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Krebszellanalyse Einzelzell-Analyse

Abb. 2: (a) Zahlreiche RGB-markierte Lebertumoren sind nach der Transplantation RGBmarkierter

BON-Zellen im Leberschnitt sichtbar. Die meisten Tumoren sind einfarbig,

einige mehrfarbig. (b) Einfarbige Tumoren wurden explantiert und in vitro kultiviert.

(c) Sekundäre Tumoren nach Retransplantation der Zellen aus den primären Tumoren.

Alle sekundären Tumoren sind einfarbig. (d) Sekundäre Tumoren nach Retransplantation

gemischter Zellen beider primärer Tumoren. Hier sind sowohl einfarbige

als auch gemischte, zweifarbige Tumoren sichtbar. (e) Molekulare Analyse der sekundären

Tumoren (aus c und d) durch Insertionsstellen-spezifische PCR, zum Nachweis

der klonalen Identität. [Modifiziert, nach Nat. Med. 17 (2011), 504-509].

aller Zellen transduziert wurden. Somit waren

aus kombinatorischer Sicht acht verschiedene

Gruppen transduzierter Zellen zu erwarten,

die jeweils 12,5% aller Zellen umfassen sollten

(Tab. 1) 17 . Vier dieser Gruppen waren durch die

Expression mindestens zweier unterschiedlicher

Fluoreszenzproteine charakterisiert und ließen

mithin die für das RGB marking notwendige

Entstehung von Mischfarben erwarten (Tab. 1).

Eine grundlegende Voraussetzung für die Vielfalt

der generierten Mischfarben bestand darin, dass

die zu mischenden Grundfarben in unterschiedlichen

Intensitäten vorliegen. Beim RGB marking

mit LeGO-Vektoren sollte dies durch zwei wichtige

Parameter des Gentransfers gewährleistet

werden: Erstens, kann bei Gentransferraten von

mehr als 50% pro Vektor davon ausgegangen

werden, dass in einzelnen Zellen die Zahl der

Vektorinsertionen für jede Farbe zwischen

eins und drei variiert 18, 19 . Zweitens ist bekannt,

Tab. 1: Bei einer Transduktionsrate von 50%

je Farbe, sind die dargestellten Gruppengrößen

zu erwarten.

Vektoren pro Zelle Gruppengröße

rot 12,5 %

grün 12,5 %

blau 12,5 %

rot + grün 12,5 %

rot + blau 12,5 %

grün + blau 12,5 %

rot + grün + blau 12,5 %

nicht transduziert 12,5 %

dass die Integrationsstelle eines Vektors einen

signifikanten Einfluss auf die Expression des

eingebrachten Transgens hat 19 .Die entscheidende

Frage war, ob diese beiden Parameter

zusammengenommen nicht nur hochspezifisch

für eine gegebene Zelle sind, sondern auch an

alle Tochterzellen weitergegeben werden und

somit einen klonalen Marker darstellen.

Wie erste Analysen in vitro mit HEK293T-

Zellen zeigten, erlaubte das RGB marking

tatsächlich die Identifikation von Zellklonen

anhand der spezifischen Farbe, die allen Zellen

des Klons gemein war (Abb. 1d) 17 . Dabei werden

die verschiedenen Zellklone anhand ihrer individuellen

Farbe im Fluoreszenzmikroskop direkt

sichtbar gemacht, ohne dass die Zellintegrität

zerstört werden muss (Abb. 1d). Damit ist eine

Klonalitätsanalyse in sehr kurzer Zeit möglich.

Im nächsten Schritt war die für die Anwendbarkeit

des RGB marking entscheidende

Frage der Farbkonstanz in vivo zu klären.

Eines der von uns dazu benutzten Modelle

basierte auf der seriellen Transplantation von

RGB-markierten karzinogenen BON-Zellen.

Wie erwartet hatten die RGB-markierten

BON-Zellen in primären Rezipienten Lebertumoren

gebildet, die in der Mehrzahl aus Zellen

ein- und derselben Farbe bestanden (Abb. 2a) 17 .

Allerdings waren auch einige „Mischtumoren“

nachweisbar (Abb. 2a) 17 . Wir explantierten einige

der monochromen Tumoren, vereinzelten

die Zellen und nahmen diese in Kultur. Wie wir

zeigen konnten, wiesen alle aus einem Tumor

isolierten Zellen über den gesamten Beobachtungszeitraum

hinweg dieselbe Farbe wie der

Ursprungstumor auf (Abb. 2b) 17 . Wurden diese

Zellen in sekundäre Rezipienten transplantiert,

entstanden erneut Tumoren, die durch die

gleiche RGB-Farbe wie der Ausgangstumor

charakterisiert waren (Abb. 2c) 17 . Mischten wir

für die Transplantation RGB-markierte Zellen,

die von zwei unterschiedlichen Tumoren

abstammten, entstanden in den Sekundärrezipienten

sowohl monochrome Tumoren, die

den beiden Ausgangstumoren entsprachen,

als auch zweifarbige Tumoren, die aus Zellen

beider Ausgangstumoren bestanden (Abb.

2d) 17 . Folglich haben nicht die Zellen innerhalb

eines Tumors in vivo ihre Farbe geändert, sondern

mehrfarbige Tumoren sind aus mehreren

Zellen verschiedener Farbe entstanden. Mit

diesen sowie damit einhergehenden molekularbiologischen

Untersuchungen (Abb. 2e)

konnten wir nachweisen, dass das RGB marking

eine klonale, langfristige und eindeutige

Zellmarkierung in vivo ermöglicht 17 .

Insgesamt ist es uns gelungen, mit dem RGB

marking eine neue Methode der klonalen Zellmarkierung

zu entwickeln, die für unterschiedlichste

Anwendungen sowohl in Modellen der

regenerativen Medizin als auch der Kanzerogenese

von großem Interesse sein dürfte.

Literatur

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[19] Kustikova, O.S. et al., Blood 102 (2003), 3934-9397

Wir möchten uns bei vielen Kollegen bedanken, die uns mit

Zellen und Konstrukten unterstützt haben: H. Wege (Universitätsklinikum

Hamburg-Eppendorf) für FH-hTERT Zellen, R.Y.

Tsien (Howard Hughes Medical Institute) mCherry cDNA, A.

Miyawaki (RIKEN) und T. Schroeder (Institute for Stem Cell Research)

Venus cDNA und D.W. Piston (Vanderbilt-Ingram Cancer

Center) für Cerulean cDNA. Durchflusszytometrie wurde in der

FACS Sorting Core Unit des Universitätsklinikums Hamburg-

Eppendorf durchgeführt. Konfokale Mikroskopie wurde mit

Hilfe von O. Bruns (Heinrich-Pette-Institut Hamburg) in Zusammenarbeit

mit dem Nikon Application Center Norddeutschland

durchgeführt. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Deutsche

Forschungsgemeinschaft (SFB841 an B.F. und D.B.) und

die Nachwuchsförderung des Forschungsförderungsfonds der

Medizinischen Fakultät Hamburg (NWF-12/09 an K.W.).

Korrespondenzadresse

Prof. Dr. Boris Fehse

Forschungsabteilung Zell- und Gentherapie

Klinik für Stammzelltransplantation

Onkologisches Zentrum – UCCH

UK Hamburg-Eppendorf

Martinistr. 52, 20246 Hamburg

Tel./Fax: +49-40-7410-55518/-55468

8 | 13. Jahrgang | Nr. 1/2012 LABORWELT

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