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IB L IN T Z T L I RC H OT Editorial Proteomics – ein Markt entsteht Erst sechs Jahre ist es her, seit der Begriff des „Proteoms“ geprägt wurde. Schon vorher hatten eine Handvoll Pioniere versucht, „Momentaufnahmen“ des sich ständig verändernden gesamten Proteinbestandes einer Zelle zu machen. Der Vergleich der Proteinmuster zweier verschiedener zellulärer Zustände sollte die Proteine identifizieren, die zum Beispiel maßgeblich über „krank“ oder „gesund“ entscheiden. Der Ansatz schien erfolgversprechender als die Gen-basierte Targetsuche, um Angriffspunkte für neue Medikamente auszumachen – sind doch die Proteine die Funktionsträger der Zelle. Was daraus geworden ist, davon berichtet die Anfang Oktober veröffentlichte Marktstudie „The World Proteomics Market“ der US-Unternehmensberatung Frost & Sullivan: Mehr als 150 Unternehmen – börsennotierte wie ganz kleine – werden in diesem Jahr mehr als eine Milliarde US-$ mit „Proteomics“ erwirtschaften; in fünf Jahren sollen es schon 5,8 Milliarden Dollar sein. Unter den vier Marktsegmenten (spezifische Proteomics-Labordienstleistungen, „Proteom-Bioinformatik“, medizinischdiagnostische Anwendungen und Instrumentation/Technologie), die die Marktforscher ausgemacht haben, ist der Bereich Instrumentation/Technologie mit rund zwei Dritteln Marktanteil heute der bedeutendste. Das älteste Segment ist hier die „klassische“ Proteomanalyse, die mit optimierten 2D-Gelelektrophorese-Methoden zunächst bis zu 10.000 verschiedene Proteine auftrennt. Über Chancen, neue Entwicklungen, aber auch Grenzen dieser bislang leistungsfähigsten Auftrennmethode informieren Sie unsere Beiträge auf den Seiten 7 und 17. Der Vergleich der 2D-Gele mit Dokumentationssystemen (s. Marktübersicht S. 45) und die manuelle Schritte beinhaltende Auswertung der Gelbilder (Seite 4 ) sind derzeit Engpässe dieser Art der Proteomanalyse, während das Ausstanzen der Spots aus dem Gel, der Proteaseverdau und die Massenspektrometrie der Proteinfragmente weitgehend automatisiert ablaufen (siehe S. 12). Probleme des klassischen Ansatzes – wie mangelhafte Darstellung von sehr sauren, basischen sowie von Membran-Proteinen und die begrenzte Reproduzierbarkeit der Auftrennung – haben in jüngster Zeit neue Verfahren auf den Plan gerufen, die zum Beispiel Subproteome analysieren. Einige, wie etwa die Surface Plasmon Resonance-Biosensoren (Seite 21) oder Two-Hybrid-Systeme, konzentrieren sich auf die Analyse der Interaktionspartner von Proteinen. Zerstörungsfreie in vivo-Methoden, die das gleiche leisten, sind etwa die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (Seite 38) und – ganz neu – das Whole Cell Protein Fingerprinting (Seite 42). Schließlich sind da noch die Protein- und Peptidchips (S. 24 und 26), die eine hochparallele Proteomanalyse versprechen, sobald es gelingt, physikalisch hochunterschiedliche Proteine in nativer Form auf den Chips zu immobilisieren. Dieses und vieles Interessantes mehr finden Sie, liebe Leser, in dieser Ausgabe. Eine interessante Lektüre dabei wünscht Ihnen Cover: Modifizierte Version der Tagungsankündigung zum diesjährigen „Cologne Spring Meeting: Protein Machines and Subcellular Organization“ vom 8. bis 10. März. Mit freundlicher Genehmigung von Prof. Dr. Maria Leptin (Design und Copyright). Handzeichnung: Prof. Dr. Rolf Knippers. Foto: Karsten Albers, Tandler Zahnrad & Getriebe. Inhalt REPORT 5 Bildverarbeitung von zweidimensionalen Gelen FRIEDRICH LOTTSPEICH REPORT 17 Proteomics – Zellbiochemische Verfahren gewinnen an Bedeutung MATHIAS DREGER BLITZLICHT 21 Detektion von Protein- Interaktionen in den Proteomics WOLFGANG JÄGER REPORT Klinische Proteomforschung 7 MICHAEL GLOCKER ET AL. REPORT Massenspektrometrische 12 Verfahren in Proteinanalytik und Proteomik MARION JÜRGENS, DETLEV SUCKAU BLITZLICHT 24 Proteinchips – Bindeglied zwischen Genomics und Proteomics HOLGER EICKHOFF ET AL. BLITZLICHT 26 Identifizierung und Optimierung von Proteasesubstraten – ein neuartiger Assay ULRICH REINEKE BLITZLICHT 37 Zellfreie Proteinexpression im präparativen Maßstab SONJA VOGEL-ROHWER BLITZLICHT 38 Einzelne Moleküle im (Laser-)Fokus PETRA SCHWILLE BLITZLICHT Laser-vermittelter Protein-K.O. 32 zur Targetvalidierung FRITZ RUDERT PLATTFORM 42 Hochdurchsatz-Proteomanalyse auf Einzellzellniveau WALTER SCHUBERT KONGRESSWELT 43 Bericht vom Siena-Meeting 2000 ANTON POSCH UND CHRISTINE GAUSS PROFILE Proteomics und Drug Discovery STEFAN SCHMIDT ET AL. 45 Marktübersicht Geldokumentationssysteme 53 Produktwelt 55 Kennziffer-Service |transkript LABORWELT Nr. 4/2000 | 3
BR L EI T P Z L O I CR H T Gelauswertung 2D-Gel-Bildverarbeitung für die Proteomanalyse DR. PHIL. DR. MED. HABIL. FRIEDRICH LOTTSPEICH MAX-PLANCK-INSTITUT FÜR BIOCHEMIE, MARTINSRIED Die Bildverarbeitung von 2D-Gelen hat durch den immensen Aufschwung der Proteomanalyse neue Bedeutung gewonnen. Dabei stellt sich die Bildverarbeitung als der zur Zeit größte Engpaß der Proteomanalyse heraus. Eine große Anzahl von Gelen muß ausgewertet werden, wobei bei der Proteomanalyse besonderer Wert auf die quantitativen Aspekte gelegt werden muß. Die quantitativen Verhältnisse werden aber von der Probenvorbereitung, der Trennung der Proteine durch die zweidimensionale Gelelektrophorese, der Anfärbung der Proteine, dem Scannen wie auch von den Algorithmen der Spoterkennung und des Bildvergleiches wesentlich beeinflußt. Vor allem die Auswerteroutinen sind trotz immer neuer verbesserter Softwareprogramme noch weit von einer Vollautomatisierung ohne manuelle Nachbearbeitung entfernt. Key Words: Proteomics, 2D-gel electrophoresis, staining, image analysis Proteomics ist der quantitative Vergleich von Proteinmustern unterschiedlicher, genau definierter Zustände. Auf den quantitativen Aspekt muß dabei das größte Augenmerk geelegt werden, da im wesentlichen die Veränderungen von Proteinen und Proteinmengen in dem komplexen und hochdynamischen Geschehen der biologischen Netzwerke unterschiedliche funktionelle Zustände charakterisieren (Abb. 1). Über eine quantitative Analyse der Proteinveränderungen in unterschiedlichen, genau definierten Zuständen werden die Informationen erhalten, die Proteomics zu einem der wesentlichen Hoffnungsträger auf dem Gebiet der „Functional Genomics“ machen. Da die quantitativen Ergebnisse so wichtig sind, muß man die wesentlichen Parameter kennen, welche die Proteinmengen und ihre Analyse beeinflussen. Probenvorbereitung Schon die Probenvorbereitung spielt hier eine wichtige Rolle, Wie genau ist das Ausgangsmaterial definiert, wie homogen und wie reproduzierbar ist es herzustellen Alles Fragen, die nur über Wiederholungen und statistische Datenanalyse beantwortet werden können. Das reproduzierbar hergestellte Ausgangsmaterial muß für eine Auftrennung der Proteine und eine Analytik vorbereitet werden. In der Praxis ist dies wegen der äußerst unterschiedlichen Eigenschaften einzelner Proteine eine immens komplizierte und schwierige Aufgabe. Trennung Die Auftrennung eines so komplexen Proteingemisches, wie es ein Proteom ist, kann nur durch Kombination verschiedener Trenntechniken erreicht werden. Als Stand der Technik wird heute die hochauflösende zweidimensionale (2D) Gelelektrophorese eingesetzt, die neben einem akzeptablen Zeitaufwand eine unübertroffene Trennleistung für Proteine bietet. Die Qualität der Proteinspots, die Auflösung, und auch die Proteinmengen, die nach der 2D-Elektrophorese im Gel zu finden sind, hängen von vielen Parametern ab. Welches Gelsystem wird unter welchen Bedingungen verwendet: Ampholine, Immobiline, eingesetzte pH- Gradienten, welche Geldimensionen, Elektrophoreseparameter Veränderungen einzelner Parameter haben einen gravierenden Einfluß auf die Form und die quantitative Abb. 1: Darstellung der Ergebnisse einer Proteomanalyse. Man erkennt den quantitativen Verlauf der Menge für einzelne ausgewählte Proteine in fünf verschiedenen Proteomzuständen. Ausbeute einzelner Proteinspots. Als Beispiel sind die unterschiedlichen Spotmuster gezeigt, die man erhält, wenn dieselbe Probe in der ersten Dimension (isoelektrische Fokussierung) in unterschiedlichen pH-Gradienten aufgetrennt wird (Abb. 2). Visualisierung Die durch 2D-Gelelektrophorese aufgetrennten Proteine müssen im nächsten Arbeitsschritt mit einem Farbstoff sichtbar gemacht werden. Neben der etwas unempfindlicheren Coomassie Blue-Färbung werden noch häufig eine Färbung mit Silber, Zn-Imidazol und neuerdings auch Sypro Ruby eingesetzt. Mit Coomassie Blue können Proteinspots mit ca. 100 ng noch gut detektiert werden, die anderen Färbungen können auch noch wenige Nanogramm nachweisen. Neben der Empfindlichkeit ist aber auch noch der dynamische Bereich wichtig – der Bereich, in dem eine Zunahme der Proteinmenge auch eine Zunahme der Färbeintensität bewirkt, in dem also noch keine Sättigung vorliegt. Hier zeigen die empfindlichen Färbungen Silber und Zn-Imidazol einen sehr geringen quantitative Resultate liefernden und damit brauchbaren Bereich von maximal 10 2 . Ganz anders die Fluoreszenz- Färbung mit Sypro Ruby, die über mehr als vier Zehnerpotenzen lineare Antworten liefert und daher immer häufiger für Proteomanalysen eingesetzt wird. Leider haben alle Färbungen unterschiedliche und für die einzelne Proteine ganz spezifische und selektive Färbeintensitäten, die eine absolute und zwischen verschiedenen Färbungen vergleichbare Quantifizierung verhindern. Daher liefern 2D-Gele prinzipiell nur relative quantitative Daten, die bei einem Wechsel der Färbung nicht oder nur sehr aufwendig abgeglichen werden können. Scannen Nach der Färbung müssen die Gele quantitativ analysiert werden, wobei in den letzten Jahren eine ausgefeilte Bildverarbeitung für 2D-Gele entwickelt wurde. Die Information, die in den angefärbten Gelen vorhanden ist, muß in digitalisierter Form verarbeitet werden. Dazu werden die Gele gescannt. Für mit Coomassie Blue, Silber oder Zn-Imidazol gefärbte Gele können preisgünstige Weißlichtscanner verwendet werden, die in Dynamik und Qualität hervorragende Bilder liefern. Für die Analyse der mit Fluoreszenzfarbstoffen gefärbten Gele sind allerdings kostspielige Fluoreszenzscanner notwendig. Hier hat man die Wahl zwischen Geräten, die auf verschiedenen Prinzipien beruhen. CCD-basierte Geräte nehmen um die Auflösung zu verbessern mit einer hoch 4 | Nr. 4/2000 |transkript LABORWELT
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