PDF Download - Laborwelt

laborwelt.de

PDF Download - Laborwelt

B L I T Z L I C H T

des Objektivs abgebildet, um eine entsprechende Tiefenschärfe in

axialer Richtung zu gewährleisten. Bei einer Detektion durch eine

solche – Pinhole genannte – Lochblende tragen nur Moleküle innerhalb

des nun in drei Dimensionen begrenzten Fokalvolumens zum

Signal bei, deren Zahl zu jedem Zeitpunkt statistischen (Konzentrations-)

Schwankungen unterworfen ist. Fluktuationen entstehen im

einfachsten Fall dadurch, daß in Lösung befindliche fluoreszente

Moleküle in das ausgeleuchtete Meßvolumen hinein- und wieder

herausdiffundieren oder dadurch, daß sich während ihrer Aufenthaltsdauer

reversible Änderungen in der molekularen Struktur oder

Umgebung ereignen, die ihr Fluoreszenzverhalten beeinflussen (Abb.

1).

Für eine zeitliche Analyse der Signalfluktuationen δF(t) im Laserfokus,

die mit einer hochsensitiven Photodiode gemessen werden,

wird von dem fluktuierenden Fluoreszenzsignal mathematisch eine

sogenannte Autokorrelationsfunktion G(t) ermittelt , der die Methode

ihren Namen verdankt:

G(t) kann als eine räumlich gewichtete Fluktuations-Zerfallsfunktion

betrachtet werden. Im Falle frei beweglicher Moleküle beschreibt

die charakteristische Abklingzeit von G(t) einfach die mittlere Aufenthaltsdauer

eines einzelnen Moleküls im Fokalbereich des Objektivs,

die spezifische Form der Abklingkurve ist durch die Art des

Transportprozesses gegeben, dem die Moleküle unterworfen sind.

Aus der mittleren Aufenthaltsdauer lassen sich sehr leicht Mobilitätsparameter

wie z.B. Diffusionskoeffizienten der Moleküle ermitteln.

Aufgrund der statistischen Natur der Konzentrationsschwankungen

ist die Amplitude G(0) der normierten Korrelationsfunktion

zudem umgekehrt proportional zur mittleren Anzahl von Teilchen

im Meßvolumen und erlaubt eine präzise lokale Konzentrationsbestimmung.

Falls Moleküle während ihres Aufenthalts im Meßvolumen

zusätzliche Fluoreszenzfluktuationen aufweisen, lassen deren

charakteristische Stärke und Frequenz wiederum Rückschlüsse auf

die zugrundeliegenden Prozesse zu. Dieses Prinzip kann genutzt

werden, um intramolekulare Dynamiken fluoreszenzmarkierter Moleküle

zu analysieren, wie etwa Konformationsänderungen von

Proteinen. Fluoreszenzfluktuationen können aber auch durch die

molekulare Mikroumgebung induziert werden. So weisen etwa

verschiedene GFP (green fluorescent protein) Mutanten ein pHabhängiges

Blinkverhalten auf, das auf Einzelmolekülebene gemessen

eine präzise lokale pH-Bestimmung erlaubt 3 .

Messung von Assoziations- und

Dissoziationsprozessen

Als eines der attraktivsten Einsatzgebiete der konfokalen Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie

in biochemischen Fragestellungen

erwies sich bislang die Analyse frei in Lösung befindlicher Biomoleküle

hinsichtlich deren Konzentration und Diffusions-koeffizienten.

Da diese beiden Parameter die Form der Meßkurve in entscheidender

Weise bestimmen, können alle Prozesse, die eine Änderung

dieser Parameter nach sich ziehen, in ihrer zeitlichen Entwicklung

mittelbar verfolgt werden (Abb. 2). Prominentes Beispiel ist die

Änderung der Diffusionseigenschaften von Nukleinsäuren oder

Proteinen durch spezifische Bindung an große Reaktionspartner, die

im Extremfall zu einer vollständigen Immobilisierung zunächst frei

beweglicher Partikel führen kann. Dies eröffnet die Möglichkeit

kinetischer Untersuchungen der fluoreszenzmarkierten Reaktionspartner

in Echtzeit in bislang nicht zugänglichen Konzentrationsbereichen

(pM-nM) 4 .

|transkript LABORWELT Nr. 4/2000 | 39

Weitere Magazine dieses Users
Ähnliche Magazine