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BR L EI T P Z L O I CR H T

Abb. 4: Fluoreszenzscan

eines 2D-Gel-Proteinmusters

von Synovialflüssigkeit

eines Patienten

mit juveniler chronischer

Arthritis. Proteinmenge

ca. 60 µg. Immobilingel

(20 x 18 cm 2 ).

Sypro ruby ® -Färbung.

Fuji FLA 3000-Fluoreszenzscanner:

Anregungswellenlänge

473 nm,

Emmissionswellenlänge

675 nm. Die Ausschnittsvergrößerungen

zeigen

Proteinspots mit

variierenden Durchmessern

von 0,2 bis 1,0 mm.

zifischer Weiterbehandlung der Proteinkonzentrate

werden hochauflösende 2D-Gelelektrophoreseläufe

(Abb. 2B) durchgeführt

(s. Abschnitt Hochauflösende Gelelektrophorese).

Unsere Untersuchungen zeigten, daß

– anders als bei den Pankreassaftproben –

die Erhöhung der Ortsauflösung allein durch

Anwendung von Zoom-Gelen (s. Abschnitt

Probenvorbereitung) nicht zum gewünschten

Erfolg führten. Die durch den Einsatz

der Free-flow-Elektrophorese erzielten Anreicherungen

an niedrig exprimierten Proteinen

waren dagegen sowohl im hochmolekularen

(Kasten I) als auch im niedermolekularen

Bereich (Kasten II) hocheffizient.

Hochauflösende

2D-Gelelektrophorese

Die 2D-Gelelektrophorese ist die zur Zeit

einzige Trenntechnik, die in der Lage ist, ein

hochkomplexes Gemisch aus Proteinen in

bis zu 10.000 unterscheidbare Proteinspots

zu trennen. Diese Zahl entspricht in etwa

der Gesamtzahl der Gene in einfachen Organismen

(z.B. Bakterien, Hefe, etc.). Für die

klinische Proteomanalyse ist die hochauflösende

2D-Gelelektrophorese für eine Reihe

von Untersuchungen, insbesondere für die

Analyse von „Partial“-Proteomen, in vielen

Fällen ebenfalls ausreichend. Die beiden häufigsten

2D-Gelelektrophoresemethoden, die

Ampholyt-Technik 6 und die Immobilin-

Technik 7 werden nachfolgend in bezug auf

ihre Anwendung für klinische Proben beschrieben.

A

B

Ampholyt-Technik

Die Ampholyt-Technik wurde bereits Mitte

der siebziger Jahre entwickelt 8 . Die Vorteile

dieser Methode für die klinische Proteomforschung

bestehen vor allem in ihrer Flexibilität,

die insbesondere für die Methodenentwicklung

von Bedeutung ist. Im Proteom-

Zentrum Rostock werden neue Probenpräparationsmethoden,

wie etwa die Kombination

der hochauflösenden 2D-Gelelektrophorese

mit Proteinvortrennungsmethoden,

daher häufig zuerst mit der Ampholyt-Technik

durchgeführt. Spezielle Randparameter,

wie Probenauftragevolumen, Beimischungen

von Inhaltstoffen zum Auftragepuffer

aus Vortrennungsmedien, frei wählbare pH-

Gradienten etc. können mit der Ampholyt-

Technik über einen breiten Bereich variiert

werden, bis die für den jeweils spezifischen

Einsatzbereich (Körperflüssigkeit, Gewebe)

optimierte Methode experimentell bestimmt

ist. Aufgrund der experimentellen und apparativen

Freiheiten können darüber hinaus

Gele mit nahezu beliebigen Dimensionen

und sehr guter räumlicher Auflösung erzeugt

werden (Abb. 3).

Immobilin-Technik

Die Immobilin-Technik 9 zeichnet sich, im

Gegensatz zur Ampholyt-Technik, durch die

einfache Handhabung und hervorragende

Reproduzierbarkeit aus, da die hier verwendeten

Gele industriell vorgefertigt erhältlich

sind. Obwohl die Variationsmöglichkeiten

Abb. 5: A. Automatische

Exzision von Proteinspots

mit Hilfe des

Flexys ® Robots von Genomic

Solutions.

B. Darstellung eines

Gelausschnitts nach erfolgter

Exzision. Stanzdurchmesser:

1,2 mm.

dadurch eingeschränkt sind, ist dies die

Methode der Wahl für den routinemäßigen

Einsatz der 2D-Gelelektrophorese in der klinischen

Proteomforschung. Mit standardisierten

Arbeitsprotokollen (Standard Operating

Procedures, SOPs), wie sie im Proteom-Zentrum

Rostock erarbeitet und in Verbindung

mit einem eigens entwickelten „Laboratory

Information and Management System

(LIMS)“ eingesetzt werden, stellen sie

die Grundvoraussetzung für die routinemäßige

klinische Proteomforschung dar. Die

jeweils eingestellten fixen Trennparameter

orientieren sich dabei meist, wie oben beschrieben,

an den mit Hilfe der Ampholyt-

Technik optimierten Trennmethoden, so daß

die 2D-Trennungen zu vergleichbar guten

Ergebnissen gelangen (Abb. 3).

Fluoreszenzfärbung, Spot-picking

und Bildverarbeitung

Zur Detektion von Proteinspots mit hoher

Nachweisempfindlichkeit werden neben

herkömmlichen Färbeverfahren (Coomassieblue,

Silberfärbung) im Proteom-Zentrum

Rostock neue Fluoreszenzfärbemethoden 10

entwickelt und für die klinische Proteomforschung

eingesetzt 11 .

Fluoreszenzfärbemethoden können in zwei

Kategorien, die prä- und post-Separationsfärbung,

unterteilt werden. In unseren jüngsten

Untersuchungen wurden bereits vielversprechende

Ergebnisse erzielt, insbesondere

für den Einsatz von kovalent an Protein

gebundenen Fluoreszenzfarbstoffen. Hierbei

konnte die Nachweisgrenze auf ca. die

Hälfte derer mit Silberfärbung bzw. kommerziell

erhältlichen Fluoreszenzfarbstoffen

(Abb. 4) gesenkt und somit deutlich verbessert

werden.

Vorbedingung für den Einsatz fluoreszenzgefärbter

Proteingele ist die Verwendung

spezieller Fluoreszenzscanner, die derzeit

noch hohe Anschaffungskosten mit sich

bringt. Dies wird jedoch durch Vorteile aufgewogen

wie

einfach zu handhabende und standardisierbare

Färbeprotokolle

ein großer dynamischer Bereich der Färbung,

mit Hilfe dessen auch in Gegenwart

von stark exprimierten Proteinen

niedrig exprimierte Proteine quantitativ

erfaßt werden können und

geringe Diskriminierung in der Anfärbung

von Proteinen trotz großer Unterschiede

in deren physikalischen Eigenschaften.

Ein Vorteil der Fluoreszenzfärbung ist die

problemlose Verwendung der so markierten

Proteine für den nachfolgenden in-gel-

Verdau und die massenspektrometrische

Identifizierung 12,13 .

Allerdings ist die Excision der fluoreszenzmarkierten

Proteinspots aus dem Gel manuell

nur sehr schwierig zu bewerkstelligen.

10 | Nr. 4/2000 |transkript LABORWELT

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