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BR L EI T P Z L O I CR H T

Standortportrait

Klinische Proteomforschung

MICHAEL O. GLOCKER 1 , BRUNO RINGEL 1 , LUTZ GÖTZE 1 , PETER LORENZ 1 , SILKE WANDSCHNEIDER 1 ,

VOLKER FEHRING 1 , BJÖRN DAMM 1 , MARCUS BANTSCHEFF 1 , SALEH IBRAHIM 1 , J.-MATTHIAS LÖHR 2 UND

HANS-JÜRGEN THIESEN 1

1

PROTEOM-ZENTRUM ROSTOCK, UNIVERSITÄT ROSTOCK, 2 SEKTION MOLEKULARE GASTROENTEROLOGIE,

MEDIZINISCHE KLINIK IV, FAKULTÄT FÜR KLINISCHE MEDIZIN MANNHEIM, UNIVERSITÄT HEIDELBERG

Im BMBF-Leitprojektverbund „Proteom-Analyse des Menschen“ wird die Proteomforschung zur

Entwicklung spezifischer Diagnostik-Methoden und kausaler Therapieansätze für „Rheumatoide

Arthritis“ (RA) sowie andere Autoimmunerkrankungen (z.B. autoimmune Pankreatitis, Multiple

Sklerose (MS), etc.) vorangetrieben. Über die Analyse aller Proteine (dem Proteom) einer Zelle, eines

Gewebes, einer extrazellulären Flüssigkeit bzw. eines Organismus soll ein ursächliches Verständnis

über Autoimmunerkrankungen erhalten werden, um unter Einbindung genomorientierter Daten

prädiktive Aussagen über den individuellen Krankheitsverlauf treffen zu können. Hierzu werden in

einem nationalen Verbund (www.proteome-alliance.de) neue Technologien zur Proteom-Analyse

erarbeitet und im Proteom-Zentrum Rostock für die Anwendung erprobt. Speziell für die Anwendung

im klinischen Umfeld werden Methoden zur Probengewinnung im Operationssaal, zur Probenaufbereitung

(Free-flow-Elektrophorese), zur Probentrennung (zweidimensionale Gelelektrophorese), zur

Proteinvisualisierung (Fluoreszenzfärbungen), zur „Proteinspot“-Isolierung („Spot-Picking“-Robot-System)

und zur Proteinidentifizierung (MALDI-TOF-Massenspektrometrie) entwickelt. Die

Ergebnisse aus der Proteomforschung sollen im Forschungsverbund zur Identifizierung und Charakterisierung

von Suszeptibilitätsgenen und deren Proteinen beitragen und damit zu einer genombasierten

individualspezifischen Therapie dieser Erkrankungen führen.

Key Words: Proteomanalyse, Autoimmunerkrankungen, Rheumatoide Arthritis (RA), Probenvorbereitung,

Proteinanreicherung, Hochauflösende 2D-Gelelektrophorese, Free-flow-Elektrophorese,

Fluoreszenzfärbung

darf daher nur aus sehr wenigen Schritten

bestehen, soll jedoch alle vorhandenen Proteine

so quantitativ wie nur möglich der nachgeschalteten

Analytik zuführen. Aufarbeitungsmethoden

für viele unterschiedliche

(überwiegend nicht-humane) Proteomproben

wurden kürzlich zusammengefaßt publiziert

1 . Der vorliegende Artikel fokussiert auf

die Besonderheiten der Präparation klinischer

Proben für die Proteomforschung. Im folgenden

sollen die Charakteristika der unterschiedlichen

Probenpräparationsverfahren,

deren Vorteile und Einsatzbereiche anhand

klinischer Beispiele beschrieben werden.

Körperflüssigkeiten

Die Proteom-Analyse bzw. die massenspektrometrische

Protein-Analytik ist insbesondere

dann für klinische Untersuchungen erforderlich,

wenn Proteine in Körperflüssigkeiten

zu erfassen und zu charakterisieren sind,

also mangels Zellmaterial keine RNA-Proben

zur Microarray-Chipanalytik erhältlich sind.

Körperflüssigkeiten sind je nach ihrer Herkunft

sehr unterschiedlicher Natur und erfordern

demzufolge speziell angepaßte Aufarbeitungsmethoden.

Während etwa bei Gallen-

bzw. Pankreassaft in erster Linie die hohen

Anteile an Proteasen, der alkalische pH-

Wert der Lösung und der hohe Gehalt an

Das Ziel des Forschungsverbundes „Proteom-Analyse

des Menschen“ innerhalb des

BMBF-Leitprojektes „Therapie und Diagnose

mit den Mitteln der Molekularen Medizin“

ist die Nutzung der Proteom-Analyse

(Analyse der Gesamtheit aller Proteine einer

Entität) zur Entwicklung spezifischer Diagnostik-Methoden

und kausaler Therapieansätze

für ausgewählte Autoimmunerkrankungen

(Rheumatoide Arthritis (RA), autoimmune

Pankreatitis, Multiple Sklerose (MS)).

Der BMBF-Leitprojektverbund „Proteom-

Analyse des Menschen“ will einen wesentlichen

Beitrag zur Ätiopathogenese von Autoimmunkrankheiten

durch die Analyse aller

Proteine – dem Proteom einer Zelle – eines

Gewebes, bzw. einer extrazellulären Flüssigkeit

leisten (unter Einbindung von RNA-Expressionsdaten

(Affymetrix-Microarray-

Chiptechnologie), um damit richtungsweisende

neue Ansätze für die Diagnostik und

kausale Therapieformen zu entwickeln. Hierzu

werden in einem nationalen Verbund

(www.proteome-alliance.de) neue Technologien

zur Proteom-Analyse erarbeitet und im

Proteom-Zentrum Rostock unter klinischem

Bezug erprobt. Die Ergebnisse dieses Forschungsverbundes

sollen zur Identifizierung

und Charakterisierung von Suszeptibilitätsgenen

bzw. deren Proteinen beitragen.

Im Proteom-Zentrum Rostock werden Expertisen

und Methodenkenntnisse aus molekularbiologischen

und proteinbiochemischen

sowie medizinischen Forschungsrichtungen

vereint, um die Gesamtheit aller Proteine

von Patientenproben (Körperflüssigkeiten,

Gewebebiopsien) quantitativ zu erfassen.

Hierzu haben wir Methoden zur Probengewinnung

und -aufbereitung (Freeflow-Elektrophorese),

zur Probentrennung (zweidimensionale

Gelelektrophorese), zur Proteinvisualisierung

(Fluoreszenzfärbungen),

zur Proteinisolierung (Picking-Robot) und

zur Proteinidentifizierung (MALDI-TOF-

Massenspektrometrie) speziell für die Anwendung

im klinischen Umfeld entwickelt.

Unter Zuhilfenahme der international zugänglichen

Gensequenzdatenbanken werden

die gewonnenen Forschungserkenntnisse

direkt der klinischen Praxis zugänglich

gemacht, mit dem Ziel molekulare Ursachen

von Autoimmunerkrankungen aufzudecken

und zu Fortschritten in Diagnose, Prognostik

und Therapie zu führen.

Probenvorbereitung

Für die Beschreibung eines (pathologischen)

Zustandes werden im Proteom-Zentrum Rostock

Proteome (und RNA-Expressionsmuster)

von menschlichen Körperflüssigkeiten

und Gewebeproben mit Hilfe optimierter

Präparationsmethoden und unter standardisierten

Bedingungen für die vergleichende

Analytik gewonnen. Die Proteomforschung

analysiert – anders als die traditionelle Proteinanalytik

– die Gesamtheit der Proteine im

komplexen Gemisch. Die Probenvorbereitung

Abb. 1: 2D-Gelelektrophorese-Proteinmuster

von Pankreassaft eines Patienten mit chronischer

Pankreatitis.

A: pH Bereich 4-7;

B: Zoom-Gel, pH 5,5-6,7. Proteinmenge ca.

50 µg pro Gel. Immobilingele (18 x 20 cm 2 ).

Silberfärbung

|transkript LABORWELT Nr. 4/2000 | 7

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