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LABORWELT

B L I T Z L I C H T

4/2000 Das Themenheft von |transkript

Klinische

Proteomforschung

Bildanalyse

von 2D-Gelen

Proteomics

Proteomics –

Zellbiochemische

Verfahren

Proteinchips

Marktübersicht

Geldokumentation

Biosensoren

zur Analyse der

Proteininteraktion

Funktionsanalyse:

Protein-

K.o.-Technologie

Zellfreie

Proteinexpression

Proteomics &

Drug Discovery

BIOCOM AG

|transkript LABORWELT Nr. 4/2000 | 1


IB L IN T Z T L I RC H OT

Editorial

Proteomics – ein Markt entsteht

Erst sechs Jahre ist es her, seit der Begriff des „Proteoms“ geprägt wurde.

Schon vorher hatten eine Handvoll Pioniere versucht, „Momentaufnahmen“

des sich ständig verändernden gesamten Proteinbestandes einer

Zelle zu machen. Der Vergleich der Proteinmuster zweier verschiedener

zellulärer Zustände sollte die Proteine identifizieren, die zum Beispiel

maßgeblich über „krank“ oder „gesund“ entscheiden. Der Ansatz schien

erfolgversprechender als die Gen-basierte Targetsuche, um Angriffspunkte

für neue Medikamente auszumachen – sind doch die Proteine die Funktionsträger

der Zelle.

Was daraus geworden ist, davon berichtet die Anfang Oktober veröffentlichte

Marktstudie „The World Proteomics Market“ der US-Unternehmensberatung

Frost & Sullivan: Mehr als 150 Unternehmen – börsennotierte

wie ganz kleine – werden in diesem Jahr mehr als eine Milliarde

US-$ mit „Proteomics“ erwirtschaften; in fünf Jahren sollen es schon 5,8

Milliarden Dollar sein. Unter den vier Marktsegmenten (spezifische Proteomics-Labordienstleistungen,

„Proteom-Bioinformatik“, medizinischdiagnostische

Anwendungen und Instrumentation/Technologie), die die

Marktforscher ausgemacht haben, ist der Bereich Instrumentation/Technologie

mit rund zwei Dritteln Marktanteil heute der bedeutendste.

Das älteste Segment ist hier die „klassische“ Proteomanalyse, die mit

optimierten 2D-Gelelektrophorese-Methoden zunächst bis zu 10.000 verschiedene

Proteine auftrennt. Über Chancen, neue Entwicklungen, aber

auch Grenzen dieser bislang leistungsfähigsten Auftrennmethode informieren

Sie unsere Beiträge auf den Seiten 7 und 17. Der Vergleich der

2D-Gele mit Dokumentationssystemen (s. Marktübersicht S. 45) und die

manuelle Schritte beinhaltende Auswertung der Gelbilder (Seite 4 ) sind

derzeit Engpässe dieser Art der Proteomanalyse, während das Ausstanzen

der Spots aus dem Gel, der Proteaseverdau und die Massenspektrometrie

der Proteinfragmente weitgehend automatisiert ablaufen (siehe S. 12).

Probleme des klassischen Ansatzes – wie mangelhafte Darstellung von

sehr sauren, basischen sowie von Membran-Proteinen und die begrenzte

Reproduzierbarkeit der Auftrennung – haben in jüngster Zeit neue Verfahren

auf den Plan gerufen, die zum Beispiel Subproteome analysieren.

Einige, wie etwa die Surface Plasmon Resonance-Biosensoren (Seite 21)

oder Two-Hybrid-Systeme, konzentrieren sich auf die Analyse der Interaktionspartner

von Proteinen. Zerstörungsfreie in vivo-Methoden, die das

gleiche leisten, sind etwa die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (Seite

38) und – ganz neu – das Whole Cell Protein Fingerprinting (Seite 42).

Schließlich sind da noch die Protein- und Peptidchips (S. 24 und 26), die

eine hochparallele Proteomanalyse versprechen, sobald es gelingt, physikalisch

hochunterschiedliche Proteine in nativer Form auf den Chips zu

immobilisieren. Dieses und vieles Interessantes mehr finden Sie, liebe

Leser, in dieser Ausgabe.

Eine interessante Lektüre dabei wünscht Ihnen

Cover:

Modifizierte Version der

Tagungsankündigung zum

diesjährigen „Cologne Spring

Meeting: Protein Machines and

Subcellular Organization“ vom

8. bis 10. März.

Mit freundlicher Genehmigung von

Prof. Dr. Maria Leptin (Design und

Copyright). Handzeichnung: Prof.

Dr. Rolf Knippers. Foto: Karsten

Albers, Tandler Zahnrad &

Getriebe.

Inhalt

REPORT

5 Bildverarbeitung von zweidimensionalen Gelen

FRIEDRICH LOTTSPEICH

REPORT

17 Proteomics – Zellbiochemische

Verfahren gewinnen an Bedeutung

MATHIAS DREGER

BLITZLICHT

21 Detektion von Protein-

Interaktionen in den Proteomics

WOLFGANG JÄGER

REPORT

Klinische Proteomforschung 7

MICHAEL GLOCKER ET AL.

REPORT

Massenspektrometrische 12

Verfahren in Proteinanalytik

und Proteomik

MARION JÜRGENS, DETLEV SUCKAU

BLITZLICHT

24 Proteinchips – Bindeglied

zwischen Genomics und Proteomics

HOLGER EICKHOFF ET AL.

BLITZLICHT

26 Identifizierung und Optimierung von

Proteasesubstraten – ein neuartiger Assay

ULRICH REINEKE

BLITZLICHT

37 Zellfreie Proteinexpression

im präparativen Maßstab

SONJA VOGEL-ROHWER

BLITZLICHT

38 Einzelne Moleküle

im (Laser-)Fokus

PETRA SCHWILLE

BLITZLICHT

Laser-vermittelter Protein-K.O. 32

zur Targetvalidierung

FRITZ RUDERT

PLATTFORM

42 Hochdurchsatz-Proteomanalyse

auf Einzellzellniveau

WALTER SCHUBERT

KONGRESSWELT

43 Bericht vom Siena-Meeting 2000

ANTON POSCH UND CHRISTINE GAUSS

PROFILE

Proteomics und Drug Discovery

STEFAN SCHMIDT ET AL.

45 Marktübersicht Geldokumentationssysteme

53 Produktwelt

55 Kennziffer-Service

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BR L EI T P Z L O I CR H T

Gelauswertung

2D-Gel-Bildverarbeitung

für die Proteomanalyse

DR. PHIL. DR. MED. HABIL. FRIEDRICH LOTTSPEICH

MAX-PLANCK-INSTITUT FÜR BIOCHEMIE, MARTINSRIED

Die Bildverarbeitung von 2D-Gelen hat durch den immensen Aufschwung der Proteomanalyse neue

Bedeutung gewonnen. Dabei stellt sich die Bildverarbeitung als der zur Zeit größte Engpaß der

Proteomanalyse heraus. Eine große Anzahl von Gelen muß ausgewertet werden, wobei bei der

Proteomanalyse besonderer Wert auf die quantitativen Aspekte gelegt werden muß. Die quantitativen

Verhältnisse werden aber von der Probenvorbereitung, der Trennung der Proteine durch die

zweidimensionale Gelelektrophorese, der Anfärbung der Proteine, dem Scannen wie auch von den

Algorithmen der Spoterkennung und des Bildvergleiches wesentlich beeinflußt. Vor allem die

Auswerteroutinen sind trotz immer neuer verbesserter Softwareprogramme noch weit von einer

Vollautomatisierung ohne manuelle Nachbearbeitung entfernt.

Key Words: Proteomics, 2D-gel electrophoresis, staining, image analysis

Proteomics ist der quantitative Vergleich von

Proteinmustern unterschiedlicher, genau

definierter Zustände. Auf den quantitativen

Aspekt muß dabei das größte Augenmerk

geelegt werden, da im wesentlichen die Veränderungen

von Proteinen und Proteinmengen

in dem komplexen und hochdynamischen

Geschehen der biologischen Netzwerke

unterschiedliche funktionelle Zustände

charakterisieren (Abb. 1). Über eine quantitative

Analyse der Proteinveränderungen in

unterschiedlichen, genau definierten Zuständen

werden die Informationen erhalten, die

Proteomics zu einem der wesentlichen Hoffnungsträger

auf dem Gebiet der „Functional

Genomics“ machen.

Da die quantitativen Ergebnisse so wichtig

sind, muß man die wesentlichen Parameter

kennen, welche die Proteinmengen und ihre

Analyse beeinflussen.

Probenvorbereitung

Schon die Probenvorbereitung spielt hier

eine wichtige Rolle, Wie genau ist das Ausgangsmaterial

definiert, wie homogen und

wie reproduzierbar ist es herzustellen Alles

Fragen, die nur über Wiederholungen und

statistische Datenanalyse beantwortet werden

können. Das reproduzierbar hergestellte

Ausgangsmaterial muß für eine Auftrennung

der Proteine und eine Analytik vorbereitet

werden. In der Praxis ist dies wegen

der äußerst unterschiedlichen Eigenschaften

einzelner Proteine eine immens komplizierte

und schwierige Aufgabe.

Trennung

Die Auftrennung eines so komplexen Proteingemisches,

wie es ein Proteom ist, kann

nur durch Kombination verschiedener

Trenntechniken erreicht werden. Als Stand

der Technik wird heute die hochauflösende

zweidimensionale (2D) Gelelektrophorese

eingesetzt, die neben einem akzeptablen

Zeitaufwand eine unübertroffene Trennleistung

für Proteine bietet. Die Qualität der

Proteinspots, die Auflösung, und auch die

Proteinmengen, die nach der 2D-Elektrophorese

im Gel zu finden sind, hängen von

vielen Parametern ab. Welches Gelsystem

wird unter welchen Bedingungen verwendet:

Ampholine, Immobiline, eingesetzte pH-

Gradienten, welche Geldimensionen, Elektrophoreseparameter

Veränderungen einzelner

Parameter haben einen gravierenden

Einfluß auf die Form und die quantitative

Abb. 1: Darstellung der

Ergebnisse einer

Proteomanalyse. Man

erkennt den quantitativen

Verlauf der Menge für

einzelne ausgewählte

Proteine in fünf

verschiedenen

Proteomzuständen.

Ausbeute einzelner Proteinspots. Als Beispiel

sind die unterschiedlichen Spotmuster

gezeigt, die man erhält, wenn dieselbe Probe

in der ersten Dimension (isoelektrische Fokussierung)

in unterschiedlichen pH-Gradienten

aufgetrennt wird (Abb. 2).

Visualisierung

Die durch 2D-Gelelektrophorese aufgetrennten

Proteine müssen im nächsten Arbeitsschritt

mit einem Farbstoff sichtbar gemacht

werden. Neben der etwas unempfindlicheren

Coomassie Blue-Färbung werden noch

häufig eine Färbung mit Silber, Zn-Imidazol

und neuerdings auch Sypro Ruby eingesetzt.

Mit Coomassie Blue können Proteinspots

mit ca. 100 ng noch gut detektiert werden,

die anderen Färbungen können auch

noch wenige Nanogramm nachweisen. Neben

der Empfindlichkeit ist aber auch noch

der dynamische Bereich wichtig – der Bereich,

in dem eine Zunahme der Proteinmenge

auch eine Zunahme der Färbeintensität

bewirkt, in dem also noch keine Sättigung

vorliegt. Hier zeigen die empfindlichen

Färbungen Silber und Zn-Imidazol einen

sehr geringen quantitative Resultate liefernden

und damit brauchbaren Bereich von

maximal 10 2 . Ganz anders die Fluoreszenz-

Färbung mit Sypro Ruby, die über mehr als

vier Zehnerpotenzen lineare Antworten liefert

und daher immer häufiger für Proteomanalysen

eingesetzt wird.

Leider haben alle Färbungen unterschiedliche

und für die einzelne Proteine ganz spezifische

und selektive Färbeintensitäten, die

eine absolute und zwischen verschiedenen

Färbungen vergleichbare Quantifizierung

verhindern. Daher liefern 2D-Gele prinzipiell

nur relative quantitative Daten, die bei

einem Wechsel der Färbung nicht oder nur

sehr aufwendig abgeglichen werden können.

Scannen

Nach der Färbung müssen die Gele quantitativ

analysiert werden, wobei in den letzten

Jahren eine ausgefeilte Bildverarbeitung für

2D-Gele entwickelt wurde. Die Information,

die in den angefärbten Gelen vorhanden ist,

muß in digitalisierter Form verarbeitet werden.

Dazu werden die Gele gescannt. Für

mit Coomassie Blue, Silber oder Zn-Imidazol

gefärbte Gele können preisgünstige Weißlichtscanner

verwendet werden, die in Dynamik

und Qualität hervorragende Bilder

liefern. Für die Analyse der mit Fluoreszenzfarbstoffen

gefärbten Gele sind allerdings

kostspielige Fluoreszenzscanner notwendig.

Hier hat man die Wahl zwischen

Geräten, die auf verschiedenen Prinzipien

beruhen. CCD-basierte Geräte nehmen um

die Auflösung zu verbessern mit einer hoch

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BR L EI T P Z L O I CR H T

auflösenden CCD-Kamera ein Gel normalerweise

in mehreren Teilbildern auf, die

dann mittels Software zusammengefügt

werden. Diese Systeme sind schnell, empfindlich

und zeigen eine hohe Dynamik,

haben allerdings den Nachteil, daß die einzelnen

Bilder oft leicht unterschiedlichen

Hintergrund aufweisen, der in dem fertig

aufgenommenen Gelbild als leichtes schachbrettartiges

Muster zu erkennen ist. Außerdem

liefern CCD-Kameras etwas diffusere

Spots als die Laserscanner. Diese Art von

Aufnahmegeräten sind Fluoreszenzscanner,

die mit einem Laserstrahl die Gele abrastern.

Sie weisen eine höhere Dynamik als

die CCD-Systeme auf, zeigen schärfere Spots,

sind aber langsamer. Letztendlich sind in

der praktischen Arbeit die Ergebnisse beider

Geräteklassen hervorragend einsetzbar,

die Unterschiede im Detail zwar vorhanden,

für die quantitativen Resultate in der praktischen

Arbeit wenig relevant, da die Genauigkeit

und Reproduzierbarkeit sowohl der

2D-Gele als auch der Bildauswertung deutlich

schlechter sind und damit die quantitativen

Aussagen im wesentlichen bestimmen.

Bildverarbeitung

Abb. 2: Einfluß des pH-

Gradienten in der

isoelektrischen

Fokussierungsdimension

der 2D-Gelelektrophorese

auf die Trennleistung und

die quantitativen

Proteinmengen

Die eingescannten Gelbilder werden im

Computer weiter verarbeitet, um quantitative

Daten für jedes einzelne Proteine zu erhalten.

Diese Aufgabe übernehmen spezialisierte

Bildverarbeitungsprogramme. Alle

sind modular aufgebaut und bestehen im

wesentlichen aus drei Programmpaketen –

der Spoterfassung, der Quantifizierung und

dem Matchen, das heißt dem Vergleichen

mehrerer Gele. Es gibt einige im Markt etablierte

und ausgereifte Programme, die vielfältige

Funktionen bieten, viele Gele auf einmal

vergleichen können und an vielen Punkten

manuelle Interaktionen zulassen:

Imagemaster (Amersham-Pharmacia,

http://proteomics.apbiotech.com)

PD-Quest

(BioRad, http://www.bio-rad.com)

Investigator HT (Genomic solutions,

http://www.genomicsolutions.com)

AIDA Proteomics

(Raytest, http://www. raytest.de)

Phoretix 2D Advanced

(Phoretix, http://www. phoretix.com)

Melanie 3 (GeneBio,

http://www.expasy.ch/melanie).

Diese Programme unterscheiden sich im

Detail in der Benutzeroberfläche und in den

Werkzeugen zur manuellen Interaktion.

Gute Unterstützung wird zur Anbindung

an die Proteinanalytik und ans Internet geliefert.

Relativ neu ist ein Programm das

andere Algorithmen zur Spoterkennung und

zum Matchen der Proteinspots verwendet:

Z3 (Compugen, http://www.2dgels.com).

Dieses Programm verfolgt das Ziel einer

möglichst vollautomatisierten Auswertung

von 2D-Gelen, ist sehr schnell, bietet allerdings

in der jetzigen Version kaum Eingriffsmöglichkeiten

und kann jeweils nur zwei 2D-

Gele vergleichen. Alle Programme sind aber

in permanenter Weiterentwicklung.

Alle Programmen haben gemein, daß sie nicht

in der Lage sind, die vielfältigen Problemzonen

in den 2 D-Gelen quantitativ richtig zu

erfassen (siehe Abb. 3). Daher muß ein enormer

Zeitaufwand für das manuelle Editieren

der Gelbilder geleistet werden, der je nach

Spotanzahl und Qualität des 2D-Gels zwi-

Abb. 3: Automatische

Erkennung von

Proteinspots durch ein

Bildauswerteprogramm.

Man erkennt Regionen, in

denen mehrere Spots nicht

einzeln erfaßt werden oder

größere Spots, die

quantitativ nicht richtig

erfaßt werden. Diese

Positionen müssen

manuell nacheditiert

werden.

schen einer und fünf Stunden beträgt, aber

für das quantitative Ergebnis von entscheidender

Bedeutung ist. Nach der automatischen

Quantifizierung müssen gleiche Spots

aus verschiedenen Gelen einander zugeordnet

werden und Unterschiede erkannt werden

– beides bei den üblichen Verzerrungen

in 2D-Gelen eine nicht einfache und heute

noch nicht vollständig automatisch abzuarbeitende

Aufgabe. Software-Werkzeuge helfen

aber, fehlerhaft zugeordnete Spots zu erkennen

und bieten die Möglichkeit zur manuellen

Korrektur. Die normalisierten quantitativen

Daten der differentiellen Analysen

der einzelnen Proteomzustände werden in

speziellen Datenbanken abgelegt und stehen

in digitalisierter Form für ein weiteres Data-

Mining über Korrelations- und Clusteranalysen

zur Verfügung (siehe auch Abb. 1). In den

letzten Versionen der Bildverarbeitungsprogramme

stehen auch Funktionen für die Datenübergabe

und Ansteuerung von Spotcuttern

zur Verfügung. Diese neu auf dem Markt

befindlichen Geräte können entweder manuell

benannte Spots oder auch automatisch

nach bestimmten Kriterien festgelegte Spots

aus den 2D-Gelen ausstechen und in Mikrotiterplatten

ablegen, von wo sie dann der

Proteinanalytik zur Identifizierung zugeführt

werden.

Zusammenfassung

Der zur Zeit aufwendigste und damit teuerste

Schritt in einer Proteomanalyse ist die

Bildauswertung von 2D-Gelen. Die Bildverarbeitung

kann nur mit qualitativ exzellenten

Gelen sinnvolle quantitative Daten liefern.

Ausgezeichnete Gele und eine optimale

Bildverarbeitung können aber nur mit

Proben erreicht werden, die nicht zu komplex

sind. Daher ist die Reduktion der Komplexität

für eine quantitativ aussagekräftige

Proteomanalyse von entscheidender Bedeutung.

Dies kann schon bei der Planung der

Experimente, über die Probenvorbereitung,

bis zu den ersten Schritten der Trennung

erreicht werden. Selbst mit ausgezeichneten

Gelen und optimaler Bildauswertung ist die

quantitative Reproduzierbarkeit aber auch

noch von den einzelnen Proteinen selbst

abhängig. Generell können aber für die meisten

Proteine bei genügend statistisch abgesicherten

Daten (wenigstens Vierfach-Wiederholungen

jedes 2D-Gels) Unterschiede,

die den Faktor 2 in den unterschiedlichen

Proteomzuständen übersteigen, mit guter

Signifikanz erkannt werden.

Korrespondenzadresse

Dr. Friedrich Lottspeich

Max-Planck-Institut für Biochemie

Proteinanalytik

Am Klopferspitz

D-82152 Martinsried

Tel. 089-8578 3964, Fax: 089-8578-2802

eMail: lottspei@biochem.mpg.de

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BR L EI T P Z L O I CR H T

Standortportrait

Klinische Proteomforschung

MICHAEL O. GLOCKER 1 , BRUNO RINGEL 1 , LUTZ GÖTZE 1 , PETER LORENZ 1 , SILKE WANDSCHNEIDER 1 ,

VOLKER FEHRING 1 , BJÖRN DAMM 1 , MARCUS BANTSCHEFF 1 , SALEH IBRAHIM 1 , J.-MATTHIAS LÖHR 2 UND

HANS-JÜRGEN THIESEN 1

1

PROTEOM-ZENTRUM ROSTOCK, UNIVERSITÄT ROSTOCK, 2 SEKTION MOLEKULARE GASTROENTEROLOGIE,

MEDIZINISCHE KLINIK IV, FAKULTÄT FÜR KLINISCHE MEDIZIN MANNHEIM, UNIVERSITÄT HEIDELBERG

Im BMBF-Leitprojektverbund „Proteom-Analyse des Menschen“ wird die Proteomforschung zur

Entwicklung spezifischer Diagnostik-Methoden und kausaler Therapieansätze für „Rheumatoide

Arthritis“ (RA) sowie andere Autoimmunerkrankungen (z.B. autoimmune Pankreatitis, Multiple

Sklerose (MS), etc.) vorangetrieben. Über die Analyse aller Proteine (dem Proteom) einer Zelle, eines

Gewebes, einer extrazellulären Flüssigkeit bzw. eines Organismus soll ein ursächliches Verständnis

über Autoimmunerkrankungen erhalten werden, um unter Einbindung genomorientierter Daten

prädiktive Aussagen über den individuellen Krankheitsverlauf treffen zu können. Hierzu werden in

einem nationalen Verbund (www.proteome-alliance.de) neue Technologien zur Proteom-Analyse

erarbeitet und im Proteom-Zentrum Rostock für die Anwendung erprobt. Speziell für die Anwendung

im klinischen Umfeld werden Methoden zur Probengewinnung im Operationssaal, zur Probenaufbereitung

(Free-flow-Elektrophorese), zur Probentrennung (zweidimensionale Gelelektrophorese), zur

Proteinvisualisierung (Fluoreszenzfärbungen), zur „Proteinspot“-Isolierung („Spot-Picking“-Robot-System)

und zur Proteinidentifizierung (MALDI-TOF-Massenspektrometrie) entwickelt. Die

Ergebnisse aus der Proteomforschung sollen im Forschungsverbund zur Identifizierung und Charakterisierung

von Suszeptibilitätsgenen und deren Proteinen beitragen und damit zu einer genombasierten

individualspezifischen Therapie dieser Erkrankungen führen.

Key Words: Proteomanalyse, Autoimmunerkrankungen, Rheumatoide Arthritis (RA), Probenvorbereitung,

Proteinanreicherung, Hochauflösende 2D-Gelelektrophorese, Free-flow-Elektrophorese,

Fluoreszenzfärbung

darf daher nur aus sehr wenigen Schritten

bestehen, soll jedoch alle vorhandenen Proteine

so quantitativ wie nur möglich der nachgeschalteten

Analytik zuführen. Aufarbeitungsmethoden

für viele unterschiedliche

(überwiegend nicht-humane) Proteomproben

wurden kürzlich zusammengefaßt publiziert

1 . Der vorliegende Artikel fokussiert auf

die Besonderheiten der Präparation klinischer

Proben für die Proteomforschung. Im folgenden

sollen die Charakteristika der unterschiedlichen

Probenpräparationsverfahren,

deren Vorteile und Einsatzbereiche anhand

klinischer Beispiele beschrieben werden.

Körperflüssigkeiten

Die Proteom-Analyse bzw. die massenspektrometrische

Protein-Analytik ist insbesondere

dann für klinische Untersuchungen erforderlich,

wenn Proteine in Körperflüssigkeiten

zu erfassen und zu charakterisieren sind,

also mangels Zellmaterial keine RNA-Proben

zur Microarray-Chipanalytik erhältlich sind.

Körperflüssigkeiten sind je nach ihrer Herkunft

sehr unterschiedlicher Natur und erfordern

demzufolge speziell angepaßte Aufarbeitungsmethoden.

Während etwa bei Gallen-

bzw. Pankreassaft in erster Linie die hohen

Anteile an Proteasen, der alkalische pH-

Wert der Lösung und der hohe Gehalt an

Das Ziel des Forschungsverbundes „Proteom-Analyse

des Menschen“ innerhalb des

BMBF-Leitprojektes „Therapie und Diagnose

mit den Mitteln der Molekularen Medizin“

ist die Nutzung der Proteom-Analyse

(Analyse der Gesamtheit aller Proteine einer

Entität) zur Entwicklung spezifischer Diagnostik-Methoden

und kausaler Therapieansätze

für ausgewählte Autoimmunerkrankungen

(Rheumatoide Arthritis (RA), autoimmune

Pankreatitis, Multiple Sklerose (MS)).

Der BMBF-Leitprojektverbund „Proteom-

Analyse des Menschen“ will einen wesentlichen

Beitrag zur Ätiopathogenese von Autoimmunkrankheiten

durch die Analyse aller

Proteine – dem Proteom einer Zelle – eines

Gewebes, bzw. einer extrazellulären Flüssigkeit

leisten (unter Einbindung von RNA-Expressionsdaten

(Affymetrix-Microarray-

Chiptechnologie), um damit richtungsweisende

neue Ansätze für die Diagnostik und

kausale Therapieformen zu entwickeln. Hierzu

werden in einem nationalen Verbund

(www.proteome-alliance.de) neue Technologien

zur Proteom-Analyse erarbeitet und im

Proteom-Zentrum Rostock unter klinischem

Bezug erprobt. Die Ergebnisse dieses Forschungsverbundes

sollen zur Identifizierung

und Charakterisierung von Suszeptibilitätsgenen

bzw. deren Proteinen beitragen.

Im Proteom-Zentrum Rostock werden Expertisen

und Methodenkenntnisse aus molekularbiologischen

und proteinbiochemischen

sowie medizinischen Forschungsrichtungen

vereint, um die Gesamtheit aller Proteine

von Patientenproben (Körperflüssigkeiten,

Gewebebiopsien) quantitativ zu erfassen.

Hierzu haben wir Methoden zur Probengewinnung

und -aufbereitung (Freeflow-Elektrophorese),

zur Probentrennung (zweidimensionale

Gelelektrophorese), zur Proteinvisualisierung

(Fluoreszenzfärbungen),

zur Proteinisolierung (Picking-Robot) und

zur Proteinidentifizierung (MALDI-TOF-

Massenspektrometrie) speziell für die Anwendung

im klinischen Umfeld entwickelt.

Unter Zuhilfenahme der international zugänglichen

Gensequenzdatenbanken werden

die gewonnenen Forschungserkenntnisse

direkt der klinischen Praxis zugänglich

gemacht, mit dem Ziel molekulare Ursachen

von Autoimmunerkrankungen aufzudecken

und zu Fortschritten in Diagnose, Prognostik

und Therapie zu führen.

Probenvorbereitung

Für die Beschreibung eines (pathologischen)

Zustandes werden im Proteom-Zentrum Rostock

Proteome (und RNA-Expressionsmuster)

von menschlichen Körperflüssigkeiten

und Gewebeproben mit Hilfe optimierter

Präparationsmethoden und unter standardisierten

Bedingungen für die vergleichende

Analytik gewonnen. Die Proteomforschung

analysiert – anders als die traditionelle Proteinanalytik

– die Gesamtheit der Proteine im

komplexen Gemisch. Die Probenvorbereitung

Abb. 1: 2D-Gelelektrophorese-Proteinmuster

von Pankreassaft eines Patienten mit chronischer

Pankreatitis.

A: pH Bereich 4-7;

B: Zoom-Gel, pH 5,5-6,7. Proteinmenge ca.

50 µg pro Gel. Immobilingele (18 x 20 cm 2 ).

Silberfärbung

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BR L EI T P Z L O I CR H T

Gallensäuren mit ihrer detergenzienähnlichen

Wirkung zu berücksichtigen sind, ist bei der

Synovialflüssigkeit insbesondere der hohe

Anteil an Immunglobulinen und Albuminen

für die Proteinaufarbeitung von Bedeutung.

Beide Körperflüssigkeiten haben jedoch gemeinsam,

daß ihre Proteinkonzentration im

Normalfall ausreichend hoch ist, um sie ohne

weitere Aufkonzentrierung einer 2D-Gelelektrophorese

zuführen zu können. Andere Körperflüssigkeiten,

die diesen Kriterien nicht

Genüge leisten, können durch den Einsatz

von Anreicherungsverfahren für die hochauflösende

2D-Gelelektrophorese vorbereitet

werden (s. Abschnitt Anreicherung niedrig

exprimierter Proteine).

Für die Gewinnung von Pankreassaft hat es

sich als wichtig erwiesen, sofort nach der

Entnahme im Operationssaal die zellulären

Bestandteile durch Zentrifugation in einer

Kühlzentrifuge zu entfernen und den Überstand

aliquotiert bei –80 °C schockzugefrieren.

Zu der noch gefrorenen Probe wird im

weiteren Verlauf der Präparation eine Mischung

aus Proteaseinhibitoren (z.B. Pefabloc

® SC) zugegeben und sofort in Rehydratisierungspuffer

für die isoelektrische Fokussierung

weiter aufgearbeitet. Die anschließende

2D-Gelelektrophorese (Abb. 1A) liefert

nach Silberfärbung zahlreiche Proteinspots

mit gegenüber nach früheren Protokollen

aufgearbeiteten Proben drastisch verringertem

Proteinabbau und ermöglicht so

die detaillierte differentielle Untersuchung

von Patientenproben.

pH 3 pH10 pH 3 pH10

A

B

Abb. 2: 2D-Gelelektrophorese-Proteinmuster

von Synovialflüssigkeit

eines Patienten mit

rheumatoider Arthritis.

A: Synovialflüssigkeit.

Proteinmenge ca. 50

µg. B: Aufkonzentrierte

Free-flow-Fraktionen

aus dem sauren Bereich

(ca. pH 3 - 6,5).

Proteinmenge ca. 60

µg. Ampholytgele (25 x

30 cm 2 ), pH 3-10.

Silberfärbung

Die Proteinkonzentration stellt im Falle des

Pankreassaftes in der Regel keine experimentelle

Limitierung dar, so daß durch die

Verwendung von Zoom-Gelen besonders

interessierende Bereiche mit hoher Auflösung

dargestellt und analysiert werden können

(Abb. 1B). Dies gelingt aufgrund der

guten Probenqualität reproduzierbar mit

kommerziell erhältlichen Zoom-Strips

(Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg)

unter vergleichsweise moderatem Aufwand.

Zellen/Gewebe

Abb. 3: Vergleich von

hochauflösenden

2D-Gel-Proteinmustern

von Synovialflüssigkeit

eines Patienten mit

rheumatoider Arthritis.

A: Ampholytgel

(25 x 30 cm 2 ).

B: Immobilingel

(18 x 20 cm 2 ). Proteinmenge

je ca. 60 µg.

Silberfärbung

Für die Präparation von Proteomen aus Geweben

stehen eine Reihe von Methoden zur

Verfügung, wie etwa die fraktionierte Extraktion

mit Hilfe unterschiedlicher Detergenzien

2 oder die sequentielle Extraktion

durch Anwendung einer Kombination mehrerer

Puffer sowie unterschiedlicher Zentrifugationsbedingungen

3 . Im Proteom-Zentrum

Rostock hat sich die fraktionierte Aufarbeitung

3 für eine Reihe von humanen Gewebeproben

wie auch für Gewebe aus Tiermodellen

bewährt, da hierbei Proteaseinhibitoren

in unterschiedlichen Mengen – angepaßt an

die Notwendigkeiten des jeweiligen Gewebes

– eingesetzt werden können. Zusätzlich

bietet diese Methode die Möglichkeit, Proteine

aus verschiedenen subzellulären Kompartimenten

sequentiell extrahieren zu können.

Als ideal hat sich herausgestellt, daß die

hierdurch erhaltenen Proteinfraktionen der

Immobilin- wie auch der Ampholyt-2D-Gelelektrophorese

gleichermaßen zugeführt

werden können (s. Abschnitt Hochauflösende

Gelelektrophorese). Entscheidend ist, daß

das biologische Material gleich bei der Gewinnung,

also bereits im Operationssaal, in

flüssigem Stickstoff schockgefroren wird und

daß während der Homogenisierung des

Gewebematerials unter schonendsten Bedingungen

gearbeitet wird, um ein frühzeitiges

Auftauen zu vermeiden. Dabei hat es sich als

unerläßlich für den Erfolg der hochaufgelösten

Darstellung von Proteommustern erwiesen,

die noch gefrorene Probe (ca. 150 bis

250 mg) in flüssigem Stickstoff und in Gegenwart

eines Proteaseinhibitorcocktails

(z.B. Pefabloc ® SC) zu zermörsern und die

nach Auftauen erhaltene Lösung am besten

sofort für die isoelektrische Fokusierung

vorzubereiten, etwa durch nachgeschaltete

Ultraschallbehandlung, Zugabe von Harnstofflösung,

Reduktion der Proteindisulfidbrücken,

Zugabe von Ampholyten, etc.

Anreicherung niedrig

exprimierter Proteine

Synovialflüssigkeiten zeichnen sich, ähnlich

wie Plasma, durch einen hohen Anteil an

Immunglobulinen und Albuminen aus. Mit

den oben bereits angesprochenen Präparationsmethoden

für Körperflüssigkeiten lassen

sich jedoch mit dieser Flüssigkeit nur bedingt

2D-Proteinmuster mit guter Qualität und

hoher Auflösung erzeugen. Die aus diesen

Proben erzeugten 2D-Proteinmuster sind

häufig trotz geringer eingesetzter Gesamtproteinmenge

im Bereich der Immunglobuline

und Albumine drastisch überladen, während

in den übrigen Bereichen im 2D-Gel

kaum Proteine nachweisbar sind (Abb. 2A).

Charakteristisch für das Vorhandensein überladener

Bereiche ist das Fehlen getrennter

Proteinspots anstelle derer sich intensiv gefärbte

„Proteinkleckse“ mit einer Vielzahl sich

überlagernder Proteine abzeichnen.

Neueste Methoden für die Anreicherung von

gering exprimierten Proteinen aus Synovialflüssigkeit

bei gleichzeitiger Abtrennung von

im Übermaß gegenwärtigen Proteinspezies

wurden mit Hilfe der Free-flow-Elektrophorese

4 im Proteom-Zentrum Rostock entwickelt 5 .

So werden beispielsweise Körperflüssigkeiten

(Plasma, Synovialflüssigkeit) durch kontinuierliche

isoelektrische Fokussierung in

der Free-flow-Apparatur vorgetrennt und

ausgewählte Fraktionen durch Ultrafiltration

aufkonzentriert. Dabei werden insbesondere

im sauren Bereich Proteinproben erzeugt,

denen auf effiziente Art und Weise

die Albumine und Immunglobuline weitestgehend

entfernt wurden und somit störende

Überlagerungen reduziert. Nach für die Immobilin-

bzw. Ampholyttechnik jeweils spe

8 | Nr. 4/2000 |transkript LABORWELT


BR L EI T P Z L O I CR H T

Abb. 4: Fluoreszenzscan

eines 2D-Gel-Proteinmusters

von Synovialflüssigkeit

eines Patienten

mit juveniler chronischer

Arthritis. Proteinmenge

ca. 60 µg. Immobilingel

(20 x 18 cm 2 ).

Sypro ruby ® -Färbung.

Fuji FLA 3000-Fluoreszenzscanner:

Anregungswellenlänge

473 nm,

Emmissionswellenlänge

675 nm. Die Ausschnittsvergrößerungen

zeigen

Proteinspots mit

variierenden Durchmessern

von 0,2 bis 1,0 mm.

zifischer Weiterbehandlung der Proteinkonzentrate

werden hochauflösende 2D-Gelelektrophoreseläufe

(Abb. 2B) durchgeführt

(s. Abschnitt Hochauflösende Gelelektrophorese).

Unsere Untersuchungen zeigten, daß

– anders als bei den Pankreassaftproben –

die Erhöhung der Ortsauflösung allein durch

Anwendung von Zoom-Gelen (s. Abschnitt

Probenvorbereitung) nicht zum gewünschten

Erfolg führten. Die durch den Einsatz

der Free-flow-Elektrophorese erzielten Anreicherungen

an niedrig exprimierten Proteinen

waren dagegen sowohl im hochmolekularen

(Kasten I) als auch im niedermolekularen

Bereich (Kasten II) hocheffizient.

Hochauflösende

2D-Gelelektrophorese

Die 2D-Gelelektrophorese ist die zur Zeit

einzige Trenntechnik, die in der Lage ist, ein

hochkomplexes Gemisch aus Proteinen in

bis zu 10.000 unterscheidbare Proteinspots

zu trennen. Diese Zahl entspricht in etwa

der Gesamtzahl der Gene in einfachen Organismen

(z.B. Bakterien, Hefe, etc.). Für die

klinische Proteomanalyse ist die hochauflösende

2D-Gelelektrophorese für eine Reihe

von Untersuchungen, insbesondere für die

Analyse von „Partial“-Proteomen, in vielen

Fällen ebenfalls ausreichend. Die beiden häufigsten

2D-Gelelektrophoresemethoden, die

Ampholyt-Technik 6 und die Immobilin-

Technik 7 werden nachfolgend in bezug auf

ihre Anwendung für klinische Proben beschrieben.

A

B

Ampholyt-Technik

Die Ampholyt-Technik wurde bereits Mitte

der siebziger Jahre entwickelt 8 . Die Vorteile

dieser Methode für die klinische Proteomforschung

bestehen vor allem in ihrer Flexibilität,

die insbesondere für die Methodenentwicklung

von Bedeutung ist. Im Proteom-

Zentrum Rostock werden neue Probenpräparationsmethoden,

wie etwa die Kombination

der hochauflösenden 2D-Gelelektrophorese

mit Proteinvortrennungsmethoden,

daher häufig zuerst mit der Ampholyt-Technik

durchgeführt. Spezielle Randparameter,

wie Probenauftragevolumen, Beimischungen

von Inhaltstoffen zum Auftragepuffer

aus Vortrennungsmedien, frei wählbare pH-

Gradienten etc. können mit der Ampholyt-

Technik über einen breiten Bereich variiert

werden, bis die für den jeweils spezifischen

Einsatzbereich (Körperflüssigkeit, Gewebe)

optimierte Methode experimentell bestimmt

ist. Aufgrund der experimentellen und apparativen

Freiheiten können darüber hinaus

Gele mit nahezu beliebigen Dimensionen

und sehr guter räumlicher Auflösung erzeugt

werden (Abb. 3).

Immobilin-Technik

Die Immobilin-Technik 9 zeichnet sich, im

Gegensatz zur Ampholyt-Technik, durch die

einfache Handhabung und hervorragende

Reproduzierbarkeit aus, da die hier verwendeten

Gele industriell vorgefertigt erhältlich

sind. Obwohl die Variationsmöglichkeiten

Abb. 5: A. Automatische

Exzision von Proteinspots

mit Hilfe des

Flexys ® Robots von Genomic

Solutions.

B. Darstellung eines

Gelausschnitts nach erfolgter

Exzision. Stanzdurchmesser:

1,2 mm.

dadurch eingeschränkt sind, ist dies die

Methode der Wahl für den routinemäßigen

Einsatz der 2D-Gelelektrophorese in der klinischen

Proteomforschung. Mit standardisierten

Arbeitsprotokollen (Standard Operating

Procedures, SOPs), wie sie im Proteom-Zentrum

Rostock erarbeitet und in Verbindung

mit einem eigens entwickelten „Laboratory

Information and Management System

(LIMS)“ eingesetzt werden, stellen sie

die Grundvoraussetzung für die routinemäßige

klinische Proteomforschung dar. Die

jeweils eingestellten fixen Trennparameter

orientieren sich dabei meist, wie oben beschrieben,

an den mit Hilfe der Ampholyt-

Technik optimierten Trennmethoden, so daß

die 2D-Trennungen zu vergleichbar guten

Ergebnissen gelangen (Abb. 3).

Fluoreszenzfärbung, Spot-picking

und Bildverarbeitung

Zur Detektion von Proteinspots mit hoher

Nachweisempfindlichkeit werden neben

herkömmlichen Färbeverfahren (Coomassieblue,

Silberfärbung) im Proteom-Zentrum

Rostock neue Fluoreszenzfärbemethoden 10

entwickelt und für die klinische Proteomforschung

eingesetzt 11 .

Fluoreszenzfärbemethoden können in zwei

Kategorien, die prä- und post-Separationsfärbung,

unterteilt werden. In unseren jüngsten

Untersuchungen wurden bereits vielversprechende

Ergebnisse erzielt, insbesondere

für den Einsatz von kovalent an Protein

gebundenen Fluoreszenzfarbstoffen. Hierbei

konnte die Nachweisgrenze auf ca. die

Hälfte derer mit Silberfärbung bzw. kommerziell

erhältlichen Fluoreszenzfarbstoffen

(Abb. 4) gesenkt und somit deutlich verbessert

werden.

Vorbedingung für den Einsatz fluoreszenzgefärbter

Proteingele ist die Verwendung

spezieller Fluoreszenzscanner, die derzeit

noch hohe Anschaffungskosten mit sich

bringt. Dies wird jedoch durch Vorteile aufgewogen

wie

einfach zu handhabende und standardisierbare

Färbeprotokolle

ein großer dynamischer Bereich der Färbung,

mit Hilfe dessen auch in Gegenwart

von stark exprimierten Proteinen

niedrig exprimierte Proteine quantitativ

erfaßt werden können und

geringe Diskriminierung in der Anfärbung

von Proteinen trotz großer Unterschiede

in deren physikalischen Eigenschaften.

Ein Vorteil der Fluoreszenzfärbung ist die

problemlose Verwendung der so markierten

Proteine für den nachfolgenden in-gel-

Verdau und die massenspektrometrische

Identifizierung 12,13 .

Allerdings ist die Excision der fluoreszenzmarkierten

Proteinspots aus dem Gel manuell

nur sehr schwierig zu bewerkstelligen.

10 | Nr. 4/2000 |transkript LABORWELT


BR L EI T P Z L O I CR H T

ständen unverändert, aber aufgrund von Migrationsunterschieden

in den Gelen verschoben sind (Abb. 6). Die Entwicklung neuer

Bioinformatik-Lösungen für die Proteomforschung, zu denen auch

Bildauswerte-Programme der nächsten Generation gehören, wird

eine Hauptzielsetzung in dem unter Federführung des Proteom-

Zentrum Rostock neu errichteten Landesforschungsschwerpunkt

Mecklenburg-Vorpommern „Genomorientierte Biotechnologie“ sein.

Abb. 6: Überlagerung zweier 2D-Gele (Ampholytgele) mit unterschiedlichen

Proteinexpressionsmustern aus zwei unterschiedlichen Zellkulturen.

In beiden Gelen übereinstimmende Proteinspots sind durch Vektoren verbunden.

Proteinspots, die nur in einem der beiden Gele erscheinen sind

schwarz hervorgehoben.

Abhilfe schaffen hier die seit kurzem kommerziell erhältlichen „Spot-

Picking Robot“-Geräte, die sehr präzise Proteinspots bzw. deren

Kern aus der Gelmatrix herausstanzen können (Abb. 5). Ein weiterer

Vorteil des Einsatzes von automatisierten „Spot-Picking Robot“-

Systemen ist die dadurch erreichbare Reduzierung an Proteinkontaminationen

(z.B. Keratine aus der Haut oder Wollkleidung), die die

massenspektrometrische Identifizierung von Proteinen mit hoher

Nachweisempfindlichkeit, wie sie in der Proteomforschung erforderlich

ist, ansonsten verhinderten. Die „Spot-Picking Robot“-Geräte

der ersten Generation arbeiten zuverlässig mit Kamerasystemen,

die ausreichend intensiv gefärbte Proteinspots im sichtbaren Bereich

detektieren.

Für die Untersuchung von fluoreszenzgefärbten Proteinspots und

somit auch für die Analyse gering exprimierter Proteine wurde im

Proteom-Zentrum Rostock ein Verfahren entwickelt, wodurch die

Koordinaten aus den Fluoreszenzscan-Bildern per Bildanalyse-Software

(vgl. Abb. 6) semi-automatisch ermittelt und dem „Spot-Picking

Robot“-Gerät auf elektronischem Wege zur präzisen Exzision der

Proteinspots aus dem Gel übertragen werden. Vielversprechend für

die Automatisierung des „Spot-Pickings“ fluoreszenzgefärbter Proteine

ist das im Endstadium der Realisierung stehende System mit

integrierter Fluoreszenzdetektionsoptik der Firma Herolab

(www.herolab.de), das zusammen mit dem Proteom-Zentrum Rostock

im Rahmen des BMBF-Leitprojektverbundes „Proteom-Analyse

des Menschen“ entwickelt und für die klinische Proteomforschung

eingesetzt werden wird. Auch für die Software-unterstützte

Quantifizierung von Proteinspots im Gel bietet die Fluoreszenzfärbung

aufgrund des oben erwähnten hohen dynamischen Bereichs

deutliche Vorteile.

Die mit Fluoreszenzdetektionssystemen verbundenen höheren Anforderungen

an bestehende Bildauswertungs-Programmsoftware 14

umfaßt unter anderem die Entwicklung neuer „Peak-matching“-

Algorithmen, mit deren Hilfe Proteinspots aus mehreren Gelen einund

desselben Proteinexpressionsmusters mit Proteinspots mehrerer

Gele eines zweiten Proteinexpressionsmusters überlagert werden

können. Das Ziel ist, die durch Vergleich zweier unterschiedlicher

Expressionszustände in ihrer Expression veränderten Proteinspots

von solchen zu unterscheiden, die in beiden Expressionszu-

Ausblick

Zusammenfassend kann man feststellen, daß eine Reihe von Methoden

zur Präparation von Proteomen aus Geweben entwickelt wurden,

die für die klinische Proteomforschung adaptierbar sind und

wovon sich einige im Proteom-Zentrum Rostock bereits in der routinemäßigen

Anwendung bewähren. Der Einsatz neuester Entwicklungen

und Verbesserungen aus dem gerätetechnischen Bereich, etwa

von neuen fluoreszenzbasierten Detektionsmethoden, erfordert jedoch

die ständige Optimierung von Arbeitsprotokollen für die effiziente

Präparation klinischer Proben.

Die moderne Proteomforschung ist durch intensive Kooperationen

zwischen sich spezialisierenden Wissenschaftsdisziplinen bestimmt

und eröffnet insbesondere durch die als Schlüsseltechnologie zu

verstehende massenspektrometrische Proteinstrukturanalytik einen

neuen wissenschaftlichen Ansatz zur Lösung medizinisch relevanter

Fragestellungen. Dabei sind umfassende Kenntnisse über Identität

der an komplexen zellulären Vorgängen beteiligten Biomakromoleküle

sowie über deren dreidimensionalen Strukturen von entscheidender

Bedeutung. Großes Anwendungspotential besitzen daher

neue chemisch-analytische, insbesondere auf der Massenspektrome

|transkript LABORWELT Nr. 4/2000 | 11


BR L EI T P Z L O I CR H T

trie basierende Methoden, die zur klinischen

Praxis voll kompatibel sind und darüber hinaus

hohe Nachweisempfindlichkeit, Automatisierbarkeit,

„High-throughput screening“-Verfahren

usw. ermöglichen sowie molekulare

Informationen über Strukturen, Molekülwechselwirkungen

und Struktur- /

Funktionskorrelationen liefern können.

Für die Weiterentwicklung der Proteomforschung

wird es von zunehmender Bedeutung

sein, inwieweit es ihr gelingt, sich künftig nicht

nur im pharmazeutischen und diagnostizierenden,

sondern auch im medizinisch-therapeutischen

Kontext als eine herausragende

Forschungsrichtung zu profilieren.

Danksagung: Wir danken Frau K. Böttcher,

Frau S. Jakobs-Emeis und Frau M. Sieb für

exzellente technische Unterstützung. Wir

danken dem Bundesministerium für Bildung

und Forschung für die finanzielle Unterstützung

(FKZ 01GG9831).

Literatur

[1] Link, A.J. (Hrsg.), 2-D Proteome Analysis Protocols

(1999), Humana Press, Totowa, New Jersey.

[2] Ramsby M.L., Makowski, G.S., in: 2-D Pro-teome

Analysis Protocols (1999), Hrsg. Link, A.J.,

Humana Press, Totowa, New Jersey, pp 53-66.

[3] Klose, J., in: 2-D Proteome Analysis Protocols

(1999), Hrsg. Link, A.J., Humana Press, Totowa,

New Jersey, pp 67-86.

[4] Hannig, K., Heidenreich, H.G. (Hrsg.), Free-flow

Electrophoresis (2000), GIT Verlag, Darmstadt.

[5] Ringel, B., Glocker, M.O., Weber, G., Kekow,

J., Thiesen, H.-J., 4 th Siena Meeting „From Genome

to Proteome“ (2000), 274-275.

[6] Klose, J., in: 2-D Proteome Analysis Protocols

(1999), Hrsg. Link, A.J., Humana Press, Totowa,

New Jersey, pp 147-172.

[7] Görg, A., Weiss, W., in: 2-D Proteome Analysis

Protocols (1999), Hrsg. Link, A.J., Humana

Press, Totowa, New Jersey, pp 189-196.

[8] Klose, J., Humangenetik 26 (1975), 211-243.

[9] Görg, A., Postel, W., Günther, S., Electrophoresis

9 (1988), 531-564.

[10] Steinberg, T.H., Chernokalskaya, E., Berggren,

K., Lopez, M.F., Diwu, Z., Haugland, R.P.,

Patton, W.F., Electrophoresis 21 (2000), 486-496.

[11] Götze, L. Bantscheff, M., Arden-Jacob, J.,

Drexhage, K.-H., Glocker, M.O., Thiesen, H.-J. 4 th

Siena Meeting „From Genome to Proteome“

(2000), 296-297.

[12] Bantscheff, M., Weiss, V., Glocker, M.O.

Biochemistry, 38 (1999), 11012-11020.

[13] Bantscheff, M., Ringel, B., Schnabel, R.,

Thiesen, H.-J., Glocker, M.O., 4 th Siena Meeting

„From Genome to Proteome“ (2000), 212-213.

[14] Appel, R.D., Hochstrasser, D.F., in: 2-D Proteome

Analysis Protocols (1999), Hrsg. Link, A.J.,

Humana Press, Totowa, New Jersey, pp 363-381.

Korrespondenzadresse

Prof. Dr. Michael O. Glocker

Proteom-Zentrum Rostock/Universität Rostock

Joachim-Jungius-Str. 9, D- 18059 Rostock

Tel:. 0381 - 4059 770, Fax: 0381 - 4059 686

eMail: michael.glocker@med.uni-rostock.de

www.proteome-alliance.de

Proteomics

Massenspektrometrische Verfahren

in der Proteinanalytik

und der Proteomanalyse

DR. MARION JÜRGENS UND DR. DETLEV SUCKAU, BRUKER DALTONIK GMBH, BREMEN

Die Massenspektrometrie (MS) hat sich als zentrales Werkzeug für die Identifizierung von Proteinen

und die Aufklärung der Proteinstruktur inklusive Modifikationen etabliert. Heutige Systeme tragen

dabei auch den speziellen Anforderungen der Proteomforschung Rechnung und sind als Plattform für

die automatisierte Hochdurchsatz-Analytik ausgelegt.

Heute lassen sich eine Vielzahl analytischer

Aufgaben mittels Massenspektrometrie

(MS) lösen, darunter:

Die vollständige Charakterisierung der

Primärstruktur, einschließlich Modifikationen

und Crosslinks.

Die schnelle Identifizierung von Proteinen

in der Proteomanalytik (Hochdurchsatz-Screening).

Dazu ist die Massenspektrometrie

einer 2D-Gelelektrophorese

oder Chromatographie nachgeschaltet.

Probenpräparation, Spektrenaufnahme

und Datenauswertung

erfolgen vollautomatisch.

Abb. 1: Das für die Hochdurchsatz-Analytik

konzipierte MALDI-TOF-Gerät autoflex ® , hier

mit Roboter für automatischen Probenträgerwechsel.

Die Aufklärung von Tertiärstrukturen

(Faltung) und Quartärstrukturen (Protein/Protein-Interaktionen).

Auch auf

diesem Gebiet erweist die Massenspektrometrie

in der Forschung als äußerst

leistungsfähig; dies soll hier jedoch nicht

weiter erörtert werden.

Die wesentlichen Vorteile massenspektrometrischer

Verfahren sind:

Spezifität der Analysenergebnisse durch

Massenbestimmung eines chemisch eindeutigen

Moleküls

Schnelligkeit

geringe laufende Kosten, wenig Verbrauchsmaterial

Empfindlichkeit bis in den sub-femtomol-

Bereich

Direkter Zugang auch zu N-terminal blokkierten

Proteinen.

Massenspektrometrische

Verfahren für die Proteinanalytik

MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/

Ionization) und ESI (Electrospray Ionization)

sind die zwei etablierten Ionisierungsverfahren

zur massenspektrometrischen Untersuchung

von Proteinen und deren proteolytischen

Abbaugemischen (Digest). Die

sich an die Ionenerzeugung anschließende

Massenanalyse erfolgt im Flugzeit- (TOF und

oTOF), Quadrupol- (Q), Ionenfallen- (IT)

oder Fourier-Transform- (FTMS oder FT-

ICR) Massenspektrometer. MALDI-TOF

ist dabei die massenspektrometrische Basistechnologie

für die Proteinanalytik. Hohe

Massengenauigkeit, Empfindlichkeit, Geschwindigkeit

und Automatisierung der

Analyse ermöglichen ein bequemes und

schnelles Probenscreening. Ein leistungsfähiges

MALDI-TOF-System ist aber auch für

die vertiefte Strukturuntersuchung einsetzbar:

Post-Source Decay (PSD) ist eine auf

dem MALDI-TOF verfügbare MS/MS-Methode,

mit der aus Fragmentionen heute bereits

vollautomatisch Sequenzinformationen

erhalten werden können.

ESI-MS ist vielseitig einsetzbar und eher für

den niedrigeren Probendurchsatz geeignet.

Die wesentliche Stärke resultiert aus der direkten

(online-)Kopplung mit elektrophoretischen

oder chromatographischen Verfah

12 | Nr. 4/2000 |transkript LABORWELT


BR L EI T P Z L O I CR H T

ren wie CE oder nanoLC und der parallelen

Akquisition von MS- und MS/MS-Daten

während ein- und desselben chromatographischen

Laufs. Dies führt zu sehr

detaillierten und umfangreichen Informationen

über die Primärstruktur. Wichtigste

Technologien für die Proteinanalytik

sind ESI-QTOF (hohe Massengenauigkeit,

MS/MS = MS 2 ) und ESI-Ion Trap (hohe

Empfindlichkeit und Analysetiefe durch

MS n , mit n=2-7).

Spezielle Technologien

Abb. 2: Speziell für die

ESI-MS-Analyse kleinster

Proteinmengen

entwickelt: eine Nano-

Electrospray-Quelle.

ESI-TOF ist besonders zur Untersuchung

von Protein-Protein-Interaktionen geeignet.

ESI-TripleQuad ist durch die Verfügbarkeit

von „linked scans“ sowohl für die

Quantifizierung als auch für das Screening

nach phosphorylierten Peptiden geeignet.

MALDI/ESI-FTMS ist die aufwendigste

MS-Technologie; mit unübertroffener

Auflösung und Massengenauigkeit liefert

sie die präzisesten Ergebnisse. Sie ist

universell einsetzbar, jedoch mit eher niedrigem

Probendurchsatz und Automatisierungsgrad.

Charakterisierung der

Primärstruktur

Typische Fragestellungen der Proteinstrukturanalytik

lauten:

Stimmt die tatsächliche Sequenz mit der

erwarteten (z.B. aus der cDNA oder genomischen

DNA abgeleitete Sequenz)

überein

Sind die Termini korrekt prozessiert oder

modifiziert Gibt es posttranslationale

Modifikationen Welche Disulfid-Brükken

liegen vor

Enthält die Probe Nebenprodukte, z.B.

weitere Proteine

Die generelle MS-basierte Vorgehensweise zur

Bearbeitung dieser Fragestellungen (Abb. 3):

Abb. 3: Strategie zur

vollständigen

Charakterisierung einer

Primärstruktur mittels

Massenspektrometrie

1. Bestimmung der Molekülmasse des intakten

Proteins und Vergleich mit der Masse des

erwarteten Proteins. Die Massenspektrometrie

erlaubt eine sehr exakte Bestimmung

der Molmasse. Stimmt diese nicht mit der

erwarteten Masse überein, so ist eine Abweichung

von der Referenzstruktur anzunehmen,

die nun in weiteren Schritten charakterisiert

werden kann. Dazu können sowohl

MALDI-TOF MS als auch ESI-MS eingesetzt

werden. ESI-Verfahren sind dabei genauer,

aber empfindlicher gegenüber Verunreinigungen

wie durch Salze.

2. Durch die massenspektrometrische Untersuchung

des Protein-Digests können vertiefte

Sequenzinformationen erhalten werden.

Je nach Zielsetzung sind verschiedene

Methoden zu bevorzugen: Zur schnellen

Identifizierung oder Absicherung der Identität

mittels Peptide Mapping (siehe auch

weiter unten) setzt man MALDI-TOF, oTOF

oder FTMS ein. Viele Fragestellungen lassen

sich auf dieser Ebene bearbeiten; erst wenn

dies nicht ausreichend ist, wird man sich im

weiteren auf online- oder offline-LC-gekoppelte

MS-Peptide Maps stützen. Eine möglichst

vollständige Sequenzabdeckung wird

dagegen mit LC-ESI-MS (IT oder oTOF) oder

offline-LC-MALDI erzielt.

3. Die Fragmentanalyse der proteolytischen

Peptide mittels MS/MS ermöglicht die exakte

Lokalisierung von Modifikationen und

deren Identifizierung (LC-ESI-MS/MS mit

IT bzw. QTOF, oder offline-LC-MALDI-

PSD). Zum Screening nach Phosphorylierungen

ist LC-MS/MS mit einem Triple-

Quad-MS besonders geeignet. MALDI-TOF-

In Source Decay (ISD) intakter, insbesondere

auch rekombinanter, Proteine gestattet im

Gegensatz zur Edman-Methode, Sequenzinformation

aus der Nähe des N-Terminus

zu erhalten (Abb. 4).

Proteomanalytik

Die gängige Strategie für die massenspektrometrische

Proteomanalytik sieht zwei Stufen

vor. Das MALDI-TOF übernimmt dabei das

Screening mit hohem Durchsatz mittels Peptide

Mapping. Die Identifizierung läuft über

Suchen in Proteinsequenzdatenbanken. Bei

unklaren Ergebnissen sowie zur Aufklärung

von Modifikationen (s.o.) wird dann zumeist

ESI-MS/MS eingesetzt; MALDI-PSD kann

jedoch ebenfalls vorteilhaft verwendet werden,

ohne die Proben erneut präparieren zu

müssen. Die typischen Schritte einer derartigen

Analyse sind in Abbildung 5 dargestellt.

Dazu gehören 2D-Gelelektrophorese, Ausstech-

und Digestroboter, MALDI-Präparationsroboter,

MALDI-TOF-MS mit PSD und

ESI-MS/MS-System sowie Software für automatisierte

Dateninterpretation und Recherche

in der hausinternen Datenbank. Derartige

Verfahren werden gegenwärtig in regelrechten

„Proteomik-Fabriken“ zur weitgehend

automatischenAnalyse integriert.

14 | Nr. 4/2000 |transkript LABORWELT


BR L EI T P Z L O I CR H T

Abb. 4: Charakterisierung eines rekombinanten Proteins.

(1) Das gemessene Intakt-Molekulargewicht (hier: FTMS-Spektrum)

stimmt nicht mit der erwarteten Masse überein!

(2) Die Peptide Map zeigt jedoch weite Bereiche mit korrekter Struktur

des erwarteten Protein A (rot markiert: im Digest gefundene Sequenzabschnitte).

(3) Im MALDI-ISD-Spektrum (Reflektormodus) zeigt sich: Tatsächlich

liegt ein Fusionsprotein aus β-Glucuronidase und Protein A vor, das

N-terminal methyliert ist. Die Berücksichtigung derartiger Informationen

führte zu einer Struktur von rekombinantem Protein A, die das

gemessene Molekulargewicht bestätigt.

1. Stufe: MALDI-TOF Peptide Mapping

Beim tryptischen Verdau eines Proteins entstehen Spaltpeptide,

die in einem Massenbereich von 800 bis 4.000 Da zur Identifizierung

herangezogen werden – die sogenannte Peptide Map. Zum

Vergleich werden die Proteinsequenzen der Datenbank im Computer

sozusagen virtuell „verdaut“: die Massen der tryptischen

Peptide werden berechnet. Als Ergebnis des Vergleichs entsteht

eine Vorschlagsliste der möglicherweise gefundenen Proteine mit

Bewertungszahlen (Score).

Folgende vollautomatisch erfolgende Interpretationen der Suchergebnisse

sind dabei möglich:

+ Das Protein ist eindeutig identifiziert; die Sequenzabdeckung

ist befriedigend.

(+) Ein Protein wurde mit gewisser Signifikanz identifiziert, z.B.

aber als Protein einer anderen Spezies. Für die Spezies der

Suche ist das Protein noch nicht bekannt. Ein sehr wertvolles

Ergebnis, das etwa Informationen zur künftigen Klonierung

liefern könnte. Oder aber es bleiben nicht direkt erklärbare

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BR L EI T P Z L O I CR H T

Signale im Spektrum. Diese stammen möglicherweise

aus Verunreinigungen

durch andere Proteine oder von modifizierten

Peptiden. Hier sollten sich

weitere MS/MS-Untersuchungen anschließen.

(-) Die Analyse ist auf Ebene der Peptide

Map gescheitert. Mindestens eines der

Peptide sollte nun weiter mittels Fragmentanalyse

in einem zweiten Schritt

untersucht werden, um eine eindeutige

Identifizierung herbeizuführen.

Zur Zeit können mittels Peptide Mapping

etwa 50 bis 90 % der Proteine aus einem Gel

vollautomatisch identifiziert werden, mit einem

Probendurchsatz von bis zu etwa 2.000

Proben pro Tag und MALDI-TOF-Gerät.

2. Stufe: MS/MS-Fragmentanalysen

Im Falle einer unklaren Identifizierung

schließen sich Fragmentanalysen an. Dabei

werden die relevanten Peptide im Massenspektrometer

isoliert und meist an den

Peptidbindungen fragmentiert. Die entstandenen

Fragmentionen lassen sich genauso

zur Identifizierung mittels Proteinsequenzdatenbanken

heranziehen wie die

Peptide Map; allerdings reicht hierbei meist

schon ein einziges Peptid aus. Daher sind

so auch noch Identifizierungen möglich,

wenn die Peptide Map allein zu wenige

geeignete Peptide enthält.

Mittels MALDI-TOF-PSD können so weitere

10 bis 20 % der untersuchten Proteine

anhand der schon vorher verwendeten

Digestprobe identifiziert werden. Künftig

wird hier möglicherweise auch MALDI-

QTOF-CID einsetzbar sein. Für den nächsten

Schritt, die Fragmentanalyse mittels

ESI-MS/MS, werden QTOF, Ionenfalle oder

TripleQuad mit Nano-Electrospray eingesetzt.

Abb. 5: Analytische Strategie für Proteomik.

Ausgangsmaterial für alle massenspektrometrischen

Analysen ist der tryptische Verdau des

Proteins. Am Ende steht eine bewertete

Ergebnisliste.

Faktoren für die erfolgreiche

Proteinidentifizierung

Für einen hohen Durchsatz an erfolgreich

analysierten Proben muß eine möglichst hohe

Erfolgsquote bei der MALDI-Peptide Map

erreicht werden, damit die Notwendigkeit

der zeitaufwendigen ESI-MS/MS so weit

wie möglich reduziert werden kann. Da die

Eindeutigkeit der Ergebnisse aus der Datenbanksuche

eng an die Qualität der Meßdaten

geknüpft ist („junk in - junk out!“), sollte

die Datenqualität hierbei möglichst hoch

sein. Folgende Faktoren sind hierfür ausschlaggebend:

Geschwindigkeit: Eine intelligente Automatisierung

sorgt bei der MALDI-TOF-

Spektrenakquisition für die Optimierung

der Meßparameter während der

Messung, so daß Spektren einer definierbaren

Mindestqualität schnell erhalten

werden. Besonders gut bewährt

hat sich hier eine Fuzzy Logic-basierte

Akquisitionssteuerung (ca. 20-30 sec/

Gelprobe), die sich verhält wie ein erfahrener

Experte.

Empfindlichkeit: Durch eine deutliche

Empfindlichkeitssteigerung mit der AnchorChip-Technologie

zur Probenvorbereitung

für MALDI-TOF konnte die

Identifizierungsrate im automatisierten

Routinebetrieb bei Proteinmengen von

weniger als 1 fmol (MS) bzw. 1-10 fmol

(MS/MS) dramatisch verbessert werden

(Abb. 6).

Massengenauigkeit: Bei einem MALDI-

FTMS-Spektrum (ca. 1 ppm Massenfehler,

extern kalibriert) mögen zwei bis drei

Peptidmassen für eine Identifizierung

ausreichend sein, bei MALDI-TOF (ca.

10-20 ppm, intern kalibriert) sind es eher

vier bis sieben Peptide.

Fazit

Die Massenspektrometrie leistet sowohl die

umfassende Charakterisierung einzelner

Proteine als auch das Screening im Bereich

der Proteomforschung. Unter der Vielzahl

der massenspektrometrischen Technologien

nimmt heute die MALDI-TOF-MS die

Rolle des Basiswerkzeugs für die Proteinund

Proteomanalytik ein. Auch unter den

Methoden für die Genomforschung stellt

sie eine herausragend schnelle Methode

dar (ca. 10.000 SNP-basierte Genotypisierungen/Tag

und Gerät). Ergänzt wird sie

durch ESI-Methoden – derzeit vor allem

QTOF und Ionenfalle –, die besonders zur

Detailcharakterisierung von Proteinen

unabdingbar sind.

Abb. 6: Steigerung von Empfindlichkeit und

Erfolgsquote bei der MALDI-TOF-Analytik

durch AnchorChip-Probenpräparation:

Identifizierung von BSA mittels Peptide

Mapping aus dem Digest. Ergebnisse der

Präparation unterschiedlicher

Probenmengen.

(a) 0,3-10 fmol auf üblichem

Stahl-Probenträger,

(b) 0,3 fmol auf AnchorChip-Probenträger

(Grün: Sicher identifiziert, Gelb: unsicher,

Rot: nicht identifiziert, Grau: keine

detektierbaren Peptide, Weiß: Kalibrant).

(c) Ein AnchorChip-Target enthält kleine

hydrophile Bereiche (Durchmesser 200–800

µm), die von einer hydrophoben Schicht

umgeben sind. Dies führt bei der

Probenpräparation zum Zusammenschrumpfen

des Probentröpfchens, zur Aufkonzentrierung

des Analyten und damit zu einer ca. 20fachen

Empfindlichkeitssteigerung.

Korrespondenzadresse

Dr. Detlev Suckau

Bruker Daltonik GmbH

Fahrenheitstraße 4

D- 28359 Bremen

Tel.: 0421-2205 200

Fax: 0421-2205 104

eMail: dsu@bdal.de

16 | Nr. 4/2000 |transkript LABORWELT


BR L EI T P Z L O I CR H T

Trend

Proteomforschung:

Zellbiochemische Methoden

gewinnen an Bedeutung

MATHIAS DREGER, INSTITUT FÜR CHEMIE – BIOCHEMIE, AG NEUROCHEMIE, FREIE UNIVERSITÄT BERLIN

Die Identifizierung von Proteinen mit proteinchemischen Methoden ist durch den Einsatz immer

empfindlicherer und genauerer Massenspektrometer und der Möglichkeit eines immer höheren

Probendurchsatzes erfolgreich wie nie zuvor. Jedoch bleibt der inhaltliche Anspruch der Proteomik,

nämlich die vollständige Beschreibung der Proteinausstattung eines untersuchten Systems in dem

Zustand zum Zeitpunkt der Untersuchung, bislang eher ein ehrgeiziges Ziel. Aufgrund der Sichtbarkeit

der Leistungsgrenzen, insbesondere hinsichtlich der aktuell dominierenden Separationstechnik,

zeichnet sich ein zusätzlicher Bedarf an alternativen experimentellen Strategien in der Proteomanalyse

ab.

Die Proteomanalyse „der ersten Generation“

basiert auf drei Kerntechnologien:

Mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese

werden die Proteine aufgetrennt bzw.

dargestellt. Die Trennung erfolgt mittels

isoelektrischer Fokussierung in der ersten

und SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

in der zweiten Dimension (2D-

IEF/SDS-PAGE)

Die Massenspektrometrie generiert Daten ,

die für die Proteinidentifizierung benötigt

werden – und

Die Bioinformatik dient hier vor allem der

Datenbankrecherche mit massenspektrometrischen

Daten.

Ein zentrales Anliegen dieses „klassischen“

Ansatzes ist es, auch die Proteine sehr komplexer

Proben wie Gewebehomogenaten auf

großen 2D-Gelen darzustellen und proteinchemisch

– vor allem massenspektrometrisch

– identifizieren zu können. Ein Ziel ist die

Detektion bisher unbekannter Proteine, ohne

die Notwendigkeit einer vorangehenden Anreicherung.

Ein zweites besteht darin, durch

Vergleich der Proteinmuster aus Proben des

untersuchten Systems in zwei verschiedenen

physiologischen Zuständen schnell Differenzspots

zu finden – zum Beispiel korrespondierend

zu vermutlich krankheitsrelevanten

Genprodukten.

Einer der attraktivsten Aspekte einer solchen

Strategie ist es, daß extrem wenige

Vorausannahmen für die Analyse erforderlich

sind –␣ vor allem, welcher Art die Veränderungen

auf Proteinebene sein könnten.

Dazu kommt, daß die Proben bis zur zweidimensionalen

Auftrennung bei dieser Strategie

nur minimal manipuliert werden müßten.

Damit schien eine Art proteinchemisches

Screening greifbar, wie es sonst nur

aus der Molekularbiologie auf Nukleinsäureebene

bekannt war. Dem Sensitivitätsnachteil

etwa gegenüber den Differential Display-Methoden

zum mRNA-Nachweis konnte

bei einem Screening auf Proteinebene entgegengesetzt

werden, daß nur wirklich vorhandene

Proteine unter Berücksichtigung

ihrer Spleißvarianten sowie co- und posttranslationaler

Modifikationen untersucht

würden.

Mittlerweile wird zunehmend klar, daß die

Strategie, alle Proteinkomponenten eines

komplexen Systems auf einem einzigen Gel

darzustellen und zu identifizieren, beim

derzeitigen Stand der Technik nicht realisierbar

ist. Das Proteomik-Konzept wandelt

sich daher zur Zeit und wird weiterentwikkelt.

Für erfolgreichere Analysen scheint es

sinnvoll, einerseits die experimentellen Fragestellungen

stärker zu fokussieren und zu

präzisieren, andererseits eine größeres Repertoire

an Techniken zu nutzen.

Identifizierung unbekannter

eukaryontischer Proteine

Abb. 1: Struktur des

Zellkerns

Mit der zunehmend breiten Anwendung der

Proteomik-Kerntechnologie der 2D-IEF/

SDS-PAGE für unterschiedlichste Forschungsprojekte

wurden Grenzen der Leistungsfähigkeit

der Methode in ihrer derzeitigen

Form sichtbar: Zwar wird eine vergleichbare

Effizienz der Proteintrennung

durch keine andere Methode erreicht. Die

Kapazität der Gele kann jedoch nicht der

stark unterschiedlichen Menge verschiedener

Proteine gerecht werden: Seltene, vor

allem regulatorische, Proteine werden nur

unzureichend detektiert 1 . Überwiegend werden

auf Gelen, auf denen Proben aus komplexeren

eukaryontischen Geweben aufgetrennt

worden sind, vor allem Proteine des

Zytoskeletts, des Intermediärstoffwechsels,

Chaperone sowie einige mitochondriale Proteine

identifiziert. Die Listen identifizierter

Proteine aus verschiedensten Geweben oder

Organen sind häufig annähernd deckungsgleich.

Die Schlußfolgerung daraus ist, daß

sich die Analyse hier auf die Ebene einiger

Housekeeping-Proteine beschränkt. Die Detektion

bisher unbekannter Proteine scheint

zumindest bei gut untersuchten Organismen

die Ausnahme.

Ebenso ist nachteilig, daß integrale Membranproteine

unterrepräsentiert sind 2 , was umso

schwerer wiegt, da zahlreiche potentiell pharmakologisch

„interessante“, membranständige

Proteine wahrscheinlich in niedriger Kopienzahl

vorliegen. Die Ursachen für die schlechte

Darstellbarkeit integraler Membranproteine

mittels 2D-IEF/SDS-PAGE sind noch nicht

wirklich geklärt, so daß mit technischen Innovationen

vielleicht überraschende Verbesserungen

erzielt werden können.

Neuerdings gehen immer mehr Arbeitsgruppen

dazu über, subzelluläre Fraktionen anstelle

von Homogenaten zu verwenden, um

bislang unbekannte Proteine zu identifizieren.

Diesen Trend dokumentiert die Zeitschrift

ELECTROPHORESIS, die dem Thema subzelluläre

Proteome eine ganze Ausgabe widmete

3 . Als subzelluläre Fraktionen können

beispielsweise bestimmte Zellorganellen wie

Mitochondrien oder Zellkerne gewonnen

werden. Auch werden zunehmend Multiproteinkomplexe

untersucht.

|transkript LABORWELT Nr. 4/2000 | 17


BR L EI T P Z L O I CR H T

Die Herstellung subzellulärer Fraktionen aus

Zellen oder Geweben kann Proteine, die innerhalb

einer bestimmten subzellulären

Struktur häufig, aber bezogen auf die Proteingesamtmenge

des unfraktionierten Systems

nicht häufig vorliegen, der Analyse

zugänglich machen. Zudem kann die Detektion

eines Proteins in einer bestimmten subzellulären

Fraktion bei Abwesenheit in anderen

Fraktionen ein erstes Charakteristikum

des Proteins enthüllen.

Beispiele für in jüngster Zeit veröffentlichte

Befunde über subzelluläre Proteome sind

Untersuchungen über Proteine des Golgi-

Apparates 4,5 , über Nukleoli-Proteine 6 und

über Kernhüllenproteine 7 . In allen Fällen

wurden jeweils mehr als hundert verschiedene

Proteine identifiziert, darunter zahlreiche

bislang unbekannte oder zumindest

bisher nicht auf Proteinebene nachgewiesene

Genprodukte.

In einer zunehmendem Zahl von Publikationen

wird über die massenspektrometrische

Analyse von Multiproteinkomplexen berichtet:

Eine wegweisende Arbeit kam von Neubauer

et al. 8 über das Spleißosom der Hefe.

Neuere spektakuläre Beispiele für die Analyse

von Multiproteinkomplexen sind die

Untersuchung des Kernporenkomplexes der

Hefe 9 und die Analyse von NMDA-Rezeptorkomplexen

10 .

Die Analyse von Multiproteinkomplexen

unterscheidet sich von ihrem inhaltlichen

Hintergrund und ihrer Zielsetzung her deutlich

von der Analyse der Zellorganellen: Letztere

trägt, wie der ursprüngliche Proteomik-

Ansatz, den Charakter eines Screening nach

möglichst allen Komponenten eines Systems,

die weiter nichts gemein haben müssen als

ihre Lokalisierung innerhalb eines bestimmten

Kompartimentes. Bei der Analyse von

Komponenten eines Multiproteinkomplexes

geht dagegen meist ein stringenteres Isolierungsprotokoll

voraus, die identifizierten

Komponenten stehen potentiell bereits in

einem funktionellen Zusammenhang zueinander.

Abb. 2: Fraktionierungs-Schema

Methodische Erfordernisse

veränderter Analysestrategien

Strategien zur subzellulären Fraktionierung

von Zellen oder Geweben sind seit langem

in der Zellbiochemie etabliert. In der Regel

erfolgt nach dem Aufbrechen der Zellmembran

mindestens ein Dichtegradienten-Zentrifugationsschritt

in einer Ultrazentrifuge.

Oft können mehrere Fraktionen simultan

gewonnen werden. Die meisten Protokolle

zielen aber dann auf die Gewinnung einer

möglichst „sauberen“ Fraktion, zum Beispiel

mit einer bestimmten Sorte Zellorganellen.

Multiproteinkomplexe werden häufig aus

subzellulären Fraktionen extrahiert oder affinitätsgereinigt.

Die Anreicherung der zu

analysierenden Struktur wird unter anderem

mit Western Blots für bestimmte, bekanntermaßen

spezifisch dort lokalisierte

Markerproteine bei gleichzeitiger Abreicherung

von Markerproteinen anderer Strukturen

nachgewiesen. Organellpräparate sowie

Präparate mit Komplexen membranständiger

Proteine enthalten einen großen Anteil

integraler Membranproteine. Zur Auftrennung

der Proteinkomponenten eignet sich

die 2D-IEF/SDS-PAGE in diesen Fällen nicht,

so daß andere Separationssysteme zur Anwendung

kommen, die sich für eine Darstellung

integraler Membranproteine eignen –

zum Beispiel flüssigkeitschromatographische

Methoden in der ersten Trenndimension,

gefolgt von SDS-PAGE der Fraktionen 9 ,

einfache Trennung über SDS-PAGE 5,10 oder

zweidimensionale 16-Benzyldimethylhexadecyl-ammoniumchlorid

(16-BAC-)/

SDS-PAGE 7 .

Die meisten dieser Trennmethoden besitzen

allerdings zum Teil eine deutlich niedrigere

Auflösung als die 2D-IEF/SDS-PAGE, so

daß bei der massenspektrometrischen Analyse

in der Regel nach der Spaltung von

Proteinen in Spots oder Banden auf Gelen

mit Proteingemischen umgegangen werden

muß. Während bei der Analyse von 2D-IEF/

SDS-PAGE-Spots die MALDI-MS aufgrund

ihres hohen Automatisierungsgrades und

ihres hohen Probendurchsatzes zur Generierung

von Peptidmassen-Fingerprints erhebliche

Vorteile gegenüber anderen massenspektrometrischen

Methoden aufweist,

kommt bei der Analyse komplexerer Proben

wie der Proteine in einer 1D-SDS-PAGE-

Bande, bei denen Peptidmassen-Fingerprints

an Aussagekraft verlieren, Analysesystemen

mit Kopplung von Flüssigkeitschromatographie

und ESI-Massenspektrometrie (LC-MS)

eine größere Bedeutung zu. Solche Systeme,

bei denen Peptide meist durch Kollisionsinduzierte

Dissoziierung (CID) fragmentiert

werden können, sind zumindest zur Zeit im

Vergleich zur MALDI-MS mit Post Source

Decay (PSD)-Fragmentierung auch effizienter

in der Generierung partieller Sequenzinformation.

CID-Spektren können wesentlich

schneller aufgenommen werden und sind

meist leicht zu interpretieren, während PSD-

Spektren, die allerdings einen erheblich größeren,

aber schwieriger interpretierbaren

Informationsgehalt haben können als ESI-

CID-Spektren, zur Zeit noch zeitraubend in

mehreren Segmenten aufgenommen werden

müssen.

Vor allem bei der Analyse von Proteinkomponenten

von Zellorganellen ist vor der

Zuordnung eines bislang unbekannten oder

uncharakterisierten Proteins zum Organell

noch ein Lokalisierungsnachweis mit einer

unabhängigen Methode zu führen – zum

Beispiel der Immuncytochemie. Denn es gelingt

praktisch nicht, subzelluläre Strukturen

völlig frei von Kontaminationen durch

Proteine anderer subzellulärer Strukturen

zu isolieren.

Identifizierung von Proteinen

subzellulärer Fraktionen:

Beispiel Kernhüllenproteine

Die Hülle von Zellkernen, eine Struktur aus

mehreren Subkompartimenten (Abb. 1), ist

eine der am wenigsten untersuchten Strukturen

eukaryonter Zellen. Am besten analysiert

sind dabei die Kernporenkomplexe –

deren Zusammensetzung bei der Hefe durch

die bahnbrechende Arbeit von Rout et al. 8

praktisch als aufgeklärt betrachtet werden

kann. Dazu kommen die nukleären Lamine

– das sind nukleäre Intermediärfilamente

mit der Fähigkeit zur Selbstassemblierung

zu einem orthogonalen Proteinnetzwerk, das

die innere Kernmembran auf der nukleoplasmatischen

Seite auskleidet. Im Gegensatz

dazu sind nur wenige integrale Membranproteine

der inneren Kernmembran bekannt

11 .

Aus Neuroblastoma Neuro 2a-Zellen der

Maus wurden in unserem Labor zunächst

Zellkerne, aus diesen ein Kernhüllenpräparat

isoliert, das auf verschiedene Arten in

jeweils einem Extraktionsschritt weiterfraktioniert

wurde (bei sequentieller Extraktion

des Kernhüllenpräparates traten durch die

notwendigen Zentrifugationsschritte Aggregationsartefakte

auf). Die jeweils unlöslichen

18 | Nr. 4/2000 |transkript LABORWELT


BR L EI T P Z L O I CR H T

Fraktionen wurden zweidimensional in einer

16-BAC/SDS-PAGE aufgetrennt, alle anfärbbaren

Proteinspots isoliert, die Proteine

im Gel tryptisch gespalten und mittels MAL-

DI-TOF-MS analysiert. Daten aus Peptidmassenfingerprints

und Post Source Decay-

Fragmentionenspektren wurden mittels der

Programme ProFound bzw. PepFrag (beide

über http://www.proteometrics.com) mit

den Datenbanken NCBInr und dbEST abgeglichen.

Die Fraktionierung des Kernhüllenpräparates

ergab Subfraktionen mit einer spezifischen

Verteilung von Markerproteinen (Abb.

2). Calnexin wurde als Marker für die äußere

Kernmembran /ER-Membran gewählt, Lamin

B als Kernlamina-Marker und LAP 2β

als Marker für die innere Kernmembran. In

allen drei Fraktionen war der Marker der

inneren Kernmembran, LAP 2β, als ein

Hauptprotein detektierbar. Nach Tritonextraktion

fehlte Calnexin, das Markerprotein

für die äußere Kernmembran/ER-Membran.

Nach Waschen mit 1M NaCl waren alle drei

Markerproteine gut detektierbar. Bei der

Chaotrop-Fraktionierung mit Carbonat und

Harnstoff wurde der Kernlamina-Marker

entfernt, die Marker für die Kernmembranen

blieben aber erhalten. Die drei Fraktionierungsmethoden

machten drei partiell

verschiedene Populationen von Kernhüllenproteinen

der Analyse zugänglich.

Pro Gel gelang eine erfolgreiche Identifizierung

zwar nur von 60 bis 70 verschiedenen

Proteinen, insgesamt wurden aber mehr als

120 verschiedene detektiert, darunter mehr

als 10 % bisher unbekannte oder noch nicht

charakterisierte Proteine (z.B. KIAA0095).

Arbeiten zur subzellulären Lokalisierung

dieser Proteine laufen zur Zeit.

Abbildung 3 zeigt ein Coomassie G-250-gefärbtes

BAC-Gel mit aufgetrennten Proteinen

(ca. 50 µg) der Pellet-Fraktion nach Extraktion

der Kernhülle mit 0,5% (w/v) Triton

X-100. Nahezu alle zur Zeit bekannten

integralen Membranproteine der inneren

Kernmembran wurden in dieser Fraktion

detektiert, dies erstmals überhaupt ohne eine

gezielte Reinigung der Proteine. Sie sind

aufgrund ihrer Interaktion mit der Kernlamina

resistent gegen die Extraktionsprozedur.

Zuvor unbekannte oder uncharakterisierte

Proteine sind durch die roten Nummern

in der Abbildung gekennzeichnet.

Dieses Ergebnis zeigt, wie kurz der Weg zu

unbekannten, uncharakterisierten oder anhand

einer Nukleotidsequenz aus einem

Genomsequenzierungsprojekt vorhergesagten

Protein sein kann, wenn mit einer angereicherten

funktionellen Untereinheit einer

Abb. 3: A. Pellet-Faktion nach

Trition X-100-Extraktion und

16-BAC-SDS-Page.

B. Ausgewählte identifizierte

Proteine

A

B

Zelle oder eines Gewebes gearbeitet wird.

Das heißt nicht, daß hier bereits auf der

Ebene der seltenen Genprodukte erfolgreiche

Analytik betrieben wurde; es kann auch

hier sein, daß nur die häufigeren Proteine

der Analyse zugänglich waren – diesmal

aber die spezifisch in der betreffenden subzellulären

Struktur vertretenen.

In einer vorangegangenen Arbeit konnten

wir anhand der Identifizierung verschiedener

in vivo-Phosphorylierungsstellen von

LAP 2β auch demonstrieren, wie nach einer

Anreicherung subzellulärer Strukturen auch

die Analyse posttranslationaler Modifika

|transkript LABORWELT Nr. 4/2000 | 19


BR L EI T P Z L O I CR H T

tionen von spezifisch dort lokalisierten, aber

in Gewebe- oder Zellhomogenaten kaum

darstellbaren Proteinen möglich wird 12 .

Eine Strategie der differentiellen Extraktion

eines Gewebe- oder Zellhomogenats ist keine

Alternative zur subzellulären Fraktionierung,

da mögliche Informationsgewinne

über strukturelle Zusammenhänge wie die

Zuordnung zu einem subzellulären Kompartiment

verschenkt werden.

Weiterführende

experimentelle Strategien

Ein Ziel der Proteomanalyse ist es nach wie

vor, alle Genprodukte eines Organismus auf

Proteinebene zu detektieren. Küster et al. 13

demonstrierten, daß es möglich ist, mit massenspektrometrischen

Daten Genprodukte

auch in komplexen Genomen zu identifizieren,

in denen die betreffenden codierenden

Gene von Introns unterbrochen sind, ohne

daß zuvor die mRNA/cDNA-Sequenz bekannt

war. Die Proteinchemie ist beim Aufspüren

offener Leserahmen auf der sequenzierten

DNS so den molekularbiologischen

Ansätzen mindestens gleichwertig.

Da für die Identifizierung möglichst aller

Genprodukte ohnehin fraktioniert werden

muß, liegt es nahe, dies zunächst anhand der

Isolierung der verschiedenen Zellkompartimente

durchzuführen. Dabei sollten verschiedene

Kompartimente möglichst simultan

in einem experimentellen Durchlauf gewonnen

werden (wofür bestehende Protokolle

für die subzelluläre Fraktionierung

weiterentwickelt werden müßten. Denkbar

wäre beispielsweise ein Organell-Sorting anhand

von Organell-spezifischen membranständigen

Oberflächenmarkern analog zum

Zell-Sorting).

In ihrer Publikation über die Darstellbarkeit

von Hefeproteinen auf 2D-IEF/SDS-PAGE-

Gelen beschreiben Gygi et al. 1 unter anderem,

daß Proteine, die in niedriger Kopienzahl

vorliegen, der Analyse zugänglich werden,

wenn eine viel größere Menge Ausgangsmaterial

(im beschriebenen Experiment 50 mg

Protein) eingesetzt wird, welches dann mittels

verschiedener Prozeduren zur Reduktion

der Probenkomplexität fraktioniert wird.

Eine derartige Fraktionierung könnte nach

subzellulären Kompartimenten durchgeführt

werden. In welchem Ausmaß derartige Fraktionierungen

reproduzierbar wären, bleibt

allerdings abzuwarten.

Eine rasche Identifizierung aller Genprodukte

wäre auch deshalb wünschenswert,

weil dann vollständige Antikörperbibliotheken

angelegt werden könnten, die zur Erstellung

immunchemischer Proteomkarten

(z.B. intakter Zellen oder Gewebe) genutzt

werden könnten.

Bei einer vergleichenden Proteomanalyse

eröffnet die Arbeit mit simultan generierten

verschiedenen subzellulären Fraktionen die

Möglichkeit der Erfassung eines zusätzlichen

Aspektes der Proteinregulation (der

bei der herkömmlichen Proteomanalyse mit

Homogenatproben selbst im günstigsten

denkbaren Falle nicht detektierbar wäre):

die signalinduzierte Proteintranslokation,

beispielsweise aus dem Zytosol in den Zellkern

oder zum Zytoskelett, aus Speichervesikeln

an die Plasmamembran usw.

Die Vermessung aller auffindbaren Proteine

in simultan gewonnenen subzellulären Fraktionen

erfordert vermutlich gegenüber einem

Homogenatansatz einen erheblich höheren

Probendurchsatz, so daß die Weiterentwicklung

von High-Throughput-Methoden

weiterhin – oder vielleicht mehr als jemals

zuvor – von zentraler Wichtigkeit ist.

Nach wie vor würde sich die Frage nach dem

optimalen Trennsystem für die Proteine der

einzelnen Kompartimente stellen. Hier können

aber aufgrund der viel geringeren Probenkomplexität

von Kompartimentfraktionen

auch Techniken, die eine schlechtere

Auflösung als die 2D-IEF/SDS-PAGE bieten,

dafür aber etwa integrale Membranproteine

adäquat repräsentieren können, effektiver

eingesetzt werden als bei der Homogenat-Analyse.

Alternativ könnte bei vergleichenden Proteomanalysen

die Technik der Isotop-codierten

Affinitäts-Tags (ICAT-Technologie) von

Gygi et al. (1999) verstärkt zum Einsatz kommen:

Proteine zweier zu vergleichender Proben

werden dabei mit einem Cystein-spezifischen

Reagenz kovalent modifiziert, das in

der einen Probe in hydrierter Form, in der

anderen Probe in mehrfach deuterierter Form

angeboten wird und außerdem in beiden

Formen eine Biotin-Gruppe trägt. Nach Abtrennung

des überschüssigen Reagenz werden

die Proben vereinigt und gemeinsam

weiterprozessiert. Nach einer proteolytischen

Spaltung in Lösung wird die Komplexität

des Peptidgemisches durch Avidin-Affinitätschromatographie

für die modifizierten

Peptide drastisch reduziert. Nach eventueller

Vorfraktionierung werden die modifizierten

Peptide in LC-MS-Läufen detektiert

und sequenziert. Aus dem Intensitätsverhältnis

eines Peptids in der hydriert modifizierten

Form (aus der einen Ursprungsprobe)

mit der des korrespondierenden Peptids

in der deuteriert modifizierten Form

(aus der anderen Ursprungsprobe) können

Unterschiede in der Menge eines bestimmten

Proteins in den beiden Ursprungsproben

detektiert werden.

Bei dieser Methode ist das Trennproblem

letztlich auf die Peptidebene verlagert, Cystein-freie

Proteine werden zwar nicht detektiert,

aber es gibt ansonsten ab der Proteinebene

keine prinzipiellen „Problemproteine“

mehr (wie z.B. integrale Membranproteine

sie für die 2D-IEF/SDS-PAGE darstellen).

Das prinzipielle Problem der unterschiedlichen

Proteinhäufigkeit bleibt allerdings

auch bei dieser Methode bestehen. Die

ICAT-Technik wird sicherlich in naher Zukunft

breite Anwendung finden und kann

erst dann in ihrer Leistungsfähigkeit angemessen

bewertet werden. Für die Analyse

subzellulärer Fraktionen, wie für den Nachweis

einer Proteintranslokation, wurde die

Technik bislang nicht eingesetzt.

Ausblick

Die verstärkte Analyse subzellulärer Fraktionen

unter Anwendung verschiedener Trenntechniken

könnte den Proteomanalyse-Projekten,

die mit Zell- oder Gewebehomogenaten

und 2D-IEF/SDS-PAGE arbeiten, neue

Impulse verleihen. Viele auf dem Proteomik-

Gebiet arbeitende Forschungsgruppen sind

dabei, ihr Know-how auf Arbeitstechniken

außerhalb der drei Proteomik-Kerntechnologien

2D-Gelelektrophorese (die in ihrer jetzigen

Form vielleicht bald keine Kerntechnik

mehr ist), Massenspektrometrie und Bioinformatik

auszuweiten oder Kooperationen

mit zellbiologisch und biochemisch erfahrenen

Gruppen zu suchen.

Literatur

[1] Gygi, S.P., et al. (2000) PNAS 97, 9390-9395

[2] Santoni, V., et al. (2000) Electrophoresis 21,

1054-1070

[3] Electrophoresis 21 (16), darin Review von

Jung, E. et al., 3369-3377

[4] Taylor, R.S., et al. (2000) Electrophoresis

21, 3441-3459

[5] Bell, A.W. et al. (2000) J Biol Chem (JBC

papers in press, published online October

19, 2000)

[6] Andersen, J.S., et al. (2000) Abstracts of

the 48 th ASMS conference on Mass

Spectrometry and Allied Topics

[7] Dreger, M. et al. (2000) Abstracts of the

48 th ASMS conference on Mass Spectrometry

and Allied Topics

[8] Neubauer, G., et al. (1998) Nature

Genetics 20, 46-50

[9] Rout M.P., et al. (2000) J Cell Biol 148,

635-651

[10] Husi, H., et al. (2000) Nature Neuroscience

3, 661-669

[11] Wilson, K.L. (2000) Trends Cell Biol. 10,

125-9

[12] Dreger, M. et al. (1999) Biochemistry 38,

9426-9434

[13] Küster, B. et al., (2000) Abstracts of the

48 th ASMS conference on Mass Spectrometry

and Allied Topics

[14] Gygi, S.P., et al. (1999) Nature

Biotechnology 17, 994-999

Korrespondenzadresse

Dr. Mathias Dreger

AG Neurochemie

Institut für Chemie – Biochemie

Freie Universität Berlin

Thielallee 63

D- 14195 Berlin

20 | Nr. 4/2000 |transkript LABORWELT


B L I T Z L I C H T

Surface Plasmon Resonance-Biosensoren

Detektion von Protein-

Interaktionen in den Proteomics

DR. WOLFGANG JÄGER, BIACORE AB, HENNEF

Obgleich heute eine große Fülle von Sequenz- und Strukturdaten von Proteinen und biologischen

Molekülen zur Verfügung steht, kann ihre Funktion durch diese statischen Informationen nicht

vollständig beschrieben werden. Das Wissen um die Wechselwirkungen von Biomolekülen und ihren

Interaktionspartnern trägt ergänzend zu einem größeren Verständnis biologischer Prozesse bei, wie

etwa von Signalkaskaden. Diese Molekül-Interaktionen können seit 1990 mit optischen Surface

Plasmon Resonance (SPR)-Biosensoren analysiert werden 1, 2 . Die in Echtzeit arbeitende, markierungsfreie

Technologie ergänzt auf optimale Weise klassisch-biochemische Methoden oder ersetzt diese sogar.

In der Proteom-Forschung ist die Analyse von Protein-Interaktionen der nächste Schritt, wenn man die

über 2D-Gele, Massenspektrometrie (MS) und Datenbank-Suche identifizierten Proteine oder Spots

näher untersuchen möchte. Bindungsstudien beschreiben die Spezifität von Biomolekülen und helfen,

bislang unbekannte Funktionen aufzuklären.

Key Words: SPR, Sensor Chip, Interaktionsanalyse, Biosensorik

Bindungsstudien in Echtzeit

Biosensoren ist aber nicht auf Proteine beschränkt,

sondern umfaßt gleichermaßen

Nukleinsäuren, Lipide, Kohlehydrate, nie-

Biosensor-Analysen 3,4 gestatten schnell und

ohne großen Materialeinsatz Aussagen zu

einer Vielzahl molekularbiologisch wichtiger

Fragen, wie etwa:

Bindet ein Biomolekül an einen zweiten

vorgegebenen Partner

Gibt es Bindungspartner und wo sind

sie lokalisiert – im Rohextrakt, Überstand

oder Serum

Wie hoch ist die Affinität zwischen den

Molekülen

Welcher Kinetik folgt die Bindung

(Komplexbildung und Stabilität)

Bei der Planung des Assays kann jede einzelne

Wechselwirkung direkt auf dem Sensor-Chip

nachgebildet werden. Zusätzlich

ist die Technik hilfreich im Laboralltag,

beispielsweise bei der Suche nach dem richtigen

Hybridom-Klon oder der Säulenfraktion,

die das gewünschte, biologisch aktive

Molekül enthält. Der Einsatz der SPRdermolekulare

Substanzen, wie Pharmazeutika,

Hormone und Vitamine, oder auch

Viren und ganze Zellen 5 .

Surface Plasmon Resonance

Das Funktionsprizip der vergleichbar einfach

zu bedienenden SPR-Biosensoren ist

in Abbildung 1 gezeigt. Exemplarisch werden

in diesem Beitrag die BIACORE ® -Systeme

2 vorgestellt. Deren Grundelemente

sind Sensor-Chips, ein Surface Plasmon

Resonance-Detektor und ein spezielles

Flußsystem 1 . Der optisch arbeitende SPR-

Detektor mißt in Echtzeit, wieviel Material

am Sensor-Chip angelagert ist und gibt die

Daten in Form eines sogenannten Sensorgrammes

am Bildschirm aus (Abb. 2).

Der erste Schritt einer Analyse ist die Beladung

der Sensoroberfläche mit einem biologischen

Molekül. Entsprechende Standard-

Prozeduren dauern 30 bis 60 Minuten, der

Materialeinsatz liegt bei 0,5 bis 2 µg pro

Immobilisierung. Chip-Oberflächen zur

Kopplung fast jeden Biomoleküls sowie von

Lipid-Doppelschichten sind erhältlich.

Abb. 1: Surface Plasmon Resonance.

Das auf der Detektor-Seite eingestrahlte und totalreflektierte Licht führt zu einem elektromagnetischen

Feld von ca. 300 nm Ausdehnung auf der Flußkanal-/Probenseite. Zudem induziert die

Totalreflexion Surface Plasmon Resonanz, also die Resonanz von Elektronen an der Goldoberfläche.

Dadurch entsteht beim reflektierten Licht ein Schattenwurf (grün). Dessen Lage ist direkt

von der Masse abhängig, die innerhalb des elektromagnetischen Feldes an der Probenseite der

Chip-Oberfläche vorliegt. Änderungen von weniger als 1 pg biologischen Materials pro mm 2

werden erfaßt.

|transkript LABORWELT Nr. 4/2000 | 21


B L I T Z L I C H T

Einmal bestückt, ist der Sensor-Chip mehrfach,

im Idealfall bis mehr als tausend Mal,

einsetzbar. Man injiziert einen Rohextrakt

oder einen gereinigten Interaktionspartner,

verfolgt die Bindung am Bildschirm

und regeneriert dann die Oberfläche, um

sie im folgenden Zyklus erneut einzusetzen

(Abb. 2). Pro Chip stehen aktuell bis zu

vier separate Meßspuren zur Verfügung,

die getrennt oder gemeinsam angesteuert

werden können. Üblicherweise dient eine

Spur als Kontrolle. Die serielle Injektion

einer einzigen Probe über Meß- und Kontroll-Oberfläche

liefert die in-line-Referenz,

die erheblich zur Präzision der Analysen

beiträgt 4 .

Affinität, Kinetik, spezifische

Konzentration

Nach der Analyse des Proteoms und der

Identifizierung relevanter Proteine ergeben

sich automatisch weitere Fragen.

Sind die Proteine mit Informationen aus

Datenbank und Literatur hinreichend

beschrieben

Agieren die identifizierten Proteine gemeinsam

Existieren weitere Moleküle, mit denen

die Proteine in Wechselwirkung treten

Was ist die Funktion von bislang unbekannten

Proteinen

All diese Fragen führen letztlich zu Bindungsstudien

(Abb. 3). Sowohl der Aufbau

von Molekülkomplexen oder Zellstrukturen

als auch die Aktionen von Rezeptoren

und Regulatoren beruhen auf Wechselwirkungen.

Je genauer man diese kennt, desto

präziser kann man Abläufe während eines

spezifischen biologischen Ereignisses bepartner

bei definierten Konzentrationen

und Pufferbedingungen injiziert. Die Auswerte-Software

greift direkt auf die originalen

Bindungskurven zurück, um Assoziations-

und Dissoziationsraten sowie Affinitäten

zu berechnen. „Globales Fitting“

ist hier das Stichwort, das die simultane

Auswertung eines kompletten Kurvensatzes

bezeichnet. So lassen sich neben Einszu-Eins-Interaktionen

auch komplexere Ereignisse

wie heterogene Proben, Konformationsänderungen

oder Bivalenzen handhaben

6 .

Bei der Bestimmung von Konzentrationen

wird ausschließlich biologisch aktives Material

gemessen. Das am Sensor-Chip gekoppelte

Detektionsmolekül gibt dabei die

Spezifität vor. Für die Nahrungsmittelanalyse

gibt es etwa Kits zur Bestimmung von

Biotin, Folsäure, Vitamin B 12

, Clenbuterol,

Sulfamethazin und Sulfadiazin. Daneben

In naher Zukunft wird die Parallelisierung

dieser Biosensoren weiter erhöht werden:

Eine Kooperation von Millenium Pharmawird

in Kürze ein validiertes System für

die Prozeß-Optimierung und Qualitätskontrolle

auf den Markt kommen 2 .

Interaktionsanalysen

in den Proteomics

Abb. 2: Sensorgramm. Der

Kurvenverlauf zeigt den

Signalanstieg während der

Injektion (Assoziation) und

den Abfall im direkt

anschließenden Pufferfluß

(Dissoziation). Die Kästchen

zeigen den jeweiligen

Zustand am Sensor-Chip.

schreiben und relevante Targets erkennen.

So geben beispielsweise Affinitäten innerhalb

einer Signaltransduktionskette Auskunft

darüber, ob Bindungspartner schon

bei niedrigen Konzentrationen (hohe Affinität)

oder erst bei hohen Konzentrationen

(niedrige Affinität) miteinander interagieren.

Die Kinetik liefert Daten über die Geschwindigkeit

einer Komplexbildung und

über die Dauer der Bindung.

Fischen neuer Liganden

Proteom- und Genomforschung bringen eine

Vielzahl an bislang kaum beschriebenen Proteinen

hervor, die an bestimmten Ereignissen

beteiligt sind oder aufgrund von Homologie-

Vergleichen interessante Funktionen ausüben

könnten. Findet man die Bindepartner, so hat

man einen großen Schritt in Richtung Funktionsaufklärung

getan. Dieses Liganden-Fi-

Die Sensorgramme (Abb. 2) zeigen schon

während der Messung an, ob eine Wechselwirkung

mit dem auf dem Chip immobilisierten

Molekül stattfindet. Diese qualitative

Ja/Nein-Antwort ist zunächst ausreichend,

wenn es darum geht, Bindeaktivitäten

nachzuweisen. Für detaillierte Analysen

werden die gereinigten Interaktionsschen

kann mit der SPR-Technologie auf unterschiedliche

Weise erfolgen 7 .

Einerseits dient der Biosensor als Monitor

bei der Suche und Aufreinigung neuer Interaktionspartner.

Das zu untersuchende Protein

oder Biomolekül ist am Sensor-Chip

gebunden, über den dann die verschiedenen

Extrakte oder Kulturmedien injiziert werden.

Der Signalausschlag zeigt an, in welcher

Probe Bindeaktivität vorhanden ist. Bei

der chromatographischen Trennung testet

man auf die gleiche Weise die einzelnen

Fraktionen auf aktive Moleküle, bis man

sauberes Material für eine Sequenzanalyse

erhält.

In jüngster Zeit sind Arbeiten 8,9 publiziert

worden, in denen die Biosensor-Technologie

direkt als präparatives Hilfsmittel genutzt

wird. Dabei ist anzumerken, daß ein

Signalausschlag von 1000 Resonanz-Units

der Anlagerung von 1 ng Protein entspricht,

welches für eine nachgeschaltete Analyse im

Massenspektrometer ausreicht. Das Material,

das am immobilisierten Partner bindet, wird

eluiert und in MALDI-TOF-, NanoESI- oder

nanoESI-MS-MS analysiert 8 . In einem anderen

Ansatz wird der Sensor-Chip direkt im

MALDI-TOF zur Untersuchung der Liganden

eingesetzt 9 .

Protein-Drug-Wechselwirkungen

Viele Fragestellung in der Proteom-Forschung

zielen darauf ab, geeignete Targets zu identifizieren

(Abb. 3). Im High-Throughput-

Screening (HTS) testet man anschließend

Substanzbanken auf bindende oder inhibierende

Stoffe. Die SPR-Technologie unterstützt

den Assay-Aufbau für das HTS

durch schnelle und präzise Festlegung von

Reaktionszeiten oder Pufferbedingungen.

Das Sekundär-Screening der im HTS gefundenen

Hits ist die besondere Stärke des

Biosensors 10 . Detaillierte Bindungsdaten,

exakt kontrollierte Meßbedingungen und

kurze Analysezeiten sind die Grundlage

für effektives Nachtesten von Hits und

Optimieren von Lead-Komponenten. Im

weiteren Verlauf des Drug-Discovery Prozesses

sind „Early ADME“ (Adsorption,

Distribution, Metabolism, and Excretion)

Studien durchzuführen 11 . Aktuell kommt

es zur Verknüpfung von Biosensor-Daten

mit Chemoinformatik-Software. Erste Ergebnisse

bei Interaktionen niedermolekularer

Substanzen mit humanem Serum-Albumin

zeigten, welche chemischen Gruppen

einen positiven oder negativen Effekt

auf die HSA-Bindung ausüben 12 .

Ausblick: SPR-Array-Chips

22 | Nr. 4/2000 |transkript LABORWELT


B L I T Z L I C H T

ceuticals (Cambridge, Massachusetts) und

Biacore AB (Uppsala, Schweden) verfolgt

die Entwicklung der SPR-Array-Chip-Technologie

für den Einsatz im Drug Discovery

12 . Folgende Schwerpunkte, die allesamt

Engpässe in der Forschung darstellen, sind

dabei von Interesse.

Charakterisierung neuer durch Genomics

und Proteomics identifizierter Proteine

in Hinblick auf deren Eignung als potentielle

Targets

Identifikation von Liganden für neue

Proteine über parallelisiertes Liganden-

Fischen

Analyse von Signaltransduktionswegen

durch Interaktionsanalysen mit Protein-

Array-Chips.

Der Durchsatz soll dabei auf 100.000 Bindungstests

pro Tag gesteigert werden.

Gleichzeitig will man die heute geschätzte

Präzision des SPR-Biosensors erhalten und

zu jeder einzelnen Bindung die kompletten

Echtzeit-Daten liefern: Für Kinetik, Affinität,

Konzentration und Bindungsspezifität

bei der ganzen Vielfalt an biologischen Interaktionen.

Literatur

[1] Jönsson, U., et al. (1991) Real-time

biospecific interaction analysis using surface

plasmon resonance and a sensor chip

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protein-protein interactions with surface

plasmon resonance biosensors. J Immunol

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matchmaking: screening orphan ligands and

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[8] Williams, C. and Addona, T.A. (2000) The

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spectrometry: possible applications for

proteome analysis. Trends Biotechnol 18, 45-

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[9] Nelson, R.W., et al. (2000) Biosensor chip

mass spectrometry: A chip-based approach.

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[11] Danelian, E., et al. (2000) SPR biosensor

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drugs and liposome surface: correlation with

fraction adsorbed in humans. J Med Chem

43, 2083-2086

[12] Press release (2000) www.biacore.com/

company/prindex.html

Korrespondenzadresse

Dr. Wolfgang Jäger

Biacore AB

Königsberger Weg 79

D- 53773 Hennef

Tel.: 02242-86 89 46

Fax: 02242-86 89 47

eMail: wolfgang.jager@biacore.com

|transkript LABORWELT Nr. 4/2000 | 23


B L I T Z L I C H T

Chiptechnologie

Protein-Chips: Bindeglieder

zwischen Genomics und Proteomics

HOLGER EICKHOFF, ANGELIKA LÜKING, KONRAD BÜSSOW, DOLORES CAHILL, ECKHARD NORDHOFF

UND HANS LEHRACH, MAX-PLANCK-INSTITUT FÜR MOLEKULARE GENETIK, BERLIN

Die Geschwindigkeit mit der Informationen in der funktionellen Genomanalyse gesammelt wird,

steigt durch die weite Verbreitung von chipbasierten Methoden immer stärker an. Die momentan am

weitesten verbreiteten Methoden, die vorwiegend für die Expressionsanalyse eingesetzt werden, sind

Oligonukleotidchips und cDNA-Microarrays, welche mittlerweile von einer Vielzahl von Herstellern

angeboten werden (The Chipping Forecast, Nature Genetics Supplement, Januar 1999). Obwohl sich

bislang weltweit noch keine Standards für das transkriptionelle Profiling auf DNA- und RNA-Ebene

gefunden haben und schon jetzt die Daten aus verschiedenen Labors nur schwer miteinander zu

vergleichen sind (Eickhoff et al., 2000, Schuchhardt et al., 2000), zeichnet sich mit Protein-Chips

schon die nächste Hochdurchsatzmethode in der Genom- und Proteomforschung am Horizont ab.

Generell gilt es, zwischen Protein- oder Antikörper-

sowie Peptid-Arrays zu unterscheiden.

Neben den initialen Arbeiten von Affymax

in den USA sind insbesondere in England

und Deutschland die grundlegenden

Arbeiten auf diesen beiden Gebieten gelegt

worden. Neben den Arbeiten von Ronald

Frank und Mitarbeitern in Braunschweig zur

SPOT-Methode von Peptidarrays (Frank

1992), beschrieben die Arbeiten von Büssow

et al. (1998), Lüking et al. (1999) und Cahill et

al. (2000) die Produktion und Verwendung

von Protein-Makro- und Microarrays aus

rekombinant hergestellten Proteinen. Prinzipiell

handelt es sich bei den auf den Arrays

verwendeten Proteinen um die translatierten

Sequenzen von DNA-Chips.

Bei der Herstellung der verwendeten cDNA-

Expressionsbanken werden Expressionskonstrukte

für tausende von cDNAs in einem

Schritt erhalten. Basierend auf bakteriellen

Systemen können Expressionssysteme für

sehr viele Proteine schnell und reproduzierbar

hergestellt werden. Die bakteriell hergestellten

Proteine können durch Antikörper

problemlos erkannt werden, sind allerdings

oftmals biologisch nur sehr eingeschränkt

aktiv. Für funktionelle Untersuchungen ist es

daher zweckmäßig, auch eukaryotische Expressionssysteme

für die Herstellung von

Proteinarrays zu verwenden.

Die für die Expression verwendeten Vektoren

zeichnen sich im allgemeinen dadurch

aus, daß sie induzierbare Promotoren tragen,

mit denen sich der Zeitpunkt der Proteinexpression

steuern läßt. Darüber hinaus weisen

Expressionsvektoren Sequenzen für sogenannte

Affinitätsepitope oder -proteine auf

(z. B. His-tag, Strep-tag, GST-tag), die zum

einen den spezifischen Nachweis der rekombinanten

Fusions-Proteine mittels eines gegen

das Affinitätsepitop gerichteten Antikörpers

erlauben. Zum anderen wird die spezifische

Aufreinigung über Affinitätschromatographie

ermöglicht. Die Proteinexpression

kann dabei entweder in Mikrotiterplatten

oder – nach roboterunterstütztem Übertragen

der Bakterienkolonien auf Membranen –

direkt auf den Membranen durchgeführt

werden.

Bei Expression in Mikrotiterplatten ermöglicht

eine Aufreinigung der rekombinanten

Proteine mittels Affinitätschromatographie

eine hochreine Darstellung der Proteine, bevor

sie auf einen Array gespottet werden.

Dieser Aufreinigungsprozeß ist mittlerweile

Abb. 1: Screening von 2600 menschlichen

cDNA-Klonen mit HSP 90β-Antikörper. In situ-

Generation der in Duplikaten angeordneten

Proteine auf einer PVDF-Membran

sehr gut automatisiert und verwendet beispielsweise

magnetische Partikel, die mit

Nickel-Nitrilotriessigsäure (Ni:NTA) beladen

sind und so mit hohen Ausbeuten 6xHistidin

enthaltende Proteine fischen, welche dann

wieder von den magnetischen Partikeln

eluiert werden können.

Auch Proteine, die nicht in funktioneller Form,

sondern als Aggregate exprimiert werden,

können gereinigt und als Array angeordnet

werden. Für die massenspektrometrische

Charakterisierung ist es möglich, die aufgereinigten

His-tag-Proteine vom Chromato-

graphie-Material direkt mit einer sauren Acetonitril-Lösung

zu eluieren und anschließend

direkt zu analysieren. Für die eindeutige Identifizierung

werden die gereinigten Proteine

auf dem Chromatographie-Medium tryptisch

gespalten und die freigesetzten Peptide eluiert

und analysiert (MALDI-MS Peptide Mapping,

Egelhofer et al., 2000).

Schon jetzt sind kommerziell erhältliche Geräte

in der Lage, mehrere hundert Proteine

pro Tag aufzureinigen. So gereinigte Proteine

finden Eingang in die Berliner Proteinstrukturfabrik,

wo sie in hochreiner Form mit

kernmagnetischen Resonanz- und kristallographischen

Methoden strukturell untersucht

werden. Auch hier werden mittlerweile Proteinarrays

in Form von in Arrays geordneten

Mikrotropfen für die Hochdurchsatz-Kristallisation

eingesetzt (Müller et al., 2000).

Eine weitere Methode zur Herstellung von

Proteinarrays besteht darin, die Bakterien

nach dem Transfer auf einem mit Wachstumsmedium-getränkten

Polyvinylidendiflourid

(PVDF)-Filter wachsen zu lassen

und die Bakterien dann zu lysieren. Ein wesentlicher

Vorteil dieser in situ-Methode liegt

in der Möglichkeit, komplette Bibliotheken

auf richtige Leseraster zu screenen und die

Präsenz von beispielsweise 6xHis- oder Strep-

Tags zu prüfen, da durch die Verwendung

von Robotern auf PVDF-Filtern hundertausende

von Expressionen parallel durchgeführt

werden können. Durch Screening mit speziellen

Antikörpern kann die Proteinausbeute

dieser Expressionen parallel ermittelt werden.

So können Expressionsklone, die kein

rekombinantes Protein erzeugen, von weiteren

Analysen ausgeschlossen werden oder

speziell maßgeschneiderte Arrays hergestellt

werden.

Für die Herstellung von Protein-Arrays werden

alle Arten von Robotern eingesetzt, die

auch für die Herstellung von DNA-Microarrays

genutzt werden. Da verschiedene Proteine

in wäßrigen Puffersystemen im Gegensatz

zu DNA-Lösungen aber eine breite Viskositätsverteilung

zeigen, werden am MPI

für molekulare Genetik vorwiegend nichtgeschlitze

Pins für die Übertragung der Lösungen

eingesetzt, da diese weniger sensibel

auf Schwankungen in der Viskosität der Proteinlösungen

reagieren als geschlitzte Pins

oder Pin und Ring-Systeme.

Membranmaterialien wie PVDF haben sich

als sehr robust erwiesen. Protein-Arrays auf

PVDF-Filtern wurden verwendet, um Antigene

für Antikörperfragmente aus Phage display-Banken

zu identifizieren (Holt et al.,

2000). Ein Array von 27.600 menschlichen

Expressionsprodukten wurde durch Stempeln

von Bakterienkulturen erzeugt und mit

zwölf ausgewählten Antikörperfragmenten

behandelt. Dabei konnten vier spezifische

neue Antigen-Antikörper-Paare identifiziert

werden. In komplementären Ansätzen gelang

es, mit der gleichen Methode Arrays von

24 | Nr. 4/2000 |transkript LABORWELT


B L I T Z L I C H T

Abb. 2: Massenspektrometrische Charakterisierung von His-tag-Fusionsproteinen.

Für die detaillierte Charakterisierung und regelmäßige Qualitätskontrolle

werden am Max-Planck-Institut für molekulare Genetik die Metall-

Chelat-aufgereinigten Fusionsproteine mit Matrix-assistierter Laserdesorptions/Ionisations-Massenspektrometrie

(MALDI-MS) analysiert. Die gezeigten

Massenspektren wurden von folgenden His-tag-Fusionsproteinen

aufgenommen: (A) Tubulin α-1 Kette ab Aminosäure 174 (P04687),

(B) Tubulin α-1 Kette ab Aminosäure 306 (P04687), (C) Golgin-95 ab

Aminosäure 414 (Q08379), (D) 40S Ribosomal-Protein S25 (P25111),

(E) Peptidyl-procyl-cis-trans-Isomerase A (P05092) und (F) 40S Ribosomal-

Protein S3A (P49241). Die Massenspektren (A-D) und (F) bestätigen die

Expression und Aufreinigung der gewünschten Fusionsproteine. Das

Massenspektrum (E) weist nach, daß der größte Teil der Expressionprodukte

C-terminal verkürzt ist (Aminosäure 1-155).

Antikörperfragmenten herzustellen, die

durch nur eine in vitro-Selektionsrunde mit

verschiedenen immobilisierten Antigenen

gewonnen wurden (deWildt et al., 2000). Die

Arrays wurden anschließend mit den Antigenen

behandelt, was die schnelle Identifizierung

spezifisch bindender Antikörperfragmente

ermöglichte. Ein Hauptgegenstand der

gegenwärtigen Forschung ist die Suche nach

neuen Oberflächen, die es ermöglichen, Proteine

in nativerer Form zu binden als dies

momentan möglich ist. Solche Oberflächen

können beispielsweise vorstrukturiert sein

und an den Nichtimmobilisierungsstellen eine

geringe Proteinbindungskapazität aufweisen,

was auch den Hintergrund bei Experimenten

signifikant reduzieren kann, in denen Protein/Protein-Wechselwirkungen

gemessen

werden sollen (Schuerenberg et al. 2000). Alternative

Strategien schließen die Verwendung

von modifizierten Gläsern ein, wenn

auch die dort gezeigten Ergebnisse teilweise

nur sehr eingeschränkt an einen Proteinarray

mit vielen verschiedenen Arrayelementen erinnern

(MacBeath und Schreiber, 2000).

Mit der noch jungen Protein-Array-Technologie

können verschiedene Anwendungsfelder

erschlossen werden. Für eine Reihe monoklonaler

Antikörper ( z. B. α-HSP90, αβ-

Tubulin) konnte beispielsweise eine Kreuzreaktion

zu anderen Proteinen gezeigt werden,

die bei immunohistochemischen oder

physiologischen Untersuchungen gegen

ganze Zellen oder Gewebeextrakte zu schwer

interpretierbaren Ergebnissen führten

(Lüking et al., 1999). Mit der Anwendung von

Proteinarrays bietet sich die Möglichkeit,

Antikörper auf ihre Spezifität gegen eine Vielzahl

von Proteinen oder auch gegen gewebespezifische

Sets an Proteinen hin zu untersuchen

und Ergebnisse zu validieren.

Weitere Applikationen schließen die Bestimmung

von Interaktionspartnern durch die

Inkubation von Protein-Arrays mit markierten

Peptiden, Gewebe-Extrakten oder chemischen

Substanzen ein. Die Identifikation von

Transkriptionsfaktoren durch die Bindung von

DNA-oder RNA-Molekülen an Proteinarrays

oder das Screening auf bestimmte Funktionen

oder Enzyme oder Enzymfamilien sind in der

Literatur bereits ansatzweise beschrieben.

Analog zu DNA-Arrays wurden von Mirzabekov

und Mitarbeitern auch Proteinarrays

in Gelen produziert, welche sich durch

eine nahezu wäßrige Proteinumgebung und

somit eine angenähert native Proteinform auszeichnen.

Eine interessante Anwendung dieses

Chiptyps wird im Bereich Diagnostik angesiedelt

sein. In ersten Versuche wurden

hierzu monoklonale Antikörper gegen Standardproteine

wie BSA oder humanes IgG auf

Gelpads immobilisiert und von ihrem Antigen

spezifisch erkannt (Arenkov et al., 2000).

Die Verwendung der Seren autoimmunerkrankter

Patienten bietet die Möglichkeit,

durch die im Serum befindlichen Autoimmun-Antikörper

die korrespondierenden und

in vielen Fällen unbekannten Antigene zu

bestimmen. Dabei können diese Antigene

mögliche Therapieziele bilden. In bisher beschriebenen

Versuchen wurden diese Seren

entweder gegen uncharakterisierte Phagenbibliotheken

oder gegen in 1D- oder 2D-Gelen

aufgetrennte Gewebe-Extrakte hybridisiert.

Die anschließende Untersuchung der

nachgewiesenen Antigene erfordert hierbei

weitere aufwendige Nachweismethoden, die

oft in eine relativ teure Sequenzierung der

Proteine einmünden. Bei der Verwendung

von Proteinarrays liegen schon eine Vielzahl

charakterisierter Proteine vor, so daß hier

viel schneller und effektiver ein Ergebnis in

Form der Bestimmung eines Bindungspartners

erreicht wird. Schwankungen, wie sie

bei der Verwendung von natürlichen Gewebe-Extrakten

vorliegen, können durch die Verwendung

von Proteinarrays minimiert werden.

Literatur

Eickhoff H. Schuchhardt J. Ivanov I. Meier-Ewert

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Rohlfs E. Nyarsik L. Reinhardt R. Nietfeld W.

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Korrespondenzadresse

Dr. Holger Eickhoff

Max-Planck-Institut für molekulare Genetik

Ihnestraße 73

D- 14195 Berlin

Tel.: 030-84131405

Fax: 030-84131128

eMail: eickhoff@molgen.mpg.de

|transkript LABORWELT Nr. 4/2000 | 25


B L I T Z L I C H T

Wirkstoff-Forschung

Identifizierung und Optimierung

von Proteasesubstraten:

ein neuartiger Assay

DR. ULRICH REINEKE, JERINI BIO TOOLS GMBH, BERLIN

Die Charakterisierung von Proteasespezifitäten ist ein wichtiger Schritt, um Proteinsubstrate zu

identifizieren und damit neuentdeckte Proteasen in physiologische und pathologische Zusammenhänge

einzuordnen. Im Rahmen der vollständigen Sequenzierung des menschlichen Genoms rechnen

Experten mit der Identifizierung von 1000 bis 2000 Proteasen. Da sich unter ihnen eine Vielzahl

potentieller Zielmoleküle für die Wirkstoffentwicklung befindet, besteht ein großer Bedarf diese

Proteasen detailliert zu studieren. Die Ermittlung der Substraterkennungsmotive ist dabei von

besonderem Interesse, da die Ergebnisse direkt für die Herstellung peptidischer Substrate für

Hochdurchsatzverfahren zur Inhibitorentwicklung eingesetzt werden können. Zudem werden die

Peptidsubstrate, nachdem sie chemisch modifiziert oder in Peptidomimetika transformiert wurden,

zur strukturbasierten Inhibitorentwicklung verwendet.

Ein neuartiger Protease-Assay

Um Proteasesubstrate zu identifizieren, muß

eine große Anzahl von Peptiden synthetisiert

und auf proteolytischen Abbau hin getestet

werden. Neben den klassischen Methoden,

die auf chromogenen und fluorogenen

Substraten oder der Charakterisierung

der Spaltprodukte mittels chromatographischer

Methoden basieren, wurden in jüngerer

Zeit verschiedene Technologien zum

Screening festphasengebundener Peptide

vorgestellt 1 . Diese ermöglichen insbesondere

die Untersuchung kombinatorischer Peptidbibliotheken

2,3 .

Vor kurzem wurde ein neuartiger Protease-

Assay beschrieben, mit dessen Hilfe festphasengebundene,

durch SPOT-Synthese

hergestellte Peptide auf Spaltung durch

Endoproteasen untersucht werden können 4 .

Die SPOT-Methode 5 ist ein Verfahren zur

schnellen und effizienten parallelen Synthese

von Peptiden, Peptidomimetika und kleinen

organischen Verbindungen auf planaren

Cellulosemembranen oder anderen polymeren

Trägermaterialien. Die Synthese erfolgt

ortsadressiert auf kleinen kreisförmigen

Reaktionsorten (SPOTs). Für den Protease-Assay

wird ein Durchmesser von 0,8

cm verwendet, so daß etwa 600 SPOTs –

entweder mit definierten Sequenzen oder

mit Peptidgemischen – auf einem Träger der

Größe 20 x 30 cm synthetisiert werden. Die

Peptide sind kovalent mit dem C-Terminus

an die Membran gekoppelt und tragen am

N-Terminus einen Fluoreszenzfarbstoff (Anthranilsäure,

Abz). Die SPOTs werden nach

der Synthese, die mit Pipettierautomaten

erfolgt, ausgestanzt und in 96-well-Mikrotiterplatten

transferiert (Abb. 1). Nach Zugabe

einer Proteaselösung erfolgt die Spaltung

von Substraten unter Freisetzung des

N-terminalen Spaltstückes, das den Fluoreszenzmarker

trägt. Zu verschiedenen Zeitpunkten

werden dem Überstand kleine Aliquots

entnommen und in eine zweite Platte

pipettiert. Die Quantifizierung der Spaltung

erfolgt mit Hilfe eines Fluoreszenz-Elisaplatten-Readers

(Anregungswellenlänge 325 nm,

Emissionswellenlänge 420 nm). Abhängig

von der Anzahl der entnommenen Aliquots

können Erkenntnisse über den zeitlichen Verlauf

der Spaltung gewonnen werden. Aufgrund

der Festphasenfixierung der Substrate

wird der Assay mit geringfügig höheren

Proteaseaktivitäten und längeren Inkubationszeiten

als bei Experimenten in homogener

Lösung durchgeführt.

Entwicklung peptidischer

Substrate aus Proteinsubstraten

Abb. 1: Schematische

Darstellung des Protease-

Assays. Peptide zwischen

sechs und zwölf Aminosäuren

Länge, die am N-Terminus

einen Fluoreszenzfarbstoff

tragen, werden mittels SPOT-

Synthese hergestellt,

ausgestanzt und in 96-well-

Mikrotiterplatten transferiert.

Nach Zugabe der Proteaselösung

werden Aliquots des

Überstandes entnommen.

Die Quantifizierung des

N-terminalen Spaltungsfragmentes

mit dem Fluoreszenzmarker

erfolgt mit Hilfe eines

Mikrotiterplatten-Readers.

Sofern Proteine als Proteasesubstrate bekannt

sind, bieten sich zur Charakterisierung

der Spezifität und zur Entwicklung

peptidischer Substrate Scans überlappender

Peptide an, die zuerst für die Kartierung

linearer Antikörperepitope beschrieben

wurden 6 . Die gesamte Sequenz des Proteinsubstrates

wird in Form kurzer, linearer Peptide

synthetisiert (Abb. 2A). Üblicherweise

werden dafür Peptide zwischen sechs und

zwölf Aminosäuren Länge verwendet. In

Abhängigkeit von der Komplexität der Erkennungssequenz

findet man verschieden

viele Bereiche, die proteolytisch degradiert

werden. Dieses Prinzip ist experimentell

anhand eines Peptid-Scans des Lysozyms

Fortsetzung auf Seite 31

26 | Nr. 4/2000 |transkript LABORWELT


B L I T Z L I C H T

Abb. 2: (A) Prinzip eines Scans überlappender

Peptide, die aus einer Proteinsequenz

abgeleitet wurden (Decamere, 7 Aminosäuren

Überlappung). (B) Scan überlappender Peptide,

die aus der Sequenz des Hühnereiweiß-

Lysozyms abgeleitet wurden (Heptamere, 4

Aminosäuren Überlappung), der auf Spaltung

durch Trypsin getestet wurde. Peptide, die

Lysin oder Arginin enthalten, zeigen hohe

Fluoreszenzsignale.

Fortsetzungvon Seite 26

aus Hühnereiweiß gezeigt, das tryptisch

verdaut wurde (Abb. 2B).

Charakterisierung und

Optimierung peptidischer Substrate

Die einzelnen Positionen eines peptidischen

Substrates haben je nach Struktur der Substratbindungsstelle

unterschiedliche Bedeutung

für die kinetischen Parameter der Spaltungsreaktion.

Diese Einflüsse können durch

eine Substitutionsanalyse, die alle möglichen

Einzelsubstitutionen durch die genetisch

codierten Aminosäuren umfaßt, bestimmt

werden. Mit diesem Experiment werden

Aminosäurereste identifiziert, die entweder

nicht oder nur durch physikochemisch ähnliche

Reste substituierbar, beliebig variabel

oder aber optimierbar sind. Abbildung 3

zeigt eine Substitutionsanalyse des Caspase-3

Substrates VDQMDGW. Die P 1

-Position

ist der C-terminale Asparaginsäurerest,

der ohne Verschlechterung der Substrateigenschaften

nicht austauschbar ist. Substitutionen,

die zu höheren Signalintensitäten

als das Ausgangspeptid führen, können zur

Optimierung der Substrateigenschaften oder

zur Erhöhung der Spezifität gegenüber anderen

Proteasen verwendet werden.

Sofern keine Proteinsubstrate zur sequenzbasierten

Identifzierung von Substraten bekannt

sind, werden kombinatorische Bibliotheken

verwendet 7 . Abbildung 4 zeigt die

gemessenen Signalintensitäten einer kombinatorischen

Bibliothek der Form Abz-

XXB 1

B 2

XX nach der Spaltung mit Trypsin. X

steht für ein Gemisch aller genetisch codierten

Aminosäuren mit Ausnahme von Cystein,

Methionin und Tryptophan, die aus

synthetischen Gründen nicht im Reaktionsgemisch

enthalten sind. B 1

und B 2

sind definierte

Positionen, die aber zwischen den

SPOTs der Bibliothek variabel sind. Alle 400

möglichen Dipeptidkombinationen, flankiert

von je zwei Gemischpositionen, sind in einer

20 x 20 Matrix repräsentiert (B 1

= Reihen,

B 2

= Spalten). Auf jedem SPOT dieser Bibliothek

befindet sich ein Gemisch aus 20 4 =

160.000 Peptiden. Eine deutliche Präferenz

für Lysin und Arginin ist in Abbildung 4 zu

sehen. Zur Dekonvolution der Gemischpositionen

wird ein SPOT mit hoher Signalintensität

ausgewählt und eine zweite Bibliothek

der Form XB 1

OOB 2

X synthetisiert

(O = nach Auswahl aus der ersten Bibliothek

fixierte Position). Jeder SPOT dieser Bibliothek

enthält bereits nur noch ein Gemisch

von 20 2 = 400 Peptiden. In einem letzten

Schritt werden Peptide der Form B 1

ZOOZB 2

synthetisiert und getestet (Z = nach Auswahl

aus der zweiten Bibliothek fixierte Position),

wobei jeder SPOT ein definiertes

Peptid darstellt.

Zusammenfassung

Die Entwicklung eines Protease-Assays auf

der Basis von Peptiden, die mittels SPOT-

Abb. 3: Substitutionsanalyse des Caspase-3 Substrates VDQMDGW mit allen möglichen Einzelsubstitutionen

durch L-Aminosäuren und 14 identischen Wildtyp-SPOTs (7 in der linken Spalte (wt) und

7 innerhalb der Substitutionsmatrix).

De novo-Identifizierung von

Proteasesubstraten

Abb. 4: Kombinatorische Bibliothek der Form Abz-XXB 1

B 2

XX, die mit Trypsin inkubiert wurde. Jeder

SPOT besitzt vier randomisierte Positionen (X) und zwei definierte Aminosäuren. Das entspricht

Gemischen von 20 4 = 160.000 verschiedenen Peptiden je SPOT. Alle 20 2 = 400 möglichen

Dipeptidkombinationen sind vertreten (B 1

= Reihen, B 2

= Spalten).

|transkript LABORWELT Nr. 4/2000 | 31


B L I T Z L I C H T

Synthese hergestellt wurden, stellt eine Technologie

dar, mit der eine Vielzahl von Peptiden

schnell, effizient und kostengünstig auf

proteolytische Spaltung getestet werden

kann. So können peptidische Substrate de

novo oder auf der Basis bekannter Proteinsubstrate

identifiziert und durch Substitutionsanalysen

charakterisiert und optimiert

werden. Proteasen, die insbesondere in jüngerer

Zeit durch Genomsequenzierungsprojekte

neu entdeckt wurden, können mit Hilfe

dieser Technologie in physiologische und

pathologische Zusammenhänge eingeordnet

werden. Darüber hinaus bietet die Identifizierung

peptidischer Substrate einen Ansatzpunkt

zur Entwicklung von Leitstrukturen

für neuartige Wirkstoffe.

Literatur

[1] Beynon, R.J., Bond J.S., Proteolytic

enzymes, a practical approach (1989), IRL

Press at Oxford University Press.

[2] Meldal, M., Svendsen, I., Breddam, K.,

Auzanneau, F.I. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 91: 3314-3318.

[3] Duan, Y., Laursen, R.A. (1994) Anal.

Biochem. 216: 431-438.

[4] Reineke, U., Kurzhals, D., Köhler, A.,

Blex, C., McCarthy, J., Li, P., Germeroth, L.,

Schneider-Mergener, J. (2000) Proceedings of

the Twenty-Sixth European Peptide

Syposium, in press.

[5] Frank, R. (1992) Tetrahedron 48: 9217-

9232.

[6] Geysen, H.M., Meloen, R.H., Barteling,

S.J. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:

3998-4002.

[7] Kramer, A., Schuster, A., Reineke, U.,

Malin, R., Volkmer-Engert, R., Landgraf, C.,

Schneider-Mergener, J. (1994) Methods: A

companion to Methods in Enzymology 6:

388-395.

Korrespondenzadressen

Dr. Ulrich Reineke

Director of Assay Development and Screening

eMail: reineke@jerini.de

Dr. Ulrich Hoffmüller

Director of Marketing

eMail: hoffmueller@jerini.de

JERINI Bio Tools GmbH

Rudower Chaussee 29

D- 12489 Berlin

Funktionsanalyse

Laser-vermittelter Protein-

Knock-out zur Targetvalidierung

DR. FRITZ RUDERT, DR. ELISABETH MEYER, DR. SUSANNE RUBENWOLF UND PETER RUDOLPH,

XERION PHARMACEUTICALS GMBH, MARTINSRIED

Das Genomics-Zeitalter hat zu einer immensen Datenflut in der Biologie geführt und ist auf dem bestem

Wege, die Medikamentenforschung zu revolutionieren („from genes to drugs“). Die Anwendung der

erst vor einigen Jahren entwickelten, robotergestützten und miniaturisierten Hochdurchsatztechnologien

– etwa Sequenzierroboter zur automatisierten DNA-Sequenzierung oder DNA-Microarrays zur

Bestimmung von Expressionsprofilen – hat allerdings zunächst eher zu einem „Informationsstau“

geführt. Die eigentliche Aufgabe, die nach der Entzifferung des menschlichen Genoms ansteht, wird von

vielen Fachleuten in der Analyse der Funktion und des Zusammenspiels der Gene gesehen. Dies aber ist

eine ungleich komplexere Aufgabe als die strukturelle Aufklärung der DNA-Sequenz, und im Moment

mangelt es noch an geeigneten Methoden, um die Funktionsanalyse des menschlichen Genoms mit dem

erforderlichen Durchsatz und der benötigten Ausagekraft anzugehen. Ansatzpunkte für die generelle

Funktionsanalyse sowie Validierung krankheitsrelevanter Zielmoleküle liegen aber sicherlich auf der

Proteinebene – denn die Proteine setzen in den allermeisten Fällen die genetische Information der DNA

in zellulären Prozessen um – folglich sind mehr als 90 % der zugelassenen Medikamente gegen Proteine

gerichtet. Jüngste Entwicklungen der „chromophore-assisted laser inactivation“ (CALI) von Proteinen

stellen einen vielversprechenden Ansatz im Bereich der funktionellen Proteomanalyse dar.

Key Words: Chromophore-assisted laser inactivation (CALI), Targetvalidierung, High Throughput-

Screening, Proteinfunktionszuordnung, Microarrays, Cellular Pathways, Pharmacogenomics

Funktionsanalysen sowie die Targetvalidierung

sollten idealerweise in lebenden Zellen

stattfinden. Um hierbei einen hohen Durchsatz

zu ermöglichen, der nicht mit Tiermodellen

höherer Säuger – etwa den Gen-

Knock-outs der Maus – erreicht werden kann,

setzt man in der Regel auf Zellkultursysteme

von Primärzellen und Zellinien in Verbindung

mit aussagekräftigen Assays. Häufig

wird ein „loss-of-function“-Ansatz gewählt,

um die funktionelle Relevanz eines

Gens oder Proteins für einen bestimmten

zellulären Prozeß zu bestimmen. Dabei

kommt oft die sogenannte Antisense-Technologie

zum Einsatz. Mittels Antisense-Expressionsvektoren

oder Antisense-Oligonukleotiden

wird entweder die Synthese oder

Translation einer bestimmten mRNA reduziert.

Um funktionelle Auswirkungen hervorzurufen,

muß aber der Primäreffekt auf

RNA-Ebene auch auf der Proteinebene zum

Tragen kommen. Allerdings kann sich dies

besonders bei langlebigen Proteinen als problematisch

erweisen. Zudem kristallisiert

sich immer mehr heraus, daß es keine eindeutige

Korrelation zwischen mRNA-Expression

und Proteinproduktion innerhalb

der Zelle zu geben scheint. Da der Antisense-

Effekt auf die RNA-Ebene zielt, bedarf es

einer gewissen Zeit, bevor er sich auf Proteinebene

manifestieren kann, wobei während

dieser Anlaufphase kompensatorische Mechanismen

in der Zelle (wie etwa strukturell

und/oder funktionell verwandte Proteine)

die potentiellen Auswirkungen des Knockouts

auf die untersuchte Funktion verwässern

können. Der Antisense-Ansatz sowie

Gen-Knock-out in Mäusen stellen chronische

Inhibierungsstrategien dar, welche zusätzlich

zu den bereits erwähnten Kompensationsmechanismen

im Falle von Knockout-Tiermodellen

mit Letalitätsproblemen

belastet sein können.

Das CALI-Prinzip

Verglichen mit Antisense- und Gen-Knockout-Strategien

setzt die „chromophore-assi-

Abb. 1: Schematische

Darstellung des CALI-

Prinzips. Erklärung

siehe Text.

32 | Nr. 4/2000 |transkript LABORWELT


B L I T Z L I C H T

sted laser inactivation“ (CALI)-Methode 1 direkt

auf der Proteinebene an und bewirkt

eine induzierbare, akute und transiente Inhibition

der Proteinfunktion. Damit wird dem

zellulären System keine Zeit zum Aufbau

von Kompensationsmechanismen gegeben,

wodurch gegebenenfalls auch andere Antworten

auf biologische Fragestellungen erhalten

werden. Das generelle Prinzip von

CALI (Abb. 1) besteht in einer lokal induzierbaren

photochemischen Reaktion, die über

Produktion kurzlebiger, freier Radikale zur

kovalenten Modifikation des Zielproteins

führt und damit dessen Inaktivierung beirken

kann. Hierzu wird ein zielmolekülspezifischer

Ligand (zumeist ein Antikörper) verwendet,

der chemisch mit einem Farbstoff

(etwa Malachitgrün (1) mit Absorptionmaximum

bei 630 nm oder Fluoreszein (2) mit

Absorptionsmaximum bei 494 nm) gekoppelt

wird, welcher mittels Laserlicht geeigneter

Wellenlänge zur Erzeugung von Radikalen

angeregt werden kann. Bindet der Ligand

in der Nähe einer für die Funktion des Proteins

wichtigen Stelle, werden die über CALI

induzierten Modifikationen mit großer Wahrscheinlichkeit

zur permanenten Inaktivierung

des betroffenen Proteinmoleküls führen.

CALI besitzt daher eine hohe räumliche und

zeitliche Auflösung und wandelt mit hoher

Abb. 2: Beladung von Säugerzellen

mit farbstoffmarkierten

Antikörpern.

(A) Primäre Herzmuskelzellen der

Ratte und (B) primäre, menschliche

Nabelschnur-Endothelzellen

(HUVEC) wurden mit fluoreszeinmarkierten

IgG-Antikörpern

(A, 50 µg/ml; B, 200 µg/ml)

mittels einer neuartigen, von

Xerion Pharmaceuticals

entwickelten Methode beladen.

A

B

Wahrscheinlichkeit nichtneutralisierende Antikörper

(der weitaus überwiegende Fall) in

funktionsinhibierende Reagenzien um. Bei

Verwendung von Malachitgrün als CALI-

Farbstoff liegt der halbmaximale Wirkungsradius

der gebildeten Hydroxylradikale bei

ca. 15 Ångstrom 3 , im Falle von Fluoreszein

und den daraus resultierenden Singulett-Sauerstoffradikalen

ist dieser Wert etwa doppelt

so hoch. Diese räumliche Auflösung ist in der

Regel ausreichend, um benachbarte Proteine

in einem Proteinkomplex nicht zu schädigen.

Dies wurde etwa durch reziproke CALI einzelner

Komponenten des T-Zellrezeptorkomplexes

in lebenden T-Zellen bestätigt, wobei

CALI etwa der α-Untereinheit keine signifikanten

Auswirkungen auf die benachbarten

β- und CD3-Untereinheiten hatte 4 . CALI

wurde erfolgreich bei einer breiten Palette

von zellulären Targetproteinen und auf unterschiedlichsten

Zelltypen eingesetzt 5 . Darüber

hinaus wurde CALI bereits in geeigneten

Tiermodellen, wie etwa Embryonen der

Fruchtfliege Drosophila melanogaster oder des

Zebrafischs zur Analyse entwicklungsbiologischer

Vorgänge verwendet 6 . Eine Sonderform

von CALI stellt das sogenannte Micro-

CALI dar 7 . Hierbei handelt es sich im Prinzip

|transkript LABORWELT Nr. 4/2000 | 33


B L I T Z L I C H T

Abb. 3: CALI-Protein-Knock-out von Caspase-3. Apoptose wurde in primären

HUVEC-Zellen (A) mit TNFα/DMS induziert (B-D). Vor Apoptoseinduktion wurde ein

Teil der Zellen zuerst mit unmarkierten (C) oder fluoreszeinmarkierten (D) Anti-

Caspase-3-Antikörpern (200 µg/ml) beladen und anschließend sowohl beladene als

auch unbeladene Zellen mit gepulstem Laserlicht (494 nm) für 5 min bestrahlt.

Apoptotische Zellen wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie nach Annexin-V-

Markierung nachgewiesen und quantifiziert.

um die Kombination eines Mikroskopes mit

einer Laserquelle, wobei der zur Inaktivierung

verwendete Laserstrahl mit Hilfe der

Mikroskopoptik besonders fein fokussiert

wird (im Bereich weniger Mikrometer verglichen

mit mehreren Millimetern im Falle von

CALI). Diese Anordnung ermöglicht eine Einzelzellanalyse

mit besonders hochauflösender

CALI bis in den subzellulären Bereich.

Mittels Micro-CALI wurde etwa die Rolle

einer Reihe von Proteinen in bezug auf Ausbildung,

Aufrechterhaltung und Wachstumsverhalten

neuronaler Wachstumskegel an der

Spitze von Neuriten untersucht 7 .

Proteintransfektion in

Säugerzellen

Im Falle von extrazellulären Proteinen ist

das Zielmolekül für den CALI-Liganden,

zum Beispiel einen farbstoffmarkierten Antikörper,

leicht erreichbar. Um intrazelluläre

Targetproteine ansprechen zu können,

muß der Antikörper jedoch erst mit geeigneten

Methoden in die Zellen eingeschleust

werden. Hierzu stehen eine Reihe Zelltypabhängiger,

mehr oder weniger effizienter

Methoden zur Verfügung. Eine klassische

Methode, die Triturierung, nützt Scherkräfte

aus, mit deren Hilfe transiente Poren in

Zellen gerissen werden, durch die Proteine

in die Zelle gelangen können. Diese Methode

läßt sich jedoch nur bei bestimmten Zellen

erfolgreich anwenden und ist zudem oft

relativ zellschädigend. Alternativ dazu kann

Elektroporation eingesetzt werden, mit der

man relativ hohe Proteintransfektionsraten

in einer Vielzahl verschiedenartiger Zellen

erreicht – die Elektroporation geht jedoch

auch oft mit einer signifikanten Zellschädigung

einher. Eine klassische Methode stellt

die Mikroinjektion dar, die weiterentwickelt

wurde und daher heute wesentlich leistungsfähiger

zur Verfügung steht. Dennoch sind

auch mit dieser Methode routinemäßig nur

bestimmte Zellen (in der Regel nur vollends

adhärente) beladbar. Darüber hinaus ist der

Durchsatz von Einzelinjektionen immer wesentlich

geringer als von Methoden, die eine

ganze Zellpopulation simultan beladen können.

Die Mikroinjektion ist daher vornehmlich

für Micro-CALI geeignet. Die Kopplung

oder genetische Fusion von zellgängigen

Shuttle-Proteinsequenzen (zumeist aus viralen

Proteinen wie etwa VP22 oder HIV-Tat)

an zu translozierende Proteine stellt eine

weitere Option dar. Diese Methode erfordert

jedoch in der Regel die Klonierung, Expression

und Reinigung eines rekombinaten Fusionsproteins;

und die Translokationseffizienz

kann, je nach verwendeter Shuttle-Sequenz,

stark vom Fusionspartner und der Zielzelle

abhängen. Xerion Pharmaceuticals hat eine

neue, einfach anzuwendende Translokationsmethode

entwickelt, die eine effiziente Proteinaufnahme

in einer Vielzahl von Zellen gewährleistet

und ideal in Kombination mit

CALI angewandt werden kann. Zwei Beispiele

sensibler Primärzellkulturen, Rattenherzmuskelzellen

und menschliche Endothelzellen,

die erfolgreich über diese Methode

mit fluoresceinmarkierten Antikörpern beladen

wurden, sind in Abbildung 2 gezeigt.

Caspase-3-CALI:

ein Anwendungsbeispiel

Als Targetvalidierungstechnologie sollte

CALI in zellgestützen Systemen einsetzbar

sein, mit denen krankheitsrelevante Prozesse

analysiert werden könnnen. Am Beispiel

der Effektorprotease Caspase-3, die eine zentrale

Funktion im Bereich Apoptose/programmierter

Zelltod besitzt, sollen Möglich-

Abb. 4: XCALIbur-

Steuer-Software für

automatisiertes CALI im

Mikrotiterplattenformat

keiten von CALI und zu erwartende Resultate

illustriert werden. Die Apoptose von

Endothelzellen spielt während der Artheriosklerose

eine wichtige Rolle. Apoptose in

primären, menschlichen Endothelzellen aus

der Nabelschnur (HUVEC, human umbilical

vein endothelial cells) kann als krankheitsrelevanter

Surrogat-Assay dienen, um

Targetproteine zu validieren, die eine Rolle

innerhalb dieses Prozesses spielen.

HUVEC-Zellen wurden über Stimulierung

des TNF-Rezeptors mittels seines Liganden,

TNFα, zur Apoptose induziert. Als Apoptoseverstärker

wurde gleichzeitig Dimethylsphingosin

(DMS) eingesetzt. Mit dieser

Kombination kann bis zu 80 % Apoptose in

HUVEC-Zellen erzielt werden (Abb. 3A und

3B). Zur Bestimmung der Zahl apoptotischer

Zellen wurde ein rotfluoreszenter Annexin-

V-Assay verwendet, welcher zelloberflächenexponiertes

Phosphatidylserin als frühen

Apoptosemarker nachweist. Für CALI

von Caspase-3 wurden HUVEC-Zellen vor

der Apoptoseinduktion entweder mit unmarkierten

(Abb. 3C, Kontrolle) oder fluoreszeinmarkierten

(Abb. 3D, CALI) Anti-Caspase-3-Antikörpern

beladen und mit gepulstem

Laserlicht bei 494 nm bestrahlt. Die

Beladung mit unmarkierten Antikörpern

und nachfolgende Laserbestrahlung hatte

keinen signifikanten Einfluß auf die Apoptose,

wohingegen die Anwesenheit von

fluoreszeinmarkierten Anti-Caspase-3-Antikörpern

zu einer signifikanten Reduzierung

der apoptotischen Zellen (ca. 75 %)

nach Laserbestrahlung führte (Abb. 3D). Aus

diesem Ergebnis kann der Schluß gezogen

werden, daß Caspase-3 wichtig für die TNF-

Rezeptor-vermittelte Apoptose in HUVEC-

Zellen ist. Wenn es sich hierbei nicht, wie im

vorliegenden Beispiel, um ein bereits validiertes

Protein handeln würde, wäre durch

das oben beschriebene Experiment ein Targetprotein-Kandidat

als Apoptose-relevantes

Protein validiert worden. Es ist jedoch

auch möglich, mehrere Targetproteine

gleichzeitig sowie unbekannte Proteine mit

CALI zu inaktivieren. Im ersten Fall könnte

somit die funktionelle Redundanz innerhalb

verwandter Proteine besser eingegrenzt oder

überwunden werden. Im zweiten Fall kann

die Rolle unbekannter Proteine, für die jedoch

bereits ein Antikörper/Ligand existiert,

innerhalb bestimmter zellulärer Prozesse validiert

werden, noch bevor die Identität des

Targetproteins bekannt ist („funktionelles

Hit-Screening“).

34 | Nr. 4/2000 |transkript LABORWELT


B L I T Z L I C H T

CALI-Automatisierung

Um Targetvalidierung mit CALI im industriellen Maßstab betreiben

zu können, ist es aus Gründen des Durchsatzes, der Reproduzierbarkeit,

aber auch der Arbeitssicherheit erforderlich, den Prozeß zu

automatisieren. Zu diesem Zweck wurde eine zentrale Steuersoftware

entwickelt (Xerion Pharmaceuticals), welche die Ansteuerung

der Laser und die Abarbeitung der zu bestrahlenden Proben koordiniert

(Abb. 4). Die Probenplatte wird hierzu mit Hilfe eines Präzisionskreuztisches

unter dem Laserstrahl auf dem zuvor definierten Weg

geführt. Verschiedene CALI-Parameter, wie Wellenlänge, Bestrahlungszeit

und Laserenergie, können individuell für jede Probe frei

gewählt werden. Ebenso ist die Programmierung von CALI-Experimenten

in verschiedenen Mikrotiterplattenformaten (96 oder 384

Kavitäten) möglich.

[5] Ilag, L. L., Ng, J. H., and Jay, D. G., Drug Development Research 49

(2000), 65-73.

[6] Schmucker, D., Su, A.L., Beermann, A., Jackle, H., and Jay, D.G., Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994), 2664-2668.

[7] Buchstaller, A. and Jay, D.G., Microsc. Res Tech. 48 (2000), 97-106.

Korrespondenzadresse

Dr. Fritz Rudert

Xerion Pharmaceuticals GmbH

Fraunhoferstraße 9

D- 82152 Martinsried/München

Tel.: 089-89 99 64-25, Fax: 089-89 99 64-10

eMail: f.rudert@xerion-pharma.com

Ausblick

Direkte Proteininaktivierung mittels CALI ist eine attraktive Methode

zur Validierung von Targetkandidaten. CALI kann sowohl komplementäre

Daten in bezug zu anderen Validierungstechnologien

generieren sowie zusätzlich neue Erkenntnisse in Situationen liefern,

in denen diese Methoden auf Probleme stoßen. Ein kritischer Faktor

für CALI, besonders bei uncharakterisierten Targetproteinen, ist die

Verfügbarkeit von spezifischen Antikörpern. Hier können zum einen

alle bereits vorhandenen Antikörper (und prinzipiell auch andere

Liganden, wie Peptide, Aptamere oder chemische Verbindungen) für

CALI genutzt werden. Zum anderen lassen sich mit Hilfe neuer

Selektionstechniken, wie etwa Phage display von single-chain-Antikörperfragmenten

(oder Ribosome Display), auf schnelle Weise eine

Vielzahl von Bindern gegen nahezu jedes Protein generieren. Die

Verwendung von Phage display-Antikörperbibliotheken zur Ligandengenerierung

für CALI wird von Xerion Pharmaceuticals bereits

erfolgreich eingesetzt. Durch die weitere Automatisierung der beiden

Schlüsseltechnologien – Ligandengenerierung und CALI – sowie

deren Integration entsteht eine Hochdurchsatzplattform zur zellgestützten

Targetvalidierung. Durch besonderes Augenmerk auf Assay-Design

und den Einsatz umfassender Auslesesysteme, wie etwa

Multiparameter High-Content-Screening (etwa mit dem von Cellomics

Inc. entwickelten Array-Scan II) oder Gen- und Proteinexpressionsanalyse

mit Microarrays nach erfolgtem CALI kann ein Höchstmaß

an Information aus einem Validierungsexperiment gewonnen

werden. Derart umfassende Information kann helfen, die globalen

Auswirkungen der Inaktivierung eines bestimmten Proteins für die

Zelle besser zu beschreiben und die Positionierung von Targetprotein

innerhalb bestimmter zellulärer Prozesse und Signaltransduktionswege

vorzunehmen. Ein interessantes Einsatzgebiet von CALI liegt

im Bereich Pharmacogenomics/Pharmacoproteomics. Hier kann versucht

werden, Aufschlüsse über Wirkstoffe mit unvorteilhaften Toxizitätseigenschaften

zu erlangen, indem man z.B. Genexpressionsprofile

nach CALI des Proteins, gegen welches der Wirkstoff gerichtet ist,

mit Expressionsprofilen vergleicht, wie sie durch den Wirkstoff selbst

erzeugt werden. Zusätzliche, nur durch den Wirkstoff deregulierte

Gene sind dann möglicherweise Gründe für dessen Toxizität und

wären ein Ansatzpunkt für Wirkstoff-Optimierungsstartegien. Mit

derartigen Analysen lassen sich zudem wichtige Erkenntnisse über

die Eignung eines bestimmten Proteins als therapeutisches Target

und dessen Toxizitätspotential gewinnen. Obige Ansätze können

einen wichtigen Beitrag zur Optimierung des Wirkstoffentwicklungsprozesses

und klinischer Studien leisten und damit zu beträchtlichen

Zeit- und Kosteneinsparungen führen.

Literatur

[1] Jay, D.G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 5454-5458.

[2] Surrey, T., Elowitz, M.B., Wolf, P.E., Yang, F., Nedelec, F., Shokat, K.,

and Leibler, S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998), 4293-4298.

[3] Linden, K.G., Liao, J.C., and Jay, D.G., Biophys. J. 61 (1992), 956-962.

[4] Liao, J.C., Berg, L.J., and Jay, D.G., Photochem. Photobiol. 62 (1995), 923-929.

|transkript LABORWELT Nr. 4/2000 | 35


P R O F I L E

Funktionsanalyse

Proteomics und Drug Discovery

STEFAN SCHMIDT, CHRISTINE GAUSS, NIKOLAI KLEY, GPC-BIOTECH AG, MARTINSRIED

Mit der „Genomics-Revolution“ wurde die Basis für den gezielten Einsatz von Hochdurchsatz-

Methoden zur Aufklärung biologischer Prozesse geschaffen. Trotz des breiten Anwendungsbereichs

derartiger Technologien ist eine vollständige Analyse und Aufdeckung der molekularen Ursachen

physiologischer und pathologischer Prozesse nur zusammen mit dem Einsatz innovativer Methoden

möglich, die eine Analyse des „Proteoms“ erlauben. Oft trägt selbst die Entdeckung neuer Krankheitsgene

nur geringfügig zur Entwicklung von Therapeutika bei, zumal diese meist keine geeigneten

Angriffspunkte darstellen. In diesen Fällen ist für die Entdeckung und rationale Selektion von

auswertbaren Zielstrukturen eine Analyse des Wirkungsmechanismus dieser Gene und deren

verknüpften Signalketten erforderlich.

Die abgeschlossene Sequenzierung von Genomen ist daher keinesfalls gleichbedeutend mit einer

funktionellen Analyse der einzelnen Gene. Nur eine Minderheit der kodierten Proteine weist eine

durch Sequenz-Homologie ableitbare Funktion auf. Da Proteine aber den überwiegenden Anteil der

pharmazeutischen Angriffspunkte darstellen, sind innovative Hochdurchsatz-Methoden erforderlich,

die zum einen die schnelle Charakterisierung von Proteinen ermöglichen und zum anderen neue

pharmakologisch relevante Zielmoleküle identifizieren. In diesem Kontext hat GPC-Biotech eine Reihe

automatisierter Techniken zur funktionellen Proteom-Analyse etabliert.

Key Words: Proteininteraktion, Reverse Genomics, Proteomanalyse

Eine dieser Technologien dient dem Nachweis

von Protein-Protein-Interaktionen (Pathcode)

mittels einer automatisierten Hochdurchsatz-Hefe-Two-Hybrid-Analyse.

Dabei

konnten sowohl der Durchsatz gesteigert als

auch die Rate der falsch-positiven Signale

drastisch verringert werden. Die simultane

Prüfung tausender von Proteinen auf potentielle

Interaktionen kann letztlich zur Aufdeckung

von Signalnetzwerken und biocheten-Entwicklung

beisteuern. Proteocode

integriert Protein-Biochemie, Hochdurchsatz-

Protein-Reinigung und Bioinformatik mit

klassischen Ansätzen wie 2D-Gelelektrophorese

und Massenspektrometrie.

Ein Kernstück der biochemischen Charakterisierung

ist die automatische Reinigung und

Präparation von Proteinen, die in Expressionsbibliotheken

vorhanden sind. Die Isolation

der rekombinanten Proteine erfolgt über

Abb. 1: Überblick über Proteomics-Technologien bei GPC-Biotech. links: Klassische 2D-Gelelektrophorese und Massenspektroskopie,

Mitte: Automatisierte Hefe-2-Hybrid-Analyse (PathCode TM ), rechts: Hochdurchsatz-Protein-Expression und -Reinigung (ProteoCode TM )

„Klassische“ Methoden wie 2D-Gelelektrophorese

und Massenspektrometrie werden

bei GPC-Biotech zur komparativen und quantitativen

Expressionsanalyse, zur Identifizierung

von Surrogatmarkern (Loferer et al., DRUG

DISCOV TODAY 2000 Mar;5(3): 107-114) für

mikrobielle Stoffwechselwege und zur Analyse

von Protein-Komplexen verwendet.

Eine Identifizierung einzelner Komponenten

temporärer oder permanenter Protein-Komplexe

erleichtert das Auffinden von Molekülen,

welche die Stabilität oder Bildung dieser

Aggregate beeinflussen, und beschleunigt die

Entwicklung geeigneter Medikamente. Ein

Protein, das Bestandteil eines Komplexes ist,

wird durch molekularbiologische Methoden

mit einem Affinitäts-Tag fusioniert, welches

zur Isolierung des Komplexes durch Affinitätschromatographie

dient. Dabei wird das

Protein mit all seinen Interaktionspartnern,

aus denen der Komplex zusammengesetzt

ist, effektiv vom übrigen Zellmaterial abgetrennt.

Die einzelnen Komponenten werden

mittels Gelelektrophorese getrennt und durch

Massenspektrometrie identifiziert. Komplexe

oder einzelne Proteine können aber auch

durch Medikamenten-Kandidaten, die mit

einem Affinitäts-Tag versehen sind, isoliert

werden. Dieser Prozeß ist Bestandteil einer

multidisziplinären Technologie, die als Reverse

Genomics bezeichnet wird.

Die von GPC-Biotech etablierten Technologien

zur Genom- und Proteomforschung erlauben

die Charakterisierung der molekularen

Grundlage des Wirkmechanismus von Submischen

Stoffwechselwegen führen. Das Verständnis

der Rolle eines spezifischen Proteins

im Kontext eines derartigen Netzwerks erlaubt

eine beschleunigte Wahl des optimalen

Angriffpunktes für einen späteren therapeutischen

Eingriff.

Der Begriff Proteocode vereinigt Methoden,

welche die parallele Analyse exprimierter

Proteine, die dynamische Beschreibung

der Protein-Regulationen und die biochemische

Charakterisierung der Protein-Funktion

ermöglichen und damit wichtige Informationen

über neue Zielmoleküle zur Medikamen-

Affinitätschromatographie, die von der Anwesenheit

eines Affinitäts-Tags abhängt, das

über einen geeigneten Expressionsvektor unmittelbar

an das heterologe Protein fusioniert

wird. Idealerweise werden für diesen Schritt

Tags wie GST, His 6

, CBP, Strep-tag oder HA

verwendet. GPC-Biotech hat diese Methode

optimiert und kann heute Trennzeiten von

weniger als 150 Sekunden pro Probe bei einer

Ausbeute von durchschnittlich 10 µg und einer

Reinheit von mehr als 80 % routinemäßig

erreichen. Die hiermit erzielte Proteinmenge

ist ausreichend für zahlreiche miniaturisierte

Analysen, zum Beispiel auf Protein-Arrays.

stanzen mit potentiell therapeutischen Aktivitäten.

Die Identifizierung des molekularen

Mechanismus durch den bioaktive Substanzen

ihren Effekt ausüben, ist von herausragender

Bedeutung in der Medikamenten-Entwicklung,

da es dadurch möglich wird, sich

auf die Substanzen mit dem höchsten klinischen

Potential zu fokussieren.

Korrespondenzadresse

Stefan Schmidt, Christine Gauss, Nikolai Kley

GPC-Biotech AG

Fraunhoferstraße 20, D-82152 Martinsried

36 | Nr. 4/2000 |transkript LABORWELT


B L I T Z L I C H T

Proteinexpression

Rapid Translation System RTS 500–

zellfreie Proteinexpression im

präparativen Maßstab

DR. SONJA VOGEL-ROHWER, ROCHE DIAGNOSTICS GMBH, MANNHEIM

Die Aufklärung der physiologischen Aufgabe von Proteinen entwickelt sich zu einem bedeutenden

Arbeitsgebiet der „Life Science“-Forschung. Das Human Genome Project (HGP) verleiht diesem

Anliegen eine ganz neue Dimension: Ende Juni wurde die Entschlüsselung des menschlichen Genoms

bekanntgegeben. Je mehr Gensequenzen aufgeklärt sind, desto mehr rückt der mit ihnen verknüpfte

Phänotyp, vor allem also die Proteine als Funktionsträger der Zelle, in den Mittelpunkt des Interesses.

Für die Erforschung der genetischen Ursachen von Krankheiten reicht es dabei nicht allein aus, die

beteiligten Gene und ihre DNA-Sequenz zu kennen. Will man Krankheiten verstehen und bekämpfen,

muß man die Funktion von Proteinen untersuchen, die im Körper bei allen biologischen Vorgängen,

wie etwa Wachstum, Stoffwechsel und Erkrankungen, beteiligt sind.

Ein entscheidender Faktor für die funktionelle Analyse ist, eine ausreichende Menge des Proteins zu

gewinnen. Dies erforderte bisher eine zeitaufwendige Expression in Bakterien, Hefe- oder anderen

eukaryotischen Zellen. Nachteile, zum Beispiel der Einschluß des Proteins in „inclusion bodies“,

mußten dabei häufig in Kauf genommen werden. Auch wenn das zu synthetisierende Protein toxisch

auf die Bakterien und Zellen wirkt oder wenn es schnell durch zelleigene Enzyme abgebaut wird, liefert

die in vivo-Expression nicht die gewünschte Ausbeute.

Als Alternative bietet sich die Proteinsynthese mittels in vitro-Translation an. Die dabei erzielten

minimalen Ausbeuten reichten jedoch bislang für eine Funktionsanalyse des Proteins nicht aus.

Das Rapid Translation System

Das Rapid Translation System RTS 500 ist

das weltweit erste kommerzielle System zur

automatisierten, zellfreien Proteinexpression

und wurde bei Roche Diagnostics entwikkelt.

Das System ermöglicht es, innerhalb

von nur zwölf Stunden ein Protein in Mengen

bis zu einigen hundert Mikrogramm

herzustellen. Das Kultivieren von Bakterien,

Hefe- oder Säugetierzellen ist dazu nicht

mehr erforderlich. Selbst toxische Proteine

können problemlos exprimiert werden, und

auch modifizierte Proteine lassen sich synthetisieren,

so daß diese beliebig markiert

werden können.

Die Technologie

Das RTS 500 arbeitet mit einer kombinierten

in vitro-Transkription und -Translation. Dabei

werden dem zellfreien System alle für

die Proteinsynthese erforderlichen Komponenten

kontinuierlich zugeführt (continuous

exchange cell-free, CECF). In einer Reaktionskammer

, die durch eine semipermeable

Membran in zwei Kompartimente unterteilt

ist, werden dem Reaktions-Mix (E.coli-Lysat,

Nukleotide, T7-Polymerase) ständig die

Komponenten eines Feeding-Mixes (Energie,

Aminosäuren) durch Diffusion bereitgestellt.

Nebenprodukte, wie anorganisches Phosphat,

gelangen durch Diffusion in den Feeding-Mix

und werden so aus dem Reaktionsansatz

verdünnt. Dadurch kann die Proteinexpression

über viele Stunden aufrechterhalten

werden. Über Nacht lassen sich so bis zu

500 µg des gewünschten Proteins synthetisieren.

Das Rapid Translation System RTS 500

besteht aus dem RTS 500-Gerät und dem RTS

500 -

E. coli-Circular Template-Kit.

Der RTS 500-E. coli-Circular Template-

Kit enthält alle Komponenten, die für die

Expression gebraucht werden: E. coli-Lysat,

energieliefernde Substrate, Nukleotide,

Aminosäuren, Puffer; außerdem ein

Kontroll-Plasmid, Vektoren für die Klonierung

und eine RNase-freie Einweg-

Reaktionskammer. Die Handhabung ist

einfach, da alle Komponenten zur Expression

aliquotiert und lyophilisiert vorliegen

und in einem einzigen Puffer zu

lösen sind.

Im RTS-500 Gerät (s. Abb. 1) findet die

Proteinexpression statt. Temperatur und

Prozeßdauer sowie Rührgeschwindigkeit

Abb. 1: RTS 500-Gerät

können individuell eingestellt werden.

Am Ende der Reaktion wird die Reaktionskammer

zum Schutz des exprimierten

Proteins automatisch gekühlt.

Um das gewünschte Protein synthetisieren

zu können, muß die zu exprimierende cDNA

in einen Expressionsvektor kloniert werden.

Exprimiert wird mittels einer T7-RNA-Polymerase

auf Basis eines E. coli-Lysates, das

alle Komponenten der Transkriptions- und

Translationsmaschinerie enthält.

Das Expressionsniveau hängt bei einigen

Proteinen stark vom verwendeten Klonierungsvektor

ab. RTS 500 verwendet prokaryotische

Expressionsvektoren, die optimal

auf das Gerät abgestimmt sind. Angeboten

werden Vektoren, die wahlweise einen N-

oder C-terminalen His-Tag tragen. Weitere

Vektoren mit verschiedenen Tags werden in

Kürze verfügbar sein.

Anwendungsbeispiele

Weltweit haben sich 40 Forschungsinstitute

und Biotech-Unternehmen während einer

dreimonatigen Testphase von der Leistungsfähigkeit

der neuen Technologie überzeugt.

Mehr als 60 funktionell verschiedene Proteine

konnten bisher exprimiert werden, darunter

Strukturproteine, Enzyme sowie Hormone

und lösliche Rezeptoren (s. Tabelle 1).

Tab. 1: Auswahl exprimierter Proteine im RTS 500.

Eine vollständige Liste der exprimierten Proteine findet sich unter: www.proteinexpression.com

|transkript LABORWELT Nr. 4/2000 | 37


B L I T Z L I C H T

Interaktionsanalyse in vivo

Einzelne Moleküle im (Laser-)Fokus

PETRA SCHWILLE, MAX-PLANCK-INSTITUT FÜR BIOPHYSIKALISCHE CHEMIE, GÖTTINGEN

Abb. 2: Reaktionskammer mit Prinzip

Sogar das zelltoxische „Microtubuli Binding

Protein“, dessen Expression bislang noch

nicht möglich war, konnte funktionsfähig

synthetisiert werden (siehe Abb. 3)

Ausblick

Im nächsten Jahr wird es möglich sein, PCR-

Produkte direkt ohne Klonierungsschritte zu

exprimieren. Dies bietet sich vor allem bei

einer großen Anzahl zu untersuchender Proteine

an. Die parallele Expression der Proteine

wird in einem Multiwell-Format ermöglicht.

Abb. 3: Immunblot-Analyse von MID

Spur 1: Negativkontrolle (Expression ohne

Vektor)

Spur 2: Reaktionsprodukt ohne Reinigung

Spur 3-5: Elutionsfraktionen der Reinigung

Daten freundlicherweise zur Verfügung gestellt von

Dr. A. Lüking, MPI für molekulare Genetik, Berlin

Einzelmoleküldetektion

in den Biowissenschaften

Verfahren zur Detektion und dynamischen

Analyse einzelner Moleküle gewinnen in

den Biowissenschaften, insbesondere im

Bereich Proteomics, seit einiger Zeit zunehmend

an Bedeutung. Viele aktuelle Fragen

der biochemischen und zellbiologischen Forschung

lassen es als sinnvoll erscheinen, die

Dynamik von Proteinen und Nukleinsäuren

sowie deren Interaktionen auf Einzelmolekülebene

zu untersuchen, wobei die intrazelluläre

Einzelmolekülanalyse in vivo besonders

attraktiv erscheint. Durch die Entwicklung

leistungsstarker Laser und hochempfindlicher

Detektoren sowie geeigneter

Markierungsfarbstoffe sind es insbesondere

die nichtinvasiven fluoreszenzspektroskopischen

Techniken mit ihrer hohen Selektivität

und Sensitivität, die diesbezüglich die

vielversprechendsten Ansätze bereitstellen.

Neben der grundlagenwissenschaftlichen

Relevanz der Analyse kleinster funktionaler

Einheiten und deren Wechselwirkungen

gewinnen diese Einzelmolekül-basierten

Verfahren auch zunehmend Einfluß auf die

pharmakologische Wirkstoffentwicklung,

wo die angestrebte Miniaturisierung und

Automatisierung immer höhere Anforderungen

an die Detektionseffizienz molekularer

Wechselwirkungen stellen.

Um das Potential der fluoreszenzbasierenden

Einzelmolekülanalyse für die „Life Sciences“

zu veranschaulichen, soll hier insbesondere

die Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie

(FCS) näher vorgestellt werden.

Diese Methode, die von der Instrumentierung

her auf der konfokalen Mikroskopie

basiert, wurde in den siebziger Jahren konzipiert

1 , konnte jedoch erst in jüngerer Zeit

die Dimension einer hochempfindlichen Einzelmolekültechnik

mit Relevanz für die Biowissenschaften

gewinnen 2 . Mittlerweile sind

erste FCS-Geräte (z.B. Zeiss ConfoCor) für

einen breiten Einsatzbereich auf dem Markt.

Mit Detektionsvolumina im Femtoliter-Bereich

(10 –15 l) und einer zeitlichen Auflösung

von Prozessen von 100 Nanosekunden bis

10 Sekunden ist die FCS ein ideales Werkzeug

für die dynamische Analyse einzelner

Biomoleküle und ihrer Interaktionen. Die

Methode eignet sich hervorragend für intrazelluläre

Anwendungen, aber auch für miniaturisierte

Hochdurchsatzverfahren mit

Probenlösungen im sub-Mikroliter-Bereich.

Idee der Korrelationsanalyse ist es, spontane

Fluktuationen im Fluoreszenzsignal kleiner

Molekül-Ensembles den ihnen zugrundeliegenden

physikalisch-chemischen Prozessen

zuzuordnen und auf diese Weise die

Dynamik inter- und intramolekularer Wechselwirkungen

ohne Störung des Gleichgewichtes

zu untersuchen. Die universelle

Methode hat in den letzten Jahren eine Fülle

biochemisch und biologisch relevanter Anwendungen

hervorgebracht, von denen einige

hier vorgestellt werden.

Prinzip der Fluoreszenz-

Korrelations-Spektroskopie

Um spontane Fluktuationen eines Zeitsignals

messen zu können, muß das analysierte System

so klein wie möglich gehalten werden.

Erreicht werden kann dies durch Kombination

winziger Meßvolumina mit sehr geringen

Konzentrationen der fluoreszenten Moleküle.

In sogenannten konfokalen Aufbauten

werden kleine Meßvolumina erzeugt,

indem man einen parallelen Laserstrahl

durch die Rückapertur in ein hochauflösendes

Mikroskopobjektiv (NA > 0.9) einstrahlt.

Der so entstehende beugungslimitierte Fokalspot

von rund 0,5 µm Durchmesser wird

dann auf eine Lochblende in der Bildebene

Die neue Technologie des RTS 500 ist ein

wertvolles Werkzeug für alle Bereiche der

Forschung, in denen an der Entdeckung von

Genen sowie an der funktionellen Analyse

von Proteinen gearbeitet wird.

Korrespondenzadresse

Dr. Sonja Vogel-Rohwer

Roche Diagnostics GmbH

Vertrieb Biochemica

Sandhofer Straße 116

D- 68305 Mannheim

Tel.: 0621-759-8568, Fax: 0621-759-4083

eMail: mannheim.biocheminfo@roche.com

Abb. 1: Prinzip der

Fluktuationsanalyse in

konfokalen Volumenelementen.

Fluktuationen

entstehen bei Durchtritt

von Molekülen durch den

Laserfokus oder durch

Blinkphänomene auf

schnelleren Zeitskalen

bzw. während der Dauer

ihres Aufenthalts.

38 | Nr. 4/2000 |transkript LABORWELT


B L I T Z L I C H T

des Objektivs abgebildet, um eine entsprechende Tiefenschärfe in

axialer Richtung zu gewährleisten. Bei einer Detektion durch eine

solche – Pinhole genannte – Lochblende tragen nur Moleküle innerhalb

des nun in drei Dimensionen begrenzten Fokalvolumens zum

Signal bei, deren Zahl zu jedem Zeitpunkt statistischen (Konzentrations-)

Schwankungen unterworfen ist. Fluktuationen entstehen im

einfachsten Fall dadurch, daß in Lösung befindliche fluoreszente

Moleküle in das ausgeleuchtete Meßvolumen hinein- und wieder

herausdiffundieren oder dadurch, daß sich während ihrer Aufenthaltsdauer

reversible Änderungen in der molekularen Struktur oder

Umgebung ereignen, die ihr Fluoreszenzverhalten beeinflussen (Abb.

1).

Für eine zeitliche Analyse der Signalfluktuationen δF(t) im Laserfokus,

die mit einer hochsensitiven Photodiode gemessen werden,

wird von dem fluktuierenden Fluoreszenzsignal mathematisch eine

sogenannte Autokorrelationsfunktion G(t) ermittelt , der die Methode

ihren Namen verdankt:

G(t) kann als eine räumlich gewichtete Fluktuations-Zerfallsfunktion

betrachtet werden. Im Falle frei beweglicher Moleküle beschreibt

die charakteristische Abklingzeit von G(t) einfach die mittlere Aufenthaltsdauer

eines einzelnen Moleküls im Fokalbereich des Objektivs,

die spezifische Form der Abklingkurve ist durch die Art des

Transportprozesses gegeben, dem die Moleküle unterworfen sind.

Aus der mittleren Aufenthaltsdauer lassen sich sehr leicht Mobilitätsparameter

wie z.B. Diffusionskoeffizienten der Moleküle ermitteln.

Aufgrund der statistischen Natur der Konzentrationsschwankungen

ist die Amplitude G(0) der normierten Korrelationsfunktion

zudem umgekehrt proportional zur mittleren Anzahl von Teilchen

im Meßvolumen und erlaubt eine präzise lokale Konzentrationsbestimmung.

Falls Moleküle während ihres Aufenthalts im Meßvolumen

zusätzliche Fluoreszenzfluktuationen aufweisen, lassen deren

charakteristische Stärke und Frequenz wiederum Rückschlüsse auf

die zugrundeliegenden Prozesse zu. Dieses Prinzip kann genutzt

werden, um intramolekulare Dynamiken fluoreszenzmarkierter Moleküle

zu analysieren, wie etwa Konformationsänderungen von

Proteinen. Fluoreszenzfluktuationen können aber auch durch die

molekulare Mikroumgebung induziert werden. So weisen etwa

verschiedene GFP (green fluorescent protein) Mutanten ein pHabhängiges

Blinkverhalten auf, das auf Einzelmolekülebene gemessen

eine präzise lokale pH-Bestimmung erlaubt 3 .

Messung von Assoziations- und

Dissoziationsprozessen

Als eines der attraktivsten Einsatzgebiete der konfokalen Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie

in biochemischen Fragestellungen

erwies sich bislang die Analyse frei in Lösung befindlicher Biomoleküle

hinsichtlich deren Konzentration und Diffusions-koeffizienten.

Da diese beiden Parameter die Form der Meßkurve in entscheidender

Weise bestimmen, können alle Prozesse, die eine Änderung

dieser Parameter nach sich ziehen, in ihrer zeitlichen Entwicklung

mittelbar verfolgt werden (Abb. 2). Prominentes Beispiel ist die

Änderung der Diffusionseigenschaften von Nukleinsäuren oder

Proteinen durch spezifische Bindung an große Reaktionspartner, die

im Extremfall zu einer vollständigen Immobilisierung zunächst frei

beweglicher Partikel führen kann. Dies eröffnet die Möglichkeit

kinetischer Untersuchungen der fluoreszenzmarkierten Reaktionspartner

in Echtzeit in bislang nicht zugänglichen Konzentrationsbereichen

(pM-nM) 4 .

|transkript LABORWELT Nr. 4/2000 | 39


B L I T Z L I C H T

Correlation G (τ)

Correlation G (τ)

FCS in Zellen und auf Membranen

Abb. 3: FCS-Diffusionsanalyse von farbstoffmarkierten

Molekülen in verschiedenen Zellkompartimenten.

Die charakteristische Abklingzeit der

Kurven gibt die mittlere Aufenthaltsdauer im

Fokus wieder. Die lokale molekulare Mobilität

kann mittels FCS über mehrere Größenordnungen

präzise bestimmt werden.

Abb. 2: Analyse von molekularen Wechselwirkungen

mittels FCS. Bei einfarbiger Autokorrelationsanalyse

wird die Wechselwirkung z.B.

durch die Änderung von Diffusionseigenschaften

bei Bindung an ein schwereres Molekül

nachgewiesen. Die Korrelationsfunktion

verschiebt sich zu größeren (Diffusions-)Zeiten.

Bei zweifarbiger Kreuzkorrelation ist der

Nachweis von Assoziation bzw. Dissoziation

nicht von Mobilitätsänderungen abhängig. Die

Amplitude der Korrelationsfunktion ist in

diesem Fall einfach proportional zur

Konzentration zweifarbiger (Komplex-)Moleküle.

Da die Erzeugung eines Laserfokus nichtinvasiv

ist, kann das FCS-Volumenelement

problemlos nicht nur in Lösung, sondern

auch in Zellen oder auf Zelloberflächen

(Membranen) erzeugt werden 5,6 . Dies ermöglicht

eine Analyse kleinster Mengen fluoreszenzmarkierter

oder autofluoreszenter Biomoleküle

in vivo. FCS erlaubt es, unterschiedliche

Transportprozesse (normale oder anomale

Diffusion in 2D oder 3D, aktiver Transport,

Fluß) zu unterscheiden sowie die Wechselwirkung

von Molekülen miteinander zu

untersuchen. Abbildung 3 zeigt Korrelationskurven

der Diffusion einzelner Moleküle

durch den Fokus in Abhängigkeit von der

Position in der Zelle bzw. der fluoreszenzmarkierten

Zellkompartimente. Die Abklingzeiten

der FCS-Kurven entsprechen den mittleren

Aufenthaltsdauern im Fokus und liefern

daher Information über lokale Diffusions-

oder allgemein Mobilitätskoeffizienten.

Diese Parameter können auch für kleinere

Moleküle abhängig von der Viskosität

und Topologie verschiedener Kompartimente

oder Organellen über mehrere Größenordnungen

variieren. Die intrazelluläre FCS-

Analyse erlaubt daher eine präzise Bestimmung

lokaler Viskosität, abhängig vom gewählten

Fluoreszenzfarbstoff und auch anderer

Umgebungsparameter wie pH-Wert,

Ionen- und Sauerstoffkonzentration 7 .

Zweifarbige FCS zur Analyse von

Enzymkinetiken

Durch eine Modifikation des optischen Aufbaus

läßt sich die klassische, einfarbige FCS

in ein Zweifarben-System überführen 8 . Dies

ermöglicht neben der parallelen Detektion

von spektral verschiedenen fluoreszierenden

Spezies auch einen spezifischen Signalvergleich

durch Kreuzkorrelation – und dadurch

eine sehr einfache Bestimmung der

relativen Konzentration zweifarbig fluoreszierender

Moleküle. Damit eignet sich das

Verfahren insbesondere zur Analyse der

molekularen Interaktion bzw. der Integrität

zwei- oder mehrfarbig markierter Moleküle.

Zu den biochemischen Prozessen, die mit

der Methode analysierbar sind, zählen Protein-Protein-Wechselwirkungen

(Bindung

zwischen Rezeptoren und Liganden), Protein-DNA-Interaktionen

(Bindung von Transkriptionsfaktoren

an Promotorsequenzen)

sowie enzymatisch katalysierte Spaltungsund

Verknüpfungsreaktionen. Am Beispiel

der Spaltung von DNA-Molekülen mit Restriktionsendonukleasen

(Abb. 4) konnte

die Sensitivität, die Präzision und die generelle

Einsetzbarkeit der Methode erfolgreich

demonstriert werden 9-10 . Das Meßprinzip

ist analog auf alle enzymatischen

Aktivitäten anwendbar, die eine Veränderung

chemischer Bindungen zwischen fluoreszierenden

Molekülen bewirken, so etwa,

wenn mehrfach markierte Biopolymere in

die Monomere zerlegt oder unterschiedlich

markierte Monomere zum Polymer

verknüpft werden 11 .

Zweiphotonen-Anregung

Für viele Anwendungen – insbesondere in

Zellen – ist es vorteilhaft, wenn nur der

unmittelbar zum Signal beitragende Raumbereich

ausgeleuchtet wird. Aus diesem

Grund ist die im Imaging-Bereich bereits

weitverbreitete Zwei- oder Mehrphotonenanregung

auch für die FCS-Einzelmoleküldetektion

interessant 5 . Hierbei werden durch

gepulste Hochleistungslaser starke temporäre

Photonendichten erzeugt, die es erlauben,

Fluorophore mit zwei „gleichzeitig“ ankommenden

Photonen der halben Energie

(der doppelten Wellenlänge) anzuregen.

Diese Mehrphotonenanregung ist räumlich

hochselektiv, da die Intensität nur im unmittelbaren

Fokalbereich für eine Anregung

ausreicht. Dadurch entfällt der übliche Fluoreszenzlichtkegel,

und die Bestrahlungsschädigung

von Zelle und Farbstoff außerhalb

des Meßvolumens wird erheblich reduziert

(Abb. 5). Zudem erzeugt das Nah-IR-Licht,

das üblicherweise für die Zweiphotonenanregung

eingesetzt wird, weniger Hintergrund

durch Streuphänomene und hat in

vielen Medien größere Eindringtiefen. Ein

weiterer Vorteil, insbesondere für mehrfarbige

Kreuzkorrelations-Anwendungen, sind

die oft stark veränderten Zweiphotonen-Anregungsspektren

der gebräuchlichen Farbstoffe.

Bei geeigneter Auswahl ist es möglich,

mit einer einzelnen Anregungslinie

spektral separierbare Farbstoffe (z.B. grüne

und rote) gleichzeitig anzuregen 12 und das

optische System dadurch entscheidend zu

vereinfachen. Zudem verspricht diese Art

der Anregung einen alternativen Zugang

zur intrinsischen Fluoreszenz von Proteinen,

deren Absorptionsmaxima im Ultravioletten

eine Messung in herkömmlichen

optischen Systemen erschweren.

Konfokale Fluoreszenzspektroskopie

im funktionalen Screening

Neben der präzisen biochemischen Charakterisierung

molekularer Wechselwirkungen

kommt der schnellen Durchmusterung vieler

unterschiedlicher Proben zunehmend Bedeutung

zu. Ein solches funktionales molekulares

Screening wird sowohl bei der Suche

nach neuen Wirkstoffen in großen Substanzbanken

(drug screening) als auch bei der

gerichteten Evolution (directed evolution) zur

Optimierung von Biomolekülen eingesetzt.

Die Anwendung einzelmolekülbasierender

Techniken wie der konfokalen Fluoreszenzspektroskopie

stellt in diesem Gebiet den

mit Abstand effizientesten Ansatz dar. Durch

Integration der zweifarbigen Kreuzkorrelation

9 konnte diesbezüglich nicht nur eine

signifikante Steigerung der Detektionsspezifität,

sondern auch eine drastische Reduktion

der für die Bewertung der Enzymaktivi-

40 | Nr. 4/2000 |transkript LABORWELT


B L I T Z L I C H T

Abb. 4: Prinzip der Kreuzkorrelations- bzw. Koinzidenzanalyse am

Beispiel der endonukleolytischen Spaltung von DNA-Molekülen. Das

Verfahren erlaubt eine einfache und schnelle Quantifizierung der

Enzymaktivität in Echtzeit. Zweifach markiertes DNA-Substrat wird durch

die Wirkung einer Restriktionsendonuklease in zwei einfarbig markierte,

separat voneinander diffundierende Teile gespalten, das Koinzidenzsignal

zwischen zwei Detektorkanälen in zweifarbig ausgeleuchteten FCS-

Modulen geht verloren.

tät einer Probe notwendigen Meßzeiten erreicht werden, so daß ein

Durchsatz von einer Million Proben pro Tag möglich wird. Durch

Einführung eines modifizierten Auswerteverfahrens, der konfokalen

Fluoreszenz-Koinzidenz-Analyse (CFCA) 13 , konnte die Schnelligkeit

und Präzision des Verfahrens maximiert werden. Kommerziell

werden solche und verwandte einzelmolekülbasierende Verfahren

im Bereich der präklinischen Wirkstoffsuche bereits von der

EVOTEC BioSystems AG, Hamburg, und im Bereich der Screeningbasierten

evolutiven Optimierung von Biomolekülen von der DIRE-

VO Biotech AG, Göttingen, eingesetzt 14 .

|transkript LABORWELT Nr. 4/2000 | 41


P L A T T F O R M

Ausblick

Ultrasensitive Hochdurchsatzanalyse

von Proteomen auf Einzelzellniveau

WALTER SCHUBERT, CEO, MELTEC GMBH, MAGDEBURG

1PE

Abb. 5: Prinzip der Zweiphotonenanregung. Bei

großen Photonendichten besteht die Möglichkeit,

Farbstoffmoleküle durch die „gleichzeitige“

(d.h. innerhalb von ca. 10 –15 s) Absorption

zweier Photonen der halben Energie, also doppelter

Wellenlänge, anzuregen. Der zweifache

Absorptionsprozeß führt zu einer quadratischen

Abhängigkeit von der Anregungsintensität des

Laserlichts, die zu einer intrinsischen Volumendiskriminierung

führt. 1PE: Einphotonenanregung,

2PE: Zweiphotonenanregung

Literatur

[1] Magde, D., E.L. Elson, and W.W. Webb. Phys.

Rev. Lett. 29 (1972), 705-708

[2] Eigen, M., and R. Rigler. PNAS 91 (1994),

5740-5747

[3] Haupts, U., S. Maiti, P. Schwille. and W.W.

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[4] Schwille, P., Bieschke J. and Oehlenschläger

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[8] Schwille, P., F.-J. Meyer-Almes, and R. Rigler.

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[9] Kettling, U., A. Koltermann, P. Schwille and

M. Eigen. PNAS 95 (1998), 14116-1420.

[10] Koltermann, A., U. Kettling, J. Bieschke, T. Winkler,

and M. Eigen. PNAS 95 (1998), 1421-1426.

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M. Meth. Enzymol., in press

[12] Heinze, K.G., A. Koltermann, and P. Schwille.

PNAS 97 (2000), 10377-10382

[13] Winkler, T., U. Kettling, A. Koltermann, and

M. Eigen. PNAS 96 (1999), 1375-1378

[14] Kettling, U., Koltermann, A., Eigen, M. in:

Curr. Top. Microbiol. Immunol. 243 (1999)

Korrespondenz

2PE

Dr. Petra Schwille

AG Experimentelle Biophysik

Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie

Am Faßberg 11

D- 37077 Göttingen

Tel.: 0551-201 1165, Fax: 0551-201 1435

eMail: pschwil@gwdg.de

Auf dem Weg zu einer umfassenden Analyse

der Funktion zellulärer Proteome sind in den

vergangenen Jahren große Fortschritte erzielt

worden. Zu nennen sind etwa die eleganten

Verfahren der Proteinstrukturanalyse

und die auf Zellhomogenaten beruhenden

„large scale protein profiling“-Verfahren, die

es ermöglichen, bis zu 10.000 verschiedene

Proteine simultan zu identifizieren und anschließend

einzeln zu analysieren.

Mit Hilfe eines neuen, international patentierten

Hochdurchsatzverfahrens (Whole

Cell Protein Fingerprinting, WCPF), das bei

der MelTec GmbH etabliert wurde, ist es

jetzt auch erstmals möglich, die zelluläre

Organisation von Proteomfraktionen auf der

Abb. 1: Prinzipschema: Vergleich zellulärer

Proteommuster und Proteomprofile

Einzelzellebene in strukturell intaktem Gewebe

zu analysieren (Tab. 1). Technische

Grundlage ist ein molekulares Scanning-Verfahren

(mass molecular scanning). Proteine

werden in definierten subzellulären Volumina

in Form von Photonen-Signalen optisch

erfaßt. Es entsteht für jedes Zellvolumen

ein Proteinfingerprint, der in einem

Datenraum „abgebildet“ wird. Durch Ver-

Tabelle 1: Vorteile des Whole Cell Protein Fingerprinting-Verfahrens

gleichsanalysen zwischen Mustern bei

Krankheiten oder in Zellassays werden

krankheitsspezifische, zellspezifische oder

mit bestimmten Zellfunktionen assoziierte

Muster gefunden und dadurch funktionell

kartiert. Einer der wesentlichen Fortschritte

dieser Technologie besteht darin, daß die

räumliche Kompartimentierung zellulärer

Sub-Proteome erhalten bleibt und daher Zelle

für Zelle im Kontext von Zellverbänden untersucht

werden kann. Die dabei gewonnene

kontextabhängige Proteininformation, die

in Zellhomogenaten naturgemäß verlorengeht,

ist von entscheidender Bedeutung für

die Identifikation spezifischer Proteinnetzwerke,

die Zellfunktionen oder -Dysfunktionen

kodieren; denn Proteinnetzwerke sind

räumlich determinierte funktionelle Einheiten

in jeder einzelnen Zelle (verschiedene

Funktionen = verschiedene zelluläre Proteinnetzwerke

= verschiedene zelluläre Proteommuster).

Das Schema (Abb. 1) verdeutlicht,

daß einzelne normale und abnorme

Zellen durch die relative Anordnung von

Proteinen spezifisch charakterisiert sind.

Werden diese Zellen durch Homogenisierung

zerstört, so ergibt die quantitative Messung

der einzelnen extrahierten Proteine keinen

Unterschied mehr zwischen den beiden

Kategorien. Die Anwendung von WCPF bestätigt

insbesondere in der Analyse invasiver

Zellen (Immunzellen, Tumorzellen), daß

nur ein kleiner Ausschnitt des Gesamtproteoms,

nämlich die gleichzeitige kombinatorische

Kartierung von 20 bis 100 Proteinen

der Zelloberfläche auf Einzelzellniveau weitaus

spezifischere Muster ergibt als die Einzel-Profile

derselben Proteine. Abstrakt betrachtet

steht jeder Zelle ein quasi infiniter

„Datenraum“ für die Generierung verschie-

Hochdurchsatz

Theoretische Empfindlichkeit für ein Proteinmolekül pro Einzelzelle

Empfindlichkeit für Membranproteine

Proteine und Glycostrukturen können gleichzeitig erfaßt werden

Es können Oberflächen- und intrazelluläre Proteine simultan erfaßt werden

Es können Hunderte bzw. theoretisch sogar Tausende verschiedene Proteinspezies

in jeder Einzelzelle lokalisiert werden

Zellen und Gewebe bleiben für die Messung strukturell intakt

Die topologische Information bleibt erhalten

Proteine können mit sehr hoher subzellulärer Auflösung kartiert werden

Hohe Homogenität der Zell- und Gewebepräparation

Gute Kalibrierbarkeit des Meßsystems

Die Wechselwirkung von Proteinen kann direkt subzellulär kartiert werden

(MELK FRET-Ansatz)

42 | Nr. 4/2000 |transkript LABORWELT


K O N G R E S S W E L T

Auf eine große Resonanz stieß auch in diesem

Jahr das zentrale Ereignis für die Proteomforschung

in Europa – der alle zwei

Jahre im toskanischen Siena veranstaltete

Kongreß „From Genome to Proteome“. Mehr

als 400 Wissenschaftler aus aller Welt hatten

sich vom 4. bis 7. September zum vierten Mal

zum Gedankenaustausch und zur Präsentation

neuester Forschungsergebnisse versammelt,

weitere 500 interessierte Forscher konnten

aus Platzgründen nicht am Kongreß teilnehmen.

Für das nunmehr 4. Meeting dieser

Art hatten die Organisatoren Dennis F. Hochstrasser,

Jean-Charles Sanchez (Universität

Genf, Schweiz), L. Bini und V. Pallini (Universität

Siena, Italien) das Motto „Knowledge

Acquisition and Representation“ gewählt.

In mehr als 100 Vorträgen berichteten

international renommierte Wissenschaftler

über Schlüsseltechniken der Proteomanalytik,

wie etwa 2D-Elektrophorese, Bildanalyse,

Massenspektrometrie, Bioinformatik, und

deren Anwendung in Pharmakologie, Toxidener

Muster bzw. Funktionen zur Verfügung.

Jede Zelle generiert über die Zeit jedoch

nur ein limitiertes, wenn auch großes

Repertoire von Mustern, das prinzipiell mittels

WCPF als „Spur“ in dem Datenraum

gelesen werden kann. Dieses „Tracing“ in

multidimensionalen Datenräumen bedeutet,

daß man gegenüber den auf Zellhomogenaten

beruhenden Proteinanalysen hier einen

exponentiellen Informationsgewinn hinsichtlich

der Abbildung biologischer Funktionen

in Proteomen erreicht: Nimmt man 20

Proteine an, die aus einer Million Zellen eines

Gewebes extrahiert wurden und in 250 verschiedenen

Konzentrationsstufen gemessen

werden können (0 bis 250), so enthielte ein

entsprechendes Proteinprofil maximal 250 20

verschiedene Möglichkeiten der Kombination

von Proteinen in verschiedenen Konzentrationen.

Tatsächlich verfügt jede einzelne

Zelle aber über die Möglichkeit, diese Proteine

in jedem definierten subzellulären Volumen

entsprechend zu kombinieren. Nimmt

man an, daß für jede der 1 Million Zellen

2000 subzelluläre Volumina gemessen werden

können, so resultiert für das Beispiel

eine maximal mögliche Zahl von 1 Mio. x

2000 x 250 20 verschiedene Proteinmuster.

WCPF stellt derartige „Leseraster“ zur Verfügung

und ermöglicht dadurch einen entscheidenden

Informationsgewinn für zelluläre

Proteomanalysen im Krankheitsvergleich

(„Walking“ durch große Proteomfraktionen).

Abb. 2: „Entschlüsselungsapparat“ für zelluläre

Proteommuster

den. MelTec hat ein System für die Entschlüsselung

solcher Muster entwickelt (Abb.

2). Es besteht aus den Kategorien: Messen

(WCPF), Filtern (Vergleichen von zellulären

Proteommustern in multidimensionalen Datenräumen),

Vorhersagen (von krankheitsspezifischen

Targets) und Experimentelle Über-

Auf der Grundlage von Reference Maps für

bestimmte Zelltypen können durch Vergleichsanalysen

von Kranken und Gesunden

mittels WCPF krankheitsspezifische zelluläre

Proteommuster relativ rasch, teilweise

innerhalb weniger Tage identifiziert werprüfung

(zelluläre Assays, mit denen Targets

validiert werden).

Mit Hilfe dieses „Entschlüsselungsapparates“

konnten bereits Targets und Drug Leads

identifiziert werden, welche die Invasivität

von Immun- und Tumorzellen bei bestimmten

Erkrankungen (sporadische Formen der

ALS, Sarkome) spezifisch beeinflussen.

WCPF kann in verschiedener Weise mit anderen

proteomanalytischen Verfahren und

HTS-Verfahren im Bereich Drug Discovery

gekoppelt werden. Interessant ist es insbesondere,

identifizierte Drug Leads mit Hilfe

von WCPF-basierten Assays funktionell zu

überprüfen. Andererseits stellt WCPF auch

eine effiziente Plattform für die Validierung

von Targets aus Genomics- und Proteomics-

Ansätzen dar. Die Bedeutung dieser Technologie

dürfte jedoch vor allem in dem Potential

für die Identifikation krankheitsspezifischer

Targets und Drug Leads liegen. Für

die Etablierung der Technologie als vernetzte

Hochdurchsatzanlage (Target Factory)

stehen 37 Mio. DM Seed Investment-Kapital

zur Verfügung.

Korrespondenzadresse

Dr. Walter Schubert – CEO

MelTec GmbH

ZENIT Gebäude

Leipziger Straße 44

D- 30120 Magdeburg

Kongreß

From Genome to Proteome –

Bericht vom 4. Siena-Meeting

kologie, Mikrobiologie, Onkologie, Pflanzenzüchtung

sowie bei der Analyse der molekularen

Grundlagen von Krankheiten und

der Signaltransduktion. Daneben präsentierten

insbesondere Nachwuchswissenschaftler

mit 136 Posterbeiträgen zum Teil

überaus interessante Forschungsergebnisse.

Im Mittelpunkt der ersten beiden Tage standen

vorwiegend methodische Vorträge, die

neue Möglichkeiten zur Trennung komplexer

Proteingemische, zur Proteindetektion

und -quantifizierung sowie zur massenspektrometrischen

Proteinidentifikation und zur

Analyse der posttranslationalen Modifikationen

anhand zahlreicher Anwendungsbeispiele

präsentierten.

Die Trennung komplexer Proteingemische

wird weiterhin von der mehr als 20 Jahre

„alten“ zweidimensionalen (2D-)Elektrophorese

dominiert. In ihrem eindrucksvollen

Vortrag stellte Prof. Angelika Görg von

der Technischen Universität München aktu-

elle Fortschritte der Technik und die besondere

Leistungsfähigkeit der immobilisierten

pH-Gradienten (IPGs) dar, die die klassische

Trägerampholytmethode nahezu vollständig

verdrängt haben.

Denn neben der einfacheren Handhabung

und der verbesserten Reproduzierbarkeit ermöglichen

die IPGs das Auftragen großer

Proteinmengen bis hin zu mehreren Milligramm,

so daß sowohl die Detektion und

die Analytik niedriger exprimierter Proteine

möglich wird. Inzwischen stehen Trennstrecken

von bis zu 25 cm pro pH-Einheit zur

Verfügung, die eine weitere Optimierung

der Probenvorbereitung notwendig machen.

Es wurden eine Reihe verschiedenster optimierter

Protokolle zur Probenvorbereitung

vorgestellt, die auf eine verbesserte Resolubilisierung

der Proteine im allgemeinen und

der Membranproteine im speziellen abzielen.

Es wurde jedoch in vielen Beiträgen

deutlich, daß nur durch die Addition einer

„dritten Dimension“, nämlich der Fraktionierung

des Proteoms in beispielsweise lösliche

und hydrophobe Fraktionen oder eine

Auftrennung in Zellorganellen, eine umfassende

Proteom-Analyse komplexer Proteingemische

möglich wird.

Während dieser Session wurde aber auch

deutlich, daß Alternativmethoden wie die

|transkript LABORWELT Nr. 4/2000 | 43


K O N G R E S S W E L T

Chiptechnologie und chromatographische

Mikromethoden stark aufgeholt haben und

in naher Zukunft einen festen Platz neben

der 2D-Elektrophorese zur Darstellung von

Proteinexpressionsprofilen einnehmen

werden, denn trotz aller Vorteile der 2D-

Technik ist diese eine sehr arbeitsaufwendige

und damit durchsatzlimitierte Technik.

Außerdem ist die Auftrennung extrem

saurer und extrem basischer Proteine

sowie sehr hochmolekularer Proteine problematisch.

Deshalb ist es wichtig, daß auch

Methoden zum Einsatz kommen, deren

Trennprinzip auf anderen Selektivitäten

basiert. Idealerweise werden für eine möglichst

umfassende Proteom-Analyse die

Ergebnisse aller verfügbarer Methoden

integriert.

über hinaus kompatibel mit der massenspektrometrischen

Analytik.

Der kommerziell erhältliche SyproRuby-

Farbstoff beispielsweise erreicht eine Sensitivität,

die an die der Silberfärbung heranreicht,

bei einem dynamischen Bereich von

ca. 10 3 (verglichen mit maximal 10 2 bei der

Silberfärbung). Multiplexing oder „2D-fluorescence

difference gel electrophoresis“ (2D-

DIGE) wird dann möglich, wenn verschiedene

Proteinproben vor der Elektrophorese

mit verschiedenen Fluoreszenz-Farbstoffen

kovalent markiert werden. Zur Verfügung

stehen hierfür die CyDyes (Cy2, Cy3 oder

Cy5) der Firma Pharmacia. Die Farbstoffe

müssen dabei den Ladungszustand der Proteine

erhalten, vergleichbare Molekulargewichtsverschiebungen

bewirken und sich in

Gleiches Genom – Unterschiedliche Proteinexpressionsmuster führen zu verschiedenen

Phänotypen.

Beispielsweise eignet sich der bereits kommerzialisierte

ProteinChip ® der britischen

Firma Ciphergen zur direkten Detektion,

Identifikation und Verifizierung diagnostischer

Protein- oder Peptidmarker aus

Körperflüssigkeiten wie Blut, Urin und Gewebeextrakten.

Zum Einsatz kommen hier

ProteinChip-Arrays und die sogenannte

SELDI-Technologie (surface-enhanced laser

desorption/ionisation). Dabei ist die

Oberflächenaktivität durch kovalente chemische

Modifikationen bedingt und nutzt

Affinitäten zu beispielsweise hydrophoben,

ionenaustauscheraktiven oder metallbindenden

Gruppen für die Isolierung von

Proteingruppen aus komplexen Gemischen.

Diese Arrays eignen sich auch für

weitere Prozessierungen, beispielsweise

enzymatische Spaltungen, bevor sie dann

mit Hilfe der SELDI-Methode analysiert

werden. Innerhalb weniger Tage können

so hunderte von Proben analysiert werden,

so daß sich diese Technologie ideal

für den Einsatz in Screening-Experimenten

eignet.

Fortschritte gibt es auch bei der Proteinquantifizierung.

Neue Fluoreszenzfarbstoffe

mit verbesserter Sensitivität und Linearität

sowie der Möglichkeit zum Multiplexing

sind momentan die Methode der Wahl für

die Proteindetektion, denn sie liefern wirklichkeitsgetreuere

quantitative Daten der

Proteinexpression als bisher und sind darden

Wellenlängen ihrer Absorptionsmaxima

unterscheiden. Nach der Markierung

werden die Proben wieder vereinigt und auf

einem 2D-Gel getrennt. Die Möglichkeit zum

Multiplexing ermöglicht einerseits einen höheren

Durchsatz an 2D-Gelen und beschleunigt

andererseits die Bildauswertung der

2D-Gele.

Die Kopplung chromatographischer Methoden

mit der Elektrospray-Massenspektrometrie

(LC-MS/MS) hat sich zu einem der

leistungsfähigsten Ansätze „gelfreier“ Methoden

zur Analyse von Proteinexpressionsmustern

entwickelt. Diese Kombination eignet

sich vor allem auch zur Analyse von

Proteinkomplexen. Zur Reduktion der Komplexität

des Proteingemisches werden dabei

vor allem Affinitätschromatographien, Ionenaustauschchromatographien

und die reversed

phase-Chromatographie eingesetzt.

Durch den Einsatz stabiler Isotope ist dadurch

nicht nur eine schnelle, automatisierbare

und hochempfindliche Identifizierung

der Komponenten möglich, sondern auch

deren Quantifizierung. Hier sind vor allem

die Arbeiten von Ruedi Aebersold (University

of Washington, Seattle, WA) hervorzuheben,

der stabile Isotope in spezifischen

Biotin-markierten Derivatisierungsreagenzien

(isotope-coded affinity tags, ICATs) einsetzt.

Beim Vergleich zweier Proben werden

die Cystein-Seitenketten der einen Probe mit

der „leichten“ Form der Biotin-markierten

Reagenzien derivatisiert, während die Cysteine

der anderen Probe mit dem “schweren”

Deuterium-haltigen Reagenz derivatisiert

werden. Nach Vereinigung der Proben

und enzymatischer Spaltung werden die

Cystein-haltigen Peptide anhand des Biotin-

Restes mit Hilfe von Affinitätschromatographie

aus dem Gemisch isoliert und direkt

einer LC-MS/MS-Analyse zugeführt. Die

Quantifizierung erfolgt durch den Intensitätsvergleich

von „leichtem“ und „schwerem“

Peptid.

Ein zentrales Kongreßthema war auch die

Automatisierung in der Proteomanalyse,

die durch die Integration der einzelnen

Module mit Hilfe von übergreifenden Softwarepaketen

darauf abzielt, zeitaufwendige

und repetitive manuelle Arbeitsschritte

zu übernehmen. Ziel dabei ist es, einerseits

den Durchsatz und die Qualität der

Analysen zu steigern, andererseits aber

auch eine bessere Bewältigung der anfallenden

Datenmengen zu gewährleisten. Als

weltweit mitführend ist hier die Gruppe

von Hanno Langen von Roche Genetics

aus Basel zu nennen, denn ihr automatisierter

Ansatz erlaubt es, bis zu 3.000 Proteinidentifikationen

täglich durchzuführen.

Darüber hinaus ist zu bemerken, daß

die Instrumentierungs-Unternehmen immer

mehr „Komplettlösungen“ anbieten,

die alle Arbeitsschritte von der 2D-Gelelektrophorese

über die Bilderkennung

sowie das Ausstechen und Prozessieren

der Spots und die massenspektrometrische

Analyse bis hin zum Aufbau einer Datenbank

umfassen und somit auch „Nicht-

Experten-Labors“ automatisierte Arbeitsabläufe

ermöglichen. Hier wird deutlich,

daß die Bioinformatik längst nicht mehr

ausschließlich für die Bilderkennung benötigt

wird, sondern als wesentlicher Bestandteil

der effektiven Durchführung von

Proteom-Analysen, zur Auswertung und

Datenbanksuche sowie zur Verarbeitung

und Präsentation der Daten beiträgt.

Das ausgewogene Verhältnis zwischen methodischen

und anwendungsbezogenen

Vorträgen zeigt deutlich, daß die Proteomanalyse

inzwischen einen festen Platz in der

„Postgenom“-Ära einnimmt und einen wichtigen

Beitrag zum Verständnis komplexer

biologischer Vorgänge in klinischer und biomedizinischer

Forschung liefern kann.

Korrespondenzadresse

Dr. Anton Posch

Dr. Christine Gauss

GPC Biotech AG

Bereich Proteomics

Fraunhoferstraße 20

D-82152 Martinsried

44 | Nr. 4/2000 |transkript LABORWELT


M A R K T Ü B E R S I C H T

1.

Firmenanschrift

a1-Biotech GmbH

Lena-Christ-Str. 44

D-82152 Martinsried

Tel.: 089-895568-0

Fax: 089-895568-29

eMail salesde@a1-biotech.com

www.a1-biotech.com

Produktmanager: Dr. Carsten Schneider

a1-Biotech GmbH

Lena-Christ-Str. 44

D-82152 Martinsried

Tel.: 089-895568-0

Fax: 089-895568-29

eMail salesde@a1-biotech.com

www.a1-biotech.com

Produktmanager: Dr. Carsten Schneider

a1-Biotech GmbH

Lena-Christ-Str. 44

D-82152 Martinsried

Tel.: 089-895568-0

Fax: 089-895568-29

eMail salesde@a1-biotech.com

www.a1-biotech.com

Produktmanager: Dr. Carsten Schneider

2.

Gerätebezeichnung

UVP

Chemi System

UVP

BioChemi System

UVP OptiChemi System

3. Abmessungen des Systems

(Breite x Tiefe x Höhe, cm)

800

x 400 x 900 mm

800

x 400 x 900 mm

800 x 400 x 1150 mm

4.

mögliche

optimiert

Anwendungen,

für bestimmte

Einsatzbereich/

Anwendungen

Fluorescent Gels

Plates • Autorad


Non-Fluorescent

Films • Northern

Gels • Colony

and Southern

Plates

Blots •

• Microtiter

Western Blots


Fluorescent Gels

Plates • Autorad

Micro Arrays

Analysis




Non-Fluorescent Gels • Colony

Films • Northern and Southern

High Density Areas • Microskop

Plates

Blots •

Slides

• Microtiter

Western Blots

Quantitative


Fluorescent Gels

Plates • Autorad

Micro Arrays •

Analysis

• Non-Fluorescent

Films • Northern

High Density Areas

Gels • Colony Plates

and Southern Blots •

• Microskop Slides •

• Microtiter

Western Blots

Quantitative

5.

Kurzbeschreibung

Komponenten

des

Systems

und

der

Hochsensitive Kamerasysteme

Steuerung, NT-Steuerung und

Dunkelkammer mit Filterrad für

Anwendungen.

und

Hochsensitive Kamerasysteme

Steuerung, NT-Steuerung und

Dunkelkammer mit Filterrad für

Anwendungen.

und

Hochsensitive Kamerasysteme

Steuerung, NT-Steuerung und

Dunkelkammer mit Filterrad für

Anwendungen.

PC-

mit integrierter Software und

Analysensoftware, lichtdichte

unterschiedliche Farbstoffe

PC-

mit integrierter Software und

Analysensoftware, lichtdichte

unterschiedliche Farbstoffe

PC-

mit integrierter Software und

Analysensoftware, lichtdichte

unterschiedliche Farbstoffe

und

6.

maximale Gelfläche (cm x cm)

25

x 26 cm

25

x 26 cm

25 x 26 cm

7.

maximale Imaging-Fläche (cm x cm)

25

x 26 cm

25

x 26 cm

25 x 26 cm

8.

Linearer dynamischer Bereich

2,

5

4,

0

5, 0

9.

Detektor

9.1

Typ

CCD-Kamera,

1/2" Interline CCD

CCD-Kamera,

2/3" Digital CCD

CCD-Kamera, 2/3" Digital CCD

9.2

Zoom-Linse (Bereich, mm)

( F1.0) 8-48 mm

( F0.85) 25 mm Fix • (F1.4) 11,5-69 mm Zoom

(F0.85) 25 mm Fix • (F1.4) 11,5–69 mm Zoom

9 .3 Kühlung Kühlsystem und -bereich ( ° C)

2 -stufige Peltierkühlung/ -35°C 2 -stufige Peltierkühlung mit Luftkühlung –40°C 3 -stufige Peliterkühlung mit Luftkühlung –75°C

9.4

Auflösung (Pixel x Pixel)

P ixelgröße ( µ m x µ m)

752

0,45

x

582

Mio.

Pixel


25.000

electrons/pixel

1280 x 1024

1 ,3 Mio. Pixel • 25.000 electrons/pixel • Pixelgröße 6,7 µm

1300 x 1030

1 ,35 Mio. Pixel • 25.000 electrons/pixel • Pixelgröße 6,7 µm

9 .5 Datenoutput (Graustufen/Farben)

256

(65536 Graustufen)

4096

(65536 Graustufen)

16384 (65536 Graustufen)

9.6

Sonstiges: Filegröße

8-Bit

Aquisition • 16-Bit File

12-Bit

Aquisition • 16-Bit File

14-Bit Aquisition • 16-Bit File

10.

Transilluminator/Beleuchtung

10.1

Beleuchtungsverfahren

Auflicht (weiß, 365 nm und 254 nm) • Durchlicht 254/302/365 nm

(60 und 100 % Intensität) • Durchlicht weiß und VisiBlue.

Auflicht

und 100

(weiß, 365 nm und 254 nm) •

% Intensität) • Durchlicht weiß

Durchlicht 254/302/365

und VisiBlue.

nm (60

Auflicht

und 100

(weiß, 365 nm und 254 nm) •

% Intensität) • Durchlicht weiß

Durchlicht 254/302/365

und VisiBlue.

nm (60

10.2

mögliche Anregungswellenlängen/Filter 254/302/365/480

nm – Filter integriert Blau/Grün/Gelb/Orange

254/302/365/480

nm – Filter integriert Blau/Grün/Gelb/Orange

254/302/365/480 nm – Filter integriert Blau/Grün/Gelb/Orange

10.3

Sonstiges

11.

Geräteschnittstellen/für

N etzwerklösungen für NT, Novell etc.

N etzwerklösungen für NT, Novell etc.

Netzwerklösungen für NT, Novell etc.

12.

Software

LABWORKSAnalysensoftware

und GELWORKSAnalysensoftware

LABWORKSAnalysensoftware

und GELWORKSAnalysensoftware

LABWORKSAnalysensoftware

und GELWORKSAnalysensoftware

10.1

kompatibel zu

WINDOWS

98/NT4.0 und WINDOWS 2000

WINDOWS

98/NT4.0 und WINDOWS 2000

WINDOWS 98/NT4.0 und WINDOWS 2000

10.2

Leistungsmerkmale

1-D Lane Analysis, Gel Scoring and Typing, Dot or Slot Blots, Micro

und High Density Arrays, Automatisches Koloniezählen, 2D Spot or

Area Densitometry, Microscopy Segmentation, FISH Analysis.

1-D Lane Analysis, Gel Scoring and typing, Dot or Slot Blots, Micro

und High Density Arrays, Automatisches Koloniezählen, 2D Spot or

Area Densitometry, Microscopy Segmentation, FISH Analysis.

1-D Lane Analysis, Gel Scoring and typing, Dot or Slot Blots, Micro

und High Density Arrays, Automatisches Koloniezählen, 2D Spot or

Area Densitometry, Microscopy Segmentation, FISH Analysis.

/

|transkript LABORWELT Nr. 4/2000 | 45


M A R K T Ü B E R S I C H T

1.

Firmenanschrift

Biometra biomedizinische Analytik GmbH

Rudolf-Wissel-Straße 30

D-37079 Göttingen

Tel.: 0551-50 68 6-0

Fax: 0551-50 68 6-66

eMail: info@biometra.co.uk

Internet: http://www.biometra.de

Ansprechpartner: Dr. Hartmut Groth

3. Abmessungen des Systems

(Breite x Tiefe x Höhe, cm)

Personal Computer inkl. 17‘‘-Monitor, Tastatur und Maus

Dunkelhaube 52 x 48 cm, Höhe 80 cm

4. mögliche Anwendungen, Einsatzbereich/ Aufnahme, Speicherung, Druck und Auswertung von Elektrophorese-Gelen, Blots und Dünnschichtplatten mit Farbstoffmarkierungen im sichtbaren oder fluoreszierenden Lichtbereich

optimiert für bestimmte Anwendungen

5.

Kurzbeschreibung

Komponenten

des

Systems

und

der

6 . maximale Gelfläche (cm x cm)

22 x 28 cm.

7.

maximale Imaging-Fläche (cm x cm)

22 x 28 cm

8. Linearer dynamischer Bereich

9.

Detektor

9.1

Typ

Interline Transfer-CCD-Kamera (1/2‘‘) monochrom Sony XC-75CE, modifiziert zur Langzeitintegratio n

9.2

Zoom-Linse (Bereich, mm)

Zoom-Objektiv 8-48 mm

9 .3 Kühlung Kühlsystem und -bereich ( ° C)

U ngekühlt oder gekühlt bis –10° unter Raumtemperatu r

9.4

Auflösung (Pixel x Pixel)

P ixelgröße ( µ m x µ m)

Auflösung

752(H)

x

582(V)

Pixel,

8,6(H)

x

8,3(V)

um Pixel

9.5

Datenoutput (Graustufen/Farben)

Datenoutput 256 Graustufen, 8-bit, nur monochro m

9.6

Sonstiges

Alternativ kann die Bildaufnahme über angeschlossenen Flachbettscanner erfolgen

10.

Transilluminator/Beleuchtung

10.1

Beleuchtungsverfahren

Transilluminator

312 nm (weitere Wellenlängen auf Anfrage), Filterfläche 22 x 28 cm, für UV-Durchlicht, Konverterplatte zur Nutzung als Weißlichttisch (Durchlicht), Weiß-Auflicht serienmäßig, optiona

UV-Auflich t

mit 254 nm und 365 nm separat schaltbar

10.2

mögliche Anregungswellenlängen/Filter Anregungswellenlängen

Durchlicht 312 nm (Lieferumfang, weitere auf Wunsch), Auflicht 254 nm und 365 nm (Lieferumfang, weitere auf Wunsch), sichtbares Licht im Auflicht und als Durchlicht über UV-Konv erter

10.3

Sonstiges

11.

Geräteschnittstellen/für

Digitalisierungskarte PCI für IBM-kompatiblen PC, Software Microsoft Windows 95/98/NT und kompatible Programm e

12.

Software

10.1

kompatibel zu

Microsoft Windows 95/98/NT und kompatible Programm e

2.

Gerätebezeichnung

BioDocAnalyze Video-Dokumentations- und Gel-Auswertesyste m

C CD-Kamera (monochrom) mit Zoom-Objektiv und DNA-Spezialfilter mit Digitalisierungskarte (8-bit) und Bildaufnahme-

und Auswertesoftware für IBM-kompatible PC (als Hard- und Software-Set erhältlich, Best.-Nr

.

035-000,

Preis DM 7.250) • Komplettsysteme zzgl. Personal-Computer inkl. Monitor, digitalem Thermodrucker Sony UP-D890, Stativ oder Dunkelhaube mit/ohne Transilluminator, optional mit kurz-

und langwellige

m

UV-Auflicht (Komplettsystem inkl. Transilluminator Best.-Nr. 035-300, Preis DM 19.500) • Alle Systemkomponenten sind einzeln erhältlich, Systeme sind individuell zu konfigurieren.

10.2

Leistungsmerkmale

BioDocAnalyze

Bildaufnahme-Softwar e (Lieferumfang): Kamerasteuerung • Veränderung von Integrations-Zeit, Helligkeit, Kontrast und Gamma-Korrektur • Live- und Freeze-Modus • Invertieren und Rotieren von

Vorlagen

• Sättigungsanzeige über Falschfarbendarstellung, oberer und unterer Bereich • Speichern und Laden von Vorlagen in den Formaten BMP, TIF und JPG • Belegen der Funktionstasten mit voreingeste llten

Aufnahmeparametern • Druckfunktion über Thermoprinter oder Drucker nach Wahl • Bedienung über Maus und/oder Tastatur (Short-Cuts)

BioDocAnalyze

Auswerte-Software (Lieferumfang): Direkte Übernahme der Vorlage aus BioDocAnalyze oder Import im BMP-, TIF-

oder JPG-Format, alternativ Ansteuerung von handelsüblichem Flachbettscanner über

T WAIN-Treiber • Automatische Spur- und Bandenerkennung (1D) in frei definierbarem Auswertebereich • Einfachste Optimierung der Erkennungsalgorithmen • Hintergrundkalibrierung manuell und automatisch •

Umfangreiche Editierfunktionen zum Löschen, Hinzufügen, Trennen von Spuren und Banden • Größenbe-stimmung von Proteinen/Nukleinsäuren nach RF-Werten • Mengenbestimmung von Proteinen/Nukleinsäuren

nach

Graustufen-Integralen • Automatische Gelentzerrung • Darstellung der digitalisierten Vorlage, des Densitogramms, der Kalibrierungskurven für Größen-

und Mengenbestimmungen • Zoom-Funktion, Darstellun

g

i nvers oder in Falschfarben • Skript-Modul zum Beschriften der Vorlagen • Normalisierungs-funktion (100%) im Datenblatt • Ausdruck über Thermo-

oder Standard-Drucker • Datenexport im Microsoft-Excel Format •

optionale statistische Bearbeitung

B ioDocAnalyze Statistik-Software (optional )

/

l

46 | Nr. 4/2000 |transkript LABORWELT


M A R K T Ü B E R S I C H T

1.

Firmenanschrift

Amersham Pharmacia Biotech Europe

GmbH

Munzinger Str. 9

D-79111 Freiburg

Ansprechpartner: Bruno Bacher

Tel.: 0761-4903 324

Fax: 0761-4903 405

eMail: cust.servde@eu.apbiotech.com

Amersham Pharmacia

GmbH

Biotech

Europe

Munzinger Str. 9

D-79111 Freiburg

Ansprechpartner: Bruno Bacher

Tel.: 0761-4903 324

Fax: 0761-4903 405

eMail: cust.servde@eu.apbiotech.com

Amersham Pharmacia

GmbH

Biotech

Europe

Munzinger Str. 9

D-79111 Freiburg

Ansprechpartner: Bruno Bacher

Tel.: 0761-4903 324

Fax: 0761-4903 405

eMail: cust.servde@eu.apbiotech.com

Amersham Pharmacia

GmbH

Biotech

Europe

Munzinger Str. 9

D-79111 Freiburg

Ansprechpartner: Bruno Bacher

Tel.: 0761-4903 324

Fax: 0761-4903 405

eMail: cust.servde@eu.apbiotech.com

Amersham Pharmacia

GmbH

Biotech

Europe

Munzinger Str. 9

D-79111 Freiburg

Ansprechpartner: Bruno Bacher

Tel.: 0761-4903 324

Fax: 0761-4903 405

eMail: cust.servde@eu.apbiotech.com

2.

Gerätebezeichnung

TYPHOO

N

STORM 860

Personal

Densitometer SI

ImageMaster

VDS-CL

ImageMaster 2D Elite 3. 1

3. Abmessungen des Systems

(Breite x Tiefe x Höhe, cm)

118

cm x 78 cm x 48 cm

78

cm x 78 cm x 48 cm

44,5 cm x 71 cm x 28 cm

– –

4.

mögliche

optimiert

Anwendungen,

für bestimmte

Einsatzbereich/

Anwendungen

Radioaktivitätsnachweis

(PhosphorImaging)

Hochsensitiver Fluoreszenznachweis

Bis zu 4 Farben

Chemilumineszenz

Probe

Radioaktivitätsnachweis

(PhosphorImaging)

Fluoreszenznachweis

Densitometrie

Coomassiegelen

und

Nachweis

Fluoreszenz

von

Chemilumineszenz

und

Software

zur

Auswertung

von

2D-Gelen

5.

Kurzbeschreibung

Komponenten

des

Systems

und

der

PC-gesteuerter

Laserscanner

PC-gesteuerter Laserscanner

(verschiedene Modellvarianten)

PC-gesteuerter Laserscanner

Transmissionsmessung

zur

6.

maximale Gelfläche (cm x cm)

36

cm x 44 cm

36

cm x 44 cm

20

cm x 25 cm

21cm x 25 cm

7.

maximale Imaging-Fläche (cm x cm)

35

cm x 33 cm

35

cm x 33 cm

20

cm x 25 cm

17,5 cm x 23 cm

8.

Linearer dynamischer Bereich

5 Größenordnungen

5 Größenordnungen

4 OD

3,4 OD im Weißlicht

9.

Detektor

9.1

Typ

2 Photomultiplier-Röhren

Photomultiplier-Röhre

Photomultiplier-Röhre

CCD-Kamera

9.2

Zoom-Linse (Bereich, mm)

Konfokale Sammeloptik, 2 Objektive

Konfokale Sammeloptik

6-fach Motorzoom 12,5 – 75mm


0 mm, +3mm über der Scanfläche

9.3

Kühlung

K ühlsystem und -bereich ( ° C)


– –

- 30°C

9.4

Auflösung (Pixel x Pixel)

P ixelgröße ( µ m x µ m)

Pixelgröße unabhängig von Gelgröße

e instellbar 200µ m 100µ m 50µ m,

entspricht 50, 100, 200 pixel/cm

Pixelgröße unabhängig von Gelgröße

e instellbar: 200µ m 100µ m 50µ m,

entspricht 50, 100, 200 pixel/cm

Pixelgröße unabhängig von

e instellbar 100 µ m 50µ m,

entspricht 100, 200 pixel/cm

Gelgröße

800 x 600 Pixel, Pixelgröße abhängig

G elgröße zwischen 47 – 287µm

von

9 .5 Datenoutput (Graustufen/Farben)

16 bit = 65536 Intensitätsstufen pro Kanal,

bis zu 4 Kanäle

16

bit = 65536 Intensitätsstufen 12

bit = 4096 OD Stufen

12 bit = 4096 Intensitätsstufen

9.6

Sonstiges

Punktförmiger

Detektor

Punktförmiger Detektor


Autofokus,

gesteuert

alle

Kamerafunktionen

10.

Transilluminator/Beleuchtung

10.1

Beleuchtungsverfahren

Laserpunktquelle,

rechtwinklig zur Probe

LED und Laserpunktquelle, rechtwinklig

zur Probe

10.2

mögliche Anregungswellenlängen/Filter 532

nm, 633 nm

450

nm, 635 nm

633

nm

312nm (optional 256nm, 360nm)

10.3

Sonstiges

6 Emissionsfilter bis zu 7 weitere Filter

nachrüstbar

– –

Filterrad

mit

6

Positionen

11.

Geräteschnittstellen/für

10-Base-T Ethernet für Windows NT PC

oder Apple

SCSI

für Windows NT PC oder Apple SCSI

für Windows NT PC oder Apple

10-Base-T Ethernet

12.

Software

ScanControl STORM, ImageQuant

Solutions

ScanControl

Solutions

STORM,

ImageQuant

ScanControl

PDSI, ImageQuant Solutions ImageMaster VDS-CL Software

10.1

kompatibel zu

MS

Windows NT /Apple

MS

Windows NT /Apple

M S Windows NT /Apple

Integriert

MS Windows 95,

MS Windows 95, 98, NT

10.2

Leistungsmerkmale

Steuerung aller Gerätefunktionen

FluorSep zur Kanalseparierung bei

Fluoreszenz

Quantifizierung einfacher Proben

Kompatibel zu ImageMaster 2D Elite

Steuerung

FluorSep

Fluoreszenz

Quantifizierung

Kompatibel zu

aller Gerätefunktionen

zur Kanalseparierung bei

einfacher Proben

ImageMaster 2D Elite

Steuerung aller

Quantifizierung

Kompatibel zu

Gerätefunktionen

einfacher Proben

ImageMaster 2D Elite

Silbervon

Peltiergekühlte, vollautomatische CCD-

Kamera mit Mikrolinsentechnologie

integrierter PC zur Steuerung, integrierter

Videoprinter

PC-

Laserpunktquelle

UV- und Weißlichtröhren, Auf- und

Durchlicht

Steuerung aller Kamerafunktionen

Linsen- und Beleuchtungskorrektur

Methodenspeicher

Kompatibel zu ImageMaster 2D Elite

Beliebig viele Gele • Akzeptiert Tiff-Dateien

und Formate vieler Hersteller • Spoterkennung,

Spotfilter • Matching •

Mittelwertgele • Datentabelle für

Spotpicker • Hyperlink-Annotationen •

Datenbankanbindung • XML-Export...

/

/

,

,

,

,

,

|transkript LABORWELT Nr. 4/2000 | 47


48 | Nr. 4/2000 |transkript LABORWELT

M A R K T Ü B E R S I C H T

Firmenanschrift

.

1 H

Gmb

Laboratories

Bio-Rad

164

Heidemannstr.

München

80939

D-

84-0

089-318

Tel.:

84-123

089-318

Fax:

www.bio-rad.com

Sticher

Udo

Dr.

Ansprechpartner:

84-224

089/318

Tel.:

GmbH

Laboratories

Bio-Rad

164

Heidemannstr.

München

80939

D-

84-0

089-318

Tel.:

84-123

089-318

Fax:

www.bio-rad.com

Sticher

Udo

Dr.

Ansprechpartner:

84-224

089/318

Tel.:

Gerätebezeichnung

.

2 r

Image

Multi

-Fluor-S

E r

Image

Multi

MAX2

Fluor-S

Systems

des

Abmessungen

3.

cm)

Höhe,

x

Tiefe

x

(Breite

cm

109

cm x

54

cm x

8

6 m

c

109

cm x

54

cm x

68

Einsatzbereich/

Anwendungen,

mögliche

4.

Anwendungen

bestimmte

für

optimiert

Petri-

Mikrotiterplatten,

Gele,

(z.B.

im Transmissions-

Fluoreszenzfarbstoffen

von

Detektion

Sensitive


und

im Durch-

Weißlichtdetektion


etc.)

Petrischalen,

Mikrotiterplatten,

(Blots,

Auflichtmodus

oder

schalen)

Petrischalen,

Mikrotiterplatten,

Dünnschichtplatten,


Blots

Gele,

gefärbte

für

Auflichtmodus

Chemilumineszenz

von

Detektion


etc

Autoradiogramme,

im

Fluoreszenzfarbstoffen

von

Detektion

Sensitive


Chemilumineszenz

von

Detektion

zur

Optimiert

Mikrotiterplatten,

(Blots,

Auflichtmodus

oder

Petrischalen)

Mikrotiterplatten,

Gele,

(z.B.

Transmissions-

Blots,

Gele,

gefärbte

für

Auflichtmodus

und

im Durch-

Weißlichtdetektion


etc.)

Petrischalen,

etc.

Autoradiogramme,

Petrischalen,

Mikrotiterplatten,

Dünnschichtplatten,

der

und

Systems

des

Kurzbeschreibung

5.

Komponenten

und

Chemilumineszenzhochauflösenden

Imagingsystem zur

quantitatives

ein

ist

MAX2

Fluor-S

Der

Breitbandeinzigartige

die

Durch

Art.

aller

Vorlagen

gefärbten

von

Aufnahme

zur

sowie

Fluoreszenzdetektion

Fluorophore

der

Selektion

Die

werden.

angeregt

Fluoreszenzfarbstoffe

alle

nahezu

können

UV-Technik

Filterrad

angesteuerten

einem automatisch

in

sich

die

Emissionsfilter,

spezieller

Wahl

die

durch

erfolgt

Wahl

eigener

Filtern

mit

können

Positionen

freie

4

belegt,

Standardfiltern

mit

4

Positionen,

(8

befinden

werden).

bestückt

Chemilumineszenzhochauflösenden

sensitiven,

Imagingsystem zur

quantitatives

ein

ist

MAX2

Fluor-S

Der

einzigartige

die

Durch

Art.

aller

Vorlagen

gefärbten

von

Aufnahme

zur

sowie

Fluoreszenzdetektion

und

der

Selektion

Die

werden.

angeregt

Fluoreszenzfarbstoffe

alle

nahezu

können

UV-Technik

Breitband

angesteuerten

einem automatisch

in

sich

die

Emissionsfilter,

spezieller

Wahl

die

durch

erfolgt

Fluorophore

eigener

Filtern

mit

können

Positionen

freie

4

belegt,

Standardfiltern

mit

4

Positionen,

(8

befinden

Filterrad

werden).

bestückt

Wahl

cm)

(cm x

Gelfläche

maximale

.

6 m

c

60

x

0

4 m

c

60

x

40

cm)

(cm x

Imaging-Fläche

maximale

.

7 m

c

30

x

5

2 m

c

30

x

25

Bereich

dynamischer

Linearer

.

8 n

Größenordnunge

.0

3 n

Größenordnunge

3,4

Detektor

9.

Typ

.1

9 a

CD-Kamer

C e

Megapixeltechnologi

mit

CCD-Kamera

Gekühlte

mm)

(Bereich,

Zoom-Linse

.2

9 v

Objekti

Jedes


Optik

Asphärische


mm Nikonobjektiv

50

Lichtstarkes

mm •

20-40

Tamron-Zoomobjektiv,

werden

System angeschlossen

das

an

zusätzlich

kann

Nikon-f-mount-Adapter

mit

Objektiv

Jedes


Optik

Asphärische


mm Nikonobjektiv

50

Lichtstarkes

mm •

20-80

Tamron-Zoomobjektiv,

werden

System angeschlossen

das

an

zusätzlich

kann

Nikon-f-mount-Adapter

mit

(

-bereich

Kühlsystem und

/

Kühlung

.3

9 ° )

C 0

-1

Peltierkühlung,

/

a

j ° r

Umgebungstemperatu

unter

C 5

-2

Luftkühlung,

Thermoelektrische

/

a

j °C

Pixel)

x

(Pixel

Auflösung

9.4

(

ixelgröße

P µ x

m µ )

m

6,8

x

6,8

Pixelgröße

bei

1037

1340x

ixeldichte

P µm 9

x

9

Pixelgröße

bei

1024

1536x

ixeldichte

P µm

(Graustufen/Farben)

Datenoutput

.5

9 n

Graustufe

bit/4096

2

1 n

Graustufe

bit/4096

12

Sonstiges

.6

9 t

Ho


Pixel-Korrektur

Dead


Current-Subtraktion

Dark


möglich

ist

Sensitivität

der

Erhöhung

zur

Binning

min

120

bis

sec

0,1

von

Aufnahmezeiten


Pixel-Korrektur

Dead


Current-Subtraktion

Dark


möglich

ist

Sensitivität

der

Erhöhung

zur

Binning

CCD •

sensitive

Blue

min.

bis120

0,1sec

von

Aufnahmezeiten


Pixel-Korrektur

Hot


Pixel-Korrektur

Transilluminator/Beleuchtung

10.

Beleuchtungsverfahren

0.1

1 t

Epi-Weißlich


Epi-UV


Weißlichttransilluminator

scannender


UV-Transilluminator

cannender

s t

Epi-Weißlich


Epi-UV


Weißlichttransilluminator

scannender


UV-Transilluminator

scannender

Anregungswellenlängen/Filter

mögliche

0.2

1 0

(34

Kit

Scanning

UV

Long

Optional:


nm)

750


(400

Weißlicht


nm)

365


(290

UV-Anregung

Breitband

nach

können

Filter

Zusätzliche


clear

610LP,

530DF60,

520LP,

Standard-Emissionsfilter:


nm)

390


werden

angefertigt

Kundenwunsch

(340

Kit

Scanning

UV

Long

Optional:


nm)

750


(400

Weißlicht


nm)

365


(290

UV-Anregung

Breitband

nach

können

Filter

Zusätzliche


clear

610LP,

530DF60,

520LP,

Standard-Emissionsfilter:


nm)

390


werden

angefertigt

Kundenwunsch

Sonstiges

0.3

1 m

i


wodurch

Weißlichtlampen,

oder

UVscannenden

mit

im Durchlichtmodus

System arbeitet

Das

wird

erzielt

Probe

der

Ausleuchtung

homogene

absolut

eine


Transilluminatoren

normalen

zu

Vergleich

im


wodurch

Weißlichtlampen,

oder

UVscannenden

mit

im Durchlichtmodus

System arbeitet

Das

wird.

erzielt

Probe

der

Ausleuchtung

homogene

absolut

eine


Transilluminatoren

normalen

zu

Vergleich

Geräteschnittstellen/für

1.

1 I

CS

S I

SCS

Software

2.

1 e

Databas

Diversity

TDS


optional)

(2-D Software,

PDQuest

TDS


(inklusive)

Software

One

Quantity

TDS

oben

jeder

aus

direkt

können

Imaging-Systeme

Bio-Rad

Alle


optional)

(RFLP-/Fingerprint-Software,

notwendig!)

Tiff-Import

(kein

werden

angesteuert

Software

angeführten

Database

Diversity

TDS


optional)

(2-D Software,

PDQuest

TDS


(inklusive)

Software

One

Quantity

TDS

oben

jeder

aus

direkt

können

Imaging-Systeme

Bio-Rad

Alle


optional

(RFLP-/Fingerprint-Software,

notwendig!)

Tiff-Import

(kein

werden

angesteuert

Software

angeführten

zu

kompatibel

0.1

1 •

Macintosh-Ausführung

oder

95/98/2000/NT)

(Win

PCin

Software

One

Quantity

TDS

User)

400

bis

(2

erhältlich

PC

für

Netzwerk-Serverlizenzen

Netzwerk-


Macintosh-Ausführung

oder

95/98/2000/NT)

(Win

PCin

Software

One

Quantity

TDS

User)

400

bis

(2

erhältlich

PC

für

Serverlizenzen

Leistungsmerkmale

0.2

1 d

un

Laneautom.

(Volumenanalyse,

Analyseoptionen

umfangreichen

mit

Auswertesoftware

und

Aufnahme-

Guides"

"Quick

VNTR-Analyse);

Display,

Differential

RFLP-Analysen,

einfache

Counting;

Colony

Bandfinding,

Rotation,

freie

Invertierung,

(Zoom,

Bildbearbeitung

zur

Möglichkeiten

viele

Bedienung,

einfachen

zur

drei

zu

bis

von

Übereinanderlegen

Falschfarbendarstellung,

Ausschneiden,

Beschriftung,

Filteroptionen,

Aufnahme,

der

während

Bereiche

gesättigte

Anzeige

Stacking-Modus,

Farben),

unterschiedlichen

in

Bildern

Acquire"-Modus

"Live

und

Laneautom.

(Volumenanalyse,

Analyseoptionen

umfangreichen

mit

Auswertesoftware

und

Aufnahme-

Guides"

"Quick

VNTR-Analyse);

Display,

Differential

RFLP-Analysen,

einfache

Counting;

Colony

Bandfinding,

Rotation,

freie

Invertierung,

(Zoom,

Bildbearbeitung

zur

Möglichkeiten

viele

Bedienung,

einfachen

zur

drei

zu

bis

von

Übereinanderlegen

Falschfarbendarstellung,

Ausschneiden,

Beschriftung,

Filteroptionen,

Acquire"-Modus.

"Live

Stacking-Modus,

Farben),

unterschiedlichen

in

Bildern


M A R K T Ü B E R S I C H T

1.

Firmenanschrift

biostep GmbH

Herr Dipl.-Ing.

Meinersdorfer

D-09387 Jahnsdorf

Tel.:

Fax:

Mixtacki

Str. 47A

(49)-3721-22574

(49) 3721-38572

biostep GmbH

Herr Dipl.-Ing.

Meinersdorfer

D-09387 Jahnsdorf

Tel.:

Fax:

Mixtacki

Str. 47A

(49)-3721-22574

(49) 3721-38572

biostep GmbH

Herr Dipl.-Ing.

Meinersdorfer

D-09387 Jahnsdorf

Tel.:

Fax:

Mixtacki

Str. 47A

(49)-3721-22574

(49) 3721-38572

biostep GmbH

Herr Dipl.-Ing.

Meinersdorfer

D-09387 Jahnsdorf

Tel.:

Fax:

Mixtacki

Str. 47A

(49)-3721-22574

(49) 3721-38572

2.

Gerätebezeichnung

GelSystem

Compac t

GelSystem

GeneLink

GelSystem

8Entry TotalLab

GelSystem GeneGenius

3.

Abmessungen des Systems (Br x Ti x H, cm) 60

x 32 x 75

68

x 35 x 75

98

x 53 x 75 (inklusive PC)

90 x 45 x 92 (inklusive PC)

4.

mögliche Anwendungen

DNA/RNA,

Protein

DNA/RNA,

Protein

DNA/RNA,

Fluoreszenz, Protein

DNA/RNA, Fluoreszenz, Protein

5.

Kurzbeschreibung

Komponenten

des

Systems

und

der

K omponenten: Kamera, Zoom-Objektiv, Filter,

Dunkelhaube mit integrierter Kontrolleinheit (inkl.

numerischem Display, Tastatur (4 Tasten) und

Diskettenlaufwerk, Transilluminator 20x20cm,

12"s/w-Monitor, Video-Printer (Mitsubishi P91),

Auswertesoftware UVIdoc zur optionalen

A bspeicherung auf PC • Beschreibung:

kompaktes

(3Kabel) analoges System, Steuerbox in der

Dunkelhaube integriert, Überbelichtungskontrolle

während der Aufnahme, Ausdruck beschrifteter Gele,

Auswertung am PC möglich, aufrüstbar

6.

maximale Gelfläche (cm x cm)

20

x 20

20

x 20

22

x 28

20 x 30

7.

maximale Imaging-Fläche (cm x cm)

22

x 28

22

x 28

24

x 30

24 x 31

8.

Linearer dynamischer Bereich

2,5

OD

2,9

OD

2,7

OD

2,9 OD

9.

Detektor

9.1

Typ

CCD-Kamera

b/U-CCD 8S

CCD-Kamera

b/U-CCD 8K

CCD-Kamera

b/U-CCD 8E

CCD-Kamera b/U-CCD 8K

9.2

Zoom-Linse (Bereich, mm)

manuelles

Zoomobjektiv 8-48 mm, F1:1. 2

manuelles

Zoomobjektiv 8-48 mm, F1:1. 0 manuelles

Zoomobjektiv 8-48 mm, F1:1. 0

motorisiertes Zoomobjektiv 8-48 mm, F1:1. 2

9 .3 Kühlung Kühlsystem und -bereich ( ° C)

nein

nein

O ptional, Peltier, max. –10°C O ptional, Peltier, max. –10°C

9.4

Auflösung (Pixel x Pixel)

P ixelgröße ( µ m x µ m)

Pixel

752 x 582

Pixel

786 x 582

Pixel

752 x 582

Pixel 786 x 582

9 .5 Datenoutput (Graustufen/Farben)

G raustufen, 8 Bit (256)

G raustufen, 8 Bit (256)

Graustufen,

8 Bit (256)

Graustufen, 8 Bit (256

9.6

Sonstiges

optional

andere Filter und andere Objektive

optional

andere Filter und andere Objektive

optional

andere Filter, Filterrad und andere Objektive

optional andere Filter, Filterrad und andere Objektive

10.

Transilluminator/Beleuchtung

breite Auswahl an unterschiedlichen

Transilluminatoren

breite Auswahl an

Transilluminatoren

unterschiedlichen

10.1

Beleuchtungsverfahren

UV-Durchlicht,

Weißauflicht, Weißdurchlicht

U V-Durchlicht, Weißauflicht, Weißdurchlicht

UV-Durchlicht, UV-Auflicht, Weißauflicht,

Weißdurchlicht

10.2

mögliche Anregungswellenlängen/Filter Anregungswellenlängen 312 nm (254 nm, 366

nm)/Filter: DNA (EtBr)

10.3

Sonstiges

optional ist eine UV-Transverterplatte (wandelt UV-

Licht in Weißlicht) lieferbar

11.

Geräteschnittstellen/für

1V-Videosignal für z.B. Grabberkarten, weitere

Monitore, u.a. • Diskettenlaufwerk für PC, MAC

Anregungswellenlängen

Filter: DNA (EtBr)

optional

Licht in

ist eine

Weißlicht)

1V-Videosignal

Monitore, u.a.

Images in den


312

nm (254

UV-Transverterplatte

lieferbar

nm,

366

(wandelt

für z.B. Grabberkarten, weitere

Schnittstelle zum Download des

PC

nm)

Anregungswellenlängen 312 nm (254 nm,

Filter: DNA (EtBr), SP (z.B. SYBR Green),

SYPRO Orange), LP (z.B. SYPRO Red)

optional

Licht in

ist eine

Weißlicht)

Schnittstellen:

Netzwerk

UV-Transverterplatte

lieferbar

Scanner,

366

MP

(wandelt

Druckeransteuerung,

nm)

(z.B.


optional andere Filter,

UV-Auflicht (254nm,

Weißdurchlicht

UV-Durchlicht,

Weißdurchlicht

Filterrad

366nm)

UV-Auflicht,


und andere

Weißauflicht

Weißauflicht,

Anregungswellenlängen 312 nm (254 nm,

Filter: DNA (EtBr), SP (z.B. SYBR Green),

SYPRO Orange), LP (z.B. SYPRO Red)

Inklusive

Licht in

Schnittstellen:

Netzwerk

einer UV-Transverterplatte

Weißlicht) lieferbar

Scanner,

Objektive

und

366

MP

(wandelt

Druckeransteuerung,

12.

Software

U VIdoc (Windows-Software)

G eneSnap (Download), GeneTools (Auswertung)

P horetix Grabber (Steuerung), TotalLab (Auswertung)

GeneSnap (Steuerung), GeneTools (Auswertung)

10.2

Leistungsmerkmale

Bildoptimierung, Drehen, Spiegeln • Beschriften,

Ausdrucken • einfachste Auswertung

(Volumenvergleiche der Banden, MW-Kalibrierung

(1 Methode) • Abspeichern


UV-

10.1

kompatibel zu

erzeugte

TIF-Bilder sind PC-

und MAC-kompatibel.

Windows

95, 98, NT4.0, 2000

Windows

95, 98, NT4.0, 2000

Windows 95, 98, NT4.0, 2000

Bildoptimierung, Drehen, Spiegeln, Ausschneiden

Beschriften, Ausdrucken, Export • schnelle Aus-

wertung (Lanedefinition, BKG-Funktionen, Volumenvergleiche

der Banden, MW-Kalibrierung,

Quantifizierung) • GLP-Protokolle

Reproduzierbare Aufnahme mit automatischen Level-

Finder (optimale Ermittlung der Integrationszeit) •

Bildoptimierung, Drehen, Spiegeln, Ausschneiden •

Beschriften, Ausdrucken, Export • Import von Roh-

daten anderer Hersteller • automatisierte Auswertung

(Lanedefinition, BKG-Funktionen, Volumenvergleiche

der Banden, MW-Kalibrierung, Quantifizierung,

Normalisieren, Matchen) • Auswertung für 1D, Array,

ColonyCounter) • Einfacher Export der Tabellen und

Auswertungen in andere Windowsanwendungen •

GLP-Protokolle • Aufrüstbar auf Phoretix 1D Quantifier,

Advanced, RFLP-Datenbank, 2D, Proteindatenbank,

High-Density-Grid

nm)

(z.B.

K omponenten: Kamera, Zoom-Objektiv, Filter,

Dunkelhaube, externe Steuerbox mit Tastatur und

PC-Schnittstelle, Transilluminator 20x20cm, 12"s/w-

Monitor, Video-Printer (Mitsubishi P91),

Aufnahmesoftware GeneSnap zur optionalen

Abspeicherung auf PC

B eschreibung: modulares, analoges System,

schnelle Bedienung,Download der Images über

Kabel in den PC, Auswertung am PC möglich,

aufrüstbar

K omponenten: Kamera, Zoom-Objektiv, Filter,

Dunkelhaube, Transilluminator 20x20cm, Phoretix-

Grabbersoftware, PC-System mit 17"-Monitor, smart-

Spezialtastatur, Digital-Photo-Drucker oder

Tintenstrahldrucker, Auswertesoftware TotalLab

B eschreibung: Digitale Standard-Gel-Dokumentation;

Steuerung mittels PC; Aufnahme, Ausdruck,

Auswertung am PC; komfortable Bedienung;

aufrüstbar

K omponenten: Kamera, Motor-Zoom-Objektiv, Filter,

Dunkelhaube, Transilluminator 20x20cm,

Steuersoftware GeneSnap, PC-System mit 17"-

Monitor, smart-Spezialtastatur, Sublimations-Drucker,

Auswertesoftware GeneTools

Beschreibung:

automatisiert, digitale High-End-Gel-

Dokumentation; vollständige Steuerung mittels PC;

Aufnahme, Ausdruck, Auswertung am PC; sehr

komfortable Bedienung; aufrüstbar

breite Auswahl an unterschiedlichen Transillumi-

natoren (Einfach-,Duo-, Trio-WL, Regelbar, Weißlicht,

Präparativ • UV-Auflicht (254nm, 366nm) • Weißauflicht

und Weißdurchlicht

UV-

UV-

Reproduzierbare Aufnahme mit automatischen Level-

Finder (optimale Ermittlung der Integrationszeit) •

Steuerung aller Funktionen des Kamerasystems und

der Dunkelhaube vom PC (GeneSnap • Bildoptimierung,

Drehen, Spiegeln, Ausschneiden •

Beschriften, Ausdrucken, Export • schnelle

Auswertung (Lanedefinition, BKG-Funktionen,

Volumenvergleiche der Banden, MW-Kalibrierung,

Quantifizierung, Normalisieren) • Auswertung für 1D,

ColonyCounter • Einfacher Export der Tabellen und

Auswertungen in andere Windowsanwendungen •

GLP-Protokolle



/

/

|transkript LABORWELT Nr. 4/2000 | 49


M A R K T Ü B E R S I C H T

Schnittstellen:

Netzwerk

Schnittstellen:

Netzwerk

Schnittstellen:

Netzwerk

Schnittstellen:

Netzwerk

1.

Firmenanschrift

biostep GmbH

biostep GmbH

biostep GmbH

biostep GmbH

Herr Dipl.-Ing. Mixtacki

Herr Dipl.-Ing. Mixtacki

Herr Dipl.-Ing. Mixtacki

Herr Dipl.-Ing. Mixtacki

Meinersdorfer Str. 47A

Meinersdorfer Str. 47A

Meinersdorfer Str. 47A

Meinersdorfer Str. 47A

D-09387 Jahnsdorf

D-09387 Jahnsdorf

D-09387 Jahnsdorf

D-09387 Jahnsdorf

Tel.: (49)-3721-22574

Tel.: (49)-3721-22574

Tel.: (49)-3721-22574

Tel.: (49)-3721-22574

Fax: (49) 3721-38572

Fax: (49) 3721-38572

Fax: (49) 3721-38572

Fax: (49) 3721-38572

2.

Gerätebezeichnung

G elSystem MultiGeniu s

G elSystem ChemiGenius ChemiGenius PLUS*

PowerScan

14U4 PowerScan 12U3*

GelSystem Color

3 . Abmessungen des Systems (Br x Ti x H, cm) 90

x 45 x 92 (inklusive PC)

90

x 45 x 92 (inklusive PC)

76

x 56 x 43 (inklusive PC)

98 x 53 x 75 (inklusive PC)

DNA/RNA,

Fluoreszenz, Chemilumineszenz, Protein D NA/RNA, Fluoreszenz, Chemilumineszenz, Protein

Proteine, Blots, 2D Gels, Autoradiographien,

TLC, DNA/RNA, Fluoreszenz, Protein

4. mögliche Anwendungen

CoomassieBlue-, SilverStain-Gele

Komponenten:

A4/A3*-Scanner mit

5. Kurzbeschreibung des Systems und der Komponenten:

gekühlte Kamera, Motor-Zoom-

Komponenten:

gekühlte 16bit-Kamera, Motor-Zoom-

K omponenten: Farbkamera, Zoom-Objektiv, Filter,

Durchlichteinheit, Steuersoftware PowerScan (inkl.

Komponenten

Objektiv, Filter, Dunkelhaube, Transilluminator Objektiv, Filter, Dunkelhaube, Transilluminator

Dunkelhaube, Transilluminator 20x20cm,

Graustufenkeil zur Intensitätskalibrierung), PC-

20x20cm, Steuersoftware GeneSnap, PC-System mit 20x20cm, Steuersoftware GeneSnap, PC-System mit

Steuersoftware GeneSnap, PC-System mit 17"-

System mit 17"-Monitor, Auswertesoftware

17"Monitor, smart-Spezialtastatur, Sublimations-

17"-Monitor, smart-Spezialtastatur, Sublimations-

Monitor, smart-Spezialtastatur, Farb-Sublimations-

TotalLab

Drucker, Auswertesoftware GeneTools •

Drucker, Auswertesoftware GeneTools

Drucker, Auswertesoftware GeneTools

Beschreibung:

optimiertes System für nasse

Beschreibung:

automatisiert, digitale High-End-Gel-

Beschreibung:

automatisiertes, digitales High-End-

B eschreibung: Digitale Farb-Gel-Dokumentation;

und/oder gefärbte Gele (Besonderheit separierbare

Dokumentation; vollständige Steuerung mittels PC; Gel-Dokumentations- und Chemilumineszenz-System;

Steuerung mittels PC; Aufnahme, Ausdruck,

Farbkanäle); vollständige Steuerung mittels PC;

Aufnahme, Ausdruck, Auswertung am PC; sehr vollständige Steuerung mittels PC; Aufnahme,

Auswertung am PC; komfortable Bedienung;

Aufnahme, Ausdruck, Auswertung am PC;

komfortable Bedienung; aufrüstbar

Ausdruck, Auswertung am PC; sehr komfortable

aufrüstbar

komfortable Bedienung; aufrüstbar

Bedienung; aufrüstbar

6.

maximale Gelfläche (cm x cm)

20

x 30

20

x 30

Durchlicht

21,5 x 25,4cm / 28,5 x 40,5 cm*

22x 28

7.

maximale Imaging-Fläche (cm x cm)

24

x 31

24

x 31

21,5

x 29,7cm / 29,0 x 43,2 cm*

24 x 30

8.

Linearer dynamischer Bereich

2,9

OD

3,0

OD

3,3

OD

2,7 OD

9. Detektor

9.1

Typ

C CD-Kamera b/U-CCD 8K

CCD-Kamera

b/U-CCD 16K 16K*

CCD-Zeile

mit 8000 Elementen

CCD-Kamera f/U-CCD 8C

9.2

Zoom-Linse (Bereich, mm)

m otorisiertes Zoomobjektiv 8-48 mm, F1:1. 2 motorisiertes

Zoomobjektiv 8-48 mm / 12,5-75mm*

- manuelles Zoomobjektiv 8-48 mm, F1:1. 0

9 .3 Kühlung Kühlsystem und -bereich ( ° C)

j a, Peltier, max. –10°C j a, Peltier, max. –40°C nein

nein

9.4 Auflösung (Pixel x Pixel)

P ixel 786 x 582

P ixel 694 x 494 1300 x 1030*

Pixel

1200 x 2400 700 x 1400*

Pixel 1600 x 1200

P ixelgröße ( µ m x µ m)

9 .5 Datenoutput (Graustufen/Farben)

G raustufen, 8 Bit (256)

G raustufen, 16 Bit (65536)

Graustufen 14 Bit (16384) 12 Bit (4096)*,

Graustufen 8 Bit (256)

Farbe 42 Bit (4,39E12) 36 Bit (6,87E10)* Farbe 24 Bit (16,7E6)

9.6

Sonstiges

optional

andere Filter, Filterrad und andere Objektive

optional

andere Filter, Filterrad und andere Objektive

Inklusive eines Graustufenkeils zur

optional andere Filter, Filterrad und andere Objektive

Intensitätskalibrierung

10.

Transilluminator/Beleuchtung

breite Auswahl an unterschiedlichen

breite Auswahl an unterschiedlichen

Separierbare Farbkanäle im Graustufenmodus für breite Auswahl an unterschiedlichen

Transilluminatoren • UV-Auflicht (254nm, 366nm) • Transilluminatoren • UV-Auflicht (254nm, 366nm) • Durchlicht und Reflexion

Transilluminatoren (Einfach-,Duo-, Trio-WL, Regelbar,

Weißauflicht und Weißdurchlicht

Weißauflicht und Weißdurchlicht

Weißlicht, Präparativ • - UV-Auflicht (254nm, 366nm)

• Weißauflicht und Weißdurchlicht

10.1

Beleuchtungsverfahren

UV-Durchlicht, UV-Auflicht, Weißauflicht,

UV-Durchlicht, UV-Auflicht, Weißauflicht,

Separierbare Farbkanäle im Graustufenmodus für UV-Durchlicht, UV-Auflicht, Weißauflicht,

Weißdurchlicht

Weißdurchlicht

Durchlicht und Refelxion

Weißdurchlicht

10.2

mögliche Anregungswellenlängen/Filter Anregungswellenlängen 312 nm (254 nm, 366 nm) • Anregungswellenlängen 312 nm (254 nm, 366 nm) • Anregungswellenlängen 415 – 765 nm • Filter Anregungswellenlängen 312 nm (254 nm, 366 nm) •

Filter: DNA (EtBr), SP (z.B. SYBR Green), MP (z.B. Filter DNA (EtBr), SP (z.B. SYBR Green), MP (z.B. Rotfilter, Blaufilter, Grünfilter

Filter DNA (EtBr), SP (z.B. SYBR Green), MP (z.B.

SYPRO Orange), LP (z.B. SYPRO Red)

SYPRO Orange), LP (z.B. SYPRO Red)

SYPRO Orange), LP (z.B. SYPRO Red)

10.3

Sonstiges

Inklusive einer UV-Transverterplatte (wandelt UV-

Inklusive einer UV-Transverterplatte (wandelt UV- geeignet

auch für nasse Gele

optional ist eine UV-Transverterplatte (wandelt UV-

Licht in Weißlicht) lieferbar

Licht in Weißlicht) lieferbar

Licht in Weißlicht) lieferbar

11.

Geräteschnittstellen/für

Scanner, Druckeransteuerung,

Scanner, Druckeransteuerung,

Twain, Druckeransteuerung,

Scanner, Druckeransteuerung,

12.

Software

G eneSnap (Steuerung), GeneTools (Auswertung)

G eneSnap (Steuerung), GeneTools (Auswertung)

PowerScan (Steuerung), TotalLab, Phoretix 1D,

GeneSnap (Steuerung), GeneTools (Auswertung)

Phoretix 2D (Auswertung)

10.1

kompatibel zu

Windows

95, 98, NT4.0, 2000

Windows

95, 98, NT4.0, 2000

Windows

95, 98, NT4.0, 2000

Windows 95, 98, NT4.0, 2000

10.2

Leistungsmerkmale

Reproduzierbare Aufnahme mit automatischem Level-

Reproduzierbare Aufnahme mit automatischem Level-

Reproduzierbare Aufnahme durch Intensitäts-

Reproduzierbare Aufnahme mit automatischem Level-

Finder (optimale Ermittlung der Integrationszeit) • Finder (optimale Ermittlung der Integrationszeit) • kalibrierung • Bildoptimierung, Drehen, Spiegeln, Finder (optimale Ermittlung der Integrationszeit) •

Steuerung aller Funktionen des Kamerasystems und Steuerung aller Funktionen des Kamerasystems und Ausschneiden • Beschriften, Ausdrucken, Export • Steuerung aller Funktionen des Kamerasystems und

der Dunkelhaube vom PC (GeneSnap) • Bildopti- der Dunkelhaube vom PC (GeneSnap) • Bildopti- Import von Rohdaten anderer Hersteller automa- der Dunkelhaube vom PC (GeneSnap) • Bildoptimierung,

Drehen, Spiegeln, Ausschneiden • Be- mierung, Drehen, Spiegeln, Ausschneiden • tisierte Auswertung (Lanedefinition, BKG- mierung, Drehen, Spiegeln, Ausschneiden •

schriften, Ausdrucken, Export • schnelle Auswertung Beschriften, Ausdrucken, Export • schnelle

Funktionen, Volumenvergleiche der Banden, MW- Beschriften, Ausdrucken, Export • schnelle

(Lanedefinition, BKG-Funktionen, Volumenvergleiche Auswertung (Lanedefinition, BKG-Funktionen, Kalibrierung, Quantifizierung, Normalisieren, Auswertung (Lanedefinition, BKG-Funktionen,

der Banden, MW-Kalibrierung, Quantifizierung, Volumenvergleiche der Banden, MW-Kalibrierung, Matchen) • Auswertung für 1D, Array,

Volumenvergleiche der Banden, MW-Kalibrierung,

Normalisieren) • Auswertung für 1D, ColonyCounter • Quantifizierung, Normalisieren) • Auswertung für 1D, ColonyCounter • Einfacher Export der Tabellen und Quantifizierung, Normalisieren) • Auswertung für 1D,

Einfacher Export der Tabellen und Auswertungen in ColonyCounter • Einfacher Export der Tabellen und Auswertungen in andere Windowsanwendungen • ColonyCounter • Einfacher Export der Tabellen und

andere Windowsanwendungen • GLP-Protokolle Auswertungen in andere Windowsanwendungen • GLP-Protokolle • Aufrüstbar auf Phoretix 1D Auswertungen in andere Windowsanwendungen •

GLP-Protokolle

Quantifier, Advanced, RFLP-Datenbank, 2D, GLP-Protokolle

Proteindatenbank, High-Density-Grid

/

:

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/

/

/

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/

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:

:

:

50 | Nr. 4/2000 |transkript LABORWELT


M A R K T Ü B E R S I C H T

1.

Firmenanschrift

BIOTEC-FISCHER GmbH

BIOTEC-FISCHER GmbH

Herolab GmbH

Daimlerstraße 6

Daimlerstraße 6

Ludwig-Wagner-Str.12

D- 35447 Reiskirchen

D- 35447 Reiskirchen

D- 69168 Wiesloch

Ansprechpartner: Herr Markus Fischer

Ansprechpartner: Herr Markus Fischer

Tel: 06222-5802-0

Tel.: 06408-6072

Tel.: 06408-6072

Fax: 06222-5802-34

Tel.: 06408-64265

Tel.: 06408-64265

Ansprechpartner: Herr Knorr, Herr Wenzel

2.

Gerätebezeichnung

Baby-do

c

PHERO-doc

E.A.S.Y Win32 HiRes System mit PC

3 . Abmessungen des Systems (Br x Ti x H, cm) 45

x 60 x 80 cm (ca. Angaben! )

Gehäuse

60 x 50 x 90 cm (ca. Angaben! ) 150 cm x 80 cm x 70 cm

DNA-Geldokumentation,

Protein-Geldokumentation DNA-Geldokumentation,

Protein-Geldokumentation

Komplettsystem zur Video-Dokumentation, Chemolumineszenz, Densitometrie und Analyse von Durchlicht-

Vorlagen wie Acrylamid-

und Agarose-Gelen, Autoradiogrammen, Mikrotiterplatten, DotBlots. Für Auflicht-

4. mögliche Anwendungen

Vorlagen läßt sich das System mit optional erhältlichen Einsätzen für die UV-Epi-Illumination erweitern. •

Optimiert für DNA RNA-Gele.

An der Dunkelhaube RH-5.1 ist die Herolab E.A.S.Y 1.3HC High Resolution CCD-Kamera mit Festwinkel-

Tischgerät, mit UV-Transilluminator-Schublade, Tischgerät, mit UV-Transilluminator-Schublade,

Objektiv an einer verschiebbaren Halterung über einem UV-Transilluminator befestigt. Die Kontrolle der

Sicherheitsdeckel, Abschaltautomatik des

Sicherheitsdeckel, Abschaltautomatik des

5. Kurzbeschreibung des Systems und der

Kameraein-stellungen und Belichtungszeit erfolgt "live" im PC über die GLP-konforme E.A.S.Y Win32-

Transilluminatores, Analog-Kontrollmonitor, Transilluminatores, Analog-Kontrollmonitor,

Komponenten

Software. "On-Chip- Integration" bis zu zwei Stunden sind möglich. Die Fernbedienung TP-1 ermöglicht die

Videoprinter, geeignet für Räume mit Tageslicht Videoprinter, geeignet für Räume mit Tageslicht

Steuerung der wichtigsten Parameter ohne Verwendung von Tastatur und Maus. Zur Dokumentation wird

das Bild der Vorlage sofort mit dem Videoprinter (Mitsubishi CP770DW) ausgedruckt. Die Bearbeitung und

Quantifizierung der Vorlage erfolgt mit den spezifischen Auswertungsmodulen in E.A.S.Y Win32 mit

abschließendem Export nach Word oder Excel.

6.

maximale Gelfläche (cm x cm)

11

x 14 cm

22

x 28 cm

22 x 28 cm

7.

maximale Imaging-Fläche (cm x cm)

11

x 14 cm

15

x 21 cm

22 x 28 cm

8 . Linearer dynamischer Bereich

2 O.D.

2 O.D.

Über den gesamten Bereich linear • OD von 0-4 (Probenabhängig)

9. Detektor

9.1

Typ

CCD-Kamera

CCD-Kamera

E.A.S.Y 1.3HC CCD-Kamera: High Resolution-Kamera mit ca. 1.3 Mio. Pixeln, Lens-on-Chip-Technologie

und On-Chip-Integration. Schnelle Vorschaubilder erhält man mit der Binning-Funktion (max. Faktor 64).

Spezial-Gehäuse für die rechtwinklige Befestigung an der Dunkelhaube.

9.2 Zoom-Linse (Bereich, mm)

Festwinkelobjektiv 12,5 mm, F/1.4 • Optional: Zoom-Objektiv (8-48 mm, 1:1,0) mit Spezial-DNA-Filter und

f este Brennweite (12 mm, 1:1,2)

Brennweite (8 - 48 mm, 1:1,2)

Nahlinse

9 .3 Kühlung Kühlsystem und -bereich ( ° C)

keine

Kühlung

keine

Kühlung

Zweistufige Peltier-Kühlung

9.4 Auflösung (Pixel x Pixel)

736

x 576 pixel (Quadratpixel)

736

x 576 pixel (Quadratpixel)

S ensorformat 2/3’’ • Effektive Pixeldichte 1300 x 1030 • Pixelgröße 6,7 x 6, 7 µm

P ixelgröße ( µ m x µ m)

9.5

Datenoutput (Graustufen/Farben)

BAS

über BNC

BAS

über BNC

12 Bit 4096 Graustufen

9.6

Sonstiges

Helligkeitsregulierung

über Blende

Helligkeitsregulierung

über Blende

Das Modell E.A.S.Y 440K mit Zoom-Objektiv (8-48 mm, 1:1,0), Spezial-DNA-Filter und Nahlinse kann für

die tägliche Routinearbeit zusätzlich auf der RH 5.2 montiert werden. Der Wechsel zwischen den

Kameratypen erfolgt direkt in der E.A.S.Y Win32-Software.

10. Transilluminator/Beleuchtung

10.1

Beleuchtungsverfahren

UV-Transilluminator,

Transmission

UV-Transilluminator,

Transmission

UV-Durchlichtverfahren mit Leuchtstoffröhren

10.2

mögliche Anregungswellenlängen/Filter 254

nm, 312 nm, 365 nm

254

nm, 312 nm, 365 nm

UV-Bereich: 254 nm, 312 nm (Standard), 365 nm Weißlicht

10.3

Sonstiges

Spezial-DNA-Filter

Spezial-DNA-Filter

Der UV-Transilluminator ist auf einem herausziehbaren Schlitten mit automatischer An/Aus-

Sicherheitsschaltung zum bequemen Auflegen der Vorlage und präparativem Arbeiten in die Hauben der RH

5-Serie integriert. Der eingebaute UV-Schutzschirm ermöglicht das Betrachten der Gele ohne zusätzlichen

Vollgesichtsschutz oder Schutzbrille. Weißes Auflicht zum Ausleuchten von Blots, DC usw. ist Standard. –

®

D ie Bedienung erfolgt von außen • Herolab long-life -Elektronik ermöglicht flackerfreien Schnellstart der

UV-Röhren mit daraus resultierenden höheren Standzeiten und geringerer Wärmeentwicklung, die einen

Lüfter überflüssig macht. • Spezialreflektoren aus Reinstahlaluminium gewährleisten homogene

Ausleuchtung der Vorlagen mit hoher Nutzung der UV-Intensität der Röhren.

11.

Geräteschnittstellen/für

BAS-Signal

über BNC für FrameGrabber

B AS-Signal über BNC für FrameGrabber

Der Computer dient als Standard-Schnittstelle für diverse Peripheriegeräte wie Scanner, Drucker... usw.

12. Software

32 Bit-Software, E.A.S.Y Win32, GLP-konform: • Digitalisierung and Kamera-Integrations-Steuerung • Über-

Software

zur Dokumentation nicht nötig

Software zur Dokumentation nicht nötig

und Unterbelichtung wird durch Hilfsfarben angezeigt • Um die GLP-konforme Unveränderlichkeit der Daten

zu gewährleisten, verwenden wir ein geschütztes Datenformat (HRX), welches nicht manipuliert werden

kann • E.A.S.Y Win32 Analyse-Software grundsätzlich mit Quantifizierung durch automatische

Hintergrunderkennung, verschiedene Kalibrierungsfunktionen und Datentransfer in Word, Excel,

Datenbanken, ASCII.

10.1

kompatibel zu

E.A.S.Y Win32 ist offen für eine Vielzahl von Datenformaten (z. B. TIFF, BMP, JPEG, CMS, GIF, PCX, PNG,

SMC und andere), welche importiert und analysiert werden können. TIF und BMP sind die Exportformate

der E.A.S.Y Win32-Software.

10.2

Leistungsmerkmale

M odul A:

Abspeicherung, Texteingabe (drehbar), Bild-Rotation • Import- und Export-Funktionen (TIFF,

BMP, etc.) • Bildverbesserung diverse Filterfunktionen • Artefakte-Entfernung, 3D-Darstellung, Makro-

Generator • Twain 32 - Software-Schnittstelle (z. B. für Scanner) • offene DLL-

Schnittstelle für Add-on-

F unktionen • Sprachumschaltung im Programm: Englisch, Deutsch und Französisch • M odul B:

MW –

M olekulargewichts- Bestimmung mit automatischer Multi-Lane Multi-Spot-Erfassung • Modul

C:

Spot - 2D

A nalyse von Einzelvolumen • M odul D:

D ot Blot-Analyse (ELISA) • M odul E:

Mikrotiterplatten-Analyse •

M odul F: D C – Dünnschichtauswertung Rf-Werte, Volumen • Modul

G:

Definierbare quantitative

Reihenauswertung (PCR)

/

f

f

/

/

f

/

f

|transkript LABORWELT Nr. 4/2000 | 51


M A R K T Ü B E R S I C H T

1.

Firmenanschrift

Herolab GmbH

Herolab GmbH

Ludwig-Wagner-Str.12

Ludwig-Wagner-Str.12

D- 69168 Wiesloch

D- 69168 Wiesloch

Tel: 06222-5802-0

Tel: 06222-5802-0

Fax: 06222-5802-34

Fax: 06222-5802-34

Ansprechpartner: Herr Knorr, Herr Wenzel

Ansprechpartner: Herr Knorr, Herr Wenzel

2.

Gerätebezeichnung

E.A.S.Y

Win32-Komplettsystem mit PC

ImageDoc-System mit UV-Transilluminator und ICU-1

3.

Abmessungen des Systems (Br x Ti x H, cm) 150

cm x 80 cm x 70 cm

80 cm x 40 cm x 80 cm

4.

mögliche Anwendungen

Komplettsystem zur Video-Dokumentation, Densitometrie und Analyse von Durchlicht-Vorlagen wie Acrylamid - Preiswerter Einstieg in die Video-Dokumentation von Durchlicht-Vorlagen wie z. B. Acrylamid- und

und Agarose-Gelen, Autoradiogrammen, Mikrotiterplatten, DotBlots. Für Auflicht-Vorlagen läßt sich das System Agarose- Gelen, Autoradiogrammen, Mikrotiterplatten usw. in einem vorhandenen Dunkelraum (mit

mit optional erhältlichen Einsätzen für die UV-Epi-Illumination erweitern. Optimiert für DNA RNA-Gele optionaler Dunkelhaube auch im normalen Labor verwendbar). • Optimiert für DNA RNA-Gele

5. Kurzbeschreibung des Systems und der An der Dunkelhaube RH-5.1 ist die Herolab E.A.S.Y 440K CCD-Kamera mit Zoom-Objektiv und Spezial-DNA-

An einem Repro-Stativ ist die Herolab E.A.S.Y 429K CCD-Kamera mit Zoom-Objektiv und Spezial-DNA-

Komponenten

Filter an einer verschiebbaren Halterung über einem UV-Transilluminator befestigt. Die Kontrolle der Kamera-

Filter über einem UV-Transilluminator befestigt. Mit Hilfe der ICU-1 (Integration Control Unit) wird die

einstellungen und Belichtungszeit erfolgt "live" im PC über die GLP-konforme E.A.S.Y Win32-Software. "On- Belichtungszeit der CCD-Kamera digital gesteuert. "On-Chip Integration" bis zu 1000 "frames" oder 40 sec

Chip Integration" bis zu zwei Stunden sind möglich. Die Fernbedienung TP-1 ermöglicht die Steuerung der macht auch die schwächste Bande sichtbar. Am Bildschirm des 9" Monitors können die

wichtigsten Parameter ohne Verwendung von Tastatur und Maus. Zur Dokumentation wird das Bild der Vor-

Kameraeinstellungen "live" kontrolliert werden. Zur Dokumentation wird das Bild der Vorlage sofort mit

lage sofort mit dem Videoprinter (Mitsubishi CP770DW) ausgedruckt. Die Bearbeitung und Quantifizierung der dem Videoprinter (Mitsubishi P-91E) ausgedruckt.

Vorlage erfolgt mit den spezifischen Auswertungsmodulen in E.A.S.Y Win32 mit abschließendem Export nach

Word oder Excel.

6.

maximale Gelfläche (cm x cm)

22

x 28 cm

20 x 40 cm

7.

maximale Imaging-Fläche (cm x cm)

22

x 28 cm

22 x 28 cm

8 . Linearer dynamischer Bereich

Ü ber den gesamten Bereich linear • OD von 0-4 (Probenabhängig )

Über den gesamten Bereich linear • OD von 0-4 (Probenabhängig )

9. Detektor

9.1

Typ

E.A.S.Y 440K CCD-Kamera: Standard-Kamera mit ca. 440.000 Pixeln, Lens-on-Chip-Technologie und On-Chip - E.A.S.Y 429K CCD-Kamera: Standard-Kamera mit ca. 429.000 Pixeln, Lens-on-Chip-Technologie und On-

Integration. Spezial-Gehäuse für die rechtwinklige Befestigung an der Dunkelhaube.

Chipmm)

Z oom-Objektiv (8-48 mm, 1:1,0) mit Spezial-DNA-Filter und Nahlinse .

Zoom-Objektiv (8-48 mm, 1:1,0) mit Spezial DNA-Filter und Nahlinse .

Integration. Standard-Gehäuse für Stativ-Benutzung.

9 .2 Zoom-Linse (Bereich,

9 .3 Kühlung Kühlsystem und -bereich ( ° C)

Nein

Nein

9.4 Auflösung (Pixel x Pixel)

Effektive Pixeldichte: 752 x 582

Effektive Pixeldichte: 755 x 569

P ixelgröße ( µ m x µ m)

P ixelgröße: 8,6 x 8,3 µm

P ixelgröße: 8,6 x 8,3 µm

9.5

Datenoutput (Graustufen/Farben)

8 Bit 256 Graustufen • 10 Bit 1023 Graustufe n

8 Bit 256 Graustufen • 10 Bit 1023 Graustufe n

9.6

Sonstiges

Modell E.A.S.Y 440KC: Für länger Integrationszeiten, vor allem für Chemolumineszenzapplikationen bei

Die Kontrolle der E.A.S.Y 429K CCD-Kamera erfolgt über die Kamerasteuerungs-

und

Standardauflösung ist die zweistufige, Peltier-gekühlte CCD-Kamera optional erhältlich

Digitalisierungseinheit ICU-1. Sie ist gleichzeitig zentrale Geräteschnittstelle für Peripheriegeräte (s. u.)

10. Transilluminator/Beleuchtung

10.1

Beleuchtungsverfahren

UV-Durchlichtverfahren

mit Leuchtstoffröhre n

UV-Durchlichtverfahren mit Leuchtstoffröhre n

10.2

mögliche Anregungswellenlängen/Filter UV-Bereich:

254 nm, 312 nm (Standard), 365 nm • Weißlich t

UV-Bereich: 254 nm, 312 nm (Standard), 365 nm • Weißlich t

®

10.3

Sonstiges

Der UV-Transilluminator ist auf einem herausziehbaren Schlitten mit automatischer An/Aus-

H erolab long-life Elektronik ermöglicht flackerfreien Schnellstart der UV-Röhren mit daraus

Sicherheitsschaltung zum bequemen Auflegen der Vorlage und präparativem Arbeiten in die Hauben der RH 5- resultierenden höheren Standzeiten und geringerer Wärmeentwicklung, die einen Lüfter überflüssig

Serie integriert. Der eingebaute UV-Schutzschirm ermöglicht das Betrachten der Gele ohne zusätzlichen macht. • Spezialreflektoren aus Reinstahlaluminium gewährleisten homogene Ausleuchtung der Vorlagen

Vollgesichtsschutz oder Schutzbrille. Weißes Auflicht zum Ausleuchten von Blots, DC usw. ist Standard. – Die mit hoher Nutzung der UV-Intensität der Röhren

®

B edienung erfolgt von außen. • Herolab long-life -Elektronik ermöglicht flackerfreien Schnellstart der UV-

Röhren mit daraus resultierenden höheren Standzeiten und geringerer Wärmeentwicklung, die einen Lüfter

überflüssig macht. • Spezialreflektoren aus Reinstahlaluminium gewährleisten homogene Ausleuchtung der

Vorlagen mit hoher Nutzung der UV-Intensität der Röhren.

11.

Geräteschnittstellen/für

Der

Computer dient als Standard-Schnittstelle für diverse Peripheriegeräte wie Scanner, Drucker..... usw.

SU-1: In Verbindung mit der ICU-1 wird die Aufnahme direkt als TIF-Datei auf eine 1,44 MB-Diskett e

gespeichert. Es wird keine Tastatur, Maus oder Festplatte benötigt. Die TIF-Datei kann auf diese Weise

auf jedem beliebigen Computer bearbeitet und ausgewertet werden. • Image2WinPC:Transfer-Kit für die

Bildübertragung der TIF-Dateien von der ICU-1 zu einem vorhandenen PC via parallele Schnittstelle. Die

TIF-Datei kann auf diese Weise auf dem Computer bearbeitet und ausgewertet werden.

12.

Software

32 Bit-Software, E.A.S.Y Win32, GLP-konform: Digitalisierung and Kamera-Integrations-Steuerung • Über- und

Für die Steuerung des System wird keine Software benötigt.

Unterbelichtung wird durch Hilfsfarben angezeigt • Um die GLP-konforme Unveränderlichkeit der Daten zu

gewährleisten, verwenden wir ein geschütztes Datenformat (HRX), welches nicht manipuliert werden kann. •

E.A.S.Y Win32 Analyse-Software grundsätzlich mit Quantifizierung durch automatische Hintergrunderkennung,

verschiedene Kalibrierungsfunktionen und Datentransfer in Word, Excel, Datenbanken, ASCII.

10.1

kompatibel zu

E.A.S.Y Win32 ist offen für eine Vielzahl von Datenformate (z. B. TIFF, BMP, JPEG, CMS, GIF, PCX, PNG, SMC

Herolab E.A.S.Y Win32-Software sowie gängige Bildbearbeitungssoftware.

und andere), welche importiert und analysiert werden können. TIF und BMP sind die Exportformate der

E.A.S.Y Win32-Software.

10.2

Leistungsmerkmale

M odul A:

Abspeicherung, Texteingabe (drehbar), Bild-Rotation • Import- und Export Funktionen (TIFF, BMP,

Die TIF-Dateien können in der Herolab E.A.S.Y Win32-Software dokumentiert und quantifiziert werden.

etc.) • Bildverbesserung diverse Filterfunktionen • Artefakte-Entfernung, 3D-Darstellung, Makro-Generator •

Twain 32 - Software-Schnittstelle (z. B. für Scanner) • offene DLL-

Schnittstelle für Add-on-Funktionen •

S prachumschaltung im Programm: Englisch, Deutsch und Französisch • Modul

B:

MW – Molekulargewichts-

B estimmung mit automatischer Multi-Lane Multi-Spot-Erfassung • Modul

C:

Spot - 2D Analyse von

E inzelvolumen • M odul D:

D ot Blot-Analyse (ELISA) • M odul E:

M ikrotiterplatten-Analyse • M odul F:

DC –

Dünnschichtauswertung

R f- Werte, Volumen • M odul G:

Definierbare quantitative Reihenauswertung (PCR)

/

/

f

/

/

/

/

f

/

/

52 | Nr. 4/2000 |transkript LABORWELT


P R O D U K T W E L T

Kennziffer 25LW04

Sicher Proben

identifizieren mit

Laser-Codierung

TraXis ist ein neues Logistik-

System der Integra Biosciences

GmbH zur sicheren Lagerung

und Identifizierung von Proben.

Die neuen Microtubes

sind am Boden mit einer speziellen

Codierung versehen, die

in einem TraXis-Reader rasch

und sicher identifiziert werden

können. Die einzigartige Laser-Codierung

der TraXis-

Kennziffer 26LW04

Neue Software zur Auswertung von 2D-Gelen

Eine wesentlich beschleunigte

Auswertung von 2D-Elektrophorese-Gelen

verspricht die

neue Software Delta2D der

DECODON GmbH. Delta2D

erzeugt Falschfarbenbilder, auf

denen Unterschiede in den

Spot-Intensitäten zweier Gele

direkt sichtbar gemacht

werden.

Das Hauptproblem beim

Vergleich von 2D-Gelen ist die

durch Laufunterschiede

bedingte Variation der

Positionen der Protein-Spots.

Diese Variation behindert den

direkten visuellen Vergleich,

so daß bei traditioneller

Auswertungssoftware mehrere

Verarbeitungsschritte mit

aufwendigen manuellen

Korrekturen erforderlich sind.

Delta2D entzerrt eines der

Gele, so daß die Spots exakt

zur Deckung gebracht werden

können.

Dazu werden zunächst beide

Gelbilder geladen und zu

einem Falschfarbenbild (Kontrollgel:

grün, Experiment: rot)

kombiniert. Dann markiert der

Benutzer korrespondierende

Spots; es genügt dabei, nur

einen kleinen Bruchteil der

vorhandenen Spots zu markieren.

Im anschließenden Bildbearbeitungsschritt

werden die

markierten Spots exakt zur

Deckung gebracht. Durch

einen speziellen Warping-

Algorithmus erhalten auch die

nicht markierten Spots übereinstimmende

Positionen. Das

Ergebnis ist ein Falschfarbenbild,

auf dem Spots die nur in

einem Gel vorkommen rot

bzw. grün eingefärbt sind,

während Spots mit gleicher

Intensität gelb dargestellt

werden.

Die Software läuft unter

Windows, Linux und Solaris.

Eine kostenlose Demo-Version

ist als Download unter

www.decodon. com oder als

Demo-CD unter Tel. +49-

(0)3834-515230 erhältlich.

Microtubes ermöglicht 8,5

Milliarden Kombinationsmöglichkeiten,

wodurch Verwechslungsmöglichkeiten

sicher

ausgeschlossen werden können.

Mit neuen Verschlußkappen-

Matten können 96 Röhrchen

komplett verschlossen werden.

Nach Entfernung der Zwischenstege

können die Tubes

auch einzeln verschlossen

entnommen werden.

Wahlweise stehen drei Reader

unterschiedlicher Kapazität

zur Identifizierung und Zuordnung

Ihrer Proben zur Verfügung:

der Profi-Reader zur Identifizierung

eines vollen

Racks in weniger als 3

Sekunden

der Reader für Einzelproben

zur Identifizierung eines

Röhrchens in 0,5 Sekunden

und ein Reader auf Scanner-

Basis zur Identifizierung

eines vollen Racks in 45

Sekunden.

Mehr Informationen über

eMail: info@integra-biosciences.

com oder das WWW:

www.integra-biosciences.com

Kennziffer 27LW04

AxioVision-Modul „Mark & Find“

Ein neues Software-Modul

„Mark & Find für die Mikroskopie

hat Carl Zeiss Jena im

Oktober vorgestellt. Die neue

Software für automatische

Mikroskope – etwa Axioplan 2

imaging, Axiovert 200 M oder

Axioskop 2 MOT – erspart

dem Nutzer die handschriftliche

Aufzeichnung von Kreuztisch-Koordinaten,

um ein

Präparat exakt repositionieren

zu können. Denn die Software,

die kombiniert mit motorisierten

und sogenannten kodierten

Objektträgertischen einsetzbar

ist, kann Positionen auf Objektträgern

markieren und markierte

Positionen wieder

aufsuchen. „Kodiert“ bezeichnet

in diesem Fall nichtmotorisierte

Tische, deren

Position durch Computer

ausgelesen werden kann. Auch

an anderen Mikroskopen

können mit Hilfe der AxioVision-Software

gespeicherte

Präparatpositionen wiedergefunden

werden. Zur Verwaltung

von Präparatdaten und

Positionslisten stellt die Software

eine Datenbank bereit.

Kennziffer 28LW04

Perfekte Plasmid-

Aufreinigung

Perfectprep, 96 Vac Direct Bind

– hinter dieser Bezeichnung

verbirgt sich ein von der

Eppendorf AG entwickeltes

System zur parallelisierten

Aufreinigung von Plasmid-

DNA aus Bakterien in kürzester

Zeit. Es arbeitet im 96er

Mikrotiterplattenformat und

benötigt nur 35 Minuten zur

Prozessierung der Bakterienklone.

Das System arbeitet mit

Membranplatten und Vakuumtechnologie.

Die Bakterien

werden zunächst in 96er-

Platten kultiviert. Dann erfolgt

die DNA-Aufreinigung über

eine modifizierte alkalische

Lyse in Kombination mit einer

optimierten Filtertechnologie.

Die isolierte, hochreine

(salzfreie) DNA ist nach Elution

ohne Fällungsschritt einsetzbar

für weitere Downstream-

Applikationen wie PCR, DNA-

Sequenzierung sowie Transformation/-fektion.

Das Elutionsvolumen

ist konstant und liegt

bei etwa 70 µl. Dies gewährleistet

eine reproduzierbare

Konzentration an Plasmiden

pro Volumeneinheit.

|transkript LABORWELT Nr. 4/2000 | 53


P R O D U K T W E L T

Kennziffer 29LW04

Neu: Digitale Mikroskopkamera von Olympus Optical

len C-Mount-Anschluß an alle

Standardmikroskope

anschließen. Das System ist

PC-kompatibel und eignet

sich für die Erfassung,

Archivierung und Analyse

von Bildern.

Die neue Optical-Swing-

Technologie des DP50 basiert

Kennziffer 30LW04

Die neue digitale Mikroskopkamera

DP50 von Olympus

eignet sich für alle Kontrastverfahren

einschließlich

Fluoreszenzmikroskopie und

läßt sich über einen universelauf

einem Peltier-gekühlten

CCD-Chip mit einer

Auflösung von 1,5 Millionen

Pixeln. Über die hochpräzise

Kippung des einfallenden

Lichtstrahles in Kombination

mit einer räumlich verschobenen

Mehrfachbelichtung

werden Bilder mit einer

physikalischen Auflösung

von 5,8 Millionen Pixel

erzeugt. Die Bilddaten

automatisch verarbeitet und

in Sekundenschnelle auf dem

PC-Monitor angezeigt, wobei

zwischen drei verschiedenen

Bildauflösungen gewählt

werden kann.

Das bei Langzeitbelichtungen

in der Fluoreszenzmikroskopie

auftretende thermische

Hintergrundrauschen wird

durch die Peltierkühlung

deutlich reduziert, und dies

verbessert die Bildqualität.

Die Einstellung und

Steuerung der Kamera erfolgt

über eine Software mit

grafischer Benutzeroberfläche.

Die Belichtung der

digitalen Bilder wird über

Sensorflächen gesteuert, die

Applied Biosystems: Neue oMALDI-

Quelle für die Proteomforschung

Hohen Durchsatz bei der

Identifikation und Sequenzierung

aufgetrennter Proteine

mit der Genauigkeit der

Tandemmassenspektrometrie

verbindet ein im Oktober von

Applied Biosystems vorgestelltes

System. Neu daran ist die

Kopplung einer sogenannten

orthogonalen MALDI-Quelle

(oMALDI) mit einem Tandemmassenspektrometer

– dem

bereits im März diesen Jahres

vorgestellten API QSTAR

Pulsar Hybrid LC/Tandemmassenspektrometer-System.

Die neue oMALDI-Quelle

erlaubt zum Beispiel die

Identifikation von Proteindigests

aus ein- und zweidimensionalen

Gelen durch „peptide

mass fingerprinting“ sowie die

Bestimmung von Proteinsequenzen

durch Tandemmassenspektrometrie

auf derselben

Plattform. Das QSTAR Hybrid,

Da neben der oMALDI-Option

auch mit API- und Nanospray

arbeitet, erfaßt einen Massenbereich

zwischen 5 bis 12.000

Dalton bei einer Genauigkeit

von 5 ppm.

Das QSTAR Pulsar Hybrid LC/MS/

MS-System

sich im Bildausschnitt frei

positionieren lassen.

Zusätzlich kann man

zwischen Flächen- und

Spotmessung unterschiedlicher

Größe wählen und so die

optimale Belichtung im

Durchlicht als auch in der

Fluoreszenz direkt einstellen.

Echtzeitbilder werden mit

einer Bildwiederholrate von

bis zu 16 Bildern/Sek.

angezeigt, wodurch die

Fokussierung und die

Auswahl des Bildausschnitts

der Präparatbilder schnell,

problemlos und einfach

erfolgen kann.

Kennziffer 31LW04

MT-Online-Shop

Mettler-Toledo hat seine

E-Business-Plattform, den

Online-Shop www.mt-shop.de,

komplett überarbeitet. Alle

Angebote gibt es jetzt in 10

Ländern, 5 Sprachen und 11

Währungen. Von der Einstiegsseite

surft man auf die

landesspezifischen Portalseiten.

Dort können Kundenmagazine

in Landessprache geordert

und ein aktueller eMail-

Informationsservice kostenfrei

abonniert werden. Darüber

hinaus bieten die Portalseiten

vielfältige Informationen zu

landesspezifischen Neuigkeiten

sowie zu Messen und Veranstaltungen.

Der zweite Teil des Internetangebots

besteht aus einer grundlegend

überarbeiteten Navigation,

die den Kunden über

verschiedene Ebenen spezifisch

zu dem gesuchten Produkt

bzw. Anwendung führen

kann. Mit jeder Ebene nimmt

die Informationstiefe zu, das

heißt, man startet mit einer

relativ unspezifischen Anfrage,

erhält eine Übersicht über die

Angebote und kann dann

spezifisch auswählen. Kennt

man das gesuchte Produkt

bereits, steht eine Suchfunktion

zum schnellen Zugriff zur

Verfügung. Die passenden

Produkte können direkt ausgewählt

und online bestellt werden.

Die Online-Produktpalet-

Impressum

LABORWELT – das Themenheft

von |transkript erscheint vierteljährlich

als Supplement des Nachrichtenmagazins

mit zusätzlichem

Verteiler im Verlag der

BIOCOM AG

Stralsunder Str. 58-59

D- 13355 Berlin

Internet: www.biocom.de

Redaktion:

Dipl.-Biol. Thomas Gabrielczyk

(verantw.)

Dr. Pablo Serrano, Dipl.-Biol.

Tel. 040/264921-50

Fax 040/264921-11

eMail: laborwelt@biocom.de

Anzeigenleitung:

Oliver Schnell

Tel. 040/264921-45

eMail: schnell@biocom.de

Leserservice:

Tel. 040/264921-4o

Graphik & Bildredaktion:

Heiko Fritz

Alle Beiträge sind urheberrechtlich

geschützt. Ohne schriftliche Genehmigung

der BIOCOM AG darf kein

Teil in irgendeiner Form reproduziert

oder mit elektronischen Systemen

verarbeitet, vervielfältigt oder

verbreitet werden.

© BIOCOM AG, Berlin

Bildnachweis: © Titelbild Prof. Maria

Leptin (Univ. zu Köln) mit freundlicher

Genehmigung.

te umfaßt eine erweiterte

Auswahl an Elektroden, Titratoren

und von Labor- sowie

Industriewaagen. Zu

hocherklärungsbedürtigen

Produkten wird neben einer

Vielzahl an Informationen im

Netz auch die fachliche Beratung

eines Außendienstmitarbeiters

angeboten. Literatur

und zahlreiche Servicedienstleistungen

runden den neuen

Internetauftritt ab.

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