. Für die pharmazeutische Industrie heißt dies, die für die mikrobielle Qualitätssicherung (QA) und -Kontrolle (QC) benötigte Zeit zu verkürzen – sowohl bei der Reinraum-Validierung, der in-Prozess-Kontrolle als auch bei der finalen sterilen Produktformulierung. Eine neue von NanoLogix entwickelte Technologie bietet eine Lösung: Durch eine signifikante Verbesserung der zuverlässigen Kulturmethoden in Petrischalen wird das mikrobielle Wachstum schnell erkannt. Die neue, auf Nanoporen-Membranen basierende Methode verringert die Zeit, um mikrobielle Kontaminationen zu erkennen auf allen Stufen des pharmazeutischen Produktionsprozesses. Durch die NanoLogix-Technologie verkürzt sich die Zeit des Kulturnachweises zum Beispiel von Listeria spp und E. coli von 18 bis 24 Stunden auf nur 5 Stunden. Salmonellenwachstum kann sogar schon nach vier Stunden beobachtet werden. Abb. 1: Entfernen einer BNP-Membran vom Nähragar Die Verifikation steriler Bedingungen während des Produktsprozesses – ob durch aseptisches Prozessing oder Sterilisation – ist oft nach wichtigen Schritten erforderlich, wie dem Ansetzen von Lösungen, dem Bulk Transfer, Abfüllen der Ampullen etc. Wenn multiple Haltezeiten für die in-Prozess mikrobiologische Testung benötigt werden, kann dies den Produktionsprozess um Tage verlängern, was den effizienten Einsatz von Ausrüstung und Personal erschwert. Zwar können für die in-Prozess mikrobiologische Testung alternative Verfahren wie PCR und Durchflusszytometrie eingesetzt werden, die schneller sind als die Kultivierung. Aber sie sind nicht imstande, auch nur annähernd brauch- und belastbare Ergebnisse zu liefern. Dazu kommt, dass allein PCR-Tests eine 18-Stunden-Übernacht-Anreicherung benöti- 28 | 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 LABORWELT


Zellkultur Zellbiologie gen können. Das mag kurz erscheinen. Doch haben solche in-Prozess-Haltezeiten ernste Folgen für die pharmazeutische Industrie. Denn während des Produktionsprozesses werden solche Tests zu verschiedensten Zeiten auf der Stufe des Processings durchgeführt, und die Haltezeiten summieren sich und verlängern die Produktionszeit bis zum Endprodukt. Firmen können durch verlängerte Produktionszeiten an Wettbewerbsfähigkeit einbüßen, da eine kosteneffiziente Logistikkette essentiell für die Industrie ist. Mangel an Alternativen zur Kultur Da es nicht möglich ist, das Wachstum der Mikroorganismen zu beschleunigen, suchen pharmazeutische Unternehmen nach Verfahren, die schneller Ergebnisse liefern als die traditionellen mikrobiologischen Kulturmethoden. Die Poymerase-Kettenreaktion (PCR) liefert Ergebnisse binnen Minuten, allerdings erst nachdem die Assays einen 18-stündigen Anreicherungsprozess über Nacht durchlaufen haben. Dazu kommmt, dass ein PCR-Screening nur die Anwesenheit von DNA detektieren kann, dagegen nicht verwertbare Informationen über bakterielles Wachstum. Zudem sind nach der PCR in der Regel weitere PCRoder Kultur-basierte Verifikationsschritte notwendig, um festzustellen, ob den Prozess gefährdende Mikroorganismen präsent sind. Der Hauptnachteil der Durchflusszytometrie ist ihre geringe Durchsatzrate, was die effiziente Handhabung einer großen Probenanzahl ausschließt. Eine einfache schnellere Methode zur Kultivierung NanoLogix‘ fortgeschrittene Kulturtechnologie erfüllt die Forderung der FDA nach einem sensitiven Schnelltest. Die Methode liefert belastbare Kultivierungsdaten vier- bis 24mal schneller als die konventionelle Kultivierung, abhängig von Bakterium und genutztem Produkt. Die Technologie ermöglicht es QA/QS- Technikern, das Wachstum von Mikrokolonien wesentlich schneller zu sehen und diese zu identifizieren als mit traditioneller Petrischalen-Kultur, PCR oder Durchflusszytometrie. Obgleich das Verfahren derzeit nur in zwei Standard-Petrischalengrößen zur Verfügung steht, ist es grundsätzlich möglich, die Technologie in Well plate-Arrays für das Hochdurchsatz-Screening zu überführen. Das Funktionsprinzip Herzstück der BioNanoPore (BNP)-Methode von NanoLogix ist eine permeable Polymermembran, die sich zwischen zwei Agarschichten befindet. Die extrem dünne, durchsichtige Abb. 3: Prinzip der BFN-Technologie von NanoLogix Membran gestattet es den Mikroorganismen, für einige Stunden zu wachsen. Dann, nach einem Bruchteil der herkömmlichen Inkubationszeit, wird die Membran auf eine Färbeplatte transferiert. Kapillarkräfte transportieren das Färbemittel – eine HRP-konjugierte Antikörper- Lösung – durch die Membran und bringen es in Kontakt mit den Mikrokolonien. Nach 10 bis 15 Minuten Färbezeit können die Mikrokolonien detektiert und identifiziert werden. Bei der Testung eines parenteralen Produktes, ergab sich nach Filtration der „sterilen“ Lösung mit der BioNanoFilter (BFN)-Technologie eine Nachweissensitivität von einer Zelle pro Liter bei einer Nachweiszeit von vier bis sechs Stunden. Damit hat die NanoLogix-Technologie das Potential, Produktionszeiten durch Verkürzung von in-Prozess-Haltezeiten zu reduzieren. Das Verfahren lässt sich auf jeder Stufe des Produktionsprozesses kosteneffizient, verlässlich und mit angemessenem Durchsatz implementieren. Diverse Wissenschaftler, betrachten die Nanologix-Technology bereits als ‘neuen Goldstandard’ im Gebiet der Schnelldiagnostik 2 . Literatur [1] Pharma QBD. FDA Releases Strategic Plan for Advancement of Regulatory Science, August 18, 2011. http:// www.pharmaqbd.com/fda_strategic_plan_regulatory_science/ [2] Jonathan Faro, Allan Katz, Karen Bishop, Gerald Riddle, Sebastian Faro. “Rapid Diagnostic Test for Identifying Group B Streptococcus. American Journal of Perinatology. Thieme eJournals, August, 2011. Korrespondenzadresse Bret Barnhizer, CEO NanoLogix, Inc. 843 North Main Street Hubbard, OH 44425 USA Tel.: +1-(0)330-534-0800 Fax: +1-330-534-0826 LABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 | 29


Zellbiologie Durchflusszytometrie READYFlow – Lange Leuchtdauern für schnelle Flow Cytometry-Analysen Dr. Peter Klauth, Hochschule Niederrhein, Krefeld; Dr. Wolfgang Göhde, Quantum Analysis GmbH, Münster; Martin Gründkemeyer, Technologieförderung Münster GmbH, Münster (Westfalen) Durchflusszytometer (Flow Cytometer, FCM) erlauben einen schnellen Nachweis und die Analyse von biologischen Zellen und anderen mikroskopischen und submikroskopischen Partikeln, die mit hoher Geschwindigkeit an einem Lichtstrahl vorbeifließen. Das 1968 entwickelte Messprinzip der fluoreszenzbasierten Durchflusszytometrie wurde anfangs für die Untersuchung eukaryotischer Zellen und ihrer Zellteilung verwendet. Durch international immer weiter entwickelte biochemische Verfahren und eine zunehmend einfachere Handhabung wird das Messverfahren inzwischen auf zahlreichen Gebieten eingesetzt: Medizinische und zellbiologische Grundlagenforschung, Routinediagnostik in Kliniken, Nanopartikel-Analysen und mikrobiologische Prozessüberwachung in der Lebensmittelproduktion sind nur einige Beispiele hierfür. Durch einen neuen Ansatz auf der Basis von biochemischen Sonden mit langer Leuchtdauer sollen nun die Präzision und Anwendungsmöglichkeiten im Rahmen eines vom BMWi geförderten Forschungsprojekts deutlich erweitert werden. Abb. 2: Differenziertes Anfärben von Zellen. Autofluoreszenz (weiße Sterne) kann die Fluoreszenz der spezifischen Farbstoffsonden (mit grünen und orangen Sternen) störend überlagern. Nach Messzeiten von wenigen Sekunden bei bis über 10.000 Zellen/Sek. können so Proben mit hoher statistischer Sicherheit analysiert werden. Präziser Nachweis von Bakterien – neue Farbstoffklassen für FCM Die Durchflusszytometrie ist ein Verfahren zur schnellen automatisierten Analyse der optischen Eigenschaften einzelner Partikel oder Zellen. Eine Probensuspension strömt durch eine hochpräzise optische Küvette (vgl. Abb. 1). Dabei wird der Probenfluss so fokussiert, dass die Zellen einzeln und nacheinander den Messbereich passieren. Zuvor in einem Präparationsschritt biochemisch an Zelloberflächen gekoppelte spezifische Leuchtsonden (Marker) werden durch einen Lichtstrahl angeregt. Mit Fluoreszenzfarbstoffen gekoppelte monoklonale Antikörper sind in der FCM weit verbreitete Sonden, mit denen Zellen anhand ihrer spezifischen Zell- Oberflächen-Antigene erkannt und voneinander unterschieden werden können. Für jede Zelle werden Streu- und Fluoreszenzsignale von optischen Detektoren aufgenommen und mit schnellen Computerprogrammen ausgewertet und gezählt. In den gesammelten Daten lassen sich unterschiedliche Gruppen von Zellen voneinander differenzieren und ihre Zellzahl bestimmen. In der Durchflusszytometrie können gleichzeitig mehrere Fluoreszenzfarbstoffe mit unterschiedlichen Emissionsspektren analysiert werden. Dafür werden in mehreren optischen Spektralbereichen (z.B. im Grünen und Orangen) Fluoreszenzintensitäten analysiert. Mehrere Zellgruppen lassen sich dadurch in einer Messung voneinander unterscheiden (vgl. Abb. 2). Bei dem Nachweis von Bakterien sollen möglichst kleine Zellzahlen schnell und sicher nachgewiesen werden. Häufig wird aber ein präziser und schneller Nachweis kleiner Zellzahlen gerade bei Mikroorganismen dadurch erschwert, dass die Lichtsignale der Fluoreszenzsonden durch eine natürliche Fluoreszenz (Autofluoreszenz) anderer Substanzen in der Probe oder in der Zelle störend überlagert werden. Eine sichere Interpretation der Messergebnisse ist dann oft mit hohem Aufwand verbunden oder sogar unmöglich. Dieses Problem soll durch einen neuen Ansatz auf Basis von für die FCM neuen Farbstoffklassen und auf Grundlage zeitlicher Auflösung der Lichtsignale gelöst werden. Eine neuartige Kombination von lang leuchtenden Farbstoffsonden und angepasster Messgeometrie soll „saubere“ Messdaten liefern und damit das Einsatzspektrum von Flow Cytometern signifikant erweitern. Zeitaufgelöstes Messen für präzise Analysen Abb. 1: Messprinzip der Durchflusszytometrie. Lichtsignale (Streulicht/side/forwardscatter und Fluoreszenz/fluorescence) einzelner Zellen in einer Probensuspension werden durch eine Lichtquelle (Laser oder LED) angeregt, einzeln registriert und analysiert. Die spektrale Differenzierung von verschiedenen Farbstoffen in der Durchflusszytrometrie ist Stand der Technik. Jedoch ist dieses Verfahren wegen störender spektraler 30 | 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 LABORWELT


Durchflusszytometrie Zellbiologie Überlappungen limitiert: Erstens durch die Autofluoreszenz und zweitens wegen mehrerer Zielfarbstoffe untereinander, so dass eine präzise Unterscheidung in bestimmten Fällen nicht möglich ist. Um dieses Problem zu umgehen, sollen anstelle der üblichen Fluoreszenzsonden nun Phosphoreszenzmarker mit sogenannten Selten-Erd-Farbstoffen eingesetzt werden. Durch diese Leuchtstoffe lässt sich eine Emissionsstrahlung erzeugen, deren Dauer im Bereich von Millisekunden die der Autofluoreszenz um typischerweise mehr als das 1.000-fache übersteigt. Das Prinzip ist unter anderem auch bekannt bei der Phosphoreszenz von Ziffernblättern in Armbanduhren – diese leuchten noch länger nach. Das gesamte Leuchtsignal jedes Partikels (Total Luminescence, vgl. Abb. 3) wird erst nach Abklingen der störenden Autofluoreszenz (Autofluorescence) aufgenommen, was eine Analyse ohne störende Hintergrundemissionen ermöglicht. Durch die Erweiterung der Messergebnisse um die Dimension Zeit ist bei diesem Vorgehen eine deutlich höhere Sensitivität gegenüber bestehenden Verfahren und eine einfachere Auswertung der eigentlich komplexen Datenausgabe eines Durchflusszytometers zu erwarten. Eine weitergehende Analyse basiert auf der für verschiedene Farbstoffe charakteristischen Abklingkurve. Wenn sich die überlagernden Phosphoreszenz-Abklingzeiten der Farbstoffe (Abb. 3 Phosphorescence 1 & 2) ausreichend voneinander unterscheiden, können ihre Daten aus einer zeitaufgelösten Analyse der Abklingkurve (z.B. durch multi-exponentiellen Fit) voneinander separiert werden. Bisher können Phosphoreszenzmarker in der Flow Cytometry nicht genutzt werden, da die lange Abklingzeit zum üblichen Messprinzip konträr ist. Lichtsignale von Zellen lassen sich üblicherweise nur in einem sehr kurzen Messfenster von wenigen Mikrosekunden detektieren, in dem sie sich im Fokus des Lasers befinden. Das „Nachleuchten“ über Millisekunden kann in bestehenden Geräten systembedingt nicht aufgenommen werden. Die Zellen oder Partikel verweilen dafür zu kurz im Messbereich. Es gibt wohl einige Ansätze für zeitaufgelöstes Messen, zum Beispiel durch zwei hintereinander geschaltete Messfenster 1 . Dieser Ansatz ist jedoch auch zeitlich sehr eingeschränkt und bisher nicht zur praktischen Anwendung gekommen. Ein Durchflusszytometer, das Abklingkurven solch lang leuchtender Phosphoreszenzmarker analysieren kann, benötigt eine spezielle, der Anregungsstelle nachgelagerte Messstrecke, die derzeit in keinem am Markt befindlichen Gerät vorhanden ist. Die Idee ist nun, durch eine optische Nachführung mit einem Kippspiegel das Phosphoreszenzsignal über einen längeren Zeitraum zu sammeln und zu detektieren (vgl. Abb. 4). Dabei soll der Fokus durch optische Zeilensensoren und einen Kippspiegel, ähnlich denen in DLP-Projektoren, nachgeführt werden. Durch die deutlich verlängerte Messstrecke wird eine Zelle während der gesamten Abklingzeit verfolgt und eine Abklingkurve aufgenommen. Forschungsprojekt READYFlow Quantum Analysis entwickelt und produziert portable Durchflusszytomenter. Das iNano Institut der Hochschule Niederrhein hat sich auf die Verwendung von Selten-Erd-Farbstoffen in umweltanalytischen Diagnoseverfahren spezialisiert. Das iNano hat ein für die Anwendung geeignetes Messverfahren zum Patent angemeldet und stellt sein diesbezügliches Know-how zur Verfügung. Gemeinsam mit der Fachhochschule Münster, welche seit vielen Jahren Phosphoreszenzfarbstoffe und -marker erforscht, wurden bereits zahlreiche Leuchtstoffsonden entwickelt. READYFlow soll als innovatives Verfahren der Durchlusszytometrie im Rahmen einer vom BMWi geförderten Zusammenarbeit innerhalb der nächsten zwei Jahre erforscht Abb. 4: READYFlow-Kippspiegel-Prinzip: Einzelne Zellen bzw. ihr Lichtsignal werden nach Durchlaufen des Anregungslasers mithilfe einer Kombination aus optischem Zeilendetektor und Kippspiegel während der Leuchtdauer verfolgt. und zur Marktreife entwickelt werden. Dabei werden sowohl eine neue Gerätekomponente als auch passende Selten-Erd-Farbstoffe entwickelt. Neue Farbstoffsonden werden für die neue Gerätekomponente und Schlüsselanwendungen „maßgeschneidert“. Das neue Produkt soll präzise, mobil, einfach zu bedienen und preiswert sein, um eine tiefe Durchdringung im Diagnostik- und Analysemarkt zu ermöglichen. Einsatzorte wären zum Beispiel der schnelle Nachweis von MRSA (Multi-resistenter Staphylococcus aureus) während der Patientenaufnahme im Krankenhaus oder die Analyse von Blutproben in einer Facharztpraxis. Derzeitige Durchflusszytometer sind in beiden Fällen zu teuer und arbeitsintensiv in der Dateninterpretation. Die 2011 aufgetretene Welle an EHEC-Infektionen (Enterohämorrhagische Escherichia Coli) zeigt die Notwendigkeit mobiler, preiswerter und vor allem schneller Testsysteme. Korrespondenzadresse Martin Gründkemeyer Netzwerk Oberfläche NRW Technologieförderung Münster GmbH Mendelstraße 11 D-48149 Münster Tel.: +49-(0)251 980–1125 Fax: +49-(0)251 980-31125 gruendkemeyer@technologiefoerderungmuenster.de www.technologiefoerderung-muenster.de Abb. 3: Prinzip der innovativen FCM-Phosphoreszenz-Analyse (schematisch, unterschiedliche vertikale Skalierungen). Die Lumineszenz-Abklingkurve wird erst nach Abklingen des Autofluoreszenzsignals (außerhalb des schattierten Bereichs) aufgenommen. www.laborwelt.de LABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 | 31


Zellbiologie Paperwelt Adjuvantien-Toolbox für die gezielte Steuerung der Immunantwort Zygmunt BM, Weissmann SF, Guzman CA. (2012): NKT Cell Stimulation with alpha-Galactosylceramide Results in a Block of T H 17 Differentiation after Intranasal Immunization in Mice, PLoS One. 2012;7(1):e30382 Die intranasale Verabreichung von modernen Subunit-Impfstoffen gegen Infektionserreger gilt als sehr aussichtsreich, stellt die Forscher aber auch vor einige Schwierigkeiten. So müssen die Impfstoffe aufgrund der geringen Aktivierung von Immunantworten mit einem Immunstoffverstärker versetzt werden. Ein weiteres Problem war bislang, dass die intranasale Impfung stets von der Aktivierung einer sogenannten T H 17-vermittelten Immunantwort begleitet wurde. Die dadurch ausgelöste, teils überschießende Immunantwort kann bei vielen Impfungen eher hinderlich als erwünscht sein. Die Gruppe um Carlos Guzmán vom Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung in Braunschweig hat jetzt den Mechanismus aufgeklärt, mit dem ein spezieller Impfstoffverstärker, das pegylierte a-Galactosyl-Ceramid (a-GalCerPEG) die T H 17-vermittelte Immunantwort selektiv abschaltet. a-GalCerPEG hemmt die Induktion von T H 17-Zellen , indem es NKT-Zellen dazu bringt, die Botenstoffe Interferon-g (IFNg) und vor allem Interleukin-4 (IL-4) auszuschütten. Die Kombination a-GalCerPEG mit anderen Adjuvantien bei der intranasalen Impfung bietet somit erstmals die Möglichkeit zu steuern, welche Art von Immunantwort bei der Impfung gefördert wird – die T H 2-vermittelte Antikörperbildung gegen extrazelluläre Erreger oder die T H 1-vermittelte Abwehr durch Killerzellen bei intrazellulären Erregern. Das gezielte Zu- oder Abschalten der T H 17-unterstützten Immunantwort würde Impfstoffherstellern die Gelegenheit bieten, Impfstoffe mittels einer Adjuvantien-Toolbox für die jeweilige klinische Anwendung maßzuschneidern. Carlos A. Guzmán Carlos A. Guzmán leitet die Abteilung „Vakzinologie und Angewandte Mikrobiologie“ am Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung (HZI) in Braunschweig. Der Mediziner ist APL-Professor an der Medizinischen Hochschule Hannover und Gast- Dozent für die Promovierenden der Fachrichtung Biotechnologie an der Universität von Catania (Italien). Nach dem Studium der Medizin an der Nationalen Universität Rosario (1981) und Facharztabschluss in medizinischer Bakteriologie (1986) in Argentinien sowie Promotion zum MD und PhD in Italien übernahm Guzmán 1994 die Leitung der Forschungsgruppe Vakzinologie an der Gesellschaft für Biotechnogische Forschung (GBF) in Braunschweig. 2005 wurde er zum Leiter der neuen Abteilung Vakzinologie am HZI. LABORWELT: Was sind ihre wichtigsten Ergebnisse Guzmán: Wir haben einen über die Nase verabreichbaren Impfstoffverstärker entwickelt, der eine maßgeschneiderte Immunisierung gegen bestimmte Erreger ermöglicht. Grundsätzlich wird bei intranasalen Impfstoffen eine sogenannte T H 17-unterstützte Immunreaktion hervorgerufen. Dies ist meistens erwünscht, da sie die Immunreaktion gegen Bakterien fördert, kann aber auch zu unerwünschten Entzündungsreaktionen führen. Deshalb ist es wichtig die Stimulierung der T H 17-Zellen regulieren zu können, damit es keine unerwünschten Nebenwirkungen gibt. Uns ist es nun gelungen den Mechanismus aufzuzeigen, mit dem a-GalCerPEG die T H 17- vermittelte Immunantwort ausschaltet und zugleich in Impfstoffformulierungen die Produktion von Antikörpern und Killerzellen stimuliert. Setzt man a-GalCerPEG darüber hinaus zusammen mit anderen Adjuvantien ein, die die von T H 2-Zellen unterstützte Bildung von Antikörpern gegen extrazelluläre Erreger oder die von T H 1-Zellen vermittelte Aktivierung von Killer- Zellen (CTL) gegen intrazelluläre Pathogene fördern, lässt sich die Immunantwort maßschneidern, indem die T H 17-Komponente zu- oder abgeschaltet wird. Auf diese Weise erhalten wir eine Toolbox, die den Einsatz des optimal für einen klinischen Zweck geeigneten Impfstoffverstärkers ermöglicht. LABORWELT: Wo liegt die biologische und medizinische Relevanz Ihrer Arbeit Guzmán: Die meisten Adjuvantien basieren im Moment auf Aluminiumsalzen, und es gibt zur Zeit nicht viele Alternativen – schon gar keine, die eine gezielte Steuerung der Immunantwort gestatten. Dazu kommt: Fast alle Adjuvantien, die wir haben, sind auf Parenteralimpfstoffe ausgelegt, welche man spritzen muss. Das ist in bestimmten Ländern, wo Kreuzkontaminationen auftreten können, ein Problem. Bislang gibt es kein zugelassenes Adjuvans, das gut über die Schleimhaut funktioniert und so für viele Zwecke nützlich wäre. Ein Adjuvans allein nutzt natürlich nichts. Wir testen und validieren daher das a-GalCerPEG mit Partnern in verschiedenen Impfstoffformulierungen, vor allem gegen virale Humanpathogene. Zudem haben wir in präklinischen Versuchen gesehen, dass a-GalCerPEG helfen kann, die nachlassende Immunantwort im Alter (Immuns eneszenz), zu verbessern. Das ist klinisch bedeutend, da Impfungen nur bei einem kleinen Teil der älteren Bevölkerung wirken, da bei diesen die Immunreaktion nicht mehr so ausgeprägt ist wie bei den Jüngeren. Dies erforschen wir aktuell im BMBF-geförderten Projekt GERONTOSHIELD. LABORWELT: Wie geht Ihre interessante Forschungsarbeit nun weiter Guzmán: Hinsichtlich möglicher Anwendungen von a-GalCerPEG in Impfstoffen treiben wir die Zusammenarbeit mit Industrieunternehmen und akademischen Gruppen voran. Zudem forschen wir weiter an der Aktivierung des Immunsystems älterer Menschen. Schließlich wollen wir den Wirkmechanismus des neuen Adjuvans noch detaillierter verstehen. Bisher wissen wir, dass die T H 17-Hemmung über Natürliche Killer-T-Zellen (NKT-Zellen) vermittelt wird. Wir sehen eine Stimulierung von NKT-Zellen, die bestimmte Zytokine ausschütten. Diese Zytokine sind kritisch, um ein bestimmtes Milieu im Rahmen der Antigenpräsentation zu erzeugen; so verhindern beispielsweise IL-4 und IFNg die Bildung von T H 17-Zellen. 32 | 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 LABORWELT


Imaging Zellbiologie Zellteilungsdauer im High-Content-Screening bestimmen Dr. Andreas Pippow 1 , Stefan Borbe 1 , Sebastian Räse 2 , Dr. Stefan Prechtl 2 , Prof. Dr. Thomas Berlage 1 ; 1 Fraunhofer-Institut für Angewandte Informationstechnik FIT, Schloss Birlinghoven, Sankt Augustin; 2 Bayer Healthcare Pharmaceuticals, Global Candidate Generation & Exploration Screening, High Content Analysis Bei der Entwicklung neuer Wirkstoffe für die Krebstherapie sind bildgebende Verfahren nicht mehr wegzudenken. Eines dieser Verfahren ist das High-Content-Screening. Dabei kann man herausfinden, ob bestimmte Substanzen die Teilung von Krebszellen und damit das Wachstum von Tumoren verringern oder sogar verhindern. Automatisierte Mikroskope generieren bei der Aufnahme sich teilender Zellen riesige Datenmengen, die in zeitaufwändigen Prozessen analysiert werden müssen. Die Etablierung dieser Experimente und die Auswertung der Bilddaten dauert dabei oft länger als die eigentliche Aufnahme der Bilder am Mikroskop. Deshalb ist es besonders wichtig, neue Software-Strategien zu entwickeln, die einerseits die Assay-Etablierung vereinfachen und gleichzeitig große Datenmengen in kurzer Zeit verarbeiten können. Krebs ist die zweithäufigste Todesursache in Deutschland. Auch wenn die Ausprägungen und Überlebensraten bei den verschiedenen Krebsarten sehr unterschiedlich sein können, haben alle Erkrankungen eines gemeinsam: Eine unkontrollierte Zellvermehrung führt zu Gewebewucherungen weit über die Organgrenzen hinaus. Die zelleigenen Mechanismen zur Wachstumskontrolle sind umprogrammiert, wodurch die Krebszellen potentiell unsterblich werden. Lösen sich einzelne Zellen aus dem Gewebeverband des Tumors, kommt es zur Metastasierung, und die Überlebenswahrscheinlichkeit des Patienten sinkt rapide. Um den Krebs möglichst rasch und vollständig zu bekämpfen, werden neue, noch spezifischere und besser wirkende Medikamente entwickelt. gerade befindet. Um dies zu optimieren, müssen unter Umständen Verfahren angewendet werden, die eine Anreicherung der Zellen in der Zellteilung bewirken. Diese Verfahren sind nicht unkritisch, weil dadurch Zellen eventuell geschädigt werden oder ihre Eigenschaften sich verändern. Beides kann den Effekt von Wirkstoffen verfälschen. Neue Verfahren gehen einen anderen Weg: Beim Live-Cell-Imaging wird das Verhalten lebender Zellen über ihren gesamten Lebenszyklus aufgezeichnet. Solche Experimente entsprechen vielmehr der physiologischen Situation im Körper. Sie ermöglichen damit eine sehr viel detailliertere und qualifiziertere Aussage zum Effekt der untersuchten Wirkstoffe. Diese Art dynamischer Studien an lebenden Zellen sind grundsätzlich nur mit automatisierten Verfahren im höheren Durchsatz realisierbar. Ein computergesteuertes Mikroskop nimmt Bildsequenzen der lebenden Zellen auf, die anschließend von verschiedenen Bildanalysealgorithmen ausgewertet werden. Dies hat nennenswerte Vorteile gegenüber manuellen Verfahren: Ein Mensch ist nie vollständig objektiv bei der Analyse von Bilddaten. In der Biologie existieren häufig Grenzfälle, die mit automatisierten Verfahren trotzdem nach eindeutigen Kriterien bewertet werden können. Dies setzt voraus, dass die Bilddaten mit einer objektiven und robusten Bildanalysesoftware verarbeitet werden können. Nur so werden valide, statistisch abgesicherte Resultate möglich, die eindeutige Schlussfolgerungen zulassen. Eine Entwicklung des Fraunhofer FIT für diese Anforderungen ist die Software Zeta. Sie ist darauf ausgerichtet, den Flaschenhals der Analyse von High-Content-Screening-Daten zu verringern und den gesamten Prozess vom Experiment zum Ergebnis deutlich zu beschleunigen. Das Projekt Zeta wurde vor ca. 15 Jahren ins Leben gerufen und bereits bei einigen unterschiedlichen Fragestellungen eingesetzt [1,2] . Bildanalyse Für das High-Content-Analyse-Team von Bayer Healthcare Berlin hat das Fraunhofer FIT eine neue Version der Software Zeta entwww.laborwelt.de Wirkstoffscreening Bei der Suche nach neuen Krebsmedikamenten werden Wirkstoffe auf lebende Zellen appliziert. Beim Wirkstoff-Screening geschieht dies viele Tausend- bis Millionen- Mal in verschiedenen Ansätzen. Wirkstoffe, die die Teilung von Krebszellen verhindern und gleichzeitig körpereigene Zellen unberührt lassen, haben dabei das Potential, ein Medikament zu werden. Bei bisherigen Versuchsansätzen geschah dies mit sogenannten Single-Time-Point-Assays. Die Zellen werden mit den Wirkstoffen inkubiert, zu einem bestimmten Zeitpunkt fixiert und anschließend gefärbt. Dabei hat man nur bedingt Kontrolle darüber, in welcher Phase sich die Mehrzahl der beobachteten Zellen Abb. 1: Graphische Oberfläche von Zeta. Der Benutzer sieht nur die Optionen, die für die Analyse der Daten nötig sind. LABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 | 33


Zellbiologie Imaging wickelt. Sie kommt besonders gut mit großen Datenmengen zurecht, wie sie bei präklinischen Wirkstoffuntersuchungen anfallen. Ziel ist es, die Teilung von lebenden Krebszellen zu beobachten und zu quantifizieren. Eine besondere Herausforderung an die Bildanalyse besteht darin, die einzelnen Phasen der Teilung zu differenzieren und sie miteinander in zeitlichen Bezug setzen zu können. Die Zel- Daten sich teilender Zellen optimiert. Der Benutzer kann sich während der Arbeit mit der Anwendung nacheinander durch die Plug-Ins klicken. Bewegungsartefakte, die durch kleine Verwackelungen des Mikroskoptisches während der Bildaufnahme entstehen, werden durch das Registrierungs-Plug-In eliminiert. Dieses richtet die einzelnen Bilder einer Zeitserie neu zueinander aus. Der Prozess der Registrierung ist für jede Art von Live-Cell-Imaging-Daten erforderlich. Mit dem Vordergrund-Hintergrund-Plug- In werden die Zellobjekte vom Hintergrund getrennt. An dieser Stelle bietet Zeta ein interaktives Verfahren an. Der Benutzer markiert mit der Maus einige Zellen und Hintergrundregionen. Die Software lernt anhand dieser Beispiele, wie Zellen vom Hintergrund unterschieden werden können und gibt direkt ein visuelles Feedback. Der Anwender sieht, welche Regionen Zeta als Vordergrund und welche als Hintergrund klassifiziert hat, und kann diese Erkennung verbessern, indem er Beispiele hinzufügt oder entfernt. Die Software wird auf diese Weise trainiert, die Zellen vom Hintergrund bestmöglich zu trennen. Diese Trainierbarkeit ist ein Schlüsselkonzept der Software, weil dadurch die Flexibilität erhöht wird. Das Segmentierungs-Plug-In, ermöglicht die Trennung von Zellclustern in einzelne Zellobjekte. Dadurch ergibt sich die Möglichkeit, jede einzelne Zelle morphologisch zu beschreiben. Das Klassifikations-Plug-In ist für die Sortierung sich teilender Zellen besonders wichtig. Mit diesem Plug-In wird jede einzelne Zelle einer bestimmten Zellzyklusphase zugeordnet. Durch die integrierte Trainierbarkeit genügt es, einige Zellen beispielhaft mit einem Label zu versehen. Diese werden anschließend auf alle entsprechenden Zellen der Bildserien übertragen. Mit dem Tracking-Plug-In wird ein Zelltracking innerhalb der aufgenommenen Zeitserie durchgeführt. Hierbei wird für jede Zelle eine Historie angelegt, der zu entnehmen ist, wie lange sich eine Zelle in einer Zellzyklusphase befindet. Zudem bietet Zeta ein Evaluationsmodul an, mit dem die Informationen der einzelnen Analyse-Plug-Ins integriert werden und in Form einer csv-Datei exportiert werden können. Ausblick Abb. 2: Objekterkennung in Zeta (Konturen) und Klassifizierung nach den Zellteilungsphasen (Farben) len müssen nicht nur als Objekte erkannt und den einzelnen Zellteilungsphasen zugeordnet werden, auch das Erkennen der zeitlichen Abfolge ist wichtig. Für jede Zelle wird also eine Historie angelegt. Besonders großen Wert ist bei der Entwicklung von Zeta auf die einfache Bedienbarkeit, die Integrierbarkeit in bestehende Datenmanagementsysteme und die Performance gelegt worden. Mit wenigen Mausklicks wird die Software darauf trainiert, bestimmte Zellmuster zu erkennen und zu klassifizieren. Dadurch wird sie sehr flexibel und kann auch für andere biologische Fragestellungen eingesetzt werden. Der Zeta-Workflow Eine Besonderheit von Zeta ist seine Plug- In-Struktur. Bei Arbeitsbeginn werden über eine Konfigurationsdatei bestimmte, für die Analyse notwendige Module in die Benutzeroberfläche geladen. Im Falle der Krebszellen sind folgende Plug-Ins sinnvoll: Registrierung, Vordergrund- Hintergrund-Erkennun, Segmentierung, Klassifikation, Zelltracking und Evaluation. Auswahl und Reihenfolge dieser Plug-Ins sind für die Analyse von Live-Cell-Imaging- Automatisierte, bildgebende Verfahren sind etablierte Hilfsmittel für die Suche nach neuen Wirkstoffen gegen Krebs. Oft ist dabei die Auswertung der generierten Daten ein Engpass innerhalb des Arbeitsprozesses. Die hier vorgestellte Software soll den Analyse-Workflow deutlich vereinfachen und beschleunigen. Während eines automatisierten Screenings können derzeit etwa bis zu 50.000 Bilder pro Tag anfallen. Idealerweise ist der Algorithmus für die Bilderkennung so schnell, dass er in der gleichen Zeit fertig ist. Rechnerisch bleiben also weniger als zwei Sekunden pro Bild für die Analyse. In ersten Tests konnte Zeta diesen Wert mit einem Server mit 20 Prozessoren und 20 GB Arbeitsspeicher erreichen. Die Software-Architektur ist so angelegt, dass mit größeren Rechnern auch noch höhere Geschwindigkeiten erzielt werden können. Gegenstand der Forschung bleibt die Integration der Daten. Literatur [1] Malthan D, Huchler R, Brandenburg A, Thielecke H, Hildebrandt C, Zühlke D (2008). Association for Laboratory Automation, Abstracts: pp.74 [2] Scheede S, Herpens A, Burmeister F, Oltrogge B Saenger K, Schmidt-Rose T, Schreiner V, Wenck H, Knieps T, Berlage T (2011) Skin Research and Technology: 17(2):186-195 Korrespondenzadresse Dr. Andreas Pippow Fraunhofer-Institut für Angewandte Informationstechnik FIT Schloss Birlinghoven, 53754 Sankt Augustin Tel.: +49-(0)2241-14-1524 Fax: +49-(0)2241-144-1524 andreas.pippow@fit.fraunhofer.de www.fit.fraunhofer.de 34 | 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 LABORWELT


Zellbiologie Expertenpanel Zellbasierte Tox-Assays Der Bedarf an in vitro-Toxizitätstests ist hoch – nicht zuletzt seitdem politische Entscheidungsträger den Ersatz von Tierversuchen bei der Substanztestung proklamieren. Der Fortschritt läuft dagegen langsamer als die politischen Absichtserklärungen. Denn die Test-Zulassung braucht im Durchschnitt 10 Jahre und verschlingt hohe Kosten. Auch wenn es nach Experteneinschätzung nicht absehbar ist, ob und wann komplexe systemische Endpunkte, wie die Reproduktionstoxizität, die Toxizität bei wiederholter Gabe/Langzeittoxizität oder Toxikokinetik, mit in vitro-Tests messbar sein werden, laufen Versuche an, die Paramenter anhand von omics-Daten zu modellieren, wie etwa im von Jürgen Hescheler koordinierten Detective-Projekt oder dem Human Toxome Project. der verschiedenen Technologien können Biomarker mit Vorhersagekraft für humane Toxizität in vitro entwickelt werden. Basierend auf integrativer statistischer Analyse, systematischer Überprüfung und Korrelation mit in vivo-relevanten Daten, werden spezifische, sensitive und prädiktive Biomarker entwickelt. Die Definition genereller, relevanter humaner Toxizitätspathways für unterschiedliche Organsysteme eröffnet schließlich die Möglichkeit eines systemischen Ansatzes der Toxizitätstestung. Thomas Hartung Prof. Dr. Dr. med Thomas Hartung, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health, Baltimore & Univ. Konstanz LABORWELT: Welche Fortschritte gibt es bei in vitro-Toxizitätstests auf Basis von Metabolomanalysen Hartung: Metabolomics ist auf dem Vormarsch in der Toxikologie. Von den gängigen Omics-Technologien ist sie am nächsten am Phänotyp, also den tatsächlich stattfindenden Veränderungen. Während wir mit 22.000 Genen und ihren Transkripten oder mehr als einer Million Proteinen umgehen müssen, gibt es nur wenige Tausend Metabolite, die wir recht gut inklusive ihrer metabolischen Verknüpfungen kennen. Insbesondere die Massenspektriebasierten Methoden der Metabolomics haben in den letzten Jahren enorme Fortschritte bezüglich Standardisierung und Sensitivität gemacht, und die Kosten einer Einzelanalyse sind relativ niedrig. Es wundert deshalb nicht, dass die Methode zunehmend in der Toxikologie genutzt wird. Pionierarbeiten bei BASF haben mit Kurzzeit-Tierversuchen für rund 500 Chemikalien gezeigt, dass sich typische Signaturen von Metaboliten-Veränderungen für eine ganze Reihe von toxischen Effekten im Blut nachweisen lassen. Dies wird bereits für eine biologische Gruppierung von Substanzen für Testungen im Rahmen der von der EU- Chemikalienrichtlinie REACH vorgeschriebenen Substanztestung eingesetzt und kann vermutlich Effekte in Langzeit-Versuchen vorhersagen. Auch Zellkulturen kommen zunehmend zum Einsatz – wir haben bereits 2008 den Einsatz für Entwicklungsstörungen des Gehirns beschrieben, was jetzt von der FDA in unserem Labor gefördert wird. Stemina in Madison (USA) hat ganz ähnlich humane embryonale Stammzellen mit Metabolomics kombiniert und arbeitet mit der US EPA zusammen, um teratogene Effekte vorherzusagen. Zudem gibt es große Erwartungen, dass Metabolomics in vitro bei der Identifizierung von Toxiziäts- Pathways helfen kann, wie im NIH-geförderten Human Toxome Project angestrebt. Wir haben gerade mit BASF einen Workshop in Berlin veranstaltet, der die enormen Möglichkeiten dieser Technologie beleuchtete, aber auch noch zu meisternde Herausforderungen gezeigt hat. Ende des Jahres machen wir etwas ähnliches in den USA. Jürgen Hescheler Prof. Dr. Jürgen Hescheler, Direktor des Instituts für Neurophysiologie an der Universität zu Köln LABORWELT: Wie lassen sich komplexe Endpunkte künftig in vitro testen Hescheler: Die Grundlage innovativer in vitro Toxizitätstests ist die Entwicklung von robusten, zuverlässigen, sensitiven und spezifischen Biomarkern. Dabei ermöglicht die systematische Auswertung von komplementären funktionellen und „-omics“ Technologien, einschließlich High-Content und High-Throughput Screening Technologien, die Identifizierung und Untersuchung humaner Biomarker in zellulären Modellen. Während funktionelle Parameter Einblicke in die Wirkung von Schadstoffen auf spezifische Zellfunktionen geben, liefern „-omics“-Technologien Informationen zur gesamten zellulären Situation auf molekularer Ebene. Die Auswirkungen von Wirkstoffen auf Epigenetik und microRNA Expression versprechen unser Verständnis von toxischen Wirkmechanismen vertiefen zu können. Diese beiden Parameter haben sich als kritisch für das Verhalten der Zelle herausgestellt und es gilt nun, zu evaluieren, inwiefern die Anwendung von Chemikalien Zellen auf dieser Ebene beeinflussen. Durch Kombination und anschließende Integration Dirk Dressler Dr. Dirk Dressler ist leitender Mitarbeiter bei der BioTeSys GmbH und zuständig für die Auftragsforschung in vitro- Wirknachweise. LABORWELT: Welche Fortschritte gibt es bei der Automation der in vitro-Genotoxizitätstestung Dressler: Die in vitro-Prüfung einer Substanz auf genotoxischer Substanzeigenschaften erfolgt zur Zeit durch eine Kombination von verschiedenen Testverfahren, wobei jedoch z.T. falsch positive Aussagen auftreten. Der FADU-Assay (Fluorimetric detection of Alkaline DNA Unwinding) bietet hier neue Möglichkeiten. Er ist automatisiert einsetzbar und zeichnet sich durch eine hohe Sicherheit und eine einfache, schnelle und robuste Durchführung aus. Neben bereits etablierten Zelllinien werden nun auch komplexe Gewebemodelle als Testgrundlage etabliert. Mit dieser Technologie können DNA Strangbrüche und DNA Repair getrennt erfasst werden. Wichtiges Kriterium ist dabei, dass die Einwirkzeit der Testsubstanzen sehr variabel (von sehr kurz bis lang) gewählt werden kann. So ist es erstmals möglich beide Prozesse in sensitiver und reproduzierbarer Weise zuverlässig zu detektieren. Es können wie gezeigt DNA Strangbrüche in peripheren Blutlymphocyten nachgewiesen werden, die von verschiedensten Chemikalien hervorgerufen wurden. Chemikalien ohne genotoxisches Profil fungierten als Negativ- Kontrolle. Zur Zeit wird dieses der FADU-Assay bei der Bewertung möglicher genotoxischer Eigenschaften von Nanopartikeln geprüft. So kann die Kombination von intelligentem Assay und Automatisierung Grenzen der Analytik erweitern und mehr Sicherheit in der Bewertung erreicht werden. www.laborwelt.de LABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 | 35


Branche Labormarkt im Umbruch Qiagen: Auf der Suche nach Wachstumstreibern Dr. Patrick Dieckhoff, BIOCOM AG Milliardenschwere Übernahmen sind gang und gäbe im Labormarkt. Grund genug, in dieser LABORWELT-Serie einen Blick auf die Player, ihre Strategien und Deals zu werfen. Klar ist: Elefantenhochzeiten bleiben an der Tagesordnung. Die Preise bleiben hoch, genauso wie die Wahrscheinlichkeit, dass sich der Labormarkt in zehn Jahren völlig anders darstellen wird als heute. Die Qiagen NV hat sich in den vergangenen Jahren durch Übernahmen selbst transformiert. Früher ausschließlich als Laboranbieter bekannt, ist das Unternehmen heute ein Spezialist für Molekulardiagnostik und personalisierte Medizin. Diese Wachstumsbereiche müssen Schwächen im Portfolio der Hildener ausgleichen. Qiagen in Zahlen: Umsatz: 1,17 Mrd. US-$ Gewinn (operativ): 319,6 Mio. US-$ Umsatzrendite: 27 % F&E-Investiton: 12 % des Umsatzes Börsenwert: 2,68 Mrd. Euro (Stichtag 6.3.) Mitarbeiter: 3.600 CEO: Peer Schatz Umsätze: regional – Europa 36 % – Asien 18 % – Nord- und Südamerika 46 % Kunden nach Umsatz: – Molekulardiagnostik (50 %) – Applied Testing (7 %) – Pharma (19 %) – Akademia (24 %) Vor nicht allzu langer Zeit war die Qiagen NV ein ganz normaler Laborzulieferer. Die charakteristischen blauen Packungen standen auf fast jeder Bench. Doch der Erfolg war gleichzeitig ein Fluch. Das Unternehmen wuchs nur noch schleppend. Unternehmenschef Peer Schatz und seine Kollegen wagten die Flucht nach vorn. Die 40 Mio. US-$ teure Akquisition des Hamburger Molekulardiagnistik-Pioniers Artus GmbH im Jahr 2005 war der Auftakt für die Transformation des Unternehmens hin zu einem Geräte- und Testentwickler. 2007 folgte schließlich der Paukenschlag. Für die bemerkenswerte Summe von 1,7 Mrd. US-$ verleibte sich Qiagen den US-amerikanischen Spezialisten Digene Corp. ein. „Dies ist ein Schritt in eines der am schnellsten wachsenden Felder der Molekulardiagnostik“, sagte Schatz nach der Übernahme und meinte damit vor allem die Diagnostik von humanen Papillomviren (HPV), die Gebärmutterhalskrebs auslösen können. In den folgenden Jahren verleibten sich die Hildener weitere Firmen ein, darunter die französische Ipsogen, einen Spezialisten für Hämatologie. Die Strategie dahinter: Es geht darum, Qiagens Analyseplattform QiaSymphony auszulasten. Content is king! Je mehr Tests für sie verfügbar sind, desto attraktiver werden die Geräte. Starker Wettbewerb Die Konkurrenz ist namhaft: Mit Siemens, Abbott und Roche streiten sich Großkonzerne mit Qiagen um die Gunst der Diagnostik-Labore. Bis Ende 2011 waren weltweit 550 QIAsymphony Geräte installiert. Im laufenden Jahr soll die Zahl auf 750 Stück steigen. Der Verkaufspreis ist dabei nicht entscheidend – oft werden solche Geräte auch geleast. Vielmehr sind es die Verkäufe von passenden Reagenzien und Tests, die sich pro Gerät auf etwa 50.000 bis 60.000 US-$ pro Jahr belaufen. Im Jahr 2011 stammte bereits fast die Hälfte von Qiagens Jahresumsätzen – 2011 waren das 1,17 Mrd. US-$ – aus der Molekulardiagnostik. Die akademische Forschung, einst dominierendes Segment, trägt heute nur noch ein Viertel des Umsatzes. Die Kundenbasis vervollständigen Pharmaunternehmen (19 %) und Spezialisten für Applied Testing (7 %). Unter allen Bereichen wuchsen die Einnahmen aus Akademia am schwächsten. Im vergangenen Jahr stiegen die Umsätze in diesem Bereich gerade einmal um 3 %. Vor allem in den USA sinken die Ausgaben für öffentliche Forschung, was sich in den Zahlen niederschlägt. Auch in der näheren Zukunft werde sich das nicht ändern, glaubt Qiagens Management. Generell macht Deutschlands größtem Biotech-Unternehmen mit 3.600 Mitarbeitern die derzeitige Schwäche wichtiger Märkte wie den USA zu schaffen. Weil sich hier die finanzielle Situation auch von Privatleuten verschlechtert hat, wird immer weniger Geld für Vorsorge ausgegeben. Damit ist Qiagen abhängig von der Entwicklung der Weltwirtschaft. Entsprechend schlecht verkaufen sich die HPV-Tests des Unternehmens. Marktbeobachter glauben nicht, dass sich das so schnell ändern wird. Endmontage einer QIAsymphony-Plattform. Die makroökonomische Gefahr Und so ist das Unternehmen auf der Suche nach neuen Wachstumsfeldern. Die sieht das Management vor allem in der personalisierten Medizin. Auch hier half Qiagen wieder eine Übernahme. Nach dem Kauf der britischen DxS im Jahr 2009 positionieren sich die Hildener als Partner für Pharmakonzerne, die zunehmend auf der Suche nach begleitenden Diagnostika für ihre Medikamente sind. Nur wenige Unternehmen wie Roche oder Abbott haben diese Expertise im eigenen Haus. Die meisten Unternehmen müssen hier zukaufen. Qiagen hat sich als Partner für Branchengrößen wie Eli Lilly oder Pfizer positioniert. Es bleibt abzuwarten, wie erfolgreich Qiagens Diagnostik- Entwicklungsplattform sein wird. 36 | 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 LABORWELT


Stellenmarkt Service Akademischer Stellenmarkt Institute of Gender in Medicine Berlin Doctoral student The group of Prof. Regitz-Zagrosek / Dr. Mahmoodzadeh is looking for a motivated PhD student with expertise in cardiomyocyte Ca2+-signaling, interest in sex hormone effects, and in animal surgery. We offer a 3 years position with integration into an internationally well connected active research group with expertise in cellular/molecular biology, mitochondrial function, human tissue and animal models. Main research focus of our group is the investigation of sex differences in myocardial hypertrophy (for more information, please visit our web sites at: http://gender.charite.de or http://www.ccr.charite.de/en/research/research_group_regitz_zagrosek/ Requirements – A highly motivated candidate with an interest in cellular and molecular biology and cardiomyocyte physiology – Candidates applying for a PhD position must hold a Master/Diploma degree in the natural sciences or related disciplines, an excellent academic record and practical experience in molecular and cellular biology; having obtained a certificate for conducting animal experiments is an advantage. Employment Successful candidate will be employed from April 2012 on for 36 months Application letters including a CV and contact details of three referees should be sent before March 20, 2012 to: Dr. Shokoufeh Mahmoodzadeh Charite-Universitätsmedizin Institute of Gender in Medicine (GiM) Center for Cardiovascular Research (CCR) Hessische Str. 3-4, 10115 Berlin, Germany or via email: s.mahmoodzadeh@charite.de Alle Stellenanzeigen finden Sie auch unter: www.laborwelt.de FMI International PhD Program in Biomedical Research Applications are invited for internally funded PhD student fellowships at the Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research (FMI) in Basel, Switzerland. The FMI is part of the Novartis Research Foundation and is affiliated with the University of Basel. Our research focuses on epigenetics, mechanisms of cancer and neurobiology. We employ state-of-the-art technologies to explore basic molecular mechanisms of cells and organisms in health and disease. Our international PhD program has approximately 100 graduate students from more than 25 countries. The working language is English. Most students are registered at the University of Basel. The successful candidate holds a Diploma (or M.Sc.) acceptable for matriculation at the University and has a strong background in cell and molecular biology. Current topics include: Biology of aging / cancer and metastasis / DNA repair / cell adhesion / protein structure / proteomics and genomics / molecular mechanisms of cell signaling / cell type specification and differentiation / connectivity and functionality of neuronal circuits / vision, olfaction, motor control / synaptic plasticity / brain and behavior / learning and memory / sensory processing / epigenetic regulation and chromatin modification / gene expression and silencing / genomic integrity / microRNAs and posttranscriptional regulation. Research group leaders: Joy Alcedo / Silvia Arber / Momo Bentires-Alj / Marc Bühler / Pico Caroni / Ruth Chiquet-Ehrismann / Rafal Ciosk / Witold Filipowicz / Rainer Friedrich / Susan Gasser / Helge Grosshans / Brian Hemmings / Nancy Hynes / Georg Keller / Andreas Lüthi / Patrick Matthias / Thomas Oertner / Antoine Peters / Jan Pielage / Ulrich Rass / Filippo Rijli / Botond Roska / Dirk Schübeler / Nicolas Thomä Financial support is in accordance with the scale of the Swiss National Science Foundation. Your income will be generous relative to international standards for PhD students. Duration of the appointment is typically 4 years. Application forms and further information: www.fmi.ch/training/phd/apply phdprogram@fmi.ch Application deadline: May 7, 2012 Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research Maulbeerstrasse 66 CH-4058 Basel Switzerland LABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 | 37


Service Verbände Seite bitte abtrennen – per Fax an 030-264921-11 Kontakt zu Verbänden Die Mitglieder der nachfolgenden Fachgesellschaften erhalten LABORWELT regelmäßig mit freundlicher Empfehlung ihrer Organisationen. Wer sich darüber hinaus für eine Mitarbeit oder einen Beitritt interessiert, erreicht die Fachgesellschaften unter den folgenden Kontakt daten: Ich interessiere mich für den Beitritt Unterstützung für Jungwissenschaftler Interessenvertretung eine Spende Fachgruppen im Bereich Name Tel. Bitte kontaktieren Sie mich Firma Fax Verband (siehe unten, bitte ankreuzen) E-Mail Dt. Ver. Gesell. f. Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin e.V. (DGKL) Geschäftsstelle der DGKL Friesdorfer Str. 153 53175 Bonn Tel.: +49-(0)-228-92-68-9522 Fax: +49-(0)-228-92-68-9527 geschaeftsstelle@dgkl.de www.dgkl.de Gesellschaft für Genetik GESELLSCHAFT FÜR GENETIK c/o HZM – Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit/Inst. of Developmental Genetics Tel.: +49-(0)-89-3187-2610 Fax: +49-(0)-89-4620 www.gfgenetik.de Netzwerk Nutrigenomik Netzwerk Nutrigenomik Arthur-Scheunert-Allee 114 14558 Nuthetal Tel.: +49-(0)-33200-88-301 Fax: +49-(0)-33200-88-541 mail@nutrigenomik.de www.nutrigenomik.de Deutsche Gesellschaft für Proteomforschung BIO Deutschland c/o MPI für Biochemie Am Klopferspitz 18a 82152 Martinsried Tel.: +49-(0)-89-1897-9007 Fax: +49-(0)-89-1897-9009 c.kleinhammer@dgpf.org www.dgpf.org Tegeler Weg 33/ berlinbiotechpark 10589 Berlin Tel.: +49-(0)-30-3450593-30 Fax: +49-(0)-30-3450593-59 info@biodeutschland.org www.biodeutschland.org Deutsche Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie (DGHM) c/o Institut für Hygiene und Med. Mikrobiologie Carl-Neuberg-Straße 1 30625 Hannover Tel.: +49-(0)-511-532-4655 Fax: +49-(0)-511-532-4355 www.dghm.org Gesellschaft für Signaltransduktion c/o Prof. Dr. Ralf Hass Med. Hochschule Hannover AG Biochemie u. Tumorbiol. 30625 Hannover Tel.: +49-(0)-511-532-6070 Fax: +49-(0)-511-532-6071 www.sigtrans.de Gesellschaft für Pharmakologie und Toxikologie Geschäftsstelle der DGPT Achenbachstraße 43 40237 Düsseldorf Tel.: +49-(0)-211-600-692-77 Fax: +49-(0)-211-600-692-78 mitglieder@dgpt-online.de www.dgpt­online.de Nationales Genomforschungsnetz c/o DKFZ Im Neuenheimer Feld 580 69120 Heidelberg Tel.: +49-(0)-6221-424-743 Fax: +49-(0)-6221-423-454 S.Argo@dkfz-heidelberg.de www.ngfn.de DiagnostikNet­BB Netzwerk Diagnostik Berlin-Brandenburg e.V. Neundorfstraße 17 16761 Henningsdorf Tel.: +49-(0)-3302-55-199-14 Fax: +49-(0)-3302-55-199-10 f.adams@diagnostiknet-bb.de www.diagnostiknet­bb.de Verband der Diagnostica­Industrie e.V. Verband der Diagnostica-Industrie e.V. Neustädtische Kirchstr. 8 10117 Berlin Tel.: +49-(0)-30-200-599-40 Fax: +49-(0)-30-200-599-49 vdgh@vdgh.de www.vdgh.de Österreichische Reinraumgesellschaft (ÖRRG) ÖRRG Neudorf 41 A-8262 Ilz Tel.: +43-(0)-3385-8117 Fax: +43-(0)-3385-8117 office@oerrg.at www.oerrg.at bts (Biotechnologische Studenteninitiative e.V.) c/o BIOCOM Lützowstraße 33–36 10785 Berlin Tel.: +49-(0)-30-2649-21-21 Fax: +49-(0)-30-2649-21-11 www.bts­ev.de Deutsche Gesellschaft für Neurogenetik Institut für Humangenetik Calwer Straße 7 72076 Tübingen Tel.: +49-(0)-7071-2977692 Fax: +49-(0)-7071-295171 peter.bauer@ med.uni-tuebingen.de www.hih­tuebingen.de/dgng/ Österreichische Ges. f. Laboratoriumsmedizin & Klinische Chemie ÖGLMKC Geschäftsstelle Infomedica-KEG, Xenius Behal Tullnertalgasse 72 A-1230 Wien Tel./Fax: +43-(0)-1889-6238 office@oeglmkc.at www.oeglmkc.at 38 | 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 LABORWELT


Produktwelt Service Greiner Bio-One Mini-Bioreaktor für Particular Biokunjugiertes Gold aus dem Laserlabor kleine Probenmengen Die Particular GmbH in Hannover hat 2010 Der neue CELLreactor von Greiner Bio-One ist ein mit Filterschraubverschluss ausgestattetes innovatives 50 ml-Röhrchen aus Polypropylen. Es ermöglicht die Miniaturisierung großer Probenvolumina bei gleichzeitiger Maximierung paralleler Experimente innerhalb eines Versuchsansatzes. Damit ist es als kleiner Bioreaktor für die Kultivierung von Zellen einsetzbar. Jeder CELLreactor-Verschluss besitzt eine spezifische nach USP Class VI zertifizierte ihr Geschäft als weltweit erster Produzent lasererzeugter Nanomaterialien aufgenommen. Angeboten werden Nanopartikel aus verschiedensten Metallen, Legierungen oder Keramiken, die stabil in Wasser, Aceton oder anderen Lösungsmitteln dispergiert sind. Die hohe Reinheit, Vielfalt und Flexibilität prädestinieren die Produkte für die nanotechnologische Forschung und Entwicklung. Neben ligandenfreien Nanopartikel- Dispersionen bietet Particular seit 2011 auch Goldkonjugate mit Oligonukleotiden, Peptiden und Antikörpern an, die in einigen Millilitern Wasser perfekt dispergiert sind. Der physikalische Laserabtrag macht die Gold- Konjugate besonders rein sowie kostengünstig, und durch die hohe Oberflächenaktivität der Partikel wird die Affinität des Goldes zu Biomolekülen mit schwefelhaltigen Gruppen besonders effizient ausgenutzt. Die Folge sind mehr Moleküle pro Partikel und weniger Molekülverluste. Die Goldpartikel besitzen einen Durchmesser von ca. 10 nm und können mit Funktionsmolekülen wie zellpenetrierenden Peptiden oder DNA verbunden werden, die das Gold nicht nur sichtbar macht, sondern auch als universelles Verbindungselement koppelt. Die besonderen optischen Eigenschaften erlauben leichte Nachweise und Charakterisierung. Während für viele Laborversuche heute noch toxische Farbstoffe verwendet werden, wird Gold besonders interessant, wenn die Ergebnisse auch auf Gewebe übertragen werden sollen. Kleine Mengen an Gold lösen keine unerwünschten Reaktionen aus. So sollen Biologen ihre Substanzen künftig beispielsweise durch Zellmembranen transportieren und mit DNA-Sequenzen verbinden, um Krankheiten zu erkennen oder zu bekämpfen. Particular GmbH Dr.-Ing. Niko Bärsch Hollerithallee 8 30419 Hannover Tel.: +49-(0)511-2788-313 Fax: +49-(0)511-2788-100 sales@particular.eu www.particular.eu Polytetrafluorethylen beschichtete Kapillarporenmembran mit einer Porengröße von 0,2 µm. Diese Membran garantiert die Sterilität des Röhrcheninhalts. Sie stellt außerdem einen ausgezeichneten Gasaustausch sicher. Das Durchmischen der Flüssigkeiten erfolgt mit Standard-Laborschüttlern, so dass Schaumbildung und zelluläre Scherkräfte während der Kultivierung minimiert werden können. Ein weiterer Vorzug des CELLreactors ist, dass für die Zellernte kein Transfer erforderlich ist. Aufgrund seiner konischen Form passt das Röhrchen in alle gängigen 50 ml- Zentrifugenrotoren, und die Zellen können innerhalb des Röhrchens direkt sedimentiert werden. Neben den Zellkulturanwendungen eignet sich der CELLreactor für die Expansion von aeroben Bakterien, Hefen und anderen Mikroorganismen in Schüttelkulturen sowie für die Lagerung von Komponenten und Flüssigkeiten, die einen Gasaustausch benötigen. Greiner Bio-One GmbH Sylvia Bauer Tel.: +49-(0)7022-948-0 marketing@de.gbo.com www.gbo.com/bioscience Dunn Labortechnik Dunn Labortechnik erweitert Produktportfolio von Laborkleingeräten Neu im Programm bei Dunn Labortechnik sind Geräte der englischen Firma Medline Scientific Ltd. Neben kostengünstigen Laborkleingeräten für allgemeine Anwendungen, wie Magnetrührer, Heizmäntel, Exsikkatoren, Elektrobrenner und Overhead-Rührer, werden auch Spezialgeräte wie Pflanzenwachstumskammern, Öfen und Niedrigtemperatur- Inkubatoren angeboten. Die große Auswahl an Heizmänteln und Exsikkatoren dürfte besonders für Chemielabore, die Niedrigtemperatur-Inkubatoren z.B. für die Zellkultur und die Pflanzenwachstumskammern speziell für botanische Anwendungen interessant sein. Günstig und einfach in der Bedienbarkeit, sind die Magnetrührer u.a. für Schülerlabore oder Praktika zu empfehlen, während die Elektrobrenner eine interessante und sichere Alternative zu gasbetriebenen Brennern in Laboren darstellen. Dunn Labortechnik GmbH Thelenberg 6 53567 Asbach Tel.: +49-(0)-268-343-094 Fax: +49-(0)-268-342-776 info@dunnlab.de www.dunnlab.de LABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 | 39


Service Produktwelt Promocell Der PromoCell-Turbo für die Stammzell-Forschung Auf Grund ihrer einzigartigen biologischen Eigenschaften gewinnen Mesenchymale Stammzellen (MSC) in vielen Forschungsgebieten zunehmend an Bedeutung. PromoCell, der Spezialist für die Kultur humaner primärer Zellen, beliefert seine Kunden schnell und zuverlässig mit einem breiten Spektrum an Produkten für die Stammzellforschung. Primäre humane MSC werden bei Promo- Cell unter strengen ethischen Richtlinien aus unterschiedlichen Geweben isoliert, zum Beispiel aus Knochenmark, Fettgewebe oder der Nabelschnur-Matrix. Jede Charge unterliegt einer ausführlichen Charakterisierung und strengen Qualitätstests. Für die Kultur bzw. die gezielte in vitro- Differenzierung von MSC ist PromoCell als Lieferant für gebrauchsfertige, optimierte Expansions- und Differenzierungsmedien ein etablierter Partner. Das Unternehmen erweitert sein Portfolio nun durch ein neu entwickeltes serumfreies MSC-Expansionsmedium, das MSC Growth Medium DXF (definiert/xeno-frei). Das MSC Growth-Medium DXF wurde von PromoCell speziell für die Kultur von multipotenten, undifferenzierten MSC unter chemisch definierten, xeno-freien Bedingungen entwickelt. Die gezielte Aktivierung der Selbsterneuerung garantiert die robuste Proliferation von MSC und eine hohe Zellausbeute. Die Primär-Isolation von MSC, zum Beispiel aus Knochenmark, wird ebenfalls unterstützt. PromoCell GmbH Sickingenstraße 63/65 69126 Heidelberg Tel.: +49-(0)6221-649340 info@promocell.com www.promocell.com Porvair Besonders einfache SPE- Verfahrensentwicklung Porvair Sciences hat eine Version seiner beliebten Festphasenextraktions-Mikroplatten Microlute (SPE) eingeführt, die eine breit gefächerte Palette an Phasenchemikalien und Sorbentladungen auf einer einzigen Platte ermöglicht und somit für die Methodenentwicklung ideal ist. Durch die Mischung aus Promocell Multiplex-ELISA für Immun- und Molekularbiologie PromoFectin ermöglicht einen hocheffizienten und reproduzierbaren Transport von Nukleinsäuren in eine Vielzahl adhärenter und nicht-adhärenter Zelltypen – mit oder ohne Mediumwechsel. Es zeigt extrem geringe Zytotoxizität und ist daher für die Transfektion sehr empfindlicher und schwer zu transfizierender Zell-Linien und primärer Zellen bestens geeignet. PromoFectin komplexiert und schützt die Nukleinsäuren und bewirkt in der Zelle eine sehr effiziente und schnelle Freisetzung der Nukleinsäuren und deren Transport in den Zellkern. Varianten von PromoFectin sind speziell auch für eine optimale Transfektion von Endothelzellen (z.B. HUVEC), Hepatozyten und Makrophagen sowie neuronaler Zellen und Insektenzellen entwickelt worden. Weitere PromoFectin-Varianten für den Transport von siRNA und funktionellen Proteinen/Peptiden in Zellen sind ebenfalls erhältlich. Die „Magnet-Assisted Transfection“-Technologie (MATra) wurde für eine sehr schnelle (ca. 15 Minuten) und hocheffiziente Transfektion einer Vielzahl von Zelltypen entwickelt und zeigt – ebenfalls mit oder ohne Serum – exzellente Ergebnisse auch mit vielen bekanntermaßen schwer zu transfizierenden Zelltypen (wie etwa Primärzellen) sowie eine geringe Zytotoxizität. Die MATra-A Reagenz besteht aus einer Suspension speziell beschichteter magnetischer Nanopartikel, welche die interessierenden Nukleinsäuren (z.B. Plasmid-DNA, Oligonukleotide oder siRNA) binden und komplexieren. Durch ein starkes magnetisches Feld unter den zu transfizierenden Zielzellen werden die MATra-A/Nukleinsäure-Komplexe sehr schnell und quantitativ auf die Zellen gezogen und in hoher Dosis direkt auf den Zellmembranen abgelegt, was zu einer sehr effizienten Aufnahme der Komplexe in die Zellen führt. Die MATra-A Reagenz ist für die Transfektion von adhärenten Zellen konzipiert, doch lassen sich auch Suspensionszellen mittels eines einfachen Zwischenschritts (mit dem MATra-S Immobilizer) optimal transfizieren. Zusätzlich bietet PromoKine das MA Lipofection Reagent an, das mit den meisten gebräuchlichen Transfektionsreagenzien kombiniert werden kann, um Transfektionsergebnisse mittels der MATra-Technologie noch weiter zu optimieren. Mehr Informationen zur aktuellen PromoFectin-Sonderaktion gibt es unter: www.promokine.info/promotion PromoCell GmbH Sickingenstraße 63/65 69126 Heidelberg Tel.: +49-(0)649 34-0 Fax: +49-(0)649 34-40 www.promokine.info info@promokine.de Phasenchemikalien und Sorbentladungen, die bei der Development Microlute zur Verfügung steht, wird eine schnelle und einfache Untersuchung auf die optimale Bindung und Selektivität möglich. Mit Development Microlute hat der Benutzer auf einer 96-Loch-Mikroplatte im Standardformat eine einzigartige Auswahl aus bis zu zwölf unterschiedlichen Phasen- und Sorbentladungen (10 bis 100 mg). Durch Bereitstellung einer kompletten SPE- Verfahren-Entwicklungslösung, die nicht vom Anwender konstruiert werden muss, kann der Zeitaufwand im Labor mit Development Microlute erheblich verkürzt werden. Die neuartige Bauart des Development Microlute bietet alle Vorteile einer automatisierten SPE- Probenvorbereitung. Einzelne SPE-Kartuschen müssen nicht wiederholt ein- und ausgesteckt werden. Durch Verwendung eines patentrechtlich geschützten Slurry-Ladeverfahren konnte Porvair die Kanalisierungsauswirkungen vermeiden. Jede Senke einer Development Microlute-Platte verfügt über eine individuelle Ablasstülle, so dass ein 100%iger Probentransfer gewährleistet ist, bei dem eine Kreuzkontamination ausgeschlossen werden kann. Development Microlute-Platten von Porvair sind zu allen gängigen Roboter-Probenhandhabungs- und Vorbereitungssystemen kompatibel, was einen problemlosen Betrieb mit hoher Produktivität gewährleistet. Porvair Sciences Ltd. Dr. Bill Bradbury Tel.: +44-(0)208-546-0869 info@primetek-solutions.com www.porvair-sciences.com 40 | 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 LABORWELT


Kalender Service März – Mai 2012 Veranstaltungskalender 19.-21.3.12 BIO-Europe Spring® 2012 International Partnering Conference, Amsterdam (NL) Info: www.ebdgroup.com/bes 19.-20.3.12 2 nd Symposium on the Replacement, Reduction and Refinement of Animal Experiments, Hannover Info: www.tiho-hannover.de 19.-21.3.12 6 th Glycan Forum, Berlin Info: www.glycan-forum.de 20.3.12 Update Innovationsforum Bewertung, Regulierung, Erstattung, Berlin Info: www.diagnostiknet-bb.de 27. März 2012, Erlangen Zellbasierte Therapien Auf dem Kooperationsforum „Zellbasierte Therapien„ in Erlangen werden Fortschritte in der Stammzellforschung und der Zellbiologie vorgestellt. Zu den Schwerpunktthemen gehören Plattformtechnologien für die Stammzellproduktion und therapeutische Anwendungen in der Immunologie. Info: www.bayern-innovativ.de/ zelltherapie2012 21.-24.3.12 35. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Zellbiologie, Dresden Info: www.zellbiologie2012.de 26.-28.3.12 24 th DIA-EuroMeeting, Kopenhagen (DK) Info: www.diahome.org 26.-29.3.12 5 th Companion Diagnostics Summit, Frankfurt (Main) Info: www.companion-dxeurope.com 20. April 2012, München jobvector career day Neben persönlichen Gesprächen mit Personalverantwortlichen aus Biotechnologie, Pharma, Medizin und den Life Sciences bietet der jobvector career day ein umfangreiches Vortragsprogramm. Info: www.jobvector.de/muenchen 26.-27.3.12 5. Bundesalgenstammtisch, Pullach Info: www.dechema.de/algen2012 27.-29.3.12 Bioassays and Bioanalytics & Stability Testing for Biological/Biotechnological Drug Substances and Drug Products, Kopenhagen (DK) Info: www.gmp-navigator.com 28.-29.3.12 Advances in Microarray Technology, Edinburgh (UK) Info: https://selectbiosciences.com/conferences/ AMT2012 2.-5.4.12 Protein Modellierung – von der Sequenz zur Struktur, Erlangen Info: http://kwi.dechema.de/PM.htm 10.-12.4.12 Environmental Microbiology & Biotechnology Conference 2012, Bologna (I) Info: www.efb-central.org 16.-20.4.12 WFC11 – 11 th World Filtration Congress, Graz (A) Info: www.wfc11.org 17.-20.4.12 Analytica 2012, München Info: www.analytica.de 19.4.12 6. Biotech-Tag der FH Bingen Info: www.fh-bingen.de 19.-20.4.12 10 th EGA International Symposium on Biosimilar Medicines, London (UK) Info: www.gpaconferences.com 23.-24.4.12 Charité Entrepreneurship Summit 2012, Berlin Info: www.charite-summit.de/2012 25.4.12 Einführung in die „Gute Laborpraxis“, Karlsruhe Info: www.fortbildung.kit.edu 25.-27.4.12 GMP for Vaccine Manufacturers, Berlin Info: www.gmp-navigator.com 1.5.12 Companion Diagnostics – from Early Drug Discovery to Clinical Application, Thame, Oxfordshire (UK) Info: www.elrig.org 2.-4.5.12 9 th International Conference on Protein Stabilisation, Lisbon (PT) Info: http://prostab2012.ist.utl.pt 2.-5.5.12 7 th International Symposium on Neuroprotection and Neurorepair, Potsdam Info: www.neurorepair-2012.de 7.–9. Mai 2012, Basel Klinische Nanomedizin Alle Facetten der Nanomedizin werden auf dem European Summit for Clinical Nanomedicine 2012 behandelt. Programmschwerpunkte sind Themen wie Drug Delivery, Nanodiagnostik und regenerative Medizin Info: www.clinam.org LABORWELT 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 | 41


Ausblick Next-next-Generation Sequencing ist marktreif von Thomas Gabrielczyk, Redaktion LABORWELT Vor fast drei Jahren berichtete das kleine Unternehmen Oxford Nanopore in LABORWELT über den Prototypen eines Nanopore-Sequencers, der auf Basis von Leitfähigkeitsmessungen hochparallel die Sequenz von (c)DNA-Einzelsträngen ausliest, die in einen Chip eingebettete Hämolysin-Poren passieren (LABORWELT 3/2009). Mitte Februar kündigte das Unternehmen auf der AGBT-Konferenz (Marco Island, Florida) den Vermarktungsstart für seine Technologie noch in diesem Jahr an. Wie alle Geräte, die neu auf den hochdynamischen Markt der Hochdurchsatz-Sequencer kommen, werden auch das GridION-System (Durchsatz mind. 10Gb/Tag) und das Einweg- System MinION (Durchsatz mind. 1.2 Gb/Tag), das die Größe eines USB-Sticks hat, ihre Kinderkrankheiten haben. Derzeit liegt die Fehlerrate mit 4% beim Basecalling noch viel zu hoch. Doch das Potential der neuen Methode ist gigantisch. Neben Leselängen, die das Sanger-Sequencing gleich bei der Vorstellung der ersten Sequenzierungsdaten um das Zehnfache übertrafen (10.000 Basen pro Lauf!), versprechen der Datendurchsatz und der Preis pro Base, bereits bei Vermarktungsbeginn genauso günstig zu sein wie der des derzeit unangefochtenen Weltmarktführers Illumina. Doch wird der in Aussicht gestellte Preis von $10/Gb auf dem GridION und $1.000/Gb auf dem Minion weiter fallen. Denn als erste Firma bietet Oxford Nanopore eine Sequenzierungstechnologie an, die weder teure Fluoreszenzkameras noch Fluoreszenzfarbstoffe für die Signaldetektion braucht, noch auf die vorherige Amplifikation der DNA mit PCR angewiesen ist, um eine ausreichende Signalstärke zu erreichen. Gleichwohl muss Illumina die Nanopore- Sequenzer GridION und MinION nicht fürchten. Denn die US-Firma hat sich früh die Rechte an einer noch genaueren Version des Verfahrens gesichert, über dessen Entwicklungsstand die Briten indes nichts verraten: Anders als beim „Strand Sequencing“ wird bei diesem Impressum LABORWELT (ISSN 1611-0854) erscheint vierteljährlich im Verlag der BIOCOM AG Lützowstraße 33–36 10785 Berlin, Germany Tel./Fax: 030/264921-0 / 030/264921-11 laborwelt@biocom.de www.biocom.de Redaktion Dipl.-Biol. Thomas Gabrielczyk Tel.: 030/264921-50 Anzeigenleitung Oliver Schnell Tel. 030/264921-45, o.schnell@biocom.de Leserservice Angelika Werner, Tel. 030/264921-40 Graphik-Design Michaela Reblin www.laborwelt.de Druck: Druckhaus Humburg GmbH, 28325 Bremen „Exonuclease Sequencing“ nicht ein intakter DNA-Einzelstrang durch die Pore geschleust. Statt dessen haben die Briten eine Exonuclease an die Nanopore fusioniert, die die DNA bindet und jeweils ein Nucleotid vom Ende her abschneidet – das verspricht, die mäßige Genauigkeit des Verfahrens um ein Vielfaches zu verbessern. Denn – anders als beim Strand Sequencing – muss keine technische Lösung dafür gefunden werden, den DNA-Strang am schnellen Durchtritt durch die Pore zu hindern und dessen Geschwindigkeit so zu verlangsamen, dass tatsächlich Base für Base abgelesen wird – ein derzeit nur unbefriedigend gelöstes Problem, an dem auch Illumina-Konkurrent Roche gemeinsam mit Partner IBM knobelt. Hope & Hype In ihren Ankündigungen übertreffen sich derzeit die Anbieter. Anfang Januar kündigte Life Technology ein update seiner IonTorrent- Pyrosequencing-Plattform an, die anstelle eines Fluoreszenz-Readouts die Halbleitertechnologie nutzt. Gegen das Nanopore-Sequencing können sowohl der Ion PGM Sequencer und sein größerer Bruder Ion Proton indes schon wegen der 50-fach geringeren Leseweite nicht bestehen. Wer das Rennen im schnellwachsenden 1 Mrd. US$-Next-Gen-Sequencing-Markt macht, ist nicht zuletzt durch Roches 5,7 Mrd. US$-Offerte an Illumina (vgl S. x) nicht abzusehen. Für einen regelmäßigen Bezug von LABORWELT ist eine kostenlose Registrierung unter www.biocom.de oder per Fax erforderlich. Namentlich gekennzeichnete Beiträge stehen in der inhaltlichen Verantwortung der Autoren. Alle Beiträge sind urheberrechtlich geschützt. Ohne schriftliche Genehmigung des BIOCOM Verlages darf kein Teil in irgendeiner Form reproduziert oder mit elektronischen Systemen verarbeitet, vervielfältigt oder verbreitet werden. Titelbild: ancroft/iStockphoto © BIOCOM AG, Berlin BIOCOM AG Inserentenverzeichnis BIOCOM AG ........................19, 22, 27 CRELUX GmbH ......................Beilage Dunn Labortechnik GmbH .............. 21 European Biotechnology Foundation 13, 16 Fördergesellschaft IZB mbH. ............ U3 Life Science Austria LISA/BOB ........... U2 New England Biolabs GmbH ............ U4 Particular GmbH ........................ 7 Porvair Science Ltd. ...................... 19 Toso Haas . .............................. 11 Vorschau Heft 2/2012 Themen Laborautomation & Aktuelles Jüngste Fortschritte in der Laborautomation sowie zwei weitere, aktuell ausgewählte Themen stehen im Mittelpunkt der nächsten Printausgabe von LABOR- WELT (Erscheinungsdatum 21. Juni 2012). Bereits zuvor wird ein Teil der Beiträge, Expertenpanels und Top-Publikationen auf der völlig überarbeiteten Online-Plattform LABORWELT.de veröffentlicht werden. Für das LABORWELT-Hauptthema „Laborautomation“ sind die Themen „Biobanking & Biomarkers: Präparation, Probenlagerung und Analyse“, Drug Discovery Automation: „Zellbasierte Assays, Liquid Handling und Detektion“ sowie „Mikrofluidik/Omics- Automation“ geplant. Bei Interesse, einen Beitrag beizusteuern, hilft die Redaktion (Tel.: 03026492150, E-Mail: t.gabrielczyk@ biocom.de) gerne weiter. Expertenpanel Klinische Diagnostik Werbekunden bietet diese Ausgabe eine opti male Plattform für ihre Produkt-und Image anzeigen. Reservieren Sie Ihren Werbeplatz in der LABORWELT-Themenausgabe bis spätestens zum 8. Juni 2012. Ergänzend zum Thema „Laborautomation“ lassen wir Automations- und Diagnostikexperten zu aktuellen Entwicklungen im Anwendungsfeld „Automation in der klinischen Diagnostik“ zu Wort kommen. Informationen zur möglichen Teilnahme einer Ihrer Experten sowie über die aktuellen Themen gibt Oliver Schnell (Tel.: +49-30-264921-45, E-Mail: o.schnell@biocom.de). 42 | 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 LABORWELT


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