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Zielgen-Anreicherung Sequence Capture

Laborwelt Hintergrund

Prinzip der Schallübertragung im Innenohr

Schall wird vom Trommelfell über die Gehörknöchelchen

des Mittelohrs im sogenannten

ovalen Fenster auf die Cochlea (Schnecke, im

Bild blau) übertragen. Die Cochlea ist im

Querschnitt in drei Röhren unterteilt: Die

Scala vestibuli (oberer Gang) ist mit dem

ovalen Fenster verbunden. Sie nimmt den

Schalldruck auf und führt ihn bis zur Spitze

der Cochlea, dem Helicotrema. Dort führt

eine scharfe Kehre in die zurücklaufende

Röhre, die Scala tympani (untere Röhre), die

am runden Fenster des Innenohrs endet.

Zwischen den beiden Röhren liegt die Scala

media, die den sensorischen Apparat, das

Corti-Organ (große Abbildung), enthält.

Trifft Schall über das ovale Fenster ein, bildet

sich eine Wanderwelle, deren Maximum bei

hohen Frequenzen den vorderen Abschnitt,

bei tiefen Tönen den dünneren, hinteren

Abschnitt der Basilarmembran zum Schwingen

anregt. Die Frequenzinformation wird

so in eine Ortsinformation umgewandelt.

Basilar- und Tektorialmembran werden nun

gegeneinander verschoben. Dies stimuliert

die äußeren Haarzellen (OHC), ihre Länge

zu ändern, was die lokalen Bewegungen im

Cortiorgan etwa 1000-fach verstärkt. Die so

verstärkte Wanderwelle erregt nun lokal die

inneren Haarzellen (IHC), die das sensorische

Signal erzeugen.

BC

RC

Derzeit sind vier X-chromosomale vererbte

Loci (DFNX) kartiert, die mit dem Auftreten

des nicht-syndromischen Gehörverlustes

(NSHL) in Zusammenhang stehen. DFNX1

ist durch eine fortschreitende Beeinträchtigung

des Hörvermögens gekennzeichnet

und tritt typischerweise im Alter zwischen 5

und 15 Jahren bei Männern sowie bei Frauen

um die 50 auf. Welche Rolle das bei DFNX1

mutierte PRPS1-Gen, das ein Enzym der

Nukleotidbiosynthese kodiert, im Innenohr

spielt, ist unklar 2 . Ebenso fanden sich Mutationen

3 im Transkriptionsfaktor Pou3F4 bei

Patienten mit DFNX2. Hierbei kommen die

Kinder bereits mit stark eingeschränktem

Hörvermögen (prälingualer Hörverlust) zur

Welt, weil die Schallübertragung zwischen

Mittel- und Innenohr gestört ist. Hübner et

al. untersuchten einen dritten, postlingualen

NSHL in einer großen deutschen Familie. Die

Krankheit beginnt bei Jungen im Alter von

3 bis 7 Jahren, mit Hördefekten im oberen

Frequenzband, schreitet aber progressiv

bis zur Taubheit fort. Bei Frauen beginnt

der Hörverlust zwischen dem 20. und 30.

Lebensjahr und führt nach 10 bis 15 Jahren zu

schweren Hörschädigungen, ohne dass zuvor

Störungen der Schallweiterleitung aus dem

Mittelohr oder eine Beeinträchtigung des

Gleichgewichtssinnes zu bemerken wäre.

Genomweite Kopplungsanalyse

Eine genomweite Kopplungsanalyse (Gene

Chip Human Mapping 10K Array, Affymetrix)

deutete bei 11 der Familienmitglieder mit

sehr hoher Wahrscheinlichkeit (LOD-Score

2.23) darauf hin, dass der Defekt sich in einer

17,5 Mb-Region auf dem Chromosomenabschnitt

Xp22.12 befindet. Die Berechnung

der LOD-Scores erfolgte mit dem Programm

ALLE GRO 4 unter der Annahme einer dominanten

Vererbung mit vollständiger Penetranz.

Die Allelfrequenz der pathogenen Variante

wurde auf 0,0001 gesetzt. Die mit MERLIN 5

konstruierten Haplotypen für SNP-Marker

auf dem Chromosomenabschnitt Xp22.12

engten den Krankheits-Locus auf die Region

zwischen rs1482816 und rs1557901 ein.

Identifikation des ursächlichen Gens

mit NimbleGen SeqCap TM Arrays

Um die dem Hörverlust zugrundeliegende

Genmutation zu identifizieren, wurden alle

Exons und je 1KB der Promotoren der 88

proteincodierenden Regionen der Zielregion

zweier betroffener Männer sowie bekannte

miRNAs mit dem Roche NimbleGen 385K

Custom Sequence Capture Array angereichert

(Dienstleister: ATLAS Biolabs GmbH)

und sequenziert (Dienstleister: Cologne

Center for Genomics). Der Chip repräsentierte

dabei 96,3% der Zielsequenzen des

Krankheitslocus. Insgesamt wurden die

Targetgensequenzen um den Faktor 280

bzw. 284 angereichert, wie qPCR-Kontrollen

ergaben. Nach Elution der hybridisierten

Sequenzen vom Array und Amplifikation

wurden diese sequenziert (Illumina GA IIx)

und lieferten 2,8286 Gb bzw. 2,6060 Gb

Rohsequenz. Die Reads wurden mit der MAQ

short read-Alignment-Software 5 gegen das

humane Referenzgenom (Version hg19)

kartiert. Einzelbasen-Variationen (SNPs)

wurden mittels MAQ, Indels mittels dem

BWA-Aligner 6 und SAM-Tool 7 analysiert.

Auf diese Weise identifizierten Hübner und

Kollegen 3.858 bzw. 3.443 X-chromosomale

Varianten in den beiden Personen.

Zugleich wurden DNA-Proben weiterer

betroffener Männer dieser Familie hinsichtlich

hochpolymorpher Mikrosatelliten-

Marker genotypisiert. Die Kopplungsregion

konnte so auf eine 8,5 Mb-Region eingeengt

werden, die nur noch 398 bzw. 347 single

nucleotide-Varianten (SNVs) enthielt. Diese

wurden hinsichtlich ihrer evolutionären Konserviertheit

und ihrer Auswirkungen auf die

Proteinbiosynthese weiter analysiert. Nach

Sanger-Sequenzierung des aussichtsreichsten

Kandidaten – einer nonsense-Mutation

des small muscle protein, X-linked (SMPX)

– zeigte sich, dass das Sequenzintervall den

DFNX4-Locus enthielt.

Dieser X-chromosomale Locus war 1996

bereits von Forschungspartnern von Hübner

et al. in einer spanischen Familie kartiert

worden 8 und steht in Zusammenhang mit

dem Auftreten eines fortschreitenden, postlingualen

Hörverlust. Bei Männern tritt die

Erkrankung allerdings erst zwischen dem 5.

und 7. Lebensjahr, bei Frauen erst im vierten

Lebensjahrzehnt auf. Die retrospektive

Analyse von SMPX in dieser Familie lieferte

gleichfalls eine nonsense-Mutation (c175

G>T) in der proteinkodierenden Sequenz.

Ebenso wie die in der deutschen Familie

identifizierte Mutation (c.109G>T) scheint

diese über vorzeitige Stopp-Codons einen

18 | 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 LABORWELT

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