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BR L EI T P Z L O I CR H T

tionen von spezifisch dort lokalisierten, aber

in Gewebe- oder Zellhomogenaten kaum

darstellbaren Proteinen möglich wird 12 .

Eine Strategie der differentiellen Extraktion

eines Gewebe- oder Zellhomogenats ist keine

Alternative zur subzellulären Fraktionierung,

da mögliche Informationsgewinne

über strukturelle Zusammenhänge wie die

Zuordnung zu einem subzellulären Kompartiment

verschenkt werden.

Weiterführende

experimentelle Strategien

Ein Ziel der Proteomanalyse ist es nach wie

vor, alle Genprodukte eines Organismus auf

Proteinebene zu detektieren. Küster et al. 13

demonstrierten, daß es möglich ist, mit massenspektrometrischen

Daten Genprodukte

auch in komplexen Genomen zu identifizieren,

in denen die betreffenden codierenden

Gene von Introns unterbrochen sind, ohne

daß zuvor die mRNA/cDNA-Sequenz bekannt

war. Die Proteinchemie ist beim Aufspüren

offener Leserahmen auf der sequenzierten

DNS so den molekularbiologischen

Ansätzen mindestens gleichwertig.

Da für die Identifizierung möglichst aller

Genprodukte ohnehin fraktioniert werden

muß, liegt es nahe, dies zunächst anhand der

Isolierung der verschiedenen Zellkompartimente

durchzuführen. Dabei sollten verschiedene

Kompartimente möglichst simultan

in einem experimentellen Durchlauf gewonnen

werden (wofür bestehende Protokolle

für die subzelluläre Fraktionierung

weiterentwickelt werden müßten. Denkbar

wäre beispielsweise ein Organell-Sorting anhand

von Organell-spezifischen membranständigen

Oberflächenmarkern analog zum

Zell-Sorting).

In ihrer Publikation über die Darstellbarkeit

von Hefeproteinen auf 2D-IEF/SDS-PAGE-

Gelen beschreiben Gygi et al. 1 unter anderem,

daß Proteine, die in niedriger Kopienzahl

vorliegen, der Analyse zugänglich werden,

wenn eine viel größere Menge Ausgangsmaterial

(im beschriebenen Experiment 50 mg

Protein) eingesetzt wird, welches dann mittels

verschiedener Prozeduren zur Reduktion

der Probenkomplexität fraktioniert wird.

Eine derartige Fraktionierung könnte nach

subzellulären Kompartimenten durchgeführt

werden. In welchem Ausmaß derartige Fraktionierungen

reproduzierbar wären, bleibt

allerdings abzuwarten.

Eine rasche Identifizierung aller Genprodukte

wäre auch deshalb wünschenswert,

weil dann vollständige Antikörperbibliotheken

angelegt werden könnten, die zur Erstellung

immunchemischer Proteomkarten

(z.B. intakter Zellen oder Gewebe) genutzt

werden könnten.

Bei einer vergleichenden Proteomanalyse

eröffnet die Arbeit mit simultan generierten

verschiedenen subzellulären Fraktionen die

Möglichkeit der Erfassung eines zusätzlichen

Aspektes der Proteinregulation (der

bei der herkömmlichen Proteomanalyse mit

Homogenatproben selbst im günstigsten

denkbaren Falle nicht detektierbar wäre):

die signalinduzierte Proteintranslokation,

beispielsweise aus dem Zytosol in den Zellkern

oder zum Zytoskelett, aus Speichervesikeln

an die Plasmamembran usw.

Die Vermessung aller auffindbaren Proteine

in simultan gewonnenen subzellulären Fraktionen

erfordert vermutlich gegenüber einem

Homogenatansatz einen erheblich höheren

Probendurchsatz, so daß die Weiterentwicklung

von High-Throughput-Methoden

weiterhin – oder vielleicht mehr als jemals

zuvor – von zentraler Wichtigkeit ist.

Nach wie vor würde sich die Frage nach dem

optimalen Trennsystem für die Proteine der

einzelnen Kompartimente stellen. Hier können

aber aufgrund der viel geringeren Probenkomplexität

von Kompartimentfraktionen

auch Techniken, die eine schlechtere

Auflösung als die 2D-IEF/SDS-PAGE bieten,

dafür aber etwa integrale Membranproteine

adäquat repräsentieren können, effektiver

eingesetzt werden als bei der Homogenat-Analyse.

Alternativ könnte bei vergleichenden Proteomanalysen

die Technik der Isotop-codierten

Affinitäts-Tags (ICAT-Technologie) von

Gygi et al. (1999) verstärkt zum Einsatz kommen:

Proteine zweier zu vergleichender Proben

werden dabei mit einem Cystein-spezifischen

Reagenz kovalent modifiziert, das in

der einen Probe in hydrierter Form, in der

anderen Probe in mehrfach deuterierter Form

angeboten wird und außerdem in beiden

Formen eine Biotin-Gruppe trägt. Nach Abtrennung

des überschüssigen Reagenz werden

die Proben vereinigt und gemeinsam

weiterprozessiert. Nach einer proteolytischen

Spaltung in Lösung wird die Komplexität

des Peptidgemisches durch Avidin-Affinitätschromatographie

für die modifizierten

Peptide drastisch reduziert. Nach eventueller

Vorfraktionierung werden die modifizierten

Peptide in LC-MS-Läufen detektiert

und sequenziert. Aus dem Intensitätsverhältnis

eines Peptids in der hydriert modifizierten

Form (aus der einen Ursprungsprobe)

mit der des korrespondierenden Peptids

in der deuteriert modifizierten Form

(aus der anderen Ursprungsprobe) können

Unterschiede in der Menge eines bestimmten

Proteins in den beiden Ursprungsproben

detektiert werden.

Bei dieser Methode ist das Trennproblem

letztlich auf die Peptidebene verlagert, Cystein-freie

Proteine werden zwar nicht detektiert,

aber es gibt ansonsten ab der Proteinebene

keine prinzipiellen „Problemproteine“

mehr (wie z.B. integrale Membranproteine

sie für die 2D-IEF/SDS-PAGE darstellen).

Das prinzipielle Problem der unterschiedlichen

Proteinhäufigkeit bleibt allerdings

auch bei dieser Methode bestehen. Die

ICAT-Technik wird sicherlich in naher Zukunft

breite Anwendung finden und kann

erst dann in ihrer Leistungsfähigkeit angemessen

bewertet werden. Für die Analyse

subzellulärer Fraktionen, wie für den Nachweis

einer Proteintranslokation, wurde die

Technik bislang nicht eingesetzt.

Ausblick

Die verstärkte Analyse subzellulärer Fraktionen

unter Anwendung verschiedener Trenntechniken

könnte den Proteomanalyse-Projekten,

die mit Zell- oder Gewebehomogenaten

und 2D-IEF/SDS-PAGE arbeiten, neue

Impulse verleihen. Viele auf dem Proteomik-

Gebiet arbeitende Forschungsgruppen sind

dabei, ihr Know-how auf Arbeitstechniken

außerhalb der drei Proteomik-Kerntechnologien

2D-Gelelektrophorese (die in ihrer jetzigen

Form vielleicht bald keine Kerntechnik

mehr ist), Massenspektrometrie und Bioinformatik

auszuweiten oder Kooperationen

mit zellbiologisch und biochemisch erfahrenen

Gruppen zu suchen.

Literatur

[1] Gygi, S.P., et al. (2000) PNAS 97, 9390-9395

[2] Santoni, V., et al. (2000) Electrophoresis 21,

1054-1070

[3] Electrophoresis 21 (16), darin Review von

Jung, E. et al., 3369-3377

[4] Taylor, R.S., et al. (2000) Electrophoresis

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[5] Bell, A.W. et al. (2000) J Biol Chem (JBC

papers in press, published online October

19, 2000)

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[10] Husi, H., et al. (2000) Nature Neuroscience

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[11] Wilson, K.L. (2000) Trends Cell Biol. 10,

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[12] Dreger, M. et al. (1999) Biochemistry 38,

9426-9434

[13] Küster, B. et al., (2000) Abstracts of the

48 th ASMS conference on Mass Spectrometry

and Allied Topics

[14] Gygi, S.P., et al. (1999) Nature

Biotechnology 17, 994-999

Korrespondenzadresse

Dr. Mathias Dreger

AG Neurochemie

Institut für Chemie – Biochemie

Freie Universität Berlin

Thielallee 63

D- 14195 Berlin

20 | Nr. 4/2000 |transkript LABORWELT

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